一種蛇足石杉孢子體試管扦插的方法

2024-02-27 14:28:15

專利名稱：一種蛇足石杉孢子體試管扦插的方法
技術領域：
本發明屬於無性繁殖技術領域，具體涉及ー種蛇足石杉孢子體試管扦插的方法
背景技術：
蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb. ) Trev ,又名千層塔，山芝和蛇足草等，為石杉科Huperoaceae石杉屬Huperzia Bernh.多年生草本蕨類植物，在中國民間主要將全草用於治療跌打損傷、淤血腫痛和精神分裂等疾病。自1972年我國科技工作者首次報導從該植物中分離的石杉鹼甲具有橫紋肌鬆弛作用後，對其進行了大量的研究，發現石杉鹼甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的こ醯膽鹼酯酶抑制劑，對治療老年痴呆症(AD)、重症肌無カ和單純記憶障礙等有顯著療效。近年來隨著人口老齡化的加劇，市場對石杉鹼甲的需求量不斷攀升，石杉鹼甲的來源還是以其原藥材蛇足石杉為主。但是，蛇足石杉中石杉鹼甲的含量很低，僅為0.007%左右，而且現存的該類植物大多生長緩慢，野生狀態下蛇足石杉的繁殖主要以孢子繁殖為主，孢子萌發周期長，萌發後屬地下生配子體，需6 15年才能成熟。另外，研究表明蛇足石杉的生長對環境溼度的要求很高，溼度在81%-90%才能適合其正常生長繁殖。這些都極大地限制了蛇足石杉野生資源的再生。現由於蛇足石杉在主產國一中國的蘊藏量甚少，很本不夠社會的需求。吳葒等對中國蛇足石杉野生蘊藏量進行了調查，初步確定我國蛇足石杉天然生物量為4656. 6t。並以此為基礎，在進一步考慮人的採集能力的前提下，判定我國蛇足石杉的理論可採量為1604t。我國蛇足石杉商業可採量大約不會超過200t。由於蛇足石杉資源分散，而且許多相對集中的產地均位於自然保護區和風景區範圍內，不可能大規模開採，解決資源短缺的問題還有賴於尋求其他更加科學合理的途徑。不然，這種寶貴的自然資源將處於滅絕的邊緣。到目前為止，蛇足石杉的扦插實驗只能在人工氣候室或溼度較大的地區進行，而在中國西部地區進行相關的扦插或移栽實驗均以失敗告終。

發明內容
針對蛇足石杉野生資源短缺，並對生長環境中溼度要求在81% 90%之間，本發明目的在於，提供ー種蛇足石杉孢子體試管扦插的方法，以保存蛇足石杉的種質資源，並能為實驗室相關方面的研究提供鮮活的實驗材料。為了實現上述任務，本發明採取如下的技術解決方案ー種蛇足石杉孢子體試管扦插的方法，其特徵在於，具體按以下步驟操作(I)培養基質的準備將乾燥水苔置於含3-吲哚丁酸0. 5mg/rimg/L的1/2MS培養液中充分吸水後，裝入廣ロ培養瓶中達1/3體積處，用封瓶膜將瓶ロ封住，於121°C下滅菌25min，晾涼備用；(2)材料的表面滅菌從野外採集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]新鮮材料,經自來水衝洗乾淨，剪取頂芽6-8cm在超淨工作檯中先浸在質量分數為75%的こ醇溶液中30_60s 』然後置於濃度為0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5-8min，再用無菌水衝洗3_5次，作為扦插的材料；(3)孢子體的扦插培養將滅菌後的頂芽扦插在滅過菌的培養瓶中培養，培養溫度為22±2°C、光照時間12-16/d條件下進行培養10-12周，頂芽的下端生根，上端長出新的頂芽或發生分支；(4)孢子體的繼代擴繁剪取步驟(3)中獲得植株的頂芽，然後扦插於另一新的培養瓶中繼續培養，而剩下的形態學下端接種於含細胞分裂素培養液的培養瓶中培養，培養條件與步驟(3)中的溫度、光照時間相同；培養10周後，原來剪去頂芽的下端可長出新的頂芽，而扦插的頂芽則能產生新的根井能伸長或發生分支。 所述的蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]新鮮材料為石杉科(Huperziaceae)石杉屬(Huperzia Bernh.)植物蛇足石杉(Huperzia serrata (Thunb.)Trevis)的頂芽。所述的步驟(3)中水苔浸泡培養液為常規的1/2MS培養液中加入0. lmg/L^lmg/L的3-吲哚丁酸(IBA)。所述的含細胞分裂素培養液為常規的1/2MS培養液中加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) lmg/L 10mg/L。採用本發明進行蛇足石杉試管扦插的方法，帶來的技術效果體現在以下幾方面I、將蛇足石杉扦插於培養瓶中並用封瓶膜封閉瓶ロ，這樣既保證了蛇足石杉生長時對溼度的要求，又保證瓶子內外能進行一定的氣體交換，因此蛇足石杉能正常地在瓶中生長，這對於蛇足石杉種質資源的保存有一定的意義；2、蛇足石杉培養的基質中添加有多種植物激素，激素可促進其生根生芽，這能加快蛇足石杉的擴繁，能為實驗室進行相關方面的研究提供鮮活的實驗材料。
具體實施例方式考慮到人工氣候室培養蛇足石杉成本極高，申請人經過對多種培養基質的篩選，最終確定水苔作為理想的扦插基質，用培養瓶來提供適宜的溼度條件，配合植物激素的調節作用，首次成功對蛇足石杉孢子體進行了試管扦插。以下所述的1/2MS培養液也稱為1/2MS培養基。MS培養基是常用的基本培養基，是Murashige和Skoog於1962年為菸草細胞培養設計的，其特點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養分的數量和比例合適，能滿足植物細胞的營養和生理需要，因而適用範圍比較廣，多數植物組織培養快速繁殖用它作為培養基的基本培養基。而1/2MS是將MS的大量元素減半其他不變而配置的培養基，這主要是降低無機鹽濃度。目前已經有商品化的產品面市，例如上海麗臣生物科技有限公司生產的1/2MS培養基(產品編號11944，規格250g/瓶)，主要用於植物組織培養。以下是發明人給出的實施例，需要說明的是，本發明不限於這些實施例。實施例
I:
(I)培養基質的準備將乾燥水苔置於含3-吲哚丁酸(IBA) 0. 5mg/L的1/2MS培養液中充分浸泡，再裝入廣ロ培養瓶中達1/3體積處，用封瓶膜將瓶ロ封住，於121°C下滅菌25min，晾涼備用；(2)材料的表面滅菌從野外採集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]新鮮材料,經自來水衝洗乾淨，剪取頂芽6cm在超淨工作檯中先浸在質量分數為75%的こ醇溶液中30s ;然後置於濃度為0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡8min，再用無菌水衝洗3次，作為扦插的材料；
(3)孢子體的扦插培養將所述頂芽扦插於滅過菌的培養瓶中，培養溫度為22±2°C、光照時間16h/d條件下進行培養12周，頂芽的下端生根率為93%，上端長出新的頂芽(葉片)或發生分支；(4)孢子體的繼代擴繁剪取步驟(3)中獲得植株的頂芽，然後扦插於另一新的培養瓶中繼續培養，而剩下的形態學下端接種於含細胞分裂素培養液的培養瓶中培養，該含細胞分裂素培養液為常規的1/2MS培養液中加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)5mg/L。培養溫度和光照條件與步驟(3)相同。培養10周後，原來剪去頂芽的下端可以長出新的頂芽，而扦插的頂芽則能產生新的根井能生長或發生分支。實施例2 (I)培養基質的準備將乾燥水苔置於含0. 5mg/L 3_吲哚丁酸的1/2MS培養液中充分浸泡，再裝入廣ロ培養瓶中達1/3體積處，用封瓶膜將瓶ロ封住，於121°C下滅菌25min，晾涼備用；(2)材料的表面滅菌從野外採集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]新鮮材料,經自來水衝洗乾淨，剪取頂芽8cm在超淨工作檯中先浸在質量分數為75%的こ醇溶液中60s ;然後置於濃度0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5min，再用無菌水衝洗3次，作為扦插的材料；(3)孢子體的扦插培養將所述頂芽扦插於培養瓶中，培養溫度為22±2°C、光照時間12h/d條件下進行培養12周，頂芽的下端生根率為87%，上端長出新的葉片或發生分支；(4)孢子體的繼代擴繁剪取步驟(3)中獲得植株的頂芽，然後扦插於另一新的培養瓶中繼續培養，而剩下的形態學下端接種於含10mg/L 6-節氨基嘌呤的培養瓶中培養,培養溫度和光照條件與步驟(3)相同。培養10周後，原來剪去頂芽的下端可以長出新的頂芽，而扦插的頂芽則能產生新的根井能伸長或發生分支。
權利要求
1.ー種蛇足石杉孢子體試管扦插的方法，其特徵在於，按以下步驟操作 (1)培養基質的準備 將乾燥水苔置於含3-吲哚丁酸0. 5mg/L^lmg/L的1/2MS培養液中充分吸水後，裝入廣ロ培養瓶中達1/3體積處，用封瓶膜將瓶ロ封住，於121°C下滅菌25min，晾涼備用； (2)材料的表面滅菌 從野外採集蛇足石杉新鮮材料，經自來水衝洗乾淨，剪取頂芽6cm 8cm,超淨工作檯中先浸在質量分數為75%的こ醇溶液中30s 60s ;然後置於濃度為0. 1%的升汞(HgCl2)溶液中浸泡5min 8min,再用無菌水衝洗3次,作為扦插的材料； (3)孢子體的扦插培養 將滅菌後的頂芽扦插在滅過菌的培養瓶中，培養溫度為22±2°C、光照時間12/d 16/d條件下進行培養10周 12周，頂芽的下端生根，上端長出新的頂芽或發生分支； (4)孢子體的繼代擴繁 剪取步驟(3)中獲得植株的頂芽，然後扦插於另一新的培養瓶中繼續培養，而剩下的形態學下端接種於含細胞分裂素培養液的培養瓶中培養，培養條件與步驟(3)中的溫度、光照時間相同，培養10周後，原來剪去頂芽的下端長出新的頂芽，而扦插的頂芽則能產生新的根井能生長或發生分支。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的蛇足石杉新鮮材料為石杉科(Huperziaceae)石杉屬(Huperzia Bernh.)植物蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trevis)的頂芽。
3.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述的含細胞分裂素培養液為常規的1/2MS培養液中加入6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) lmg/L 10mg/L。
全文摘要
本發明公開了一種蛇足石杉孢子體試管扦插的方法，該方法以新鮮蛇足石杉孢子體頂芽為材料，用試管扦插的方式進行材料的繁殖和保存。方法簡單易行，效率高，對於蛇足石杉的種質資源保存有著重要的意義，並能為各地實驗室進行相關方面的研究提供鮮活的實驗材料。
文檔編號A01H4/00GK102640706SQ20121014386
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者包日雙, 尉亞輝, 郭斌 申請人:西北大學