一種構建轉基因大型海藻的方法
2023-05-28 08:01:11 2
專利名稱：一種構建轉基因大型海藻的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一種構建轉基因大型海藻的方法。
背景技術：
大型海藻是藻膠(瓊脂、卡拉膠、褐藻酸等)生產的主要來源，目前已經實現大規模人工栽培的大型海藻包括紅藻(紫菜、江蘺、石花菜、麒麟菜)、綠藻(石蓴)與褐藻(海帶、裙帶菜)，全球栽培面積達3百萬畝，年產量達635萬噸鮮重，除部分作為營養食品外，主要用於藻膠的提取。近年來，由於對藻膠產量與質量改進的需求迅速提高，基因工程技術被引入大型海藻的研究領域，用於定向改造海藻種質。轉基因大型海藻還可用於外源高值產品的表達生產以及海洋環境的修復。
現有的構建轉基因植物的成熟技術均是針對高等植物的，主要採用的技術工藝流程為1.轉化方法利用農桿菌Ti質粒系統導入外源基因，或利用電擊法向原生質體內導入基因，或利用基因槍法向組織細胞中導入基因；2.載體元件廣泛使用高等植物來源的啟動子(如CaMV35S)用於驅動外源基因的表達；3.轉化受體及植株再生利用了植物細胞的全能性，或培養原生質體再生植株，或誘導組織去分化形成愈傷組織，再誘導愈傷組織分化並再生植株；4.篩選標記大多以Npt II基因為選擇標記基因，通過卡那黴素或新黴素篩選，獲得轉基因植株。
大型海藻是生活在海洋環境中的低等植物，不同於上述高等植物，表現在1.轉化方法不具有類似於農桿菌的轉化系統；2.載體元件至今未克隆到自身啟動子；3.轉化受體及植株再生不同種類的細胞及組織培養研究差別大，個別種類(如紫菜)能實現原生質體再生植株，很多種類(如海帶、裙帶菜)的原生質體難以再生植株，組織培養再生植株的效率也很低；4.篩選標記大型海藻敏感的抗生素種類及敏感程度不同於高等植物。
目前絕大多數研究完全借鑑高等植物的技術，利用大型海藻的組織切塊或原生質體為轉化受體，僅實現了外源基因的瞬間表達，在原生質體再生的新植株中未檢測到外源基因的穩定表達；由於只使用了一種高等植物來源的啟動子(CaMV35S)，效率較低；大型海藻對抗生素的敏感性實驗尚未涉及。
發明內容
針對上述技術難點，根據大型海藻的生活史特點，經過多年研究，本發明的目的是提供一種效率高、能實現外源基因穩定表達的構建轉基因大型海藻的方法。
為實現上述目的，本發明技術方案如下將報告性外源基因重組於或將功能性外源基因與抗生素或除草劑抗性基因融合後重組於高等植物或藻類來源的啟動子下遊，構建成轉化用的載體。以大型海藻的孢子為轉化受體，用基因槍將重組後的質粒DNA導入大型海藻的孢子中，經自然發育途徑生成新植株；採用功能性外源基因途徑生成新植株後可經篩選獲得抗生素或除草劑抗性的轉基因大型海藻；並可進一步獲得外源基因產品(例如表達的疫苗、防禦素、抗體、藥物蛋白)。
其中所述功能性外源基因為藻膽蛋白基因、生長因子基因、抗體基因、疫苗基因、防禦素基因或抗菌肽基因等；所述抗性基因為cat基因、hpt基因或bar基因；所述抗生素為氯黴素或潮黴素，所述除草劑為草丁膦；所述的啟動子為SV40啟動子、CaMV35S啟動子、ubiquitin啟動子或藻類自身fcp啟動子等；其中選擇標記基因-選擇壓力組合為cat基因-氯黴素、hpt基因-潮黴素或bar基因-草丁膦。
與現有技術相比，本發明屬全面的創新，具有如下有益效果1、本發明在所用轉化方法上，採用的基因槍法雖然是適用範圍廣且可實現透過細胞壁轉化的通用方法，但本發明首創性地將大型海藻的孢子作為基因槍新的應用領域。
2、本發明在載體元件上，廣泛試驗並驗證了多種高等植物來源及微藻來源啟動子在大型海藻中的有效性，極大拓展了大型海藻中可應用啟動子的範圍。
3、在所用轉化受體上，本發明採用大型海藻孢子作為轉基因的受體以獲得純系轉基因大型海藻是本發明的第二個獨創之處。很多可人工栽培的大型海藻都建有孢子階段的純培養種質庫，如海帶、裙帶菜的雌、雄配子體，紫菜的絲狀孢子體，從單個孢子細胞生成新植株的技術也已具備，從而為海藻孢子介導轉化方式的實施提供了可靠的材料來源。
4、在篩選標記方面，本發明的實驗證明大型海藻中海帶、裙帶菜對氯黴素敏感，對潮黴素更加敏感，對草丁膦極敏感，採用三種可行的選擇標記基因-選擇壓力組合(cat基因-氯黴素、hpt基因-潮黴素、bar基因-草丁膦)是本發明的又一技術特點。
5、本發明能實現外源基因的穩定表達，lacZ報告基因轉化海帶雄配子體，在受精發育的二倍體孢子體中檢測到轉化率最高可達50％，表達率可達30％。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明的方法及該方法所達到的效果作進一步詳細說明。
實施例1用報告基因實證對海帶雌配子體有效採用fcp啟動子(來自海洋硅藻的墨角藻黃素葉綠素a/c結合蛋白基因)-GUS報告基因質粒，基因槍法轉化海帶雌配子體，在孤雌生殖的海帶孢子體中檢測到GUS基因的穩定表達。具體工藝流程如下
1.基因槍微粒子的製備稱取60mg金粉(美國Bio-Rad公司基因槍配套耗材，直徑1.0μm)，加入1ml無水乙醇，劇烈振蕩1分鐘；10000轉/分離心10秒，除去上清液；加入1ml無菌水重新懸浮、離心分離去上清液，共重複3次，最後將金粉懸浮於1ml無菌水中，按每份50μl進行分裝，4℃存放備用。
轉化時取1份(1份是50μl)轉移到1.5ml離心管，連續振蕩過程中依次加入5μl DNA(1μg/μl)、50μl CaCl2(2.5mol/L)、20μl亞精胺(0.1mol/L)，振蕩3分鐘；10000轉/分離心10秒，棄上清液；250μl乙醇漂洗，離心去上清，重複1次；60μl無水乙醇重懸金粉。
2.海帶雌配子體的轉化轉化前1-2天，取2片無菌載玻片輕柔對磨海帶絲狀雌配子體，使其鬆動散開並斷裂，至鏡檢每段配子體不超過5個細胞；用血球計數板計數，遮光恢復培養備用。轉化時用圓形無菌篩絹(400目，直徑4cm)做為靶細胞的承載體，將雌配子體均勻平鋪於中央，形成直徑約2cm的圓形有效轟擊範圍，作為樣品。每個樣品轟擊一次，每次轟擊約用12μl金粉懸浮液，轉化1.0×106雌配子體細胞。
轉化用高壓氦氣式基因槍(型號PDS1000/He)為美國Bio-Rad公司產品，轟擊過程在無菌室或超淨臺中進行；操作臺面、基因槍表面及內部均用70％乙醇擦拭消毒，轟擊用耗材為可裂膜(Rupture disk)、DNA載片(Macrocarrier)與阻擋網(Stopping screen)，預先在70％無水乙醇中浸泡20分鐘，紫外燈下晾乾待用；轉化參數為受體細胞距離阻擋網6.0cm，真空度28(英寸汞柱)。
另設用不含質粒DNA的金粉轟擊的對照組，操作方法相同。
3.轉化後的培養轉化後，將轉化組和對照組的海帶雌配子體轉入含鐵海水培養基(消毒海水配製，含NaNO30.71mmol/L；KH2PO40 0.032mmol/L；檸檬酸鐵0.0019mmol/L；VB120.5μg/L)，培養溫度10.0±0.5℃，光暗周期10h/14h，光強約為100μmol·m-2·s-1；孤雌生殖海帶出苗後仍採用該培養基培養、同樣培養條件，每周更換一次。
4.GUS基因的整合與表達檢測採用標準的組織化學原位染色方法在孤雌再生海帶孢子體中檢測到GUS基因的表達，PCR擴增得到陽性結果，提示GUS基因已發生整合。而用不含質粒DNA的金粉轟擊的對照組未檢測到基因表達。
其中外源基因是指轉化受體生物以外來源的基因，既包括用於轉化體系建立的報告基因，還包括編碼特殊功能蛋白質或多肽的基因，如疫苗、抗體等蛋白藥物基因；本實施例中外源基因採用一種報告基因；啟動子是指一段特殊的核苷酸序列，驅動外源基因的表達。
實施例2用報告基因證明對海帶雌雄配子體都有效(實施例1與2是孢子介導的方法學證明)
採用SV40啟動子-lacZ報告基因質粒，用基因槍法分別轉化海帶雌、雄配子體，在受精發育的海帶二倍體孢子體中檢測到lacZ基因的穩定表達。
轉化微粒子的製備及轉化操作同實施例1，海帶雌、雄配子體的製備過程相同，具體參照實施例1中步驟2。其他步驟為3.轉化後的培養轉化後，將轉化組和對照組的海帶雌配子體轉入含鐵海水培養基，營養鹽配方及培養條件同實施例1，分別取未轉化的雌配子體與轉化的雄配子體等量混合，取未轉化的雄配子體與轉化的雌配子體等量混合；二倍體海帶幼孢子體出苗後仍採用該培養基培養、同樣培養條件，每周更換一次。
4.lacZ基因的整合與表達檢測採用標準的組織化學原位染色方法在兩種途徑生成的海帶二倍體幼孢子體中均檢測到lacZ基因的表達；其中，雄配子體途徑的轉化率為50％，表達率(陽性個體中的染色面積佔葉片總面積的百分比)約30％，較雌配子體途徑(轉化率20％，表達率4-5％)有很大提高，同時雄配子體途徑中1.9％的個體表現為均一性表達，提示lacZ基因的整合發生在單細胞階段。PCR擴增得到陽性結果，提示lacZ基因已發生整合。
實施例3延伸到應用，同時使用了外源基因與選擇標記基因採用SV40啟動子-cat選擇標記基因-HBsAg基因(編碼B肝病毒表面抗原)質粒，基因槍轉化海帶雄配子體，經氯黴素篩選，在受精發育的海帶二倍體孢子體中檢測到HBsAg基因的穩定表達。
其中轉化微粒子的製備、海帶雄配子體的製備及轉化操作同實施例1，轉化後的培養同實施例2。其他步驟為3.氯黴素的篩選轉化後，當受精發育的海帶二倍體孢子體體長達到約2cm時進行氯黴素篩選。向滅菌燒杯中加入海帶、N-P營養海水和氯黴素，氯黴素濃度按梯度增加，1-2天為20μg/ml，3-7天為50μg/ml，每天更換一次篩選培養液。
4.HBsAg基因的整合與表達檢測應用定量ELISA方法對總共38個樣品進行HBsAg定量檢測，陽性率為34.21％，即在13株轉基因海帶二倍體幼孢子體中檢測到表達，平均表達量約為0.465μg/(mg可溶性蛋白)，最高表達量約為1.2μg/(mg可溶性蛋白)。PCR擴增得到陽性結果，提示HBsAg基因已發生整合。
5.轉HBsAg基因海帶的應用有研究表明口服免疫的疫苗用量與注射免疫用量相差不大，一個成人的B肝疫苗注射量為15μg，只相當於約2.5g轉基因海帶鮮重的表達水平，提示應用本發明技術獲得的轉基因海藻具有較高的應用潛力。
篩選標記，也可稱為選擇標記基因，特指一種抗生素或除草劑的抗性基因，攜帶標記(即獲得成功轉化)的植物會在相應的抗生素或除草劑壓力下表現抗性而存活，未攜帶標記的植物則會死掉以達到篩選的目的；本實施例中的外源基因是疫苗基因，選擇標記基因是cat基因。
實施例4延伸到應用，同時使用了外源基因與選擇標記基因採用SV40啟動子-hpt選擇標記基因-防禦素基因質粒，基因槍轉化海帶雌配子體，經潮黴素篩選，在存活的孤雌生殖海帶孢子體中PCR檢測到防禦素基因的整合。
其中轉化微粒子的製備、海帶雌配子體的製備、轉化操作及轉化後的培養同實施例1，不同步驟是潮黴素的篩選。轉化後，當孤雌生殖海帶孢子體的體長達到約1-2cm時進行潮黴素篩選。向滅菌燒杯中加入海帶、N-P營養海水和潮黴素，潮黴素濃度為50μg/ml，每星期更換一次篩選培養液。
實施例5用報告基因證實在裙帶菜中有效採用SV40啟動子-lacZ報告基因質粒，基因槍分別轉化裙帶菜雄配子體，在雄配子體絲狀體及受精發育的裙帶菜二倍體孢子體中均檢測到lacZ基因的穩定表達。
其中轉化微粒子的製備、裙帶菜雄配子體的製備及轉化操作同實施例1，轉化後的培養同實施例2；採用標準的組織化學原位染色方法在裙帶菜雄配子體及二倍體幼孢子體中均檢測到lacZ基因的表達。其中，在幼孢子體中的表達率接近70％，PCR陽性結果提示lacZ基因已發生整合。
本發明所述功能性外源基因還可以為藻膽蛋白基因、生長因子基因、抗體基因或抗菌肽基因等；所述抗性基因亦為bar基因；所述抗生素亦為除草劑草丁膦；所述的啟動子也可採用CaMV35S啟動子或ubiquitin啟動子等；其中選擇標記基因-選擇壓力組合也可採用bar基因-草丁膦；報告基因還可選用luc報告基因或GFP報告基因等。
權利要求
1.一種生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於將報告性外源基因重組於或將功能性外源基因與抗生素或除草劑抗性基因融合後重組於高等植物或藻類來源的啟動子下遊，構建成轉化用的載體，以大型海藻的孢子為轉化受體，用基因槍將重組後的質粒DNA導入大型海藻的孢子中，經自然發育途徑生成新植株。
2.按照權利要求1所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於採用功能性外源基因途徑生成新植株後可經篩選獲得抗生素或除草劑抗性的轉基因大型海藻。
3.按照權利要求1或2所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於所述功能性外源基因是藻膽蛋白基因、生長因子基因、抗體基因、疫苗基因、防禦素基因或抗菌肽基因。
4.按照權利要求1或2所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於所述的啟動子為SV40啟動子、CaMV35S啟動子、ubiquitin啟動子或藻類自身fcp啟動子。
5.按照權利要求1或2所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於所述抗性基因是cat基因、hpt基因或bar基因。
6.按照權利要求1或2所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於所述抗生素為氯黴素或潮黴素。
7.按照權利要求1或2所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於所述除草劑為草丁膦。
8.按照權利要求1或2所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於所述的轉化方法是直接轉化方法中的基因槍法或電擊法。
9.按照權利要求1或2所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於其中選擇標記基因-選擇壓力組合是cat基因-氯黴素、hpt基因-潮黴素或bar基因-草丁膦。
10.按照權利要求1所述生產轉基因大型海藻的方法，其特徵在於其中所述報告基因為GUS報告基因、lacZ報告基因、luc報告基因或GFP報告基因。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一種生產轉基因大型海藻的方法。它將報告性外源基因重組於或將功能性外源基因與抗生素或除草劑抗性基因融合後重組於高等植物或藻類來源的啟動子下遊，構建成轉化用的載體，以大型海藻的孢子為轉化受體，用基因槍將重組後的質粒DNA導入大型海藻的孢子中，經自然發育途徑生成新植株；採用功能性外源基因途徑生成新植株後可經篩選獲得抗生素或除草劑抗性的轉基因大型海藻。採用本發明能實現外源基因的穩定表達。
文檔編號C12N15/82GK1524955SQ0311106
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月26日 優先權日2003年2月26日
發明者秦松, 姜鵬, 於道展, 李富超, 孫國瓊, 秦 松 申請人:中國科學院海洋研究所