一種靶向DR5的多肽類PET顯像劑及其製備方法
2024-04-16 00:22:05
一種靶向dr5的多肽類pet顯像劑及其製備方法
技術領域
1.本發明屬於pet顯像劑製備領域，具體涉及一種靶向dr5的多肽類pet顯像劑及其製備方法。
背景技術：
2.18
f-fdg是pet/ct最常見的用於標記的正電子放射性核素，但其並非腫瘤特異性顯像劑，因此在診斷過程中會出現假陰性和假陽性的情況。在腫瘤發展進程中，某些失調或突變的基因導致相關蛋白在腫瘤組織中異常表達，靶向這些異常受體的腫瘤成像也已成為腫瘤治療和成像的主要趨勢。因此，開發示蹤和監測腫瘤靶標受體的抗體顯像劑應運而生。然而抗體或者其片段，均存在分子量較大，在較短時間內難以得到較高的腫瘤/非腫瘤(t/nt)比值的問題。相比較抗體，多肽的分子量小血液清除快、組織穿透力強、t/nt比值高、無免疫原性，具有靈敏度高、特異性強和準確性好，且合成成本相對低廉，並可對其結構進行化學修飾，因此多肽作為小分子配體標記探針是分子核醫學最為活躍的前沿研究領域之一，探索新的生物學標記物進行高質量顯像在腫瘤早期診斷過程中至關重要。
3.trail(tnf related apoptosis inducing ligand)是繼tnf、fasl之後的第三個tnf超家族的凋亡分子，主要通過與靶細胞表面的受體特異性結合而發揮作用。例如trail可通過與死亡受體dr4(death receptor 4)和dr5(death receptor 5)結合而激活下遊通路而誘導細胞的凋亡，且有研究表明trail與dr5結合的親和力高於其它膜表面的trail受體，即在生理條件下，trail更傾向於與dr5結合。dr5激活後可選擇性誘導某些腫瘤細胞凋亡，對正常細胞無毒性。研究表明dr5高表達於多種腫瘤細胞中，而在正常細胞中低表達或不表達。
技術實現要素：
4.本發明要解決的技術問題是現有的pet顯像劑中採用抗體或者抗體片段時均存在分子量較大，難以得到較高的腫瘤/正常組織攝取比值(t/nt)造成檢測準確度差的問題，提供了一種靶向dr5的多肽類pet顯像劑及其製備方法。
5.本發明採用如下技術方案是：
6.一種靶向dr5的多肽類pet顯像劑，具有如下結構：
68
ga-dota-nym522，以
68
ga標記多肽前體，所述多肽前體為dota-nym522，所述多肽前體由雙功能螯合劑dota與多肽nym522偶聯得到。
7.進一步的，所述多肽前體dota-nym522的結構為
[0008][0009]
進一步的，所述多肽nym522的序列為yckvilthrcy。
[0010]
進一步的，所述多肽nym522為d型胺基酸或l型胺基酸。
[0011]
一種靶向dr5的多肽類pet顯像劑的製備方法：
[0012]
(1)取多肽前體dota-nym522凍乾粉溶解，加入緩衝溶液，連續晃動使其充分混合均勻；
[0013]
(2)取
68
gacl3溶液緩慢加入至多肽前體dota-nym522中，加入緩衝液調節溶液ph值為4-4.5，於反應溫度70～100℃下反應10～15min；
[0014]
(3)反應結束後冷卻至室溫，加入抗壞血酸溶液，經純化、過濾後得到
68
ga-dota-nym522。
[0015]
進一步的，所述
68
gacl3溶液為採用
68
ge-68
ga發生器加入0.05m鹽酸溶液或0.1m鹽酸溶液製備得到。
[0016]
進一步的，所述多肽前體dota-nym522凍乾粉使用二甲基亞碸試劑溶解。
[0017]
一種靶向dr5的多肽類pet顯像劑，加入輔料能夠用於製備檢測dr5表達水平的多肽類pet探針試劑盒，輔料包括但不限於醋酸/醋酸鈉緩衝溶液、抗壞血酸鈉和二甲亞碸。
[0018]
本發明的優點具體如下：
[0019]
(1)本發明利用dota作為放射化學標記中間體進行
68
ga標記，得到高純度的pet顯像劑
68
ga-dota-nym522，該pet顯像劑體外穩定性好、水溶性強，能夠經腎臟代謝，體內清除快，在肌肉、骨骼、心臟、肺、肝臟等背景臟器和組織背景攝取低，適合用作pet顯像劑，在dr5陽性表達的kp4荷瘤鼠中攝取明顯，t/n比值能夠達到14.85％，腫瘤攝取對比度好，能清晰分辨病灶部位，具有較好的dr5陽性腫瘤特異性顯像應用前景。
[0020]
(2)本發明製備
68
ga-dota-nym522的方法，步驟簡單易於操作，標記結果直觀準確。
附圖說明
[0021]
圖1為實施例1的
68
ga-dota-nym522的放射性hplc圖譜。
[0022]
圖2為實施例1的
68
ga-dota-nym522的體外穩定性實驗結果。
[0023]
圖3為實施例1的
68
ga-dota-nym522在balb/c小鼠體內的生物分布圖。
[0024]
圖4為
68
ga-dota-nym522和
18
f-fdg在kp4荷瘤鼠模型中的pet/ct顯像圖。
具體實施方式
[0025]
為了使本發明的上述目的、特徵和優點能夠更加明顯易懂，下面結合具體附圖對
本發明的具體實施方式作進一步的說明。
[0026]
本發明實施例中使用的
68
ge-68
ga發生器外購於isotopen technologien m
ü
nchen同位素生物技術公司。
[0027]
68
gacl3溶液的製備：配製低金屬雜質含量的高純度的0.05m的hcl溶液，使用帶有魯爾螺紋接口的注射器吸取5ml的hcl溶液，將注射器接頭接至
68
ge-68
ga發生器的進口管位置，出口管置於廢液瓶中，推動注射器使得hcl溶液流經
68
ge-68
ga發生器內部並經出口管流出，棄初始1.5ml流出液將出口管至於核素接收瓶內，繼續收集2ml，
68
ge-68
ga發生器內
68
ga核素被洗脫出來收集至接收瓶中，即得到
68
gacl3溶液，其中放射性核純度＞99.9％，其他雜質＜0.1％，ph＜2.0；
[0028]
實施例1
[0029]
68
ga-dota-nym522的製備步驟如下：
[0030]
(1)取40μg多肽前體dota-nym522凍乾粉，使用40μl的二甲基亞碸試劑溶解，再加入0.4ml醋酸或醋酸鈉緩衝溶液至含有溶解多肽前體dota-nym522的反應瓶中；
[0031]
(2)取10mci 68
gacl3溶液至反應瓶中，加入醋酸鈉溶液調節溶液ph值至4.5，將反應瓶至於加熱器內，100℃下反應12min；
[0032]
(3)純化：選sep-pak c-18柱進行純化，依次使用10ml無水乙醇、20ml滅菌注射用水活化；將反應後的溶液使用注射器加入至c-18固相萃取小柱中，使用20ml滅菌注射用水衝洗後使用1.2ml 70％無水乙醇溶液淋洗c-18柱，得到目標產物
68
ga-dota-nym522；
[0033]
(4)過濾除菌：選0.22μm無菌濾膜進行過濾除菌，得到
[0034]
68
ga-dota-nym522。
[0035]
68
ga-dota-nym522放射性hplc圖譜如圖1所示，產品的放射性化學純度》95％，該產物放射性化學收率為60％。合成所需總時間為22min，以每次投入68ga核素活度計算未經衰變校準產率為75
±
2％(n＝10)。
[0036]
實施例2
[0037]
68
ga-dota-nym522的製備步驟如下：
[0038]
(1)取40μg多肽前體dota-nym522凍乾粉，使用40μl的二甲基亞碸試劑溶解，再加入0.4ml醋酸或醋酸鈉緩衝溶液至含有溶解多肽前體dota-nym522的反應瓶中；
[0039]
(2)取20mci 68
gacl3溶液至反應瓶中，加入2mol/l醋酸鈉溶液調節溶液ph值至4，將反應瓶至於加熱器內，在70℃條件下反應15min；
[0040]
(3)純化：選sep-pak c-18柱進行純化，依次使用10ml無水乙醇、20ml滅菌注射用水活化；將反應後的溶液使用注射器加入至c-18固相萃取小柱中，使用20ml滅菌注射用水衝洗後使用1.2ml 70％無水乙醇溶液淋洗c-18柱，得到目標產物
68
ga-dota-nym522；
[0041]
(4)過濾除菌：選0.22μm無菌濾膜進行過濾除菌，得到
68
ga-dota-nym522。
[0042]
合成所需總時間為22min，以每次投入
68
ga核素活度計算未經衰變校準產率為75
±
2％(n＝10)。
[0043]
實施例3
[0044]
1、
68
ga-dota-nym522的體外穩定性測試：
[0045]
對
68
ga-dota-nym522在pbs緩衝液和小鼠血清中的穩定性進行測試。
[0046]
取2mlph為7.4的pbs緩衝液與50μci 68
ga-dota-nym522充分混合，在孵箱中37℃孵
育2h，取少量溶液，通過hplc檢測顯像劑的穩定性，以上實驗重複3次。
[0047]
babl/c小鼠摘眼取血1.5ml離心取上層血清，加入100μci
[0048]
68
ga-dota-nym522充分混合，在孵箱中37℃孵育2h，用高速離心機在轉速12000轉/分下離心5min，取上清液進行hplc分析顯像劑的體外穩定性，以上實驗重複3次。
[0049]
測試結果如圖2所示。由圖2可知：
68
ga-dota-nym522在pbs緩衝液和小鼠血清中100％以原型穩定存在，這表明
68
ga-dota-nym522具有較好的體外穩定性。
[0050]
2、
68
ga-dota-522的脂水分配係數測定：
[0051]
脂水分配係數(log p)是化合物的一項基本物理化學性質，尤其是藥物化學中非常重要的研究參數，是一個影響藥物在體內的吸收、分布、代謝和消除的重要因素。
[0052]
取實施例1製備的50μci 68
ga-dota-nym522裝於有1ml正辛醇與1ml水的2.5ml離心管中，密閉置於乾式恆溫器中常溫震蕩10min後，離心使兩相分層(4000r，5min)，用移液器從兩相中分別各取500μl置於γ計數管中，用γ計數器測定計數，並根據計算公式log p＝log(counts in n-octyl alcohol/counts in water)計算log p值。重新補加500μl正辛醇和500μl水，重複上述過程至連續三次log p值相接近。
[0053]
測定得到
68
ga-dota-nym522的脂水分配係數log p為-3.138
±
0.019，這表明
68
ga-dota-nym522為水溶性物質，具有較好的親水特性，在體內清除快，適用於pet顯像研究應用。
[0054]
3、
68
ga-dota-nym522的體內分布測試實驗
[0055]
取3隻正常balb/c小鼠分別經尾靜脈注射30μci的
68
ga-dota-nym522，正常飼養攝取正常飼養攝取2h，處死小鼠，取血及腦、心、肺、肝臟、腎臟等主要臟器與組織稱重並進行γ計數，研究
[0056]
68
ga-dota-nym522在小鼠體內的生物分布情況。
[0057]
實施例1的
68
ga-dota-nym522在balb/c小鼠體內的生物分布如圖3所示，由圖3結果可知，
68
ga-dota-nym522主要經腎臟代謝，血液清除速度快，骨中放射性不高。表明
68
ga-dota-nym522經腎臟代謝，體內清除快，肌肉、骨骼、心臟、肺、肝臟等背景臟器和組織背景攝取低，適合用作pet顯像劑。
[0058]
4、荷瘤鼠
68
ga-dota-nym522的micro pet/ct顯像測試：
[0059]
取dr5陽性表達人胰腺癌kp4細胞以5
×
106/只的密度進行裸鼠皮下接種，待腫瘤直徑生長至5～10mm時，進行顯像劑
68
ga-dota-nym522的micro pet/ct顯像研究，並以同一隻模型鼠同一時間的
18
f-fdg pet/ct顯像效果為對照。
[0060]
實施例1的
68
ga-dota-nym522在kp4荷瘤鼠模型中的pet/ct顯像圖如圖4所示，由圖4可知，
18
f-fdg也同樣能對腫瘤進行顯像，但其在心臟、肝、脾、腎、膀胱等器官中也有聚集；
68
ga-dota-nym522僅聚集在腫瘤部位，腫瘤部位的攝取量明顯高於肌肉、骨骼、肺、腦等器髒或組織，且其主要聚集在腫瘤以及代謝器官腎臟和膀胱中，在心臟和肝脾中幾乎沒有攝取。此外，
18
f-fdg的t/n值(腫瘤/肌肉比值)為8.86
±
1.23，
68
ga-dota-nym522的t/n值(腫瘤/肌肉比值)為13.21
±
1.64，由此可知
68
ga-dota-nym522的t/n值顯著優於傳統pet/ct顯像劑
18
f-fdg。以上結果表明
68
ga-dota-nym522能靶向特異性攝取於腫瘤部位，腫瘤攝取對比度好，能清晰分辨病灶部位，
68
ga-dota-nym522具有較好的dr5陽性腫瘤特異性顯像應用前景。