鏈黴菌BRS-24及其在防治十字花科作物根腫病和促生長中的應用

2024-04-16 06:55:05

鏈黴菌brs-24及其在防治十字花科作物根腫病和促生長中的應用
技術領域
1.本發明屬於生物技術領域，更具體地說是一株能夠促進十字花科作物生長和防治根腫病的鏈黴菌brs-24及其生防菌劑。


背景技術：

2.根腫病是十字花科作物最具破壞性的土傳病害之一，嚴重限制了作物的產量於品質。雖然抗病育種仍然是一種選擇，但是病原菌的快速進化，極大地制約了抗病品種的應用。在許多情下，對根種病的化學防控也是很不理想的，只有傳統上使用的石灰法取得了良好的效果。然而，化學的方法嚴重破壞了田間生態和威脅食品質量安全。因此需要環境友好型的替代品或更多的手段來使作物的抗性反應更穩定持久。
3.開發和應用生防微生物是一種環境友好的植物病害控制策略。然而，生防菌株在宿主植物和土壤中的定植以及對病原體生長的低效抑制限制了它們的病害控制功能的發揮。鏈黴菌能夠合成多種具有促進植物生長與生物防治功能的代謝物。此外，能以菌絲體的形式定殖於植物的各個部位和生長階段。因此，開發生防鏈黴菌具有廣闊前景。然而目前具有防治根腫菌的生防鏈黴菌較少。


技術實現要素：

4.為解決上述問題，本發明提供鏈黴菌brs-24及其在防治十字花科作物根腫病和促生長中的應用。
5.本發明提供一株能夠防治十字花科作物根腫病和促進生長的鏈黴菌brs-24，其特徵在於，其保藏號為：cctcc no.m 20221182。
6.本發明還提供含有所述鏈黴菌brs-24的十字花科作物根腫病防治劑。
7.在本發明一個具體實施方案中，所述的防治劑含有所述鏈黴菌brs-24的發酵液。
8.其中，所述防治劑可為本領域熟知的劑型，如可為固體、液體或膠囊製劑。
9.其中，所述的防治劑還可以含有菌劑載體、增稠劑、分散劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、消泡劑和防凍劑中的任意一種或幾種。
10.其中，所述菌劑載體為蛭石、草炭、沸石、硅藻土、菌糠、玉米粉、豆粕、麩皮、米糠中的任選一種或者幾種；所述分散劑為木質素磺酸鈉、木質素磺酸鈣、萘磺酸鈉甲醛縮合物nno、脂肪醯胺-n-甲基牛磺酸鹽、烷基磺基琥珀酸鈉鹽、二丁基茶磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、多芳基酚聚氧乙烯醚和乙二胺四乙酸鹽中的任選一種或者幾種；所述乳化劑為烷基苯磺酸鹽、烷基醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、苯乙基酚聚氧乙烯醚、山梨酸酯和多元醇脂肪酸酯中任選一種或者幾種；所述增稠劑為黃原膠、明膠、阿拉伯膠、瓜膠、海藻酸鈉、可溶性澱粉、雜多糖、羧甲基纖維素鈉、羧乙基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚丙烯酸胺、尿素、矽酸鎂鋁、二氧化矽、硅藻土、膨潤土和凹凸棒任選一種或者幾種；所述防腐劑為苯甲酸鈉、山梨酸鉀和對羥基苯甲酸乙酯任選-種或者幾種；所述的消泡劑為異辛醇、異戊醇、硬脂
酸、月桂酸、脂醚類和有機矽中任選一種或者幾種；所述防凍劑為乙二醇、丙二醇、丙三醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇和尿素中的任選一種或者幾種。
11.本發明還提供所述的鏈黴菌brs-24或者所述的防治劑在防治十字花科作物根腫病中的應用。
12.在本發明一個具體實施方案中，所述的應用包括如下步驟：十字花科作物播種前用鏈黴菌brs-24菌液浸種10-30分鐘，所述鏈黴菌brs-24菌液的活菌數為1
×
10
5-1
×
108cfu/ml；和/或定植後澆灌鏈黴菌brs-24菌液，5-20ml/棵，濃度為1
×
10
5-1
×
108cfu/ml。
13.本發明還提供所述的鏈黴菌brs-24或者所述的防治劑在防治十字花科作物根腫病中的應用。
14.在本發明一個具體實施方案中，所述的應用包括如下步驟：十字花科作物播種前用鏈黴菌brs-24菌液浸種10-30分鐘，所述鏈黴菌brs-24菌液的活菌數為1
×
10
5-1
×
108cfu/ml；和/或定植後澆灌鏈黴菌brs-24菌液，5-20ml/棵，濃度為1
×
10
5-1
×
108cfu/ml。
15.本發明鏈黴菌brs-24對甘藍和白菜的根腫病防治效果顯著，而對照組的發病嚴重，植株生長受限。實施例的研究表明，本發明的生防菌劑能夠顯著抑制根腫病的發生並能有效地促進植株生長。在接種病原菌的盆栽實驗中，相較於對照，分別下降了53.3％和53.2％。此外，在沒有接種病原菌的盆栽實驗中，brs-24生防菌劑的施用，顯著提高了植株的生物量。最後，鏈黴菌brs-24防控甘藍和白菜根腫病相較於化學的防控方法，更加綠色、高效，具有良好的應用前景。
附圖說明
16.圖1是本發明鏈黴菌brs-24在isp4固體培養基上的菌落形態示意圖。
17.圖2是本發明基於brs-24菌株16s rrna序列構建的進化樹及相關序列。
18.圖3是本發明鏈黴菌brs-24抑制甘藍和白菜根腫病的效果圖。
19.圖4是本發明鏈黴菌brs-24接種後甘藍和白菜根腫病的發病指數和病情指數。
20.圖5是本發明鏈黴菌brs-24促進甘藍和白菜生長的植株形態圖。
21.圖6是本發明鏈黴菌brs-24促進甘藍和白菜生長的相關指標圖。
具體實施方式
22.以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
23.實施例1菌株鑑定
24.(1)菌株的分離
25.採集蕎麥根繫於滅菌的50ml離心管內，在超淨工作檯加入50ml pbs。將離心管置於200rpm搖床30min，4000rpm離心10min。在超淨工作檯去除根等植物殘體，根據離心後的土量加入純水(質量比1：100)。土懸液梯度稀釋後(101，102，103，104，105，106，107)，吸取100微升塗布於isp4培養基上。28℃恆溫培養7天後，挑取培養基上具有鏈黴菌特徵的菌落純化。
26.(2)形態特徵
27.brs-24菌株在isp4固體培養基(可溶性澱粉10.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸鎂1.0g，氯化鈉1.0g，硫酸銨2.0g，硫酸鈣2.0g，硫酸亞鐵0.001g，氯化錳0.001g，硫酸鋅0.001g，瓊
脂20.0g，ph值7.2
±
0.2)上培養3-5d後,菌落質地緻密呈圓形,表面乾燥且褶皺，不易挑起且挑起後不易碎，在isp4培養基上不產孢，不產色素，菌落顏色為淡黃色，如圖1所示。
28.(3)分子鑑定
29.基於brs-24菌株的16s rdna序列選擇在種屬水平上最接近的22株菌，通過mega6.0軟體選擇nj(neighbor-joining)法構建系統進化樹，如圖2所示。共有2個菌株(菌株基因組id：gcf_000331005.1；gcf_003032475.1)的16s rdna與brs-24相似度高於98.65％，因此，需根據其基因組序列計算全基因組平均核苷酸序列一致性(average nucleotide identity，ani)，得到精確的物種鑑定結果。基於gtda資料庫的ani分析結果表明，brs-24與gcf_000331005.1和gcf_003032475.1的ani值分別為91.6848％和83.7049％，均小於95％的閾值，因此判定brs-24為鏈黴菌屬(streptomyces sp.)的新種(見表1-2)。
30.將brs-24(streptomyces sp.)與2022年07月26日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址中國武漢武漢大學,cctcc，保藏編號為：cctcc no.m 20221182。
31.表1基於基因組ani值對brs-24菌株的鑑定結果
[0032][0033]
表2不同菌株與brs-24 16s rdna基因的相似度
[0034]
菌株基因組id相似度(％)rs_gcf_000331005.198.95rs_gcf_003032475.198.817rs_gcf_001280005.198.642rs_gcf_003664315.198.621rs_gcf_004151105.198.62rs_gcf_001746365.198.555rs_gcf_001418565.198.555rs_gcf_002846625.198.493rs_gcf_003112535.198.49rs_gcf_000718095.198.489rs_gcf_900129855.198.424rs_gcf_002803085.198.424rs_gcf_001514235.198.359rs_gcf_001428885.198.357rs_gcf_003627815.198.295rs_gcf_001279695.198.295rs_gcf_004217285.198.292rs_gcf_001550375.198.231rs_gcf_000091305.198.231rs_gcf_000772895.198.23
rs_gcf_001514305.198.228rs_gcf_001514205.198.228
[0035]
實施例2甘藍和白菜根腫病防控實驗
[0036]
鏈黴菌brs-24發酵液及菌懸液的製備：鏈黴菌在tsa固體培養基上活化，在28℃培養3天後，挑取單菌落於yeme液體培養，在28℃和200rpm的轉速下培養3天，後轉接至ms液體培養基，在28℃和200rpm條件下培養3-5天，製成鏈黴菌brs-24發酵液。鏈黴菌brs-24發酵液，4000rpm/s離心後，用蒸餾水重懸重複3次，製成brs-24菌懸液。
[0037]
甘藍和白菜兩種作物各設置二組實驗，每組三個重複，每個重複30棵植株。對照組：蒸餾水浸種處理30分鐘後播種育苗，15天後移栽至已接種根腫菌的10
×
10釐米塑料缽，以後每7天澆灌清水10ml。處理組：鏈黴菌brs-24菌懸液浸種處理30min後播種育苗，15天後移栽至已接種根腫菌的10
×
10釐米塑料缽，以後每7天澆灌菌懸液10ml。35天後統計發病情況。由圖3和4可以看出，甘藍或白菜的對照組受根腫菌影響較大，根系發病明顯，發病指數分別高達81.7％和86.4％，地上部的生長受到極大的制約；而鏈黴菌brs-24菌懸液處理後的植株發病情況明顯改善，根際發達，地上部生長正常。相較於對照，發病指數分別下降53.3％和53.2％。結果表明，brs-24菌懸液處理能夠顯著改善根腫病的發病情況，具有較強的生防效果。
[0038][0039]
實施例3促進甘藍和白菜生長實驗
[0040]
鏈黴菌brs-24發酵液及菌懸液的製備同實施例2。
[0041]
甘藍和白菜兩種作物各設置二組實驗，每組三個重複，每個重複30棵植株。對照組：蒸餾水浸種處理30分鐘後播種育苗，15天後移栽至10
×
10釐米塑料缽，以後每7天澆灌清水10ml。處理組：鏈黴菌brs-24菌懸液浸種處理30min後播種育苗，15天後移栽至10
×
10釐米塑料缽，以後每7天澆灌菌懸液10ml。35天後統計生長量。由圖5和圖6可以看出，鏈黴菌brs-24菌懸液處理後的甘藍和白菜植株生長優勢顯著，相較於對照，鮮重分別提高了13.38％和65.71％。該實驗結果表面，brs-24能夠有效促進植株生長，提高植株的鮮重。
[0042]
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。