一種新城疫hi抗原的製備方法
2024-02-26 23:10:15
專利名稱：一種新城疫hi抗原的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種新城疫HI抗原的製備方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
新城疫(Newcastle disease, ND)，又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，是由副粘病毒屬新城疫病毒引起的一種禽類急性、高度接觸性、致死性家禽傳染病。該病於1926年首先發現於印度尼西亞，同年發現於英國新城，我國於1935年首次報導此病，當時認為是禽流感，1948 年證實是新城疫。該病在世界上曾有三次大流行，到了 20世紀80年年代末，該病發生新的變化，多發生於有母源抗體的雛雞和免疫雞群，而臨床症狀不典型；在免疫雞群中出現以呼吸道為主，有輕微神經症狀；在產蛋雞中呈現產蛋下降、產白色、軟殼蛋等非急性、致死率不高、症狀不明顯的非典型性新城疫。新城疫的不斷傳播，至今世界上大多數國家和地區均有暴發該病的記載或報導。目前，新城疫仍廣泛存在於亞洲、非洲、美洲等許多國家和地區。目前，防治新城疫的主要手段仍是免疫接種，傳統的弱毒活疫苗和滅活苗在疾病中仍發揮巨大作用。由於HI試驗(血凝抑制實驗)具有操作簡便、快捷、敏感度高、和特異性等特點，是當前實際生產過程中評價疫苗質量、雞體免疫水平的高低的最重要手段之一， 同時中國獸藥典2005版規定的新城疫類滅活疫苗效力檢驗的標準方法。在臨床和實驗室新城疫疾病防控過程中起著很重要的作用。但是，目前HI檢測方法是利用活病毒進行檢測，因此存在著一些問題，其中首要問題是缺乏穩定的、安全的HI診斷抗原。具體表現在 1)活病毒抗原隱患大，存在散毒的危險；2)活病毒抗原為了保護病毒本身的活性必須冷凍保存，要求條件高，如果在4°C條件下放置，1星期後抗原就開始出現蛋白沉澱、血凝活性降低，而反覆凍融又會使蛋白變性，抗原血凝活性降低；3)利用活的病毒作為診斷抗原需每次測定抗原的血凝活性，增加了工作量。聚乙二醇(PEG)可用作溶劑、助溶劑、o/w型乳化劑和穩定劑，用於製作水泥懸劑、 乳劑、注射劑等，也用作水溶性軟膏基質和栓劑基質，用於增加低分子量液體PEG的粘度和成固性，以及外償其他藥物；對於水中不易溶解的藥物，PEG可作固體分散劑的載體，以達到固體分散目的，穩定劑PEG4000、PEG6000、PEG8000是良好的包衣材料，親水拋光材料、膜材和囊材、增塑劑、潤滑劑和滴丸基質，用於製備片劑、丸劑、膠囊劑、微囊劑等。該系列產品無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，並與許多有機物組份有良好的相溶性。
發明內容
本發明的目的在於公開一種製備新城疫HI抗原的方法，以克服現有新城疫HI診斷抗原中缺乏安全、穩定、易儲存的抗原的問題。本發明提供的新城疫HI抗原的製備方法，包括以下步驟1)新城疫病毒液接種雞胚，收穫雞胚尿囊液，檢測HA效價，HA效價> Slog2合格；2)向收穫的HA效價合格的尿囊液中加入β -丙內酯滅活；3)將滅活後的尿囊液離心濃縮為原體積的1/10 1/20 ；
4)濃縮後的尿囊液中加入穩定劑；5)將尿囊液用PBS緩衝液稀釋溶解，PBS的體積為濃縮前尿囊液體積的1/10 1/5 ；6)將稀釋後的尿囊液超聲裂解；7)在超聲後的尿囊液中加入甘油即為新城疫HI抗原，振蕩混合均勻後使用或放 4°C下保存備用。其中步驟1)所述的新城疫病毒液，每0. Iml病毒含量為IO6EID5tl，每隻雞胚接種 0. lmL。其中步驟2)是按照尿囊液體積的0. 25%。 0. 5%。加入滅活劑β -丙內酯，在4°C 條件下滅活24 48h。其中步驟3)的離心為15000r/min，高速離心1小時。本發明穩定劑配方為PEG3 4g，KCl 0. 01 0. 05g，NaCl 1 1. 5g， Na2HPO4O. 1 0. 5g，KH2PO4O. 01 0. 05g，加入 IOOml 的尿囊液中。上述PEG 可以為 PEG4000、PEG6000 和 / 或 PEG8000。本發明尿囊液濃縮和穩定劑的溶解都在4°C環境下進行。其中步驟6)超聲裂解是使用40kHz、30 50W超聲波處理尿囊液20 40s。其中，步驟7)加入終體積20%-30%甘油，在4°C條件下儲存備用。本發明新城疫病毒是La Sota株，購自中國獸醫藥品監察所。本發明的方法是在無菌條件下，採用雞胚尿囊腔接種法，將稀釋好的病毒液接種 9 11日齡發育良好的SPF雞胚，用4%碘酒消毒氣室部位，用75%酒精脫碘，0. ImL/枚， 放置37°C繼續孵育，24h照蛋1次，棄去Mh內死亡雞胚，以後每隔Mi照蛋1次，及時取出死胚2 8 °C冷卻，孵育後，全部取出2 8 °C冷卻過夜，無菌收穫雞胚尿囊液。經檢驗合格後，將尿囊液滅活、按照一定比例加入穩定劑、濃縮、稀釋、超聲後加入甘油保護劑即為新城疫HI抗原，振蕩混勻後即可使用或是4°C保存。按照本發明提供的方法製備的抗原為滅活抗原，方便抗原的儲存、運輸和使用，同時本抗原為滅活抗原，在使用和儲備時不存在散毒的危險，減少了因為使用抗原而對人體造成的危害；此種抗原的HA血凝活性穩定，抗原在4°C環境下可以保存2年，血凝價不變， 每次使用前不需重複測定血凝價，減少了工作人員的工作量。
圖1是HI抗原的製備流程簡圖。圖2是HI抗原M個月內的血凝價變化情況圖，其中實驗1描述的是實施例1獲得的HI抗原的HA效價變化情況，實驗2描述的是實施例2獲得的HI 抗原的HA效價變化情況。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例1使用北京欣經科生物技術有限公司的PEG4000為穩定劑主要成分。HI穩定抗原的製備步驟如下(1) SPF雞胚(由北京梅裡亞維通實驗技術有限公司提供)接毒在無菌環境下，將新城疫La Sota株病毒稀釋至含IO6EIDStlA). 1ml，接種9 11日齡發育良好的SPF雞胚，0. Iml/枚，接種後封蠟。(2)培養和照胚接毒後的SPF雞胚置37°C繼續孵育，24h照蛋1次，棄去死亡雞胚，此後每Mi照蛋 1次，及時取出死亡雞胚放入4°C，至全部取出放入4°C過夜。(3)收穫及HA檢測在無菌環境下收穫雞胚尿囊液，並同時做無菌檢驗。檢測HA價> 81og2為合格。 採用其他處理過程的病毒液只要HA價符合上述要求也可實用於本發明所述的製備工藝。(4)滅活按照尿囊液體積的0.25%。加入β-丙內酯(購自Sigma公司)，在4°C磁力攪拌器滅活M小時。37°C水解2h。(5)濃縮採用BACKMAN公司出品的高速離心機，(15000r/min, lh)將尿囊液在4°C環境下進行濃縮，使其體積濃縮為原體積的1/10。(6)加入穩定劑按照IOOml 的尿囊液中加入PEG40003g，KCl 0. Olg, NaCl lg, Na2HPO4O. Ig, KH2PO4O. Olg。(7)稀釋將尿囊液用PBS緩衝液稀釋，PBS的體積為濃縮前尿囊液體積的1/10。(8)超聲將稀釋好的尿囊液超聲裂解，超聲條件是40kHz，30W超聲20s，由於是在濃縮後進行超聲，使病毒濃度增大，超聲後也使得病毒粒子更加均勻。在檢測時可達到最佳效果。(9)加入保護劑保存超聲好的尿囊液中加入終體積30%的甘油，振蕩混合均勻後即為新城疫HI抗原， 可使用或放入4°C環境保存。實施例2使用北京欣經科生物技術有限公司的PEG8000為穩定劑主要成分，HI穩定抗原的製備工藝步驟如下(I)SPF雞胚接毒在無菌環境下，將新城疫La Sota株病毒稀釋至含106EID5(1/0. 1ml，接種9-11日齡發育良好的SPF雞胚，0. Iml/枚，封蠟。(2)培養和照胚接毒後的SPF雞胚置37°C繼續孵育，24h照蛋1次，棄去死亡雞胚，此後每Mi照蛋 1次，及時取出死亡雞胚放入8°C，至全部取出放入8°C過夜。(3)收穫及HA檢測
在無菌環境下收穫雞胚尿囊液，並同時做無菌檢驗。檢測HA價> Slog2為合格。 採用其他處理過程的病毒液只要HA價符合上述要求也可實用於本發明所述的製備工藝。(4)滅活 按照尿囊液體積的0. 5%。加入β -丙內酯，在4°C磁力攪拌器滅活48小時，37°C水解2h。(5)濃縮採用BACKMAN公司出品的高速離心機(15000r/min，lh)，將滅活後的尿囊液在4°C 環境下進行濃縮，使其體積濃縮為原體積的1/20。(6)加入穩定劑按照IOOml 的尿囊液中加入PEG80004g，KCl 0. 05g，NaCl 1. 5g，Na2HPO4O. 5g， KH2PO4O. 05g。(7)稀釋將尿囊液用PBS緩衝液稀釋，PBS的體積為濃縮前尿囊液體積的1/5。(8)超聲將稀釋好的尿囊液超聲裂解，超聲條件是40kHz，50W，20s，由於是在濃縮後進行超聲，使病毒濃度增大，超聲後也使得病毒粒子分布更加均勻。在檢測時可達到最佳效果。(9)加入保護劑保存向超聲好的尿囊液中加入終體積20%的甘油，振蕩混合均勻後即為新城疫HI抗原，可使用或放入4°C環境保存。實施例3滅活檢驗將實施例1和實施例2中滅活的尿囊液按1 10000倍稀釋後，經尿囊腔接種11日齡SPF雞胚，每胚0. lmL，接種後置37°C繼續孵化5天，觀察雞胚發育情況並檢測雞胚尿囊液有無血凝活性。並將收穫的雞胚尿囊液在SPF雞胚上盲傳3代，檢測雞胚尿囊液均無血凝活性。說明本發明製備的抗原滅活完全，安全性好、無毒害。實施例4特異性實驗將實施例1和實施例2濃縮後的新城疫La Sota株尿囊液(即抗原) 分別與新城疫(ND)血清、雞傳染性支氣管炎(IB)血清、肉雞減蛋綜合證(EDS)血清、禽流感病毒H5W亞型血清、禽流感病毒H9N2血清、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILT)血清、傳染性法氏囊病毒(IBD)血清等做HI交叉抑制實驗。實驗結果見表1。結果表明本發明製備新城疫La Sota株抗原不與除新城疫以外的其他病毒陽性血清反應，說明本發明製備的新城疫 HI抗原特異性好。表1本發明製備的抗原與幾種病毒血清HI試驗結果
權利要求
1.一種新城疫HI抗原的製備方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟1)新城疫病毒液接種雞胚，收穫雞胚尿囊液，檢測HA效價，HA效價>Slog2合格；2)向收穫的HA效價合格的尿囊液中加入β-丙內酯滅活；3)將滅活後的尿囊液離心濃縮為原體積的1/10 1/20；4)向濃縮後的尿囊液中加入穩定劑；5)將尿囊液用PBS緩衝液稀釋溶解，PBS的體積為濃縮前尿囊液體積的1/10 1/5；6)將稀釋後的尿囊液超聲裂解；7)在超聲後的尿囊液中加入甘油即為新城疫HI抗原，振蕩混合均勻後使用或放4°C下保存備用。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)所述的新城疫病毒液，每隻雞胚接種 0. lmL，病毒含量為106EID5Q。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的步驟2)是按照尿囊液體積的 0. 25%。 0. 5%。加入滅活劑β -丙內酯，在4°C條件下滅活24 48h。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟3)的離心條件為15000r/min，離心1小時。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的穩定劑其配方為PEG3 4g，KCl 0. 01 0. 05g, NaCl 1 1. 5g, Na2HPO4O. 1 0. 5g, KH2PO4O. 01 0. 05g，加入 IOOml 的尿囊液中。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的PEG為PEG4000、PEG6000和/或 PEG8000。
7.如權利要求1 6之一所述的方法，其特徵在於，尿囊液濃縮和穩定劑的溶解都在 4°C環境下進行。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中步驟6)超聲裂解是使用40kHz、30 50W超聲波處理尿囊液20 40s。
9.如權利要求1所述的方法，所述新城疫病毒是LaSota株。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟7)加入終體積20%-30%甘油， 在4°C條件下儲存備用。
全文摘要
本發明提供了一種新城疫HI穩定抗原的製備方法，包括以下技術步驟(1)新城疫病毒接種雞胚後收穫雞胚尿囊液，按尿囊液體積的0.25‰～0.5‰加入滅活劑β-丙內酯；(2)將滅活的尿囊液濃縮為原體積的1/10～1/20，加入穩定劑；(3)再用體積為濃縮前尿囊液體積的1/5～1/10的PBS緩衝液稀釋抗原；(4)超聲裂解，加入終體積20％～30％甘油，振蕩混合均勻後即為可使用的抗原。本方法製備的抗原在使用和儲備時不存在散毒的危險，減少了因為使用活病毒抗原而對環境和人體的危害，該產品具有很好的穩定性，在2～8℃條件下，保存24個月以上該產品血凝價不變，可用於雞新城疫的HI檢測。
文檔編號C12N7/00GK102352345SQ20111024038
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月19日 優先權日2011年8月19日
發明者孫豐廷, 張發明, 張洪, 張紅, 李靜, 楊國良, 王世敏, 王文泉, 鄭傑, 陳玲 申請人:北京市獸醫生物藥品廠