用於確定CYP2D6基因的基因型的htSNP及其用於多重基因分型的方法

2024-02-26 22:21:15

專利名稱：用於確定CYP2D6基因的基因型的htSNP及其用於多重基因分型的方法
技術領域：
本發明的設備和方法涉及用於確定細胞色素P450認2、2々6和206、？)0 和皿 -葡萄糖醛酸基轉移酶IA基因的基因型的單倍型標籤單核苷酸多態性(htSNP)和基因晶片，更具體而言，涉及用於確定人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR1I2( = PXR)和UGTlA基因的單倍型的htSNP的選擇方法、確定所述基因的基因型的方法和用於所述方法的基因晶片。
背景技術：
出於遺傳多樣性的原因，個體對藥物的毒性和效果會有不同反應。因此，在藥物的初始開發階段考慮重要藥用蛋白相對於遺傳多樣性的效果是必要的，因為這可以降低藥物開發的可能性失敗。單倍型是決定個體之間的遺傳多樣性的因素之一。單倍型指的是在單個研究種群中每個基因序列的多態性的組合。單倍型比個體多態性提供了更準確和更可靠的關於遺傳多樣性的信息。人類細胞色素P450是血紅蛋白的一部分，血紅蛋白協助氧化外來化學物質如藥物、致癌物質和毒素以及內部物質如膽固醇、脂肪酸和維生素(Nelson等， Pharmacogenetics 6 :1-42,1996) 在肝、腎、小腸和肺中發現了細胞色素P450的各種亞科。人類細胞色素P450 1A2 (下文稱CYP1A2)基因以及CYPlAl和CYPlBl都是CYPl 基因群中包含的藥物代謝酶。CYP1A2主要在肝臟中產生，並佔細胞色素酶總量的15%。 CYP1A2參與重要醫用藥物如咖啡因、氯氮平(clozapine)、丙咪嗪(imiparamine)和普萘洛爾(propranolol)的代謝。另外，CYP1A2催化內部合成物質(如17 β-雌二醇、尿卟啉原III)，以及致癌物質的生物活化(如多環芳烴的環氧化和芳香胺/雜環胺的N-羥基化)(Brosen K. , Clinical Pharmacokinetic, 1995, 29 (suppll) :20-25 ； Josephy PD., Environ. Mol. Mutagen, 2001, 38 :12-18)。人類細胞色素 P4502A6(下文稱 CYP2A6)基因位於19號染色體上，而具有非常相似的基因序列的偽基因CYP2A7處於CYP2A6基因之上。 CYP2A6酶是一種將尼古丁轉化為可替寧(cotinine)的主要酶，且CYP2A6酶參與大約80% 的尼古丁代謝。CYP2A6酶將抗癌藥物替加氟(tegafur)轉化為體內活性藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)。所述酶主要由肝臟產生，並且在諸如肺、大腸、乳腺、腎和子宮等器官中少量表達(Drus Metab Dispos. ,29(2) :91-5,2001 ；Adv Drug Deliv Rev. , 18 ；54(10) 1245—56， 2002)。人類細胞色素P4502D6(下文稱CYP2D6)基因位於22號染色體上，而偽基因CYP2D7和CYP2D8處於CYP2D6基因的一端。已知由所述基因編碼的酶負責100種以上的重要臨床藥物(包括精神活性藥物、心血管藥物、嗎啡藥物等)的代謝。由所述CYP2D6基因編碼的酶主要由肝臟產生。儘管所述酶佔細胞色素P450酶總量的大約2%，它們卻是參與30%的藥物代謝的主要酶類。所述酶在個體中的活性各異，並根據其活性級別被劃分為PM(弱代謝劑)、IM(中等代謝劑)、EM(強代謝劑)和UM(超快代謝劑)。所述基因的遺傳多態性部分地造成了所述酶的不同活性。眾所周知，CYP1A2基因展現了遺傳多態性。到目前為止，在所述CYP1A2基因的啟動子、外顯子和內含子中發現了 M種以上的變異體。到2007年6月為止，已有36種單倍型(遺傳變異體的組合)(http//www. cypalleles. ki. se/cypla2. htm)、50 種 CYP2A6 的基因型(http://www. cypalleles. ki. se. cyp2a6. htm)以及大約 80 種 CYP2D6 基因的遺傳多態性(www. immi. ki. se. cypalleles/cyp2d6. htm)，它們在物種之間有極大的差異。由於各種類型的基因變異體和單倍型已經被報導過，因此有必要通過最小的單核苷酸多態性 (SNP)確定準確的單倍型從而增強時間和成本有效性。在各種藥物被人體吸收並排出以前，代謝和轉運將一直進行。細胞色素P450 (CYP) 和藥物轉運蛋白參與代謝和轉運。對參與藥物代謝的CYP酶的研究一直在積極地進行。目前，15 種 CYP 酶，尤其是 CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4、CYP2B6、MDRl 和 CYP2C19，已被報導具有遺傳多態性。所述遺傳多態性是影響所述酶的藥物底物的臨床效果、治療效果和副作用的主要因素。一些遺傳變異體造成酶的沉積而根本不能代謝藥物。其它遺傳變異體使酶活性部分地降低。例如，諸如CYP2D6和CYP2C9等酶根據所述遺傳變異體的不同而在表型上不同，且基因型和表型之間具有相對較高的相似性。同時，很難根據功能性遺傳變異體的存在與否來預測CYP3A4、CYP2B6和MDRl基因的表型。就人類而言，代謝50%的所有服用藥物的CYP3A4在個體之間顯示出極大的活性差異。已知CYP2B6在個體之間表現出最大270倍的差異。儘管個體差異如此之大，個體之間的活性差異仍很難直接從基因型來預測，因為基因型和表型之間具有低相關性的藥物代謝酶或藥物轉運蛋白的蛋白表達根據外部因素的不同而出現極大的不同。對於這些基因而言，蛋白的表達調節，而非遺傳變異體的存在與否，可能是更重要的導致代謝活性的個體差異的因素。當所述酶的表達被誘導後，這些酶自己大量生成來提高活性。表達誘導的機理通過將包含藥物受體的外部材料與目標基因的啟動子相結合來實現。所述藥物受體的典型實例是已知在NRl 12基因中表達的孕烷X受體(PXR)。據報導，P)(R的表達量根據個體的不同而不同。有趣的是，所述受體的表達量與藥物代謝酶如CYP3A4和CYP2B6的表達量具有高度相關性(Current Drug Metabolism, 2005, 6 :369-383) 0於是，個體之間的所述藥物代謝酶的表達量差異取決於所述P)(R基因的表達量差異或活性差異，而不是取決於變異體蛋白。在這點上，對個體P)(R基因的遺傳多態性或所述P)(R基因的表達差異的研究近來引起了關注。有報導稱，儘管胺基酸序列並未改變，一些遺傳變異體仍導致個體對藥物反應的差異，如因紅黴素呼吸測試或體內利福平(rifampin)引起的CYP3A4活性提升。這些PXR 變異體由於所述目標基因的表達變化而導致活性變化。因此，所述P)(R變異體可能導致藥物或者生物分子在體內的活性差異，並極大地影響藥物(P)CR基因的耦合劑)引起的藥物相互作用的個體差異。
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UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶(UGT)是催化葡萄糖醛酸與體內內源性物質和外源性物質相結合的酶。所述UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶產生諸如苯酚、乙醇、胺和脂肪酸化合物等具有毒性的物質的葡萄糖醛酸耦合劑，並把這些物質轉化為親水材料以從人體經膽汁或尿排出(Parkinson A, Toxicol Pathol. ,24 :48-57,1996) 據報導，所述UGT主要存在於間質細胞的內質網或核膜內，且在其它組織諸如腎和皮膚中也有表達。所述UGT酶可以根據一級胺基酸序列的相似性大致劃分為UGTl和 UGT2亞科。人類UGTlA族有9種異構體(UGT1A1和UGT1A3 UGT1A10)。其中，五種異構體 (UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6和UGT1A9)由肝臟表達。所述UGTlA基因家族的遺傳多態性因人而異。已知相對於UGT1A1、UGT1A3 UGT1A10基因存在數種遺傳多態性(http:// galien. pha. ulaval. ca/alleles/alleles. html)。所述 UGTlA 基因的多態性在種族之間有極大的差異。已證實酶的活性因多態性的不同而不同，而多態性是決定對於藥物治療的敏感性的重要因素。UGTlAlt和UGT1A158與吉爾伯特症候群有關(Monaghan G. Lancet, 347 578-581，1996)。另外，已報導了與各種疾病相關的各種功能性變異體。由於已報導了各種類型的遺傳變異體和單倍型，所以搜索方法應當是有效的。所述單倍型可以由ArlequiruSNPalyze或其它類似軟體進行分析。分析所有單核苷酸多態性 (SNP)來搜索每種單倍型的遺傳變異體會在成本和時間上不夠有效。為了提高效率，可以提供單倍型標籤SNP(htSNP)選擇方法。所述htSNP選擇方法是一種選擇最小標籤組來準確標記每種單倍型的方法。如果確定了所選SNP，則可以預測所有單倍型。對於許多基因而言，遺傳多態性的分布因種族的不同而不同。因此，有必要檢查先天遺傳變異體和單倍型是否頻繁出現在高麗人中，而如果是的話，它們有多頻繁，以及如何根據單倍型選擇htSNP。然而，對高麗人的基因中的遺傳變異體、與之對應的單倍型和根據每種單倍型的htSNP選擇的研究並不多。近來，已報導了一種通過對主要發現於白種人中的CYP2D6遺傳變異體進行 SNaPshot 分析來確定 11 種 SNP 的方法(Sistonen J 等，Clin Chem. 2005Jul ；51 (7) 1291-1295), ^P Roche或Jurilab公司的CYP2D6診斷晶片。然而，它們集中在發現於白種人中的CYP2D6遺傳變異體上。對診斷包括高麗人在內的亞洲人的CYP2D6遺傳變異體的研究還不足。因此，本發明人研究開發了一種短時間內準確確定主要發現於高麗人中的人類 CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR1I2( = PXR)和UGTlA基因的變異體的方法。本發明提供了對主要發現於高麗人中的人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、NR1I2( = PXR)和UGTlA遺傳變異體的htSNP選擇方法，以便證明所選htSNP的可用性。

發明內容
因此，本發明的一個方面提供了用於確定發現於高麗人中的CYP1A2、CYP2A6、 CYP2D6、NRl 12 ( = PXR)和UGTlA基因的單倍型的htSNP選擇方法。 另外，本發明的另一方面提供了使用所述htSNP確定人類CYP1A2、CYP2A6、 CYP2D6、NR1I2( = PXR)和UGTlA基因的基因型的方法。 另外，本發明的另一方面還提供了使用包含基因晶片的試劑盒來確定人類CYP2D6基因的基因型的方法。總發明構思的其它方面和優點將在下面的說明中部分闡明，並將部分地根據所述說明而顯而易見，或可通過實踐所述總發明構思而得到理解。本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供選自人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、 P)(R和UGTlA基因中的基因的htSNP的選擇方法而實現，所述方法包括從人類收集生物樣本；從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；用引物進行PCR(聚合酶鏈式反應)，該反應使用操作中所提取的核酸作為模板來擴增選自人類CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、P)(R和UGTlA基因中的基因或其片段；由操作(c)中所得PCR產物的基因序列確定變異體的存在；由在操作(d)中已確定具有變異體的PCR產物的基因序列確定單倍型；和用SNPtagger軟體對操作(d)中分析的所述單倍型進行測序並選擇SNP。本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供確定人類CYP2A2基因的基因型的方法而實現，所述方法包括(a)從對象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取基因組DNA; (c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的基因組DNA作為模板來擴增人類CYP1A2基因或其片段；和(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定CYP1A2基因的至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體選自-3860G > A、_3598G
>Τ、-3594Τ > G、-3113G > A、-2847T > C、-2808A > C、-2603insA、-2467delT、-1708T
>C、-739T > G、-163C > A、1514G > A、2159G > A、2321G > C、3613T > C、5347C > T 和 5521A > G0本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供檢測CYP1A2啟動子基因中的變異體的方法實現，所述方法包括(a)從對象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取基因組DNA ； (c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所得基因組DNA作為模板來擴增人類CYP1A2基因的啟動子區域；(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定CYP1A2遺傳變異體的存在，所述CYP1A2遺傳變異體包括-3860G>A、-3598G>T、-3594T
>G、-3113G > A、-2847T > C、-2808A > C、_2603insA、_2467delT、-1708T > C、-739T > G 和-163C > A0本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供確定人類CYP2A6基因的基因型的方法實現，所述方法包括(a)從對象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所得核酸作為模板來擴增人類 CYP2A6基因或其片段；和(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定CYP2A6遺傳變異體的存在，所述CYP2A6遺傳變異體選自-48T > G、13G > A、567C > T、2134A > G、 3391T > C、6458A > T、6558T > C、6582G > T、6600G > T 和 6091C > Τ。本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供確定人類CYP2D6基因的基因型的方法實現，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所得的核酸作為模板來擴增人類 CYP2D6基因或其片段；和(d)確定CYP2D6基因中至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體包括選自> TUOOC > !「和1039C > T中的一種；選自-1(^8T > C、-377Α
>G、3877G > A、4388C > T 和 4401C > T 中的一種；選自-740C > T、-678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G > C、233A > C、245A > G 和 2850C > T 中的一種； 1611T > A ；1758G > A ；1887insTA ；2573insC ；2988G > A ；4125_4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；和2D6重複。 本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供確定P)(R基因的基因型的方法實現，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸； (c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所得核酸作為模板來擴增人類P)(R基因或其片段；和(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中研究P)(R基因的遺傳變異體的存在，所述遺傳變異體選自-25385C > T、-24113G > A.7635A > G、8055C > TU1156A > C 和 11193T > C。本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供確定UGTlA基因的功能性變異體的方法實現，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來單獨地擴增人類UGTlA基因；和(d) 對操作(c)中擴增的所述基因測序並確定所述UGTlA基因中功能性變異體的存在，所述功能性變異體選自:UGT1A1 基因中的-39 (TA) 6 > (TA)7、211G > A，233C > T 禾口 686C > A ； UGT1A3 基因中的 31T > CU33C > T 禾日 140T > C ；UGT1A4 基因中的 31C > TU42T > 6和 292C > T ；UGT1A6 基因中的 19T > G、541A > G 和 552A > C ；UGT1A7 基因中的 387T > G、 391C > A、392G C 和 701T > C ；和 UGT1A9 基因中的-118T9 > T10、726T > G 和 766G > A0本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供確定UGTlA基因的與對依立替康 (irinotecan)的敏感性相關的多態性的方法而實現，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來擴增人類UGTlA基因；和(d)對操作(c)中擴增的所述人類UGTlA基因測序並確定所述UGTlA基因中變異體的存在，所述變異體選自=UGTlAl基因中的211G > A、233C > 丁和 686C > A ；UGT1A6 基因中的 19T > G、541A > 6和 552A > C ；和 UGT1A9 基因中的-118T9 > T10、726T > 6和 766G > Α。本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供用基因晶片確定人類CYP2D6基因的基因型的方法實現，所述方法包括(a)提取待研究的基因並進行多重PCR以獲得包含待鑑定的SNP的邊界(circumference)的PCR產物；(b)用識別等位基因的特異性鹼基的 ASPE (等位基因特異性引物延伸)引物進行ASPE反應；(c)將所述反應產物與基因晶片混合；和(d)分析所述基因晶片。本發明的上述和/或其它方面和優點通過提供用於確定CYP2D6基因的基因型的 SNaPshot基因分型試劑盒和用於確定SNP的具有Zip編碼(Zip Code)寡核苷酸晶片的基因晶片來實現。本發明中所述生物樣本包括對象的血液、皮膚細胞、粘液細胞和毛髮，且優選的是血液。本發明中所述核酸可以包括DNA或RNA，優選的是DNA，更優選的是基因組DNA。本發明中所述變異體將說明如下。本發明中的術語「aN>M」或「NaM」 (a是正數，N和M分別是A、C、T或G)是指在基因序列中第「a」位的鹼基N被鹼基M所替代。術語「ainsN」或「adelN」(a是正數，N是 A、C、T或G)是在基因序列中第「a」位處插入或刪除一個鹼基N。例如，「-1M8C > T」變異體是基因序列中第-1584位的C鹼基被T鹼基替代。
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「2573insC」變異體是在基因序列中第2573位插入(加入)了 C鹼基。 「4125-4133insGTGCCCACT」變異體是在人類CYP2D6基因的第4125 4133位鹼基處插入了 9 個鹼基 GTGCCCACT。"2D6刪除」變異體是將整個人類CYP2D6基因從染色體中刪除。另外，「2D6重複」變異體是在同一染色體中重複了至少2個人類CYP2D6基因。如上所述，本發明提供了使用最優搜索組合來分析與CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR 和UGTlA基因的藥物敏感性相關的功能性變異體或多態性的方法，所述最優搜索組合基於目前為止還未被檢查的高麗人CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGTIA基因的多態性。本發明可以適用於確定包括在遺傳學特性上與高麗人相似的日本人和中國人以及高麗人在內的亞洲人的CYP1A2、CYP2A6、CYP2D6、PXR和UGTlA基因的基因型。


根據結合附圖的對本發明實施方式的下述說明，本發明的上述和/或其它方面將變得顯而易見且更容易理解，在所述附圖中圖1說明了根據本發明首次確定的CYP1A2基因的一種變異體在CYP1A2基因的基因序列中的位置；圖2 6是根據本發明選擇的CYP1A2基因的htSNP組合的實例；圖7 14說明了 CYP1A2啟動子基因的變異體的結果，所述變異體是根據本發明選擇的所述CYP1A2基因的功能性變異體(這裡，X軸表示取決於引物分子數量的運動，Y軸表示每個峰的高度)，圖7說明了 CYP1A2啟動子的野生型SNP，圖8說明了位於雜合(hetero)變異體中的CYP1A2啟動子的-3860G > A(CYP1A2 *1C) ,-2467delT(CYPlA2*lD)和-163C > A (CYP1A2*1F)變異體，所述雜合變異體在雙鏈 DNA 中含有一個變異體和一個野生型，圖9說明了位於純合(homo)變異體中的CYP1A2啟動子的-3860G > A(CYP1A2*1C ),-2467delT(CYPlA2*lD)和-163C > A (CYP1A2*1F)變異體，所述純合變異體在雙鏈DNA中含有兩個變異體，圖10說明了位於雜合變異體中的CYP1A2啟動子的-163C > A (CYP1A2*1F) 和-2808A > C變異體，圖11說明了位於純合變異體中的CYP1A2啟動子的-163C > A(CYP1A2*1F)變異體,還說明了位於雜合變異體中的 _2467delT(CYPlA2*lD)、-739T > G(CYP1A2*1E)、-3598G > Τ、-3113G > A、-2847T > C 和-1708T > C 變異體，圖12說明了位於純合變異體中的CYP1A2啟動子的-163C > A(CYP1A2*1F)變異體，還說明了位於雜合變異體中的_2467delT(CYPlA2*lD)、-3598G > T和-2847T > C變異體，圖13說明了位於雜合變異體中的CYP1A2啟動子的-163C > A(CYP1A2*1F)、-246 7delT(CYPlA2*lD)和-3594T > G 變異體，圖14說明了位於純合變異體中的CYP1A2啟動子的-163C > A(CYP1A2*1F)變異體，還說明了位於雜合變異體中的-3860G > A (CYP1A2*C)、-2467delT (CYP1A2*1D)和-2603insA變異體；圖15說明了根據本發明用於選擇htSNP組合的CYP2A6在高麗人中的單倍型的種類和頻率；圖16 21舉例說明了根據本發明選擇的CYP2A6基因的htSNP組合，圖16說明了用於通過在遺傳變異體檢測目標中添加6種功能性變異體和具有所謂功能性的3種遺傳變異體來確定CYP2A6基因的單倍型的htSNP組合的選擇，圖17說明了用於確定CYP2A6基因的單倍型的htSNP組合的選擇，所述CYP2A6基因包含8種含有胺基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標記的變異體和6種頻繁 CYP2A6遺傳變異體，圖18說明了用於確定CYP2A6基因的單倍型的另一 htSNP組合的選擇，所述 CYP2A6基因包含8種含有胺基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標記的變異體和 6種頻繁CYP2A6遺傳變異體，圖19說明了用於確定CYP2A6基因的單倍型的另一 htSNP組合的選擇，所述 CYP2A6基因包含8種含有胺基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標記的變異體和 6種頻繁CYP2A6遺傳變異體，圖20說明了用於確定CYP2A6基因的單倍型的另一 htSNP組合的選擇，所述 CYP2A6基因包含8種含有胺基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標記的變異體和 6種頻繁CYP2A6遺傳變異體，圖21說明了用於確定CYP2A6基因的單倍型的另一 htSNP組合的選擇，所述 CYP2A6基因包含8種含有胺基酸替換的變異體、3種具有CYP2A6基因刪除標記的變異體和 6種頻繁CYP2A6遺傳變異體，圖22 30說明了對所選htSNP組合和CYP2A6功能性遺傳變異體組合的SNaPshot 分析的結果，圖22說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的-48T > G、2134A > 6和6558T
>C變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體和一個野生型，圖23說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的567C > 7變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體和一個野生型，圖M說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的6458A > T和6558T > C變異體， 所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體和一個野生型，圖25說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的-48T > G、13G > A和6558T > C變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體和一個野生型，圖沈說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的3391T > C變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體，而另一個被刪除，圖27說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的-48T > 6和2134A > 6變異體， 所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體，而另一個被刪除，圖沘說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的-48T > G、6558T > C和6600G
>T變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體，而另一個被刪除，圖四說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的6458A > T變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體，而另一個被刪除，
圖30說明了位於雜合變異體中的CYP2A6基因的6558T > C和6582G > T變異體， 所述雜合變異體在雙鏈DNA中含有一個變異體和一個野生型；圖31和32說明了與圖22 30中所述基因研究一起進行的SNaPshot分析，所述 SNaPshot分析另外確定了除圖22 30中的所述遺傳變異體之外的CYP2A6基因刪除，圖31說明了存在於同源染色體中的CYP2A6基因，圖32說明了不存在於一個染色體中且只有一個基因的CYP2A6基因；圖33說明了部分的CYP2A6基因和CYP2A7基因的共軛連接；圖34 39說明了根據本發明選擇的CYP2D6基因的htSNP組合，圖40和41說明了根據本發明選擇的CYP2D6基因的htSNP組合之一的SNaPshot 分析結果；圖42說明了使用基因晶片確定CYP2D6基因的基因型的過程；圖43說明了用於CYP2D6基因的所述基因晶片上的探針；圖44說明了使用長PCR進行的CYP2D6基因擴增；圖45說明了 ASPE反應過程；圖46說明了顯示根據示例性實施方式12對CYP2D6基因中的變異體的分析結果的基因晶片；圖47說明了根據本發明選擇的P)(R基因的htSNP組合；圖48 50說明了搜索根據本發明選擇的P)(R基因中的功能性變異體的結果(這裡，X軸表示取決於每個引物的分子數量的運動，Y軸表示每個峰的高度)，圖 48 說明了 PXR基因的-25385C > T、_24113G > A.7635A > G、8055C > TU1156A
>C和11193T > C功能性變異體，所述變異體均為野生型；圖49說明了位於雜合變異體中的PXR基因的-25385C > T、-24113G > A、7635A
>G、8055C > TU1156A > (和11193T > C功能性變異體，所述雜合變異體在雙鏈DNA中
含有一個變異體和一個野生型；圖50說明了位於純合變異體中的PXR基因的-25385C > T、-24113G > A.7635A
>G、8055C > TU1156A > (和11193T > C功能性變異體，所述純合變異體在雙鏈DNA中含有兩個變異體；圖51 M說明了對50個高麗人的UGTlA基因的功能性變異體的分析結果(這裡，X軸表示SNP的位置，Y軸表示每個峰的高度，紅色是T，黑色是C，藍色是G，綠色是A)；圖51說明了對UGTlAl (a)和UGT1A3 (b)基因的功能性變異體的分析結果；圖52說明了對UGT1A4 (a)和UGT1A6 (b)基因的功能性變異體的分析結果；圖53說明了對UGT1A7基因的功能性變異體的分析結果；圖M說明了對UGT1A9基因的功能性變異體的分析結果；圖55說明了對50個高麗人的UGTlAl、UGT1A6和UGT1A9基因的與對依立替康 (irinotecan)的敏感性相關的多態性的分析結果；(a) UGTlAl 基因的 211G > A、233C > T 禾口 686C > A ；UGT1A6 基因的 19T > G、541A
>6和552A > C ；以及UGT1A9基因的726T > 6和766G > A，上述均為野生型，(b)UGTlAl基因的野生型211G >六和233C > T,雜合型686C > A ；UGT1A6基因的雜合型19T > 6和552A > C，野生型MlA > G ；UGT1A9基因的野生型726T > 6和766G >A，(C)UGTlAl 基因的野生型 211G > A、233C > T 和 686C > A ；UGT1A6 基因的雜合型 19T > G、541A > 6和 552A > C ； UGT1A9 基因的雜合型 > G 和野生型 766G > Α，和(d)UGTlAl基因的雜合型211G >六和233C > T，野生型686C > A ；UGT1A6基因的雜合型 19T > G、541A > G 和 552A > C ；UGT1A9 基因的野生型 > G 和 766G > Α。
具體實施例方式下文將參照

本發明的示例性實施方式，其中相同的附圖標記表示相同要素，並且將儘量避免重複性說明。本發明可供通過對高麗人CYP1A2基因的變異體分析來確定發現於高麗人中的 CYP1A2基因的基因型、選擇htSNP作為每個單倍型的最優標籤組並確認其可用性。另外，本發明可供確定人類CYP1A2基因的新單倍型。本發明的選擇人類CYP1A2基因的htSNP的方法如下(a)從對象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來擴增人類 CYP1A2基因或其片段；(d)從操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定變異體的存在；(e)用SNPtagger軟體對操作(d)中已確定具有變異體的所述PCR產物進行測序。從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸的方法沒有限制，是本領域公知的。作為另外一種選擇，可以使用提取試劑盒來提取所述核酸。例如，可以使用由Qiagen公司(美國)和Mratagene公司(美國)生產的DNA或RNA提取試劑盒。如果從所述試劑盒提取的是RNA，則通過逆轉錄生產cDNA待用。操作(c)中所述人類CYP1A2基因的片段是指包含人類CYP1A2基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態性(SNP)。擴增所述人類CYP1A2基因或其片段的所述引物可以基於人類CYP1A2基因或其片段的基因序列來設計，並且可以選自含參照2 31的引物，但不限於此。操作(d)中的所述變異體包括SNP、基因刪除和基因重複，但不限於此。例如，所述變異體可以包括17種變異體，如表5。所述測序方法沒有限制，可以是本領域內已知方法。例如，可以使用自動DNA測序儀或進行焦磷酸測序來確定基因序列。所述焦磷酸測序是用於DNA測序中的已知SNP測定方法，是檢測來自DNA聚合時釋放的無機焦磷酸鹽(PPi)的光表達的方法。所述DNA測序可以使用來自參照32 61的引物進行，但不限於此。可以通過比較野生型CYP1A2基因的基因序列來確定操作(d)中變異體的存在。可以使用所述野生型CYP1A2基因的基因序列，例如參照1的基因序列(基因庫(GenBank)登錄號NT_010194)或本領域內已知的每個 CYP1A2 基因型的基因序列(Drug Metab. Pharmacokinet, 2005, 20 (1) :24-33)。單倍型的頻率和類型可以使用本領域內已知的技術程序或市場上銷售的程序來估計。例如，可以使用免費分發的Haploview，或商業化程序SNPAlyze。所述Haploview軟體是本領域內已知的。更優選的是，可以從http://www. broad, mit. edu/mpg/haploview下載所述軟體。本發明的方法可以另外包括對操作(a) (d)的重複。為了確定諸如種族或者病人等特定群體內的CYP1A2基因的變異相及其單倍型，可以在檢測完CYP1A2基因型的頻率並從所述群體中選出頻繁CYP1A2基因型之後執行操作(e)。在操作(e)中，用SNPtagger軟體分析CYP1A2基因的單倍型數據以選擇htSNP。所述 SNPtagger 軟體在本領域內是已知的，例如 Genehunter、Merlin、Allegro、SNPHAP、htSNP finder (基於PCA)。更優選的是，所述軟體可以從http://www. well. ox. ac. uk/ xiayi/ haplotype 或 http://slack, ser. man. ac. uk/progs/htsnp. html 下載。可以驗證所選htSNP來改善精度從而確定二倍型。當由雙鏈染色體確定人類的基因型後，將所述基因型解碼以確定兩種單倍型組合。如果同時分析數個SNP，則特定單倍型的組合可以和另一個單倍型的組合相同。如果所述基因型由根據本發明所開發的診斷解碼，則應該驗證它是否準確確定了所述基因型。可以用Matlab (邁斯沃克軟體有限公司 (The Mathfforks, hc.)，美國)來分析是否由基因分析結果對所述基因型進行了正確的解碼，從而進行所述驗證。在本發明的一個示例性實施方式中，首先研究了高麗人CYP1A2基因中的變異體來選擇發現於高麗人中的CYP1A2基因型的htSNP。結果，在高麗人CYP1A2基因中共發現 17個SNP (參見表5)。17個SNP中有一個(_2603insA)是新型的。本發明首次提供的所述單一 SNP在雙鏈DNA中包含一個變異體和一個野生型(參見圖1)。在本發明的另一個示例性實施方式中，確定了發現於高麗人中的17個SNP的單倍型。結果，本發明確定了此前從未在高麗人中發現的CYP1A2基因的的單倍型(參見表6) 和基於上述單倍型的基因型。例如，表6中的CYP1A2基因的單倍型2(CYP1A2*1L)是指在所述CYP1A2基因的基因序列中的-3860、-2467和-163位鹼基處有SNP的基因型。更具體而言，所述基因型具有-3860G > A、-2467T > delT (_2467delT)和-163C > A 的 SNP。在本發明的另一個示例性實施方式中，用SNPtagger軟體分析已由含CYP1A2基因中的變異體的基因序列確定的單倍型以便選擇htSNP，亦即發現於高麗人中的CYP1A2基因的變異體的17個單倍型的最小標記。根據本發明選擇的htSNP組合的實例如圖2 6中所示。根據本發明選擇的所述htSNP組合可以用於確定人類CYP1A2基因的單倍型。因此，本發明提供了確定人類CYP1A2基因的單倍型的方法。所述方法包括如下步驟(a)從對象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所得核酸作為模板來擴增人類CYP1A2 基因或其片段；和(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定所述CYP1A2基因中變異體的存在，所述變異體選自-3860G > A、-3598G > T、-3594T > G、-3113G > A、-2847T > C、-2808A > C、-2603insA、-2467delT、-1708T > C、-739T > G、-163C > A、1514G > A、 2159G > A、2321G > C、3613T > C、5347C > T 和 5521A > G。操作(b)中的所述提取核酸的方法與上述相同。
如上所述，所述人類CYP1A2基因的片段是指包含所述人類CYP1A2基因的已知SNP 的片段。用於操作(c)的所述引物沒有限制，可以選自參照2 31。操作(d)中研究的所述SNP可以選自圖4 6中的htSNP。所述SNP的存在可以由如下變異體研究圖4中的-3860G > A、-3598G > T、-3113G > A、-2808A > C、-2603insA、-2467delT、-163C > A、1514G > A、2159G > A、5347C > T 和 5521A > G ；圖 5 中的-3860G > A、-3113G > A、-2808A > C、-2603insA, -2467delT, -739T > G、-163C
>A、1514G > A、2159G > A、5347C > !「和 5521A > G ；以及圖 6 中的-3860G > A、-3598G
>Τ、-3594Τ > G、-3113G > A、-2808A > C、-2603insA、-2467delT、-163C > A、1514G > A、2159G > A、5347C > !「和 5521A > G，或-3860G > A、-3598G > T、2321G > C、_3113G > A、-2808A > C、-2603insA、-2467delT、-163C > A、1514G > A、2159G > A、5347C > T 和 5521A > G0操作(d)中檢測的所述SNP基於發現於高麗人中的CYP1A2基因中的變異體，且該 SNP對確定高麗人的CYP1A2基因的單倍型和基因型極具特異性。操作(d)中的所述PCR產物的基因序列中的CYP1A2基因的SNP可以用本領域內已知的多態性分析方法確定。優選的是，所述SNP可以由SNaPshot分析(參見[Peter M-Vallone等，Int J Legal Med，2004，118 :147-157])、電泳分析或它們的組合來確定，更優選的是用SNaPshot分析來確定。所述SNaPshot分析是指通過用引物進行PCR反應來確定基因型的方法，所述引物含有在SNP位點附近的已退火基因序列(除SNP區域以外)和ddNTP。本發明中使用的所述 SNaPshot是用已知方法基於操作(c)中研究的所述CYP1A2基因的SNP設計和製造的。所用SNaPshot是可變的，只要其含有緊鄰SNP位點的鹼基作為3』端，包含與SNP位點相鄰的已退火基因序列，並在5』端添加了 T鹼基即可。更具體而言，引物可以選自參照64 74。 優選的是，所述與SNP位點相鄰的已退火基因序列的長度大約為20bp。如果同時確定數個 SNP，則所述SNaPshot引物5』端的T鹼基的長度被設計為可變。例如，在所述5』端添加5 個T鹼基以使引物的大小不同，從而改變所述PCR產物的長度。然後，將所述SNaPshot引物與和每個SNP互補的ddNTP結合。所述組合物因SNP的不同而大小不同。因此，可以同時確定數個SNP。為確定用所述SNaPshot分析所得的基因分型結果是否正確，執行了另一種確定所述基因型的方法。另一種方法沒有限制，優選包括自動DNA測序或焦磷酸測序。發現於高麗人中的所述CYP1A2基因中的17種變異體的11個SNP位於啟動子區域。所述11個SNP包含由本發明首次確定的-2603insA變異體。因此，本發明提供了確定人類CYP1A2啟動子基因中變異體的方法。所述方法包括下列步驟(a)從對象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取基因組DNA ；(c)使用引物進行PCR，所述反應使用在操作(b)中所得的基因組DNA作為模板擴增人類CYP1A2基因的啟動子區域；和(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定所述CYP1A2基因中變異體的存在，所述變異體包括-3860G > A、-3598G > T、-3594T > G、-3113G > A、-2847T > C、-2808A > C、-2603insA、_2467delT、-1708T > C、-739T > G 禾口 -163C > A。
操作(b)中的所述提取基因組DNA的方法與上述相同。操作(c)中擴增人類CYP1A2基因的啟動子區域的所述引物是可變的，只要所述引物能擴增來自參照1的從-3860G > A到-163C > A的SNP，更優選的是來自參照62和63 的SNP即可。操作(d)中所述PCR產物的基因序列中的CYP1A2基因的所述SNP可以用本領域內公知的多態性分析方法確定。優選的是，所述SNP可以用SNaPshot分析確定。本發明所用SNaPshot分析可以使用基於CYP1A2基因的所述11個SNP而設計的引物進行。本發明所用的SNaPshot引物是可變的，只要其被設計為包含與除所述SNP以外的序列相鄰的基因序列即可。更優選的是，具有選自參照64 74的基因序列的引物。在本發明的另一個示例性實施方式中，基於所述影響CYP1A2酶活性的啟動子區域中的11個SNP，由SNaPshot分析檢測所述CYP1A2啟動子基因的變異體。結果，證實本發明的所述方法可以準確地高速檢測所述CYP1A2啟動子基因中的變異體(參見圖7 14)。2. CYP2A6本發明可供通過對高麗人CYP2A6基因的變異體分析來確定主要發現於高麗人中的CYP2A6基因的基因型、選擇htSNP作為每個單倍型的最優標籤組並確認其可用性。根據本發明選擇人類CYP2A6基因的htSNP的方法如下(a)從對象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來擴增人類 CYP2A6基因或其片段；(d)確定在操作(C)中所得的PCR產物的基因序列中變異體的存在；(e)由在操作(d)中已確定具有變異體的PCR產物的基因序列確定單倍型；和(f) M SNPtagger (http//www. well. ox. ac. uk/ xiayi/haplotype/) X^tM 作(e)中確定的所述單倍型進行測序以選擇htSNP。所述從操作(a)中收集的樣本中提取核酸的方法沒有限制，是本領域內的已知方法。作為另外一種選擇，可以使用提取試劑盒來提取所述核酸。例如，可以使用由Qiagen 公司(美國)和Mratagene公司(美國)生產的DNA或RNA提取試劑盒。如果提取的是 RNA,則通過逆轉錄生產cDNA待用。操作(c)中所述人類CYP2A6基因的片段是指包含人類CYP2A6基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態性(SNP)。擴增所述人類CYP2A6基因或其片段的所述引物可以基於人類CYP2A6基因或其片段的基因序列來設計，並且可以選自參照76 89的引物，但不限於此。操作(d)中的所述變異體包括SNP、基因刪除和基因重複，但不限於此。例如，所述變異體可以包括30種變異體，如表15。操作(d)中確定變異體的存在的方法可以包括本領域內已知的變異體檢測方法。 優選的是，用序列分析或電泳分析來比較本領域內已知的野生型CYP2A6基因的基因序列 (例如參照75的基因序列(基因庫登錄號NC_000019))或本領域內已知的CYP2A6基因型的各基因序列。另外，還可用RFLP分析來比較所述野生型CYP2A6基因的限制性酶的切割相。所述CYP2A6基因的刪除或重複可以通過對PCR產物的電泳分析來確定。所述測序可以通過自動DNA測序儀或焦磷酸測序進行。操作(e)中確定含有變異體的PCR產物的基因序列中的所述單倍型可以通過諸如 SNPAlyze, Haplotyper, Arlequin 等程序來確定。本發明的方法可以另外包括對操作(a) (d)的重複。為了確定諸如種族或者病人等特定群體內的CYP2A6基因的變異相，可以在檢測完CYP2A6基因型的頻率並從所述群體中選出頻繁CYP2A6基因型之後執行操作(f)。在操作(f)中，用SNPtagger軟體分析操作(e)中確定的所述單倍型的基因序列以選擇 htSNP。用於選擇 htSNP 的所述軟體包括 HapBlock、LDSelect、Haploview、htSNP、 TagIT和tagSNPs以及SNPtagger。所述SNPtagger軟體在本領域內是已知的，且優選的是可以從 http://www. well. ox. ac. uk/ xiayi/haplotype 下載。可以驗證所選 htSNP 來改善精度從而確定二倍型。可以用Matlab (邁斯沃克軟體有限公司，美國)來驗證所述htSNP。在本發明的一個示例性實施方式中，首先研究了發現於高麗人中的CYP2A6基因中的變異體來選擇高麗人的CYP2A6基因型的htSNP。結果，在高麗人CYP2A6基因中共發現 30個SNP (參見表15)。在本發明的另一個示例性實施方式中，用DYNAC0M公司生產的SNPAlyze確定了所選的30個SNP中的14個SNP的單倍型，從而確定了具有以上的頻率的總共19個單倍型。所述14個SNP包括8個導致胺基酸替換且含有功能性遺傳變異體的變異體，和6個頻繁變異體。用來確定所述單倍型的程序不限於所述SNPAlyze。作為另外一種選擇，可以使用本領域內已知的各種軟體，例如，Haplotyper (http //www. people, fas. harvard, edu/ junliu/Haplo/docMain. htm)、Arlequin (htt: //lgb. unife. ch/arlequin)禾口 Istech 公司生產的 SNP Analyzer (http://www. istech21. com/)。在本發明的另一個示例性實施方式中，用SNPtagger軟體分析了包括19個單倍型和1個基因刪除在內的20個單倍型的基因序列和頻率以選擇htSNP，亦即能方便地鑑定主要發現於高麗人中的CYP2A6基因的基因型的最小標記。htSNP的實例如圖16 21所示。可以使用本發明所選的htSNP組合來確定所述人類CYP2A6基因的基因型。因此， 本發明提供了確定所述人類CYP2A6基因的基因型的方法。所述方法包括如下步驟(a)從對象中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來擴增人類 CYP2A6基因或其片段；(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定所述CYP2A6基因中變異體的存在，所述變異體選自-48T > G、13G > A、567C > T、2134A > G、3391T > C、6458A > Τ、 6558T > C、6582G > T、6600G > T 和 6091C > Τ。操作(b)中的所述提取核酸的方法與上述相同。如上所述，所述人類CYP2A6基因的片段是指包含人類CYP2A6基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態性(SNP)。可以用於操作(c)的引物可以包括參照90、91、120 和130的引物，但不限於此。操作(d)中的所述變異體可以選自圖16 21中的htSNP。例如，在操作(d)中， 所述變異體可以由圖 16 中的-48T > G ；22C > T ；567C > T ；2134A > G ；3391T > C ；6458A>T ；6558T > C ；6582G > T ；6600G > T ；選自 6091C > T、5971G > 八和 5983T > G 中的一種；和13G > A ；51G > A ； 1620T > C ；以及1836G > !「來確定。所述變異體也可以由圖17 中的-48T > G ；22C > T ；51G > A ；567C > T ； 1620T > C ； 1836G > T ；3391T > C ；6458A > T ；6558T > C ；6600G > T ；和選自 6091C > T、5971G > 六和 5983T > G 中的一種來確定。如圖18 所示，所述變異體可以由 22C > T ；51G > A ；567C > T ； 1620T > C ； 1836G
>T ；3391T > C ；6354T > C ；6458A > T ；6558T > C ；6600G > T ；和選自 6091C > T、5971G
>A和5983T > G中的一種來確定。如圖19 所示，所述變異體可以由-48T > G ;13G > A ；22C > T ；51G > A ；567C > T ； 1620T > C ； 1836G > T ；2134A > G ；3391T > C ；6458A > T ；6558T > C ；和選自 6091C > T、5971G >々和5983T > G中的一種來確定。如圖20 所示，所述變異體可以由-48T > G ;13G > A ；22C > T ；51G > A ；567C > T ； 1620T > C ； 1836G > T ；3391T > C ；6458A > T ；6558T > C ；和選自 6091C > T、5971G > A和5983T > G中的一種來確定。另外，如圖21所示，所述變異體可以由-48T > G ；22C > T ；51G > A ；567C > T ； 1620T > C ； 1836G > T ；2134A > G ；3391T > C ；6458A > T ；6558T > C ；6600G > T ；和選自 6091C > T、5971G >々和5983T > G中的一種來確定。優選的是，所述變異體如圖16所示
來確定。在圖16中的變異體中，證實具有功能性或具有很高的潛在功能性的變異體包含了替換胺基酸或導致基因刪除的變異體。因此，要檢測圖16中的變異體中的功能性CYP2A6 變異體，可以研究圖16中的變異體中的所述胺基酸替換變異體或基因刪除變異體。基因刪除幾乎無法由SNP檢測。當搜索所述變異體以標記基因刪除時，發現了 6091C > !「變異體。 所述6091C > T變異體是特異性地發現於操作(c)所擴增的PCR產物中刪除了 CYP2A6基因的染色體中的SNP，而且所述6091C > T變異體可以用作基因刪除標記變異體。用於確定功能性的所選變異體組合包括10個變異體，即-48T > G ;13G > A ；567C > T ；2134A > G ； 3391T > C ；6458A > T ；6558T > C ；6582G > T ；6600G > T ；和 6091C > T。所述 CYP2A6 基因中的5971G > A和5983T > G變異體可以替代所述6091C > T變異體來標記基因刪除。操作(d)中研究的所述變異體基於主要發現於高麗人中的CYP2A6基因中的變異體。因此，它對確定高麗人的CYP2A6基因的單倍型和基因型極具特異性。操作(d)中的所述PCR產物的基因序列中的CYP2A6基因的變異體可以用本領域內已知的多態性分析方法研究。可以用SNaPshot分析(參見[Peter Μ. Vallone等，Int J Legal Med, 2004,118 :147-157])、電泳分析或它們的組合，更具體而言，可以使用SNaPshot 分析來研究所述變異體。所述SNaPshot分析是指通過用引物進行PCR反應來確定基因型的方法，所述引物含有在SNP位點附近的已退火序列(除SNP區域以外)和ddNTP。本發明中使用的所述 SNaPshot是用基於操作(d)中研究的所述CYP2A6基因的SNP的已知方法設計和製造的。 所用SNaPshot是可變的，只要其含有緊鄰SNP位點的鹼基作為3』端，包含與所述SNP位點相鄰的已退火基因序列，並在5』端添加了 T鹼基即可。更優選的是，引物可以選自參照 97 102。優選的是，所述與SNP位點相鄰的已退火基因序列的長度大約為20bp。如果同時確定數個SNP，則所述SNaPshot引物的5』端的T鹼基的長度被設計為可變。例如，在所
18述5』端添加5個T鹼基以使引物的大小不同，從而改變所述PCR產物的長度。然後，將所述SNaPshot引物與和每個SNP互補的ddNTP結合。所述組合物因所述SNP的不同而大小不同。因此，可以同時確定數個SNP。然後，擴增以用於SNaPshot分析的所述PCR產物的基因序列可以用本領域內的已知測序方法進行分析，優選的是使用自動DNA測序進行分析。例如，具有選自參照92 101的基因序列的引物可以在操作(c)中用於研究圖16 中的htSNP組合。優選的是，可以使用來自參照92 101的所有引物，但不限於此。然後，擴增以用於SNaPshot分析的所述PCR產物的基因序列可以用本領域內的已知測序方法進行分析，優選的是使用自動DNA測序進行分析。在本發明的另一個示例性實施方式中，對所選htSNP組合的可用性進行了確認。 通過從圖16的htSNP組合中選擇10種功能性或潛在功能性CYP2A6變異體來分析操作(c) 中所得的PCR產物的基因序列，從而進行SNaPshot分析。結果，證實本發明的方法能高速地同時確定發現於高麗人中的CYP2A6基因型(參見圖22 32)。可以用本發明所述方法確定的所述CYP2A6基因的基因型包括_48T > G、13G > A、 567C > T、2134A > G、3391T > C、6458A > T、6558T > C、6582G > T、6600G > T 和 6091C > Τ。與之相對應的每個基因型和變異體如圖22 32中所示。例如，圖22說明了含有-48Τ > G、6558T > C和2134A > G變異體和7個野生型的基因型。圖23說明了含有567C > T 和9個野生型的基因型。所述CYP2A6、基因型包含2A6刪除變異體。當從人類染色體中刪除CYP2A6基因後，根本不會生成酶。如果CYP2A6基因被刪除，則所述基因的形狀為部分 CYP2A6基因和部分CYP2A7基因相結合的形狀。所述刪除特異性變異體可以通過研究上述結合基因來確定。3. CYP2D6本發明可供通過對高麗人CYP2D6基因的變異體分析來確定主要發現於高麗人中的CYP2D6基因的基因型、選擇htSNP作為每個單倍型的最優標籤組並確認其可用性。根據本發明選擇人類CYP2D6基因的htSNP的方法如下(a)從人類中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來擴增人類 CYP2D6基因或其片段；(d)由在操作(C)中所得的PCR產物的基因序列確定變異體的存在；(e)由在操作(d)中已確定具有變異體的PCR產物的基因序列確定單倍型；和(f)用SNPtagger軟體對操作(e)中所確定的單倍型進行測序以選擇htSNP。所述從操作(a)中收集的樣本中提取核酸的方法沒有限制，是本領域內的已知方法。作為另外一種選擇，可以使用提取試劑盒來提取所述核酸。例如，可以使用由Qiagen 公司(美國)和Mratagene公司(美國)生產的DNA或RNA提取試劑盒。如果提取的是 RNA,則通過逆轉錄生產cDNA待用。操作(c)中所述人類CYP2D6基因的片段是指包含人類CYP2D6基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態性(SNP)。擴增所述人類CYP2D6基因或其片段的所述引物可以基於人類CYP2D6基因或其片段的基因序列來設計。例如，所述引物可以包含選自參照106、參照107、參照121 127、參照1 136、參照138、參照139、參照140和參照150的基因序列，但不限於此。操作(d)中的所述變異體包括SNP、基因刪除和基因重複，但不限於此。例如，所述變異體可以包括33種變異體，如表34。操作(d)中確定變異體的存在的方法可以包括本領域內已知的變異體檢測方法。 優選的是，可以用基因測序、電泳分析和RFLP分析來確定所述變異體。所述基因測序可以通過自動DNA測序儀或焦磷酸測序進行。所述焦磷酸測序是用於DNA測序中的已知SNP測定方法，是檢測來自DNA聚合時釋放的無機焦磷酸鹽(PPi)的光表達的方法。可以通過比較野生型CYP2D6基因的基因序列來確定操作(d)中的變異體的存在。 所述野生型CYP2D6基因的基因序列是本領域內已知的。例如，可以使用參照105的基因序列(基因庫登錄號AYM5216)或本領域內已知的每個CYP2D6基因型的基因序列(基因庫登錄號M33388，http//www. cypalleles. ki. se/cyp2d6. htm)。另外，還可進行 RFLP 分析來比較所述野生型CYP2D6基因的限制性酶的切割相。所述CYP2D6基因的刪除或重複可以通過對PCR產物的電泳分析來確定。操作(d)中已確定含有變異體的PCR產物的基因序列中的單倍型可以用全測序來確定。本發明的方法可以另外包括對操作(a) (d)的重複。為了確定諸如種族或者病人等特定群體內的CYP2D6基因的變異相，可以在檢測完CYP2D6基因型的頻率並從所述群體中選出頻繁CYP2D6基因型之後執行操作(f)。在操作(f)中，用SNPtagger軟體分析操作(e)中確定的單倍型的基因序列以選擇htSNP。所述SNPtagger軟體在本領域內是已知的，例如Genehunter、Merlin、Allegro、 SNPHAP、htSNP finder (基於 PCA)，更優選的是，所述軟體可以從 http://www. well. ox. ac. uk/ xiayi/hapIotype 或 http://slack, ser. man. ac. uk/progs/htsnp. html 下^^。可以驗證所選htSNP來改善精度從而確定二倍型。當由雙鏈染色體確定人類的基因型後，將所述基因型解碼以確定兩種單倍型組合。如果同時確定數個SNP，則特定單倍型的組合可能和另一個單倍型的組合相同。如果所述基因型由根據本發明所開發的診斷解碼，則應該驗證它是否準確確定了所述基因型。可以用Matlab (邁斯沃克軟體有限公司，美國)分析是否由基因分析結果對所述基因型進行了正確的解碼，從而進行所述驗證。在本發明的一個示例性實施方式中，首先研究了發現於高麗人中的CYP2D6基因中的變異體以選擇高麗人CYP2D6基因型的htSNP。結果，在高麗人CYP2D6基因中發現了 33種變異體和與之相對應的12個單倍型(基因型)(參見表34和35)。在本發明的另一個示例性實施方式中，用SNPtagger軟體對12個CYP2D6基因型進行測序以選擇htSNP，亦即可方便地鑑定主要發現於高麗人中的CYP2D6基因型的最小標記。根據本發明選擇的htSNP組合的實例如圖34 39中所示。根據本發明選擇的所述htSNP組合可以用於確定人類CYP2D6基因的基因型。因此，本發明提供了確定人類CYP2D6基因的基因型的方法。所述方法包括如下步驟(a)從人類中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來擴增人類CYP2D6基因或其片段；(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定CYP2D6基因中的至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體包括選自-1426C > TUOOC > !「和1039C > T中的一種；選自> C、-377Α > G、3877G > A、4388C > T 和 4401C > T 中的一種；選自-740C > T、-678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G > C、233A > C、 245A > 6和 2850C > T 中的一種；1611T > A ； 1758G > A ；1887insTA ；2573insC ；2988G > A ；4125-4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；禾口 2D6 重複。操作(b)中的所述提取核酸的方法與上述相同。如上所述，所述人類CYP2D6基因的片段是指包含人類CYP2D6基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態性(SNP)。可以用於操作(c)的引物可以包括選自參照106和 107、參照121 127、參照129 136、參照138、139、149和150的基因序列。操作(d)中的所述變異體可以選自圖34 39中的htSNP。例如，如圖34所示， 可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C > TUOOC > !「和1039C > T 中的一種；選自 > C、-377Α > G、3877G > A、4388C > T 和 4401C > T 中的一種；選自-740C > T、-678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G > C、233A > C、 245A > 6和 2850C > T 中的一種；1611T > A ； 1758G > A ； 1887insTA ；2573insC ；2988G > A ；4125-4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；禾口 2D6 重複。如圖35所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括_1584C > G ；選自-1426C > TUOOC > T 禾日 1039C > T 中的一種；1611T > A ； 1758G > A ；2573insC ；圭自-740C > T、-678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G > C、233A > C、 245A > 6和 2850C > T 中的一種；選自-1245insGA、-1028T > C、-377A > C、3877G > A、 4388C > T 禾口 4401C > T 中的一禾中；4125_4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；禾口 2D6 重複。另外，如圖36所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C > TUOOC > !「和 1039C > T 中的一種；-1584C > G ；選自-1028T > C、_377A > G、3877G > A、 4388C > !「和 4401C > T 中的一種；選自-740C > T、_678G > A、214G > C、221C > A、223C
>G、227T > C、232G > C、233A > C、245A > 6和 2850C > T 中的一種；1611T > A ； 1758G
>A ； 1887insTA ；2573insC ；4125_4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；禾口 2D6 重複。另外，如圖37所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括_1584C > G ； 選自> TUOOC > T 禾日 1039C > T 中的一種；1611T > A ； 1758G > A ；2573insC ；選自-740C > T、-678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G > C、233A > C、 245A > 6和 2850C > T 中的一種；選自-1245insGA、-1028T > C、-377A > G、3877G > A、 4388C > T 禾口 4401C > T 中的一禾中；4125_4133insGTGCCCACT ；-1235A > G ； 1887insTA ；2D6 刪除；和2D6重複。另外，如圖38所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括選自-1426C > TUOOC > T 和 1039C > T 中的一種；選自-1028T > C、-377A > G、3877G > A、4388C > T 和 4401C > T 中的一種；1611T > A ；選自 1661G > C和 4180G > C 中的一種；1758G > A ； 1887insTA ；2573insC ；2988G > A ；4125_4133insGTGCCCACT ；-1235A > G ； 1887insTA ；2D6 刪除；和2D6重複。另外，如圖39所示，可以確定下述變異體的存在，所述變異體包括_1584C > G ；選自> TUOOC > !「和 1039C > T 中的一種；1611T > A ；1758G > A ；2573insC ；選自-740C > T、-678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G > C、233A > C、 245A > 6和 2850C > T 中的一種；選自-1245insGA、-1028T > C、-377A > G、3877G > A、 4388C > T 和 4401C > T 中的一種；1887insTA ；2988G > A ；4125_4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；和2D6重複。優選的是，可以確定圖34中的變異體的存在。操作(d)中確定的所述變異體基於主要發現於高麗人中的CYP2D6基因中的變異體。因此，它對確定高麗人的CYP2D6基因的單倍型和基因型極具特異性。操作(d)中所述PCR產物的基因序列中的CYP2D6基因的變異體可以用本領域內已知的多態性分析方法確定。優選的是，可以用SNaPshot分析(參見[PeterM. Vallone等， Int J Legal Med，2004，118 :147-157])、電泳分析或它們的組合來確定所述變異體。如果所述CYP2D6中的變異體包含SNP，則可以使用SNaPshot分析。所述SNaPshot分析是指通過用引物進行PCR反應來確定基因型的方法，所述引物含有在SNP位點附近的已退火基因序列(除SNP區域以外)和ddNTP。本發明中使用的 SNaPshot分析是用基於操作(c)中確定的所述CYP2D6基因的SNP的已知方法設計和製造的。所用SNaPshot是可變的，只要其含有緊鄰SNP位點的鹼基作為3』端，包含與所述SNP 位點相鄰的已退火基因序列，並在5』端添加了 T鹼基即可。優選的是，所述與SNP位點相鄰的已退火基因序列的長度大約為20bp。如果同時確定數個SNP，則所述SNaPshot引物5』 端的T鹼基的長度被設計為可變。例如，在所述5』端添加5個T鹼基以使引物的大小不同， 從而改變所述PCR產物的長度。然後，將所述SNaPshot引物與和每個SNP互補的ddNTP結合。所述組合物因所述SNP的不同而大小不同。因此，可以同時確定數個SNP。例如，具有選自參照141 148以及參照152和153的基因序列的引物可以在操作(c)中用於研究圖34中的htSNP組合。更優選的是，可以使用具有選自參照141 148 以及參照152和153的基因序列的所有引物。然後，通過所述SNaPshot分析擴增的PCR產物的基因序列可以用已知基因測序方法進行分析。所述基因測序方法可以在本領域內的已知方法中靈活選取，優選的是包括自動DNA測序。在本發明的另一個示例性實施方式中，對根據本發明所選的htSNP組合的可用性進行了確認。在使用圖34中的htSNP組合進行所述SNaPshot分析後，分析了所得PCR產物的基因序列。結果，證實本發明的方法能高速地同時確定發現於高麗人中的CYP2D6基因型(參見圖40和41)。可以用本發明所述方法確定的所述CYP2D6基因的基因型包括CYP2D6*1A、 CYP2D6*2A、CYP2D6*5、CYP2D6*2N、CYP2D6*10B、CYP2D6*14B、CYP2D6*18、CYP2D6*21B、 CYP2D6*41A、CYP2D6*49、CYP2D6*52和CYP2D6*60。各個基因型和與之相對應的變異體如表 34中所示。參見表34，例如，所述CYP2D6*1A基因型包含一個野生型，而所述CYP2D6*2A基因型包含野生型CYP2D6基因的基因序列中在SNP 1、SNP 5、SNP 8、SNP 9、SNP 12 SNP 18、SNP 21、SNP 25和SNP 28位點的變異體。所述CYP2D63基因型包含2D5刪除變異體。 當CYP2D6基因從人類染色體中被完全刪除後，不再產生酶。所述CYP2D6*2N基因型包含2D6 重複變異體。即在同一染色體中至少存在2個CYP2D6基因。本發明提供了使用基因晶片確定人類CYP2D6基因的基因型的方法。所述方法包括如下步驟(a)提取待研究的基因，對所述基因進行多重PCR並得到包含SNP的邊界的PCR產物；(b)用ASPE (等位基因特異性引物延伸)引物進行ASPE反應以鑑定等位基因的特異性鹼基；(c)將所述反應產物與基因晶片相混合；和(d)分析所述基因晶片。本發明提供了用於確定SNP的基因型分析晶片(參見圖42)，所述晶片含有基於 Zip編碼(Zip Code)寡核苷酸的晶片。對每個SNP生成一對引物以在操作(b)中進行ASPE反應。所生成的ASPE引物是在3』端包含SNP位點並與等位基因特異性結合的基因序列。所述ASPE引物包含Zip編碼， 即，朝向5』端具有Mbp的寡核苷酸。所生成Zip編碼在每個等位基因中含有不同的基因序列。本發明從文獻中公開的基因序列和用生物信息學技術設計的基因序列中選擇了最優Zip編碼序列，所述最優Zip編碼序列經實驗驗證不與其它樣品發生交叉反應。所選序列的Tm為61°C。所生成的Zip編碼不互相干擾。所選基因序列具有AG值為-2以上的髮夾形二級結構。如果使用所述ASPE引物進行ASPE反應，則含有對應於所述引物的3』端的等位基因的樣品與所述引物反應以發生等位基因特異性延伸反應。如果使用與螢光材料Cyanine 5(Cy5)共價結合的dUTP(Cy5-dUTP)來進行所述延伸反應，則只有含對應等位基因的樣品會被Cy5螢光材料標記(參見圖45)。所述螢光材料不限於Cy5，可以使用其它材料，諸如 Cy3、TAMRA、TexasRed、Cy3· 5、Rhodamin 6G、SyBR Green 等。在本發明的分析晶片上提供了與所述Zip編碼互補結合的寡核苷酸探針(cZip Code，互補Zip編碼)。因此，可以識別用所述Zip編碼引物延伸的樣品中包含的每個等位基因(參見圖43)。在所述探針中，在3』端插入了 IObp的基因序列作為間隔區來誘導與目標的雜交。 例如，所述間隔區序列優選為5』 -CAG GCC AAGT-3』。本發明的所述探針優選包含參照158 184的基因序列。在操作(c)和(d)中的將所述反應產物與所述基因晶片相混合併分析經混合的所述晶片的方法可以包括本領域內已知的方法。所用的DNA晶片掃描儀可以變化。更優選的是，使用Axon公司生產的GenePix 4100B掃描儀。掃描的圖片可以用GenePix Pro6. 0軟體進行分析。如果用本發明所述基因晶片分析所述CYP2D6基因的變異體，則其結果與用序列分析所驗證的結果相同。因此，本發明的基因晶片可以低成本分析各種基因的變異體。4. PXR本發明的方法使用基於高麗人P)(R基因中的變異體選擇的htSNP來確定P)(R基因中的功能性變異體。本發明所述的選擇人類P)(R基因的htSNP的方法包括如下步驟(a)從人類中收集生物樣本；
(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來擴增人類 P)(R基因或其片段；(d)對操作(C)中所得PCR產物測序以確定變異體的存在；(e)確定操作(d)中已證實具有變異體的PCR產物的基因序列中的單倍型；和(f)用SNPtagger軟體對操作(e)中所確定的單倍型進行測序並選擇htSNP。所述從操作(a)收集的樣本中提取核酸的方法沒有限制，是本領域內的已知方法。作為另外一種選擇，可以使用提取試劑盒來提取所述核酸。例如，可以使用由Qiagen 公司(美國)和Mratagene公司(美國)生產的DNA或RNA提取試劑盒。如果提取的是 RNA,則通過逆轉錄生產cDNA待用。操作(c)中的所述人類P)(R基因的片段是指包含人類P)(R基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態性(SNP)。擴增所述人類P)(R基因或其片段的引物可以基於人類PXR 基因或其片段的基因序列來設計，並且所述引物可以選自參照221 240的引物，但不限於此。操作(d)中所述的變異體包括SNP、基因刪除和基因重複，但不限於此。例如，所述變異體可以包括22種變異體，如表48。操作(d)中確定變異體的存在的方法可以包括本領域內已知的變異體檢測方法。 優選的是，可以進行基因測序、電泳分析和RFLP分析來確定所述變異體的存在。所述基因測序可以通過自動DNA測序儀或焦磷酸測序進行。可以通過比較野生型P)(R基因的基因序列來確定操作(d)中變異體的存在。可以使用所述野生型P)(R基因的基因序列，例如參照2200的基因序列(基因庫登錄號NT 005612)或本領域內已知的每個P)(R基因型的基因序列。另外，還可用RFLP分析來比較所述野生型P)(R基因的限制性酶的切割相。所述P)(R基因的刪除或重複可以通過對PCR產物的電泳分析來確定。操作(d)中證實含有變異體的PCR產物的基因序列中的單倍型的頻率和類型可以使用本領域內已知的技術程序或市場上銷售的程序來分析。例如，可以使用免費分發的 Haploview,或商業化程序SNPAlyze。所述Haploview軟體是本領域內已知的，而更優選的是，可以從 http://www. broad, mit. edu/mpg/haploview 下載所述軟體。本發明的方法可以另外包括對操作(a) (e)的重複。為了確定諸如種族或者病人等特定群體內的P)(R基因的變異相及其單倍型，可以在檢測完P)(R基因型的頻率並從所述群體中選出頻繁P)(R基因型之後執行操作(f)。在操作(f)中，用SNPtagger軟體對操作(e)中確定的單倍型測序來選擇htSNP。 所述SNPtagger軟體在本領域內是已知的，例如Genehunter、Merlin、Allegro、SNPHAP, htSNP finder (基於PCA)，更優選的是，所述軟體可以從http://www. well. ox. ac. uk/ xiayi/hapIotype 或 http://slack, ser. man. ac. uk/progs/htsnp. html 下^^。可以驗證所選htSNP來改善精度從而確定二倍型。當由雙鏈染色體確定人類的基因型後，將所述基因型解碼以確定兩種單倍型組合。如果同時確定數個SNP，則特定單倍型的組合可能和另一個單倍型的組合相同。如果所述基因型由根據本發明所開發的診斷解碼，則應該驗證它是否準確確定了所述基因型。可以用Matlab (邁斯沃克軟體有限公司，美國)來分析是否由基因分析結果對所述基因型進行了正確的解碼，從而進行所述驗證。在本發明的一個示例性實施方式中，首先研究了高麗人P)(R基因中的變異體以選擇htSNP，高麗人P)(R基因的功能性變異體。結果，在高麗人的P)(R基因中共發現了 22個 SNP (參見表48)。在本發明的另一個示例性實施方式中，用DYNAC0M公司生產的SNPAlyze軟體確定了 22個所選SNP中的6個功能性變異體的單倍型，從而確定了總共14個單倍型(參見表 49)。在本發明的另一個示例性實施方式中，用SNPtagger軟體對所述14個單倍型進行測序以選擇htSNP，亦即可方便地確定發現於高麗人中的P)(R基因的功能性變異體的最小標記(參見圖47)。可以使用根據本發明選擇的htSNP組合來確定人類P)(R基因的功能性變異體。因此，本發明提供了確定人類P)(R基因的功能性變異體的方法。所述方法包括如下步驟(a)從人類中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的核酸作為模板來擴增人類 P)(R基因或其片段；和(d)在操作(C)中所得的PCR產物的基因序列中確定P)(R基因中功能性變異體的存在，所述變異體選自-25385C > T、-24113G > A.7635A > G、8055C > TU1156A > C 和 11193T > C。操作(b)中的所述從收集的樣本中提取核酸的方法與上述相同。所述人類P)(R基因的片段是指包含人類P)(R基因的已知變異體的片段，例如，單核苷酸多態性(SNP)。可以用於操作(c)的引物可以選自參照242 M7的引物，但不限於此。操作(d)中研究的所述SNP基於發現於高麗人中的P)(R基因的功能性變異體，它對確定高麗人PXR基因的功能性變異體和所述功能性變異體的單倍型極具特異性。可以用本領域內已知的多態性分析方法來確定操作(d)中所述PCR產物的基因序列中的P)(R基因的變異體的存在。優選的是，可以用SNaPshot分析(參見[Peter M-Vallone等，Int J Legal Med，2004，118 :147-157])、電泳分析或它們的組合，更優選的是用SNaPshot分析來確定所述變異體的存在。所述SNaPshot分析是指通過用引物進行PCR反應來確定基因型的方法，所述引物含有在SNP位點附近的已退火基因序列(除SNP區域以外)和ddNTP。本發明中使用的 SNaPshot分析是用基於操作(d)中研究的所述P)(R基因的SNP的已知方法設計和製造的。 所用SNaPshot是可變的，只要其含有緊鄰SNP位點的鹼基作為3』端，包含與所述SNP位點相鄰的已退火基因序列，並在5』端添加了 T鹼基即可。更優選的是，引物可以選自參照 242 M57的引物。優選的是，所述與SNP位點相鄰的已退火基因序列的長度大約為20bp。 如果同時確定數個SNP，則所述SNaPshot引物5』端的T鹼基的長度被設計為可變。例如， 在所述5』端添加5個T鹼基以使引物的大小不同，從而改變所述PCR產物的長度。然後， 將所述SNaPshot引物與和每個SNP互補的ddNTP結合。所述組合物因所述SNP的不同而大小不同。因此，可以同時確定數個SNP。
為了確定使用所述SNaPshot分析的基因分型結果是否正確，採用了另一種基因分型方法。另一種基因分型方法沒有限制，優選包括自動DNA測序或焦磷酸測序。在本發明的另一個示例性實施方式中，對本發明所選的htSNP組合的可用性進行了確認。使用圖47中的htSNP組合進行所述SNaPshot分析，並分析了所得PCR產物的基因序列。結果，證實本發明的方法能高速地同時確定發現於高麗人中的P)(R基因功能性變異體(參見圖48 50)。可以用本發明的方法確定的所述P)(R基因的功能性變異體包括-25385C > T、-24113G > A、7635A > G、8055C > TU1156A > C 和 11193T > C。5. UGTlA根據本發明確定人類UGTlA基因的功能性變異體的方法包括如下步驟(a)從人類中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)使用操作(b)中所提取的核酸個別地擴增人類UGTlA基因；和(d)對操作(c)中擴增的所述基因進行測序並確定UGTlA基因的功能性變異體的存在，所述變異體選自UGT1A1基因中的-39(TA)6 > (TA) 7、211G > A，233C > T和686C > A ；UGTlA3 基因中的 31T > CU33C > T 禾日 140T > C ；UGT1A4 基因中的 31C > TU42T > G 禾口 292C > T ；UGT1A6 基因中的 19T > G、541A > G 禾口 552A > C ；UGT1A7 基因中的 387T > G、391C > A、392G C 和 701T > C ；和 UGT1A9 基因中的-118T9 > T10、726T > G 和 766G > A0本發明的確定UGTlA基因的與對依立替康的敏感性相關的多態性的方法包括如下步驟(a)從人類中收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的樣本中提取核酸；(c)使用操作(b)中所提取的核酸個別地擴增人類UGTlA基因；和(d)對操作(c)中擴增的所述基因進行測序並確定UGTlA遺傳變異體的存在，所述變異體選自UGT1A1基因中的211G > A、233C > !「和686C > A ；UGT1A6基因中的19T > G、541A > G 和 552A > C ；和 UGT1A9 基因中的-118T9 > T10.726T > G 和 766G > A。本發明的方法採用了基於主要發現於高麗人的UGTlA基因的多態性而選擇的最優多態性標籤組，並確定了 UGTlA基因中的功能性變異體或藥物敏感性。與現有方法相比， 本發明的方法對分析高麗人的UGTlA基因而言在時間和成本上具有有效性。在本發明的操作(a)中，所述生物樣本採自人類，優選的是包括高麗人、中國人和日本人在內的亞洲人，而更優選的是高麗人。所述生物樣本可以包括血液、皮膚細胞、粘液細胞或毛髮，更優選的是血液。在本發明的操作(b)中，所述核酸提取自操作(a)中收集的生物樣本。所述核酸可以包括DNA或RNA，優選的是DNA，更優選的是基因組DNA。從所收集的樣本中提取核酸的工藝沒有限制，可以根據本領域內已知的技術進行。作為另外一種選擇，可以使用DNA或 RNA提取試劑盒，例如由Quiagen公司(美國)和Mratagene公司(美國)生產的試劑盒。在本發明的操作(C)中，使用操作(b)中提取的核酸作為模板並用引物擴增了所述UGTlA基因。如果操作(b)中提取的核酸是RNA，則將該RNA經逆轉錄轉化為cDNA以用作模板。所述引物由已知方法基於人類UGTlA基因或其片段的基因序列設計和製造。在本發明的操作(c)中，優選的是擴增UGT1A1、UGTlA3, UGT1A4、UGT1A6、UGT1A7 和UGT1A9基因來確定UGTlA基因中的功能性變異體。優選的是，擴增UGT1A1、UGT1A6和 UGT1A9基因來確定UGTlA基因的決定了對依立替康的敏感性的多態性。在本發明的操作(d)中，使用操作(c)中所擴增的UGTlA基因來分析所述功能性變異體或與UGTlA基因的藥物敏感性相關的多態性。可以使用本領域內已知的多態性分析方法來分析所述功能性變異體或多態性。例如，可以進行SNaPshot分析、電泳分析、焦磷酸測序或上述方法的組合。具體而言，如果待分析的UGTlA基因的變異體包含SNP，則優選的是SNaPshot分析。在SNaPshot分析中，使用可以使與SNP位點相鄰的區域退火的引物和ddNTP來進行 PCR反應。SNaPshot分析中使用的所述引物由基於UGTlA基因的SNP的已知方法設計和製造。例如，設計和製造引物使得緊鄰SNP位點的鹼基是3』端，包含與所述SNP位點相鄰的已退火基因序列，且在5』端添加了 T鹼基。優選的是，所述已退火的基因序列的長度大約為20bp。如果同時確定數個SNP，則所述SNaPshot引物5』端的T鹼基的長度被設計為不同，從而改變所述PCR產物的長度。含參照四05 314的基因序列的引物可以用來進行確定UGTlA基因的功能性變異體的SNaPshot分析。含參照315 322的基因序列的引物可以用來進行確定UGTlA基因的與對依立替康的敏感性相關的多態性。由所述SNaPshot分析擴增的PCR產物的基因序列可以用已知測序方法分析。優選的是，所述PCR產物的基因序列可以用自動測序方法來分析，但不限於此。如果待分析的UGTlA基因變異體不是SNP (例如，UGTlAl基因中的-39 (TA) 6 > (TA) 7)，則可以進行已知的焦磷酸測序來代替所述SNaPshot分析。所述焦磷酸測序評價在 DNA聚合時釋放的PPi (無機焦磷酸鹽)的表達。在本發明的一個示例性實施方式中，可以使用含參照四2 四4的基因序列的引物來進行焦磷酸測序以確定UGTlAl基因的-39 (TA) 6 > (TA)7。下文將對本發明的示例性實施方式進行詳細說明。下述示例性實施方式對本發明進行了示例性說明，但本發明並不限於下述示例性實施方式。示例性實施方式1 確定高麗人CYP1A2基因的基因型CYP1A2 基因的擴增從48個健康對象採集血液後，使用Qiagen公司生產的基因組DNA分離試劑盒將 DNA從血液中分離。所述CYP1A2基因包含7個外顯子(exon)，且大約為111Λ長。將所述 CYP1A2基因分為15個片段進行PCR。在每個PCR中使用的引物如表1所示。在本說明書中的基因序列中所寫的A、T、G和C是指腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶。[表1]用於擴增CYP1A2基因及其基因序列的引物
權利要求
1.選擇人類CYP2D6基因的單倍型標籤單核苷酸多態性的方法，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來擴增人類 CYP2D6基因或其片段；(d)在操作(c)中所得的PCR產物的基因序列中確定變異體的存在；(e)由在操作(d)中已確定具有所述變異體的PCR產物的基因序列確定單倍型；和(f)用SNPtagger軟體對操作(e)中所確定的所述單倍型進行測序並選擇單倍型標籤單核苷酸多態性。
2.如權利要求1所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細胞、粘液細胞和毛髮。
3.如權利要求1所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物包含選自參照106、107、 121 127,129 136、138、139、149 和 150 的基因序列。
4.如權利要求1所述的方法，其中，操作(d)中的所述變異體選自單核苷酸多態性、基因刪除和基因重複。
5.如權利要求1所述的方法，其中，操作(d)中對所述變異體的存在的確定包括用測序、電泳分析和RFLP分析中的一種來確定所述變異體的存在。
6.如權利要求1所述的方法，所述方法還包括重複操作(a) (d)。
7.確定人類CYP2D6基因的基因型的方法，所述方法包括(a)從人類收集生物樣本；(b)從操作(a)中所收集的所述樣本中提取核酸；(c)用引物進行PCR，該反應使用操作(b)中所提取的所述核酸作為模板來擴增人類 CYP2D6基因或其片段；和(d)確定CYP2A6基因中至少11種變異體的存在，所述至少11種變異體包括選自-1426C > TUOOC > !「和 1039C > T 中的一種；選自-1028T > C、_377A > G、3877G > A、 4388C > T 和 4401C > T 中的一種；選自-740C > T、_678G > A、214G > C、221C > A、223C>G、227T > C、232G > C、233A > C、245A > 6和 2850C > T 中的一種；1611T > A ； 1758G>A ； 1887insTA ；2573insC ；2988G > A ；4125_4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；禾口 2D6 重複。
8.如權利要求7所述的方法，其中，操作(a)中收集的所述生物樣本選自血液、皮膚細胞、粘液細胞和毛髮。
9.如權利要求7所述的方法，其中，操作(c)中的所述引物包含選自參照106、107、 121 127,129 136、138、139、149 和 150 中的基因序列。
10.如權利要求7所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自> Τ、IOOC > T 和 1039C > T 中的一種；選自 1(^8Τ > C、-377Α > G、 3877G > A、4388C > !「和 4401C > T 中的一種；選自-740C > T、_678G > A、214G > C、221C>A、223C > G、227T > C、232G > C、233A > C、245A > 6和 2850C > T 中的一種；1611T > A ； 1758G>A ； 1887insTA ；2573insC ；2988G > A ;4125_4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；和 2D6 重複。
11.如權利要求7所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1584C > G ；-1426C > TUOOC > !「和 1039C > T 中的一種；選自 161IT > A ； 1758G > A ；2573insC ；-740C > T、_678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G>C、233A > C、245A > 6和 2850C > T 中的一種；選自-1245insGA、-1028T > C、_377A > C、3877G > A、4388C > !「和 4401C > T 中的一種；4125_4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；和 2D6重複。
12.如權利要求7所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自> TUOOC > T 和 1039C > T 中的一種；選自 1584C > G ；-1028T > C、-377A > G、3877G > A、4388C > !「和 4401C > T 中的一種；選自-740C > T、_678G > A、 214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G > C、233A > C、245A > 6和 2850C > T 中的一種；161 IT > A ；1758G> A ;1887insTA ；2573insC ；4125_4133insGTGCCCACT ；2D6 刪除；禾口 2D6重複。
13.如權利要求7所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1584C > G ；-1426C > TUOOC > !「和 1039C > T 中的一種；選自 161IT > A ； 1758G > A ；2573insC ；-740C > T、_678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T > C、232G>C、233A > C、245A > 6和 2850C > T 中的一種；選自-1245insGA、-1028T > C、_377A > G、3877G > A、4388C > T 和 4401C > T 中的一種；4125_4133insGTGCCCACT ；-1235A > G ； 1887insTA ；2D6 刪除；禾口 2D6 重複。
14.如權利要求7所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自> TUOOC > !「和 1039C > T 中的一種；選自 1(^8T > C、-377Α > G、 3877G > A、4388C > T 和 4401C > T 中的一種；選自 1611T > A ；1661G > C 和 4180G > C 中的一種；1758G > A ； 1887insTA ；2573insC ；2988G > A ；4125_4133insGTGCCCACT ；-1235A>G ； 1887insTA ；2D6 刪除；禾口 2D6 重複。
15.如權利要求7所述的方法，其中，所述操作(d)包括確定變異體的存在，所述變異體包括選自-1584C > G ；-1426C > TUOOC > T禾日1039C > T中的一種；選自1611T>A ； 1758G > A ；2573insC ；-740C > T、-678G > A、214G > C、221C > A、223C > G、227T>C、232G > C、233A > C、245A > G 禾日 2850C > T 中的一種；選自-1245insGA、-1028T>C、-377A > G、3877G > A、4388C > T 和 4401C > T 中的一種；1887insTA ；2988G > A ； 4125-4133insGTGCCCACT ； 2D6 刪除；和 2D6 重複。
16.如權利要求7所述的方法，其中，操作(d)中對所述變異體的存在的確定包括用 SNaPshot分析確定所述變異體的存在。
17.如權利要求16所述的方法，其中，所述SNaPshot分析用引物進行，所述引物具有緊接單核苷酸多態性的鹼基作為3』端，具有在與所述單核苷酸多態性位點相鄰處退火的基因序列，並具有添加到5』端的T鹼基。
18.如權利要求17所述的方法，其中，所述引物包含選自參照141 148、152和153中的基因序列。
19.用基因晶片確定人類CYP2D6基因的方法，所述方法包括(a)提取待研究的基因並進行多重PCR以獲得具有待鑑定的單核苷酸多態性邊界的 PCR產物；(b)對ASPE(等位基因特異性引物延伸)引物進行ASPE反應以鑑定每個等位基因的特異性鹼基；(C)將反應物與所述基因晶片相混合；和 (d)分析所述晶片。
20.如權利要求19所述的方法，其中，所述基因晶片包含具有參照158 184的基因序列的探針。
21.CYP2D6基因分型試劑盒，所述試劑盒具有用於單核苷酸多態性檢測的Zip編碼寡核苷酸晶片。
全文摘要
本發明涉及用於確定細胞色素P450 2D6(CYP2D6)基因的基因型的單倍型標籤單核苷酸多態性(htSNP)和使用所述htSNP的基因晶片，更具體而言，涉及用於確定人類CYP2D6基因的單倍型的htSNP的選擇方法、使用所述htSNP確定所述基因的基因型的方法和用於所述方法的基因晶片。
文檔編號C12Q1/68GK102304572SQ20111024042
公開日2012年1月4日 申請日期2007年6月26日 優先權日2006年9月11日
發明者孫知弘, 崔銀貞, 張仁珍, 李相燮, 申載國, 芮晟洙, 車仁浚, 車恩暎, 鄭惠恩, 鄭玄朱, 金佑永, 金垠泳, 金江美 申請人:Inje 大學校產學協力團