核苷酸同質實時試驗的製作方法

2023-06-09 04:47:36 4

專利名稱：核苷酸同質實時試驗的製作方法
背景技術：
分子生物學全領域的最新進展使得檢測具有臨床和商業重要性的特定基因成為可能。利用核酸雜交試驗作為研究工具，檢測和鑑定完整的DNA、DNA混合物或DNA片段混合物中的一段獨特的脫氧核糖核酸(DNA)序列，使得在基因水平上診斷人類疾病成為可能。
檢測特定基因序列最常用技術依據的是雜交試驗。用可檢測標記(典型的是放射性標記(同位素)或化學修飾(非同位素))標記特定的核苷酸序列或探針。將可檢測標記與所研究的核酸樣品結合，所述樣品可以是原位完整細胞的一部分，也可以是已分離的DNA或RNA片段。雜交條件應該是這樣的允許探針與其互補的靶DNA或RNA形成特定的雜交體，但不結合非互補DNA或RNA分子。目標樣品序列可以游離在溶液中，也可以固定在固相基質上。探針的可測標記為確定雜交是否發生提供了手段，也即可以檢測到靶DNA或RNM。
核酸雜交試驗系統中所用的檢測方法能夠區別和靶核酸序列雜交的探針與非雜交探針。應用最早且最廣泛的方法叫做Southern印跡濾膜雜交試驗。該試驗通過分離靶核酸並將其固定到固相膜載體(尼龍、硝酸纖維素等)而進行。將與膜結合的靶核酸置於變性條件下(加熱或鹼處理)，然後用含有標記探針的溶液處理，在一定條件下使標記探針與其互補靶序列雜交，所述條件加強了標記探針與其互補靶序列結合的特異性。然後洗去未雜交的標記探針，用對標記類型具有特異性的方法檢測雜交的標記探針，即用同位素標記的探針檢測要使用X光膜片和放射性自顯影方法。
用非同位素或化學物質(例如高能轉移螢光團)標記的探針及其用途和在免疫螢光試驗中的檢測方法可參見美國專利Nos.3,996,345；3,996,943；4,160,016；4,174,384和4,199,559，本文全面引用和參考了其中內容。上述專利適合於樣品經激發而發出螢光和使用化學物質(猝滅劑)吸收部分光能的試驗。
歐洲專利出版物No.70,685說明了非輻射能轉移探針在同質(homogeneous)核酸診斷試驗中的設計、檢測和應用。該技術使用了兩條與靶DNA毗鄰序列雜交的探針。在探針的3』端和5』端連接化學發光部分和吸收劑/發射體部分，因而，當探針雜交時，這些部分靠得足夠近而能夠發生非輻射能轉移。靶DNA的存在令探針雜交並發射出專門針對吸收劑/發射體部分波長的輻射。
自動化核酸寡核苷酸(核糖核酸或脫氧核糖核酸)合成，和DNA擴增的聚合酶鏈反應(PCR)法的最新進展提高了核酸雜交試驗的強度和靈敏度。Alvarado-Urbina等在《科學》(Science,214:270,1981)中充分說明了自動化化學核酸合成儀合成短基因片段(DNA和RNA)的應用。自動化合成儀提高了將特殊部分摻入短基因片段的效率，所述的特殊部分在探針上起著可檢測標記和猝滅劑的作用，用於從活生物體或病毒顆粒中檢測和分離所需的天然基因。短基因片段還可以在PCR和逆轉錄(RT)試驗中用作引物，從而能擴增或拷貝天然基因攜帶的遺傳信息。
DNA片段的PCR擴增方法可參見Mullis和Faloona,Methods in Enzymol.Vol.155,pg.335(1987)。PCR技術上的改進可參見美國專利Nos:4,683,202；4,683,195和4,800,159，本文全面引用和參考了其中內容。PCR是一種酶法合成特定DNA序列的體外方法，它利用兩條脫氧核苷酸引物，所述引物與相對鏈雜交並向兩側延伸需要擴增的特定靶DNA區。使用自動熱循環儀可以進行一系列重複的反應步驟，其中包括模板變性、引物退火和依賴於DNA聚合酶的退火引物的延伸，最終造成特定DNA靶區的指數性累積，所述靶區域的末端由引物的5』端界定。Saiki等在《科學》(Science,230:1350,1985)中對選擇性富集某特定DNA序列的靶區段達109倍作了說明。
逆轉錄是分子生物技術中的常用技術，為了製備cDNA文庫用於以特定的RNA序列體外合成單鏈互補DNA(cDNA)，或者用於合成以後擴增反應(即PCR)中所用的第一條cDNA鏈。用逆轉錄合成cDNA可參見Maniatis等，《分子克隆實驗室手冊》Molecular Cloning,A Laboratory Mannal,pg.811(1989)。逆轉錄酶是一種蛋白質，它延伸與單鏈RNA的特定互補序列退火結合的脫氧寡核苷酸引物的3』末端。對逆轉錄酶的修飾可合成更長的cDNA並提高產量，可參見美國專利5,244,797，本文全面引用並參考了其中的內容。
單用PCR技術和將其與RT反應聯用就擴增核酸序列而言是極其有效的方法，但是對擴增物質的檢測可能需要對PCR產物進行附加操作和後續處理，以確定靶DNA區段是否存在。例如，去除沒與靶序列接觸的標記探針使得典型的雜交試驗大大複雜化。更有用的探針技術應當儘可能減少目前為檢測擴增物質所需的附加處理步驟。理想的是，這樣的技術將擴增反應與檢測步驟合併在同一同質系統中，因此在信號檢測前不再需要擴增後分離與靶接觸探針和未與靶接觸探針。這樣的同質系統允許對信號重複檢測，由此允許進行擴增過程的動力學分析。
動力學分析提供的優點明顯超出單次終點分析。例如，通過揭露假陽性或其它定量錯誤對信號發展過程的定性評價可以大大提高擴增系統的精確性。但是，因為探針可能干擾擴增作用，同質探針系統的設計因此而受到制約。例如在PCR中，聚合酶的持續合成能力絕不應被存在的下遊探針所阻斷。
本文全面引用並參考的美國專利5,210,015和5,487,972說明了這樣的核酸檢測方法，它依賴於核酸聚合酶的5』至3』核酸酶活性來切割退火的標記DNA探針，由此釋放出可供檢測的標記寡核苷酸片段。Livak等在PCR Methods andApplications,4:357(1995)中說明了對該技術的改進，即在寡核苷酸探針的5』和3』端連接一報導螢光染料和一猝滅螢光染料。當聚合酶沿靶DNA序列向3』端方向移動時，其5』端核酸酶活性先置換然後切下寡核苷酸探針，將報導劑與猝滅劑分離。這樣，通過檢測報導染料的螢光就可以測定靶DNA序列的存在。
上述試驗都依賴於聚合酶的5』核酸酶活性，這對可用探針的設計造成了極大的制約。例如，標記必須與DNA連接，而且探針必須設計成能夠從5』端被切下。然而，因為要求同一酶同時行使其聚合酶和核酸酶活性，所以不可能對兩種過程獨立地進行選擇和優化。
現有的可替代以PCR為基礎的試驗方法依靠靶序列產生信號的放大，而不是直接擴增靶序列。這些方法需要一些重要的處理步驟，而且針對終點分析，與對靶序列存在的動力學實時(real time)檢測正相反。
例如，本文全面引用並參考的美國專利4,876,187和5,011,769,Duck等，BioTechniques,9:142(1990)和Bekkaoui等，BioTechniques,20:240(1996)公開了一種循環探針法，它使用含RNA，最好是含DNA:RNA:DNA嵌合體的探針。該反應在能令嵌合探針與靶DNA退火結合的溫度下等溫進行。使用諸如RNase H等酶來消化探針的RNA部分，產生在反應溫度下解離的較短的標記寡核苷酸。然後，將得到的靶DNA序列與另一探針雜交，在多輪循環後，就可生成足夠多的標記以供收集和檢測。總之，這些方法依賴於標記物某部分的固定化，以便進行相分離和信號的回收與檢測。Bekkaoui等報導了該技術的改進，涉及形成RNase-鏈黴親和素融合酶及其與生物素醯化探針的聯用。鏈黴親和素與生物素的結合將融合酶帶至探針附近，由此提高其RNase活性。但是，一旦所連的探針被切除，酶即失去功能，防礙其參與其後的循環。
上述信號放大法並不產生實時信號，因為在釋放出檢測所需的足量標記之前需要多輪循環。而且，該技術是設計用來替代常規靶擴增法的，而且要求等溫條件。但是，這些方法依賴於相分離來檢測標記，所以並不針對同質系統。而且，探針設計的選擇受到局限，因為聚合酶的核酸酶活性會攻擊嵌合探針的DNA部分，而產生假信號。
所以，目前仍然需要能夠採用更多樣化的探針設計，對核酸擴增進行實時同質檢測的方法。發明概述本發明包括檢測樣品中靶DNA序列的方法，它包括a)令標記探針與具有與探針互補區域的靶單鏈DNA序列接觸並退火；b)用能夠水解雙鏈RNA:DNA雙螺旋體中的核糖核苷酸的核糖核酸酶進行切割，釋放標記的探針片段；c)對釋放出的標記片段測序，以對靶DNA序列進行動力學特性分析。該試驗同質地在單一反應混合系中進行。
較好的是，將該試驗與靶DNA序列的擴增(例如用PCR)聯用。在這類實施方案中，所述方法包括a)提供所含序列與靶DNA序列中某些區段互補的引物，引物各自能夠引發一條互補寡核苷酸的合成，使得引發所得的互補寡核苷酸能夠作為模板，以合成由另一引物引發的互補寡核苷酸；b)提供所含序列與靶DNA序列某部分互補的標記探針；c)通過如下循環步驟用聚合酶鏈反應擴增靶DNA序列，所述步驟為ⅰ)令標記探針與靶DNA序列接觸並退火，ⅱ)退火第一和/或第二引物，ⅲ)用核糖核酸酶切割退火探針中的RNA，釋放出標記的核糖寡核苷酸片段，ⅳ)用聚合反應試劑延伸引物，和ⅴ)令已延伸的引物和靶DNA序列變性；和d)對釋放出的標記片段測序，以便對靶DNA序列的擴增進行動力學特性分析。
在另一較好的實施方案中，所述方法包括使用一端具有報導螢光染料而另一端具有猝滅螢光染料的標記探針，而檢測標記核糖寡核苷酸片段釋放的步驟包括測定報導劑螢光度。在退火探針被切除之前猝滅劑抑制報導劑的螢光，使得能夠區分開與靶接觸的探針和不與靶接觸的探針。
本發明方法能夠在一同質的實時系統中檢測靶DNA序列。當與靶DNA擴增反應聯用時，該方法提供了不依賴於聚合酶活性的探針釋放，並為探針的設計提供了極大的靈活性。而且，與現有的終點試驗不同，本發明的動力學檢測方法允許進行實時分析。附圖簡要說明

圖1代表了本發明實施方案之一中隨靶DNA擴增觀察到的報導劑螢光的增加。本發明的詳細說明定義術語「樣品」或「標本」指自個體或任何含核酸物體分離的核酸，其來源包括但不限於皮膚、血漿、血清、髓液、淋巴液、滑囊液、尿液、眼淚、血細胞、器官、腫瘤、體外細胞培養物、細菌和病毒。
本文用的名詞，「核酸」、「聚核苷酸」和「寡核苷酸」指引物、探針、待測寡聚片段、寡聚對照和非標記的阻斷性寡聚物，而且廣義的應包括聚脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)，聚核糖核苷酸(含D-核糖)，以及嵌合的聚核苷酸(含2-脫氧-D核糖和D-核糖核苷酸)，和任何其它類型的聚核苷酸，即那些嘌呤或嘧啶鹼基、或修飾過的嘌呤或嘧啶鹼基的N糖苷。「核酸」、「聚核苷酸」和「寡核苷酸」之間不存在對長度差異的考慮，這些詞是混用的。所以，這些術語包括雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA。寡核苷酸由至少8個核苷酸的序列構成，以至少10至12個為宜，至少15至20個則更好，這些核苷酸與指定核苷酸序某列區域相鄰接。「鄰接」(coterminous)指與確定的序列相同或互補。
寡核苷酸不限於現有或天然序列通過物理方法衍生分離得到，也可以用各種方法產生，包括化學合成、DNA複製、逆轉錄或以上方法的聯用。「寡核苷酸」或「核酸」指來源為基因組DNA或RNA、cDNA、半合成或合成的聚核苷酸，由於衍生或處理，它們(1)全部或部分地不屬於天然情況下與之相關的聚核苷酸；和/或(2)與天然與之連接的聚核苷酸以外的聚核苷酸連接；和(3)非天然的(即自然中不存在的)。
寡核苷酸是由核苷酸單體反應構成的，使得寡核苷酸呈以下方式即一個單核苷酸戊糖環的5』磷酸通過一磷酸二酯鍵以同一方向與相鄰單核苷酸戊糖環的3』氧連接，如果5』磷酸沒有連接另一單核苷酸戊糖環的3』氧，則稱寡核苷酸的這一端為「5 』末端」，相應的，如果3』氧沒有連接後一單核苷酸戊糖環的5』磷酸，則稱寡核苷酸的這一端為「3』末端」。一段核酸序列，即使它包含在一段更長的寡核苷酸之內，仍可以說具有5』端和3』端。兩條不同且不交迭的寡核苷酸退火結合於同一線性互補核酸序列的兩個不同區段，使得一條寡核苷酸的3』末端正對另一條的5』末端，則稱前者為「上遊」寡核苷酸，而後者為「下遊」寡核苷酸。總之，「下遊」指單鏈寡核苷酸上位於3』方向的位置，或者在雙鏈寡核苷酸中，則指參照核苷酸鏈3』方向上的位置。
術語「引物」指一個以上自然分離的(例如經純化的限制性消化)或合成產生的寡核苷酸。引物必須能夠起到合成引發點的作用，即置予反應條件下引發沿一條互補鏈(DNA或RNA)的合成反應，在所述條件下合成的引物衍生產物與該核酸鏈互補。這樣的反應條件包括存在4種不同的三磷酸脫氧核苷酸和諸如DNA聚合酶或逆轉錄酶之類的聚合反應誘導劑。反應條件包括在最適溫度下使用相容性緩衝液(包括輔因子、或影響pH及離子強度等的成份)。為了在擴增反應中達到最大效率，引物最好是單鏈的。
互補核酸序列指這樣的寡核苷酸，即在將核酸序列排齊時，一個序列的5』端與另一序列的3』段互配。這樣的聯合稱為「反平行」。天然核酸中一般不存在的修飾鹼基類似物，可以(經酶反應或合成)加入到以下核酸中，包括但不限於本發明的引物、探針或延伸產物中，而且可以包括(例如)肌苷和7-脫氮鳥嘌呤。兩條核酸鏈的互補性也許不是完美的；有些穩定雙螺旋可以包含錯配的鹼基對或非配對的鹼基，核酸技術領域的熟練技術人員可以通過考慮一些變化來推定其穩定性，所述變化包括寡核苷酸的長度、離子強度、pH和錯配鹼基對的數量、頻度和位置。核酸雙螺旋體的穩定性通過熔解或解離溫度或「Tm」來測定。特定核酸在特定反應條件下的Tm是半數鹼基對解離的溫度。
本文所用的術語，「靶序列」或「靶核酸序列」指寡核苷酸中有待擴增、檢測或即擴增又檢測的一段區域。靶序列位於擴增所用的兩引物序列之間，或者是逆轉錄的單鏈cDNA產物。靶序列可以無然地衍生於樣品或標本，或者是合成生產的。
本文，「探針」包括這樣一段核糖寡核苷酸，由於該核糖寡核苷酸的至少一段序列與靶區域內的一段序列互補，其與靶核酸序中的一段序列形成雙螺旋結構。探針不宜含有與引發聚合酶鏈反應(PCR)或逆轉錄(RT)反應所用序列互補的序列。探針可以是嵌合的，即，部分地由DNA構成。當使用嵌合探針時，由DNA部分構成的探針3』端一般是被封閉的，以防探針摻入引物衍生產物中。在最後一個脫氧核糖核苷酸鹼基的3』羥基上添加生物素、螢光素、羅丹明甚至一個磷酸基團之類的化學部分即可以起到3』末端封閉基團的作用，在特定情況下還可以起到可測標記或猝滅劑的作用。而且，探針可以摻有修飾過的鹼基或修飾過的鍵，從而更大程度地控制雜交、聚合或水解。
術語「標記」指可用來提供可檢測(以可定量為佳)實時信號的任何原子或分子。可檢測標記可以與核酸探針或蛋白質連接。標記通過以下途徑提供可被測到的信號螢光、磷光、化學發光、放射性、比色(ELISA)、X光衍射或吸光度、磁性、酶活性，或者以上的組合。
術語「吸收劑/發射劑部分」指這樣的化合物，它能夠吸收一定波長的光能同時發射另一波長的光能。這包括磷光性和螢光性部分。選擇吸收劑/發射劑對的要求是(1)它們應當易於使得探針具有功能並與之偶聯；(2)吸收劑/發射劑對絕不能阻礙功能化探針與其互補核酸靶序列的雜交；(3)最後的發射(螢光)應儘可能充分，而且延續足夠長的時間以便所述領域技術人員能夠測知和衡量；(4)使用相容性猝滅劑應足以消除任何後繼發射。
在此應用中，「實時」指對信號產生的動態檢測，包括在一段時間內讀取大量數據來對信號進行特性分析。例如，實時測定可能包括對可檢測產物增加速度的測定。或者，實時檢測可能包括對靶序列擴增達可測水平之前所需時間的測定。
術語「化學發光劑和生物發光劑」包括參與發光反應的部分。化學發光部分(催化劑)包括過氧化物酶、細菌螢光素酶、螢火蟲螢光素酶、功能化離子-卟啉衍生物，及其它。
本文，「核酸酶活性」指模板特異性核糖核酸酶，即RNase H的活性。本文術語「RNase H」指這樣一種酶，它特異性地降解DNA/RNA雜交體的RNA部分。該酶不切割單鏈或雙鏈的DNA或RNA，而且，在典型的PCR所用溫度下可以獲得保留活性的熱穩定性雜交體。總之，當探針與靶DNA序列退火後，該酶即發揮其核酸酶活性，憑此去除所形成的RNA-DNA雙體中的核糖核苷酸或切除核糖寡核苷酸。
本文術語，「熱穩定的核酸聚合酶」指這樣一種酶，它與大腸桿菌的核苷酸聚合酶相比，對熱相對穩定，並催化核苷的聚合反應。總之，該酶將在與靶序列退火的引物的3』端開始合成，並向5』端的方向沿模板進行延伸。
「雜交或反應條件」指允許標記探針與其互補的靶核酸序列選擇性雜交的試驗緩衝液條件。這些條件是這樣的，探針與靶核酸序列的特異性雜交反應得到優化，同時不限制PCR試驗中靶核酸的擴增。反應條件的優化是對輔因子、離子強度、pH和溫度而言。
通用方法除非另有指明，本發明的實施採用了分子生物學、微生物學的標準技術和重組DNA技術，這些都屬於本領域的技術範疇。
本發明的各種條件利用了RNase H的特性。RNase H是一種已知的降解RNA-DNA雜交分子中RNA部分的酶。RNA:DNA雙螺旋因其特定的二級結構而成為RNase H的底物。所以，RNase H沿RNA:DNA雙螺旋的長度發揮活性而無位置限制，所以並不局限於兩個末端。RNase H將從雙螺旋上切割單核糖核苷酸或小核糖寡核苷酸片段，使之不穩定，以致於它們從較大的互補聚核苷酸(DNA)上脫離。這樣，切割作用不依賴於5』末端的特性。這一特性為設計合適的探針提供了更大的靈活性。
在單用和與PCR聯用時，本發明利用了RNase H的核糖核酸酶活性。本發明不同於以往所述的PCR擴增反應，以往是對PCR擴增後的靶核酸序列進行檢測(例如通過探針在嚴謹雜交和洗滌條件下與靶序列雜交形成穩定雙螺旋體)。與已知的PCR擴增後所用的檢測方法不同，本發明允許在靶核酸序列的擴增過程中檢測靶核酸序列。本發明中，在PCR開始時，標記探針與PCR引物和RNase H同時加入。所用的反應條件使標記探針與靶核酸序列雜交，這就允許RNase H發揮活性在PCR引物退火和DNA聚合酶延伸作用之前切割和解離標記的探針片段。探針的標記核糖核苷酸片段被水解(切割)和釋放而產生信號，提供了在擴增過程中檢測靶核酸序列的手段。
本發明的方法也易於適應其它核酸系統。例如，自身持續序列複製(3SR)同質試驗和連接酶鏈反應(LCR)系統都屬於本發明範圍之內。
在本發明中，探針上連有標記，使得因RNase H核酸酶活性切割下的單核糖核苷酸或小核糖寡核苷酸能夠被檢測到。可用數種方法來將未切割的標記核糖(-或嵌)合寡核苷酸探針與切割下的標記探針片段區分開來。本發明的這一特徵使得能夠鑑定出含有與核糖(-或嵌合)寡核苷酸探針互補序列的含核酸樣品或標本。
在本發明中，提供懷疑含有特定的所研究的「靶核酸序列」的樣品或標本。樣品中的靶核酸如果被分離成單鏈RNA，可以先逆轉錄(RT)成cDNA，或者可以分離成雙鏈基因組DNA。該cDNA或基因組DNA然後採用本領域技術人員熟知的合適的變性方法(包括物理、化學和酶方法)變性。鏈分離的物理方法包括加熱核酸直至變性完全。典型的熱變性涉及使用介於80℃至100℃之間的溫度3至10分鐘。靶核酸可能以單鏈形式存在於樣品中，例如，單鏈RNA或DNA病毒，而且，可能只需適度加熱以減少二級結構摺疊的恢復。
變性核酸鏈然後在雜交或反應條件下，與預選的寡核苷酸引物和探針一起孵育，所述條件可令引物和探針與單鏈核酸結合。對引物的選擇使其沿雙螺旋序列的相對位置令一個引物產生的延伸產物成為另一引物延伸的模板，由此，當延伸產物在隨後的變性條件下與其(互補)模板分離時得到長度確定的複製鏈。
因為合成的互補核酸鏈比探針或引物都長，所以它們具有更多的接觸點，因而有更大機會在給定時間內彼此尋找配對。為了防止較長模板的重退火，使用了高摩爾數過量的探針和引物來幫助雜交動力學偏向引物和探針的退火而不是模板的退火。
引物的長度必須足以在反應條件下引發延伸產物的合成。引物的長度和組成取決於諸多因素，包括反應溫度、引物的組成、探針退火位點相對引物退火位點的位置、以及引物與探針的濃度比。根據靶序列的複雜性，寡核苷酸引物一般包含15至30個核苷酸，雖然也可以含有更多或更少的核苷酸。引物必須具有足夠的互補性，可與其對應鏈選擇性地退火形成穩定的雙螺旋。所用的引物要選擇與待擴增各具體序列不同鏈完全互補的。本領域的熟練技術人員可能選用或設計5』端具有非互補序列(例如限制性酶切序列)的引物，但是3』端必須保持其互補性以確保由DNA聚合酶物進行的適當延伸和擴增。
在實施本發明時，標記探針必須先於引物退火之前與其互補的靶核酸鏈退火。RNase H的活性必須超過DNA聚合酶的活性，從而使得切割的探針片段從靶核酸上解離下來，不至於幹擾引物延伸和核酸靶區域的擴增。
為了確保標記探針在引物延伸聚合反應到達該雙螺旋區域之前與其互補的核酸退火，可以使用多種方法。與過去僅限於DNA寡核苷酸探針的原有技術相對比，本發明在這一特性上作了明顯優化。已知，RNA:DNA雜交體比鹼基組成相同的DNA:DNA或嵌合DNA雜交體具有更高的熔點，這就使得它們可具有更高的特異性。還已知，互補核酸的長度也影響著雜交速度和雙螺旋的相對穩定性。核酸分子越短，與靶核酸形成足夠穩定的雜交複合物通常需要的溫度越低。所以，可將探針設計得比引物長，這樣，在高於引物退火溫度的溫度下，標記探針優先與靶序列退火。而且，與DNA:DNA雜交體相比，加入甲醯胺之類變性溶液可以優化RNA:DNA雜交體的結合溫度。
也可以改變引物和探針的鹼基組成來影響熱穩定性。例如，可以選用核苷組成上G/C含量較高的探針，結果，其熱穩定性強於引物。本領域技術人員由此可以用熱循環參數來利用標記探針和引物的不同熱穩定性。在熱循環中的變性步驟之後，可以使用一中間溫度允許探針退火和RNase H的切割，但是不允許引物的結合，然後降低溫度允許引物退火和DNA聚合酶的延伸反應。
在某些實施方案中，可能需要提供與不同靶序列互補的第二探針。這樣的探針應具有產生獨自可測信號的標記。根據以上技術，可以將探針設計成具有不同但相容的熔點。
為了確保標記寡核苷酸先於引物結合，還可以使用比引物摩爾濃度高而且過量的標記核糖-或嵌合寡核苷酸探針。所述的探針濃度約高於相應的引物濃度5至25倍，一般為0.5-5×177M。
寡核苷酸引物和標記探針可利用多種方法製得。製備特定序列的寡核苷酸(脫氧的、核糖的和嵌合的)的方法是本領域眾所周知的，包括例如，克隆和序列適當的限制性酶切、定向自動化化學合成法和酶法。這些技術包括例如磷酸三酯法、磷酸二酯法、氨基磷酸二乙酯法和固相載體法。
可設計探針的組成來抑制核酸酶活性。化學合成時在標記探針中摻入修飾的磷酸二酯鍵(即硫代磷酸甲酯或磷酸甲酯)可用來防止在選定位點的切割。根據探針的長度、其5』互補區的組成和標記的位置，可以設計出用於實施本發明的優先產生或短或長的標記探針片段的探針。只要獲得4至6鹼基對的RNA:DNA序列作為RNase H的底物，本發明在探針修飾上就可能具有極大的靈活性。
如下所述，通過摻入可被比色、光化學、生物化學、免疫化學、酶法和化學方法測得的部分對探針作標記。當然，將標記與探針連接或交聯的方法取決於所用標記的種類和在探針上的標記位置，但是總的說來，包括本領域已知的各種合適的連接方法。而且，可以考慮將標記與特定核苷酸連接，即使這樣的連接可能包括一個或多個插入核苷酸。
許多適用於本發明的可檢測標記及其摻入探針的方法是本領域眾所周知的，包括但不限於，酶(例如鹼性磷酸酶和辣根過氧化物酶)和酶的底物、放射性原子、螢光染料、生色團、化學發光或生物發光標記、電化學發光標記、標記的受體與配體結合物、標記的抗體與抗原偶合物，或者能夠相互反應以加強、改變或消除某實時可測信號的任何其它標記。如果用熱循環儀進行PCR，則標記必須能夠承受此自動化過程中所需的循環溫度。
較好的是，可以在同一探針上使用兩種相互作用的標記，但是需保持它們在探針上具有合適的間隔以允許在RNase H切割過程中兩標記可被分離。有時，可能需要使用具有兩個不同標記的單個探針。
在較好的實施方案中，相互反應性標記包括報導劑(例如螢光素)和猝滅劑(例如羅丹明)螢光染料對。各染料分別與探針連接，彼此間隔至少4至6鹼基以為RNase H提供充分的底物。在單鏈狀態下，探針具有足夠的柔韌性使羅丹明以足夠的頻度接近螢光素以猝滅報導劑。但是，當探針與靶核酸序列退火併被RNase H消化後，螢光素與羅丹明分離，從而提高了可檢測報導劑的螢光。可以用合適的方法來測定螢光，包括Taq-Man LS-50B系統(Perkin-Elmer)。
為了在雜交和釋放前儘可能強地猝滅，可以對探針進行多種修飾。例如，報導劑和猝滅劑可以隔開大約10個核苷酸或略少，這樣，不依賴於單鏈探針的柔性也可以發生猝滅。總之，為了優化檢測特性，染料可以接在末端也可以接在中間。或者，可以將探針設計成具有(例如)發卡狀的二級結構，從而在脫離雜交時使報導劑與猝滅劑靠近。在此實施方案中，使用核糖寡核苷酸可能具有很大的優點。RNA所成的二級結構天然地比DNA或嵌合寡核苷酸穩定。所以，可設計出在雜交前以很高的效率猝滅報導劑螢光的探針，從而使試驗系統的背景噪音很低。此外，該技術不可能使用常規的同質試驗系統，因為DNA:DNA發卡可能是核酸酶的底物，因而造成錯誤的標記釋放。
同樣，利用螢光極化作用，可以實現檢測切割下的標記探針的實施方案。根據分子翻滾，該技術能夠區別大的和小的分子。大分子(例如完整的標記探針)在溶液中比小分子翻滾慢得多。將螢光部分與所研究的分子連接，可根據分子翻轉來檢測(和區分)該螢光部分，這樣就可以區分出完整的和被消化的探針。可以用ABI Prism7700序列檢測儀(Perkin-Elmer)在PCR進行時來衡量此檢測作用。
在另一實施方案中使用了兩個標記的核糖-或嵌合寡核苷酸探針，它們各自與某雙鏈靶區段的分開的區域互補，但彼此並不互補。例如，兩個探針可能使得一個標記產生的信號強度加倍，並進一步起到降低PCR擴增中經常發生的產物鏈重退火的作用。
在另一實施方案中，可能宜用(例如)32P的放射性原子來標記和檢測。將32P引入核酸的酶學方法是本領域眾所周知的，包括例如用聚核苷酸激酶標記5』末端，或者用切口翻譯和Klenow片段進行隨機插入。位於3』末端的標記可採用聚核苷酸末端轉移酶來加上所需的部分，例如3-脫氧腺苷35S-ATP和生物素醯化的dUTP。標記可用各種技術與核糖-或嵌合寡核苷酸探針直接或間接連接。根據所用標記的確切種類，標記可以位於探針的5』或3』端，也可以位於探針的核酸序列的中間，或者與各種大小和組成的碳鏈空間臂連接，以利於信號的反應。使用商品化的氨基磷酸酯(phosphoramidite)試劑，可以通過受適當保護的氨基磷酸酯生成兩個末端之一含有功能基團(例如硫醇或伯胺)的寡聚物。可以利用它們對第二底物的活性來檢測酶。
美國專利4,914,210說明了引入寡核苷酸功能化試劑將一個或多個巰基、氨基或羥基部分引入寡核苷酸探針序列(通常是5』末端)的方法。可以利用聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP引入一個5』磷酸基團作為放射性同位素，提供報導基團。通過合成過程中引入氨基胸腺嘧啶殘基與生物素的N-羥基琥珀醯亞胺酯反應，可在5』端加上生物素。
寡核苷酸(DNA和RNA)衍生物也是可用標記。例如，橋亞乙基-dA和橋亞乙基-A已知是螢光腺苷酸，它可以被摻入核糖-或嵌合寡核苷酸探針中。同樣，橋亞乙基-dC是可以用於探針合成的另一類似物。含有這種核苷酸衍生物的探針可以在PCR過程中釋放出強得多的螢光單核苷酸。
寡核苷酸引物依賴於模板的延伸，在足量的4種三磷酸脫氧核糖核苷(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)或上述的類似物存在下，在由合適的鹽、金屬離子和pH緩衝液組成的反應介質中，受聚合劑的催化。合適的聚合劑是已知催化引物和模板依賴性DNA合成並具有5』向3』核酸酶活性的酶。已知的DNA聚合酶包括大腸桿菌DNA聚合酶I，嗜熱棲熱菌(Tth)DNA聚合酶，嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶，濱水熱球菌(Thermococcus littoralis)DNA聚合酶和棲熱水生菌(Tag)DNA聚合酶。用這些DNA聚合酶催化DNA合成的反應條件是本領域眾所周知的。為了適用於本發明，RNase H必須高效切割核糖-或嵌合寡核苷酸探針並釋放出標記片段，由此直接或間接產生信號。
合成產物是由模板鏈和引物延伸鏈構成的雙螺旋分子，其中包括靶序列。該合成反應的副產物是由單體、二體或較大核苷酸片段混合物構成的受標記寡核苷酸片段。重複多輪變性、標記探針和引物的退火，和引物延伸以及標記探針的切割，導致由引物界定的靶區段的指數積累，和標記片段的指數生成。進行足夠次數的循環以獲取可測種類的標記，它們通常比背景信號強幾個數量級。
在較好的方法中，PCR採用熱穩定酶以自動化方式進行。在該過程中，反應混合物通過變性步驟、探針和引物退火步驟和合成步驟進行循環，切割和置換由此與引物依賴性模板延伸反應同時發生。可以使用為使用熱穩定性酶而特別設計的DNA熱循環儀，例如購自Perkin-Elmer/ABI Instruments的設備。
在此自動化過程中以溫度穩定性聚合酶為佳，因為，在PCR循環中，令雙鏈延伸產物變性的較好方法是令它們經受高溫(約95℃)。例如，美國專利4,889,818揭示了一種自棲熱水生菌分離的代表性熱穩定酶。其它代表性熱穩定酶包括，例如從Thermus flavus,Thermus ruber，嗜熱棲熱菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌(其最適溫度略低於所列的其它種類)，Thermus lacteus,Thermus rubens,Thermatoga maritima，濱水嗜熱球菌和Methanothermus fervidus提取的聚合酶。
可用多種方法來完成對標記寡核苷酸片段的檢測和驗證，而且可能根據所用標記的來源不同而不同。本發明一個方便的實施方案是對包括切下所標記片段等反應產物進行大小分析。測定標記核酸片段大小的方法是本領域眾所周知的，其中包括例如凝膠電泳、重力沉降、凝膠排阻層析和同質層析。
擴增期間或之後，可以通過(例如)令PCR混合物與固相萃取劑(SPE)接觸從PCR混合物中分離出標記片段。例如，可以在已標記尚未切割的寡核苷酸被結合而標記片段沒結合的條件下，向PCR混合物中加入根據大小、電荷或與寡核苷酸鹼基反應而能夠結合寡核苷酸的物質。這樣的SPE物質包括交換樹脂或微珠、例如市售的結合顆粒NensorbTM(DuPont Chemical Co.),NucleogenTM(The NestGroup)和羥基磷灰石。在一具體實施方案中，如果使用包含與5』標記相隔一個核酸酶易切位點的3』生物素標記的雙標記探針，作為信號手段，則可將PCR擴增混合物與含有特定結合伴侶(例如親和素或鏈黴親和素，或抗生物素的抗體或單克隆抗體)的物質接觸。這樣的物質包括包被有特定結合伴侶的微珠或顆粒，還包括磁性顆粒。
在PCR混合物與SPE接觸步驟後，可以通過過濾、沉降或磁性引力作用來去除SPE物質，留下不含未切割的標記寡核苷酸的標記片段，可供檢測。
可將本發明方法中使用的試劑裝診斷試劑盒。診斷試劑盒包括分裝在不同容器內的標記寡核苷酸和引物。如果寡核苷酸是非標記的，則試劑盒中還可以包括特定的標記試劑。試劑盒還可以包括擴增所需的其它合適包裝的試劑和材料，例如緩衝液、dTNP和/或聚合用物，檢測分析所需的試劑和物質，例如酶和固相萃取劑，以及進行試驗的說明書。
實施例表1列出了本實施例所用的PCR引物和核糖-寡核苷酸探針的寡核苷酸序列。所選的引物是用來擴增BETA-肌動蛋白基因一個片段的。探針的5』端用6-羧基螢光素(6-FAM)標記，而3』端則用6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)標記。引物和探針是購自Perkin-Elmer的合成商品。
表1．引物和探針的序列SEQ ID NO.1正向引物5』CAC ACT GTC CCC ATC TA3』SEQ ID NO.2反向引物5』GGA ACC GCT CAT TG3』SEQ ID NO.3探針序列5』AUG CCC CCC CCA UGC CAU CCU GCG U3』用GeneAmp PCR系統(Perkin-Elmer)進行PCR擴增，使用50μl反應液，其中包含1X Bicine緩衝液(Perkin-Elmer)、2.5mM Mn(OAc)2、200μMdNTP(Perkin-Elmer)、0-16單位的熱穩定性RNase H(Epicentre Technologies)、1.25單位ΔTth DNA聚合酶(Clonetech)、人雄性DNA(Perkin-Elmer)、400nM的各引物和50nM標記探針。熱循環方案為95℃2分鐘，然後40輪的60℃20秒、45℃1分鐘和95℃15秒。用Taq-Man LS-50B系統(Perkin-Elmer)測定FAM螢光。
圖1顯示PCR循環過程中實時測得的FAM螢光。曲線1代表沒有向反應中加RNase H因而沒有標記釋放時獲得的基線螢光。曲線2至5代表向反應中分別加入1、2、4和16單位RNase H。BETA-肌動蛋白基因片段的擴增通過螢光的實時增加反映出來，直接取決於用於切割探針和釋放標記的RNase H用量。
根據以上優先實施方案對本發明進行了具體的說明。但是，顯而易見的是，本領域熟練技術人員可以在本發明的範圍內進行某些改變和修飾。(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度14(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:
GGA ACC GCT CAT TG 14(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度26(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:
AUG CCC CCC CCA YGC CAU CCU GCGTU 26(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度14(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:
GGA ACC GCT CAT TG 14(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度26(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:AUG CCC CCC CCA YGC CAU CCU GCGT U2權利要求
1．一種檢測樣品中靶DNA的方法，它包括以下步驟a)將探針與樣品接觸並退火，所述探針包含與第一標記連接的核糖寡核苷酸，所述樣品含有靶單鏈DNA序列，所述序列具有與探針互補的區段；b)用核糖核酸酶切割退火探針的至少一條核糖核苷酸，釋放出已標記的核糖寡核苷酸片段，所述核糖核酸酶能夠水解雙鏈RNA:DNA雙螺旋中的核糖寡核苷酸；和c)連續測定標記片段的釋放，從而對靶DNA序列進行動力學特性分析；所述的步驟a)至c)在單一反應混合系中進行。
2．根據權利要求1所述的方法，其中提供探針的步驟包括提供嵌合寡核苷酸。
3．根據權利要求2所述的方法，其中提供探針的步驟包括提供RNA:DNA:RNA寡核苷酸。
4．根據權利要求1所述的方法，它還包括與第二標記連接的核糖寡核苷酸，其中所述的第一和第二標記含有可相互反應的信號產生部分，從而使得標記的連接造成第二標記抑制對第一標記的檢測。
5．根據權利要求4所述的方法，其中的第一標記包含報導劑螢光染料，而第二標記包括猝滅螢光染料，其中測定標記核糖寡核苷酸片段釋放的步驟包括檢測報導劑螢光。
6．根據權利要求5所述的方法，其中的報導劑和猝滅劑相隔至少約10個核苷酸。
7．根據權利要求5所述的方法，其中探針具有二級結構，該結構在探針與靶DNA序列退火前使報導劑和猝滅劑靠得很近。
8．一種檢測靶DNA序列的方法，所述序列包含與第二鏈互補的第一鏈，而且該鏈正經歷擴增反應，所述方法包括以下步驟a)提供第一引物和第二引物，所述第一引物具有與靶DNA序列第一鏈中某區段互補的序列，並能夠引發互補寡核苷酸的合成，所述的第二引物含有與靶DNA序列第二鏈中某區段互補的序列，並能夠引發互補寡核苷酸的合成，從而使得由第一引物引發合成的互補寡核苷酸能夠作為由第二引物引發合成互補寡核苷酸的模板；b)提供含有與標記連接的核糖寡核苷酸的第一探針，其中的核糖寡核苷酸具有與靶DNA序列一部分互補的序列，所述部分位於第一和第二引物的下遊；c)在溫度循環步驟許可的條件下採用聚合劑擴增靶DNA序列(ⅰ)將標記探針與靶DNA序列接觸並退火，(ⅱ)將第一和第二引物退火，(ⅲ)用模板依賴性核糖核酸酶切下退火探針的RNA，釋放出標記核糖寡核苷酸片段，(ⅳ)用聚合劑延伸引物，和(ⅴ)將延伸引物和靶DNA序列變性；和d)連續測定標記片段的釋放，對靶DNA序列的擴增進行動力學特性分析。其中步驟c)和d)在單一反應混合系中進行。
9．根據權利要求8所述的方法，其中靶DNA序列的擴增包括聚合酶鏈反應。
10．根據權利要求9所述的方法，其中的連續測定步驟包括在連續的聚合酶鏈反應循環期間檢測標記片段的釋放。
11．根據權利要求8所述的方法，它還包括與第二標記連接的核糖寡核苷酸，其中的第一標記包含報導螢光染料而第二標記包含猝滅螢光染料，從而使得標記的連接造成第二標記抑制對第一標記的檢測。
12．根據權利要求11所述的方法，其中連續測定步驟包括檢測報導螢光。
13．根據權利要求8所述的方法，其中將探針與靶DNA序列退火的步驟包括降低溫度，而將延伸片段與靶DNA序列退火的步驟則包括升高溫度。
14．根據權利要求8所述的方法，它還包括提供第二探針的步驟，所述第二探針能夠釋放出可被單獨測得的標記片段。
15．一種檢測靶DNA序列的方法，所述序列包含與第二鏈互補的第一鏈，而且該鏈正經歷擴增反應，所述方法包括以下步驟a)提供引物，該引物含有與靶DNA序列第一鏈中某區段互補的序列並能夠引發互補寡核苷酸的合成；b)提供含有與標記連接的核糖寡核苷酸的第一探針，其中的核糖寡核苷酸具有與靶DNA序列一部分互補的序列，所述部分位於第一和第二引物的下遊；c)在溫度循環步驟許可的條件下採用聚合劑擴增靶DNA序列(ⅰ)將經標記的探針與靶DNA序列接觸並退火，(ⅱ)將引物退火，(ⅲ)用模板依賴性核糖核酸酶切下退火探針的RNA，釋放出標記核糖寡核苷酸片段，(ⅳ)用聚合劑延伸引物，和(ⅴ)將延伸引物和靶DNA序列變性；和d)連續測定標記片段的釋放，對靶DNA序列的擴增進行動力學特性分析。其中步驟c)和d)在單一反應混合系中進行。
全文摘要
一種對靶核酸進行實時同質性試驗的方法,它包括將一條已標記的核糖寡核苷酸探針與目標DNA序列退火,並用RNAseH降解探針的一部分以釋放出標記片段。然後通過對被釋放片段的測定來對目標序列的存在進行動力學特性分析。較好的是,將該試驗與聚合酶鏈反應相結合,從而可以實時檢測靶序列的擴增。
文檔編號C12Q1/68GK1236395SQ97197568
公開日1999年11月24日 申請日期1997年7月24日 優先權日1996年7月26日
發明者D·J·凱斯勒, D·E·哈格羅夫斯 申請人:愛德華·E·維因格