Dc細胞的製備方法及其在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用的製作方法
2023-12-11 23:49:57
Dc細胞的製備方法及其在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了貼壁單個核細胞、未成熟DC細胞和成熟DC細胞的製備試劑盒和製備方法，以及利用上述方法製得的成熟DC細胞在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用，屬於生物【技術領域】。本發明採用CD14單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成的培養瓶皿製備貼壁單個核細胞，採用GM-CSF、IL-4和IFN-α製備未成熟DC細胞，採用TNF-α和OK-432製備成熟DC細胞。利用本發明提供的方法，能增加單個核細胞的貼壁能力，增加貼壁細胞數目，從而有利於減少雜質細胞對其轉化為未成熟DC的影響；能提高未成熟DC細胞產率；能獲得成熟度更高、細胞遷移能力和IL-12p70分泌能力更強的成熟DC細胞。
【專利說明】DC細胞的製備方法及其在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體地，涉及貼壁單個核細胞、未成熟DC細胞和成熟DC細胞的製備試劑盒和製備方法，以及利用上述方法製得的成熟DC細胞在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤免疫治療被認為是手術、放療和化療三大常規療法後的第四大治療方法。腫瘤的免疫治療是激發和增強機體的免疫功能，以達到控制和殺滅腫瘤細胞的目的。樹突狀細胞是由2011年諾貝爾生理學或醫學獎獲得者拉爾夫?斯坦曼在1973年所發現並命名的一種功能最強的抗原遞呈細胞，能將腫瘤抗原的信息通過主要組織相容性複合物(MHC I和MHC II)限制性方式將多肽複合物作為抗原傳遞給CTL和Thl細胞，在誘導特異性抗腫瘤細胞免疫中起著關鍵作用。
[0003]自從1996年美國史丹福大學醫學中心Hsu等在Nature Medicine上報導全球首項腫瘤DC疫苗臨床試驗以來，截止到2011年7月16日，全球有關DC的臨床試驗共424項，其中274項為DC腫瘤疫苗臨床試驗，其中美國165項，佔了半壁江山，中國6項(其中臺灣3項)。
[0004]全球進行的腫瘤DC疫苗臨床試驗，大部分均採用自體外周血單個核細胞等分化為未成熟DC細胞後，利用各種類型的腫瘤抗原進行負載，再使用多種細胞因子促進DC細胞的成熟，最後將負載有腫瘤抗原信息的成熟DC細胞通過各種途徑回輸入人體。單個核細胞來源的DC細胞不能增殖，其數量取決於單個核細胞分化為未成熟DC的轉化率。目前進行的臨床試驗，大部分採取的是貼壁法獲得單個核細胞，這種方法所獲得的貼壁細胞，除了單個核細胞外，還有大量的雜質細胞(如粒細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、Treg細胞等)，這些雜質細胞，會限制未成熟DC細胞的生產率。若是採用充分衝洗培養皿壁的方法來去除，又會不可避免的造成半貼壁狀態的單個核細胞的大量丟失，這一方法只能獲得單個核細胞1%~5%的產量，且病人個體之間、實驗室之間、不同操作人員之間產率差別較大。少部分臨床試驗採用CD14單抗磁珠分選方法，但該法操作步驟複雜，操作時間長，而且其高昂的費用必然會限制臨床應用。有文獻表明，利用CD14單抗磁珠分選方法，雖然可以避免雜質細胞對單個核細胞轉化為未成熟DC細胞的影響，但與貼壁法生成的DC細胞相比，其吞噬能力減弱。因此，CD14+單個核細胞的提取方法，仍需進一步改善。
[0005]臨床研究中的DC細胞來源，主要來自於外周血的單個核細胞，其培養方法多種多樣，比如經典的GM-CSF+IL-4刺激法；GM-CSF可以促進單個核細胞等向DC細胞轉化，IL-4則起到抑制粒細胞和巨噬細胞產生的作用；但是該方法獲得的未成熟DC細胞的數量和純度較低。
[0006]DC細胞的成熟狀態是決定DC疫苗有效性的一個關鍵因素。因為未成熟的DC致敏T細胞的能力有限，還可能誘導T細胞耐受。另外，與粘附性較強的未成熟DC相比，成熟DC的遷移能力更強，能更加有效地遷移至淋巴結的T細胞區，進而有效誘導免疫反應。經典的促進DC細胞成熟的方法是利用TNF-α或者利用COOKTAIL(TNF-a、IL_6、IL_1 β、PEG2)刺激未成熟的DC細胞。然而，在一項III期的黑色素瘤的DC疫苗臨床試驗中，儘管使用了所謂「金標準」的COCKTAIL刺激DC細胞成熟，仍然未取得明顯的臨床療效。研究者認為一個可能的原因是使用了 PEG2，雖然可以提高DC細胞CCR7的表達並增強其向二級淋巴結轉移的能力，但卻會顯著抑制DC細胞分泌IL-12的能力。為了提高DC細胞將抗原信息遞呈給CTL和Thl並誘導特異性殺傷免疫反應，發展新型的刺激DC細胞成熟的方法勢在必行。
【發明內容】
[0007]為解決上述問題，本發明提出了一種用於製備貼壁單個核細胞的試劑盒，貼壁單個核細胞的製備方法，用於將貼壁單個核細胞製備成未成熟DC細胞的試劑盒，利用貼壁單個核細胞製備未成熟DC細胞的方法，用於將未成熟DC細胞製備成成熟DC細胞的試劑盒，利用未成熟DC細胞製備成熟DC細胞的方法，以及利用上述方法製得的成熟DC細胞在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用。
[0008]本發明涉及一種用於製備貼壁單個核細胞的試劑盒，所述的試劑盒含有如下成分:
[0009]⑶14單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成的培養瓶皿。
[0010]其中，
[0011]所述的⑶14單克隆抗體為含⑶14單克隆抗體1-10 μ g / mL的包被液；
[0012]所述的⑶14單克隆抗體選自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種類型。
[0013]本發明還涉及一種貼壁單個核細胞的製備方法，所述的方法包括如下步驟:
[0014](I)用⑶14單克隆抗體包被培養瓶皿；所述的培養瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成；
[0015](2)從外周血、臍帶血或骨髓中獲取單個核細胞；
[0016](3)用培養基將步驟⑵獲得的單個核細胞吹打混勻，按2~5X IO6 / mL的濃度種植於步驟(1)用⑶14單克隆抗體包被好的培養瓶皿中，5% C02、37°C條件下孵育2-6個小時；然後吸棄上清，輕柔洗滌後即獲得貼壁單個核細胞。
[0017]其中，
[0018]步驟(1)中，所述的用⑶14單克隆抗體包被培養瓶皿的方法為:將含1-10 μ g /mL的⑶14單克隆抗體的包被液,加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯製成的培養瓶皿中，將培養瓶皿用錫箔紙包住以避光，平放，4°C孵育過夜；
[0019]步驟(2)中，所述的外周血為採自正常人或腫瘤患者的外周血；或者臍帶血、正常人或者腫瘤患者骨髓；
[0020]步驟(3)中，所述的培養基為GT-T551 / AIM V / X-VIVO0
[0021]本發明還涉及一種用於將貼壁單個核細胞製備成未成熟DC細胞的試劑盒，所述的試劑盒含有如下成分:
[0022]500 ~1000U / mL GM_CSF、500 ~1000U / mL IL-4 和 500 ~1000U / mL IFN- α。
[0023]本發明還涉及一種將貼壁單個核細胞製備成未成熟DC細胞的方法，所述的方法包括如下步驟:[0024](I)將單個核細胞貼壁2~4小時後，吸棄上清，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS輕輕衝洗培養瓶皿壁，吸棄上清，加入原體積的培養基、500~1000U / mL GM-CSF、500~1000U / mL IL-4、500 ~1000U / mL IFN-α 和 I ~5% 自體血漿或 AB 血漿，在 5% CO2,37 °C條件下孵育培養；
[0025](2)第2~4天，補加一倍體積的培養基、500~1000U / mL GM_CSF、500~1000U / mLIL-4、500 ~1000U / mL IFN-α 和 I ~5% 自體血漿或AB血漿，在 5% C02、37°C條件下孵育培養；
[0026](3)第4~6天，貼壁細胞分化為未成熟的DC細胞；收集懸浮生長的未成熟DC細胞。
[0027]本發明還涉及一種用於將未成熟DC細胞製備成成熟DC細胞的試劑盒，所述的試劑盒含有如下成分:
[0028]500 ~1000U / mL TNF-α 和 0.1 ~5ΚΕ / mL 0K-432。
[0029]本發明還涉及一種將未成熟DC細胞製備成成熟DC細胞的方法，所述的方法包括如下步驟:
[0030](I)第I天，將未成熟DC細胞按I~2X IO6 / mL的濃度種植於培養基中，加入腫瘤細胞裂解蛋白；放至5% CO2、37°C條件下孵育培養；
[0031](2)第2~3天，往步驟(1)中的DC細胞培養基中加入500~1000U / mL TNF-α、0.1~5ΚΕ / mL 0K-432和1%~5%自體血漿或AB血漿，吹打混勻，放至5% C02、37°C條件下孵育培養24~48小時；
[0032](3)收集刺激成熟的DC細胞。
[0033]其中，所述的腫瘤細胞裂解蛋白的終濃度為50~100 μ g / mL。
[0034]利用上述方法製備得到的成熟DC細胞在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0035]本發明的有益效果為:
[0036]利用本發明提供的製備貼壁單個核細胞的試劑盒和製備貼壁單個核細胞的方法能增加單個核細胞的貼壁能力，增加貼壁細胞數目，從而有利於減少雜質細胞對其轉化為未成熟DC的影響；利用本發明提供的製備未成熟DC細胞的試劑盒和製備方法能夠獲得更多數目的未成熟DC細胞，提高其產率；利用本發明提供的製備成熟DC細胞的試劑盒和製備方法獲得的成熟DC細胞，擁有更高的成熟度，更強的細胞遷移能力和IL-12p70分泌能力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1是本發明實施例2中，光學顯微鏡下顯示的單個核細胞以及雜質細胞的貼壁情況；其中，圖1A為採用普通貼壁法(第2組實驗)的結果圖像，圖1B為採用CD14單克隆抗體包被培養瓶皿法(第I組實驗)的結果圖像；
[0038]圖2是本發明實施例2中，流式細胞儀檢測的貼壁的單個核細胞表面CD14表達情況；其中，圖2A為採用普通貼壁法(第2組實驗)的結果，圖2B為採用⑶14單克隆抗體包被培養瓶皿法(第I組實驗 )的結果；
[0039]圖3是本發明實施例4中，流式細胞儀檢測的未成熟DC細胞的數目和純度情況；其中，圖3A為採用GM-CSF和IL-4細胞因子組合(第2組實驗)的結果，圖3B為採用GM-CSF, IL-4和IFN- α細胞因子組合(第I組實驗)的結果；
[0040]圖4是本發明實施例6中，RT-PCR方法檢測的成熟DC細胞遷移標誌物CCR7的表達情況；其中，圖中的第2組為採用TNF-α刺激組的結果，圖中的第I組為採用TNF-α和0Κ-432細胞因子組合的結果；
[0041]圖5是本發明實施例6中，流式細胞儀檢測的成熟DC細胞的表面標誌情況；其中，圖5Α為採用TNF- α刺激組(第2組)的結果，圖5Β為採用TNF- α和0Κ-432細胞因子組合(第I組)的結果。
【具體實施方式】
[0042]下面結合附圖和具體的實施例對本發明做進一步說明:
[0043]下述實施例中所使用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0044]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0045]下述實施例中涉及的試劑的濃度均為終濃度。
[0046]實施例1:貼壁單個核細胞製備
[0047](I)將含1-1Oyg / mL的⑶14單克隆抗體的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料製成的培養瓶皿中，將培養瓶皿用錫箔紙包住以避光，平放，4°C孵育過夜；其中，使用的⑶14單克隆抗體類型可為IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種；
[0048](2)第I天，無菌條件下抽取正常人或腫瘤患者50_100mL外周血或者取採血(即單採)初步分離得到的正常人或腫瘤患者的外周血單個核細胞80-100mL，轉入50mL離心管中，加入等體積生理鹽水稀釋，獲得經稀釋的樣品；再按經稀釋的樣品與淋巴細胞分離液的體積比2:1或1:1的比例，將經稀釋的樣品轉至淋巴細胞分離液上方，慢升慢降(升I降O)，2000轉/分離心20-30分鐘；然後小心吸取白膜層，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS洗滌兩次，即得到單個核細胞；
[0049](3)用培養基GT-T551 / AIM V / X-VIV0將步驟(2)獲得的單個核細胞吹打混勻，按2~5X106 / mL的濃度種植於步驟(1)用⑶14單克隆抗體包被好的培養瓶皿中，5% CO2、37°C條件下孵育2-6個小時；然後吸棄上清，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS輕柔衝洗培養瓶皿壁3次，吸棄上清，即獲得貼壁單個核細胞。
[0050]其中，本實施例採用的培養基GT-T551購自TAKARA，AIM V購自LIFE，X-VIVO購自L0NZA，⑶14單克隆抗體購自EB10SCIENCE，淋巴細胞分離液購自美國Mediatech的CELLGR0ο
[0051]IgG與聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等固相有較強的吸附能力，其連接多發生在Fe段，抗體結合點暴露於外。本發明採用CD14單克隆抗體(IgG型)包被聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料製備的培養瓶皿，利用CD14單克隆抗體結合單個核細胞表面的CD14分子，使CD14+單個核細胞更好的吸附於培養瓶皿壁，獲得的單個核細胞的貼壁能力更強，貼壁細胞的數目比常規方法更多；同時減少了雜質細胞對貼壁細胞的影響，提高了貼壁的單個核細胞向DC細胞轉化的能力；且製備方法簡單，費用低廉。
[0052]上述利用⑶14單克隆抗體包被聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料製成的培養瓶皿所獲得的CD14+單個核細胞的數目與純度與普通貼壁法相比的優點將通過實施例2來進一步詳細說明。[0053]實施例2:CD14單克隆抗體包被法能增加單個核細胞的貼壁能力，增加貼壁細胞數目，從而有利於減少雜質細胞對其轉化為未成熟DC的影響
[0054](I)按照實施例1的方法製備單個核細胞細胞，分組:
[0055]第I組:將單個核細胞按2~4X IO6 / mL種植於⑶14單克隆抗體包被的聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯等材料製成的培養瓶皿中；
[0056]第2組:將單個核細胞按2~4X IO6 / mL種植於聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯等材料製成的培養瓶皿中；
[0057]2~4小時後吸棄上清，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS衝洗瓶皿壁，獲得的即為貼壁的單個核細胞；
[0058](2)比較兩種方法獲得的⑶14+單個核細胞的數目與純度:
[0059]使用光學顯微鏡觀察單個核細胞以及雜質細胞的貼壁情況(如圖1所示)；由圖1可見，採用本發明提供的CD14單克隆抗體包被聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯等材料製成的培養瓶皿的貼壁方法，能夠獲得更多的單個核細胞，同時能減少雜質細胞的數量；
[0060](3)使用胰酶將貼壁的單個核細胞從瓶皿壁上消化下來，PBS吹打混勻兩次後進行⑶14-FITC標記，進行流式細胞儀檢測(結果見圖2);從圖2可知，⑶14單克隆抗體包被法獲得的CD14+單個核細胞的數目與純度遠高於普通貼壁法。
[0061]實施例3:利用GM-CSF、IL_4和IFN- α細胞因子組合對貼壁細胞進行培養
[0062](I)將利用實施例1的方法製備的單個核細胞貼壁2~4小時後，吸棄上清，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS輕`輕衝洗瓶皿壁3次，吸棄上清，加入原體積的培養基GT-T551 /AIM V / X-VIV0.500 ~1000U / mL GM_CSF、500 ~1000U / mL IL_4、500 ~1000U / mLIFN-α和I~5%自體血漿或AB血漿，在5% CO2、37°C條件下孵育培養；
[0063](2)第 3 天，補加一倍體積的培養基 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U /mLGM-CSF、500 ~1000U / mL IL_4、500 ~1000U / mL IFN-α 和 I ~5% 自體血漿或 AB血漿，在5% CO2、37 °C條件下孵育培養；
[0064](3)第5天，貼壁細胞分化為未成熟的DC細胞；收集懸浮生長的未成熟DC細胞，600 X g離心洗滌，得到未成熟DC細胞。
[0065]其中，本實施例採用的IFN- α、GM-CSF和IL-4購自PEPR0TECH。
[0066]採用GM-CSF、IL_4和IFN- α細胞因子組合，能夠獲得更多數目的未成熟DC細胞，使其恢復抗原遞呈功能。該培養方法與普通培養方法(GM-CSF和IL-4)相比的顯著優勢將在實施例4中得到闡明。
[0067]實施例4:採用GM-CSF、IL-4和IFN-α細胞因子組合獲得的未成熟DC細胞，與GM-CSF和IL-4細胞因子組合獲得的未成熟DC細胞相比，擁有更多的數目和更高的純度
[0068](I)將按照實施例1的方法獲得的貼壁細胞分為2組:
[0069]第I 組:用 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U / mL GM_CSF、500 ~1000U /mLIL-4、500~1000U / mL IFN-α和I~5%自體血漿或AB血漿進行培養，細胞種植密度為 I ~2Χ IO6 / mL ；
[0070]第2 組:用 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U / mL GM_CSF、500 ~1000U /mLIL-4和1%~5%自體血漿或AB血漿進行培養，細胞種植密度為I~2X106 / mL ；
[0071](2)第 3 天，第 I 組添加一次同體積的 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U /mLGM-CSF、500 ~1000U / mL IL-4,500 ~1000U / mL IFN-α 和 I ~5% 自體血漿或 AB血漿；第 2 組添加一次同體積的 GT-T551 / AIM V / X_VIV0、500 ~1000U / mL GM-CSF,500~1000U / mL IL-4和I %~5 %自體血漿或AB血漿；
[0072](3)第5天，收集懸浮的未成熟DC細胞，細胞計數；利用⑶11C(+)LIN(_)HLA-DR(+)標記DC細胞進行流式細胞儀檢測，觀察細胞的數目與純度(結果如圖3所示)；可見，採用GM-CSF、IL-4和IFN- α細胞因子組合，能夠獲得更多數目、更高純度的未成熟DC細胞。
[0073]實施例5:未成熟DC細胞抗原負載和刺激成熟
[0074](I)收集實施例3中所得培養瓶皿中的懸浮的未成熟DC細胞，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS洗滌細胞2~3次，按I~2 X IO6 / mL種植於培養基中；加入腫瘤細胞裂解蛋白，使其終濃度為50~100μ g / mL ;放至5% C02、37°C條件下孵育培養；
[0075](2)第6天，往步驟⑴中的DC細胞培養基中加入500~1000U / mL TNF-α、0.1~5ΚΕ / mL 0K-432和1%~5%自體血漿或AB血漿，吹打混勻，放至5% C02、37°C條件下孵育培養24~48小時；
[0076](3)收集刺激成熟的DC細胞，凍存或者進入臨床應用。
[0077]其中，本實施例採用的TNF- α購自PEPR0TECH公司，0Κ-432是已經進入臨床應用的一種溶血性鏈球菌A型S u株製劑，例如採用日本中外製藥公司生產的0Κ-432或者採用國產製劑，商品名為「力爾凡」。
[0078]採用TNF- α和0Κ-432刺激DC細胞成熟，所得到的DC細胞與普通刺激方法(只採用TNF-α )相比的顯著優勢可見實施例6。
[0079]實施例6:採用TNF- α和0Κ-432細胞因子組合刺激成熟的DC細胞，與TNF- α刺激成熟的DC細胞相比，擁有更高的成熟度，更強的細胞遷移能力和IL-12p70分泌能力
[0080](I)收集實施例5所得的未成熟DC細胞，分成兩組:
[0081]第I 組:採用 GT-T551 / AIM V / X-VIVO、1000u / mL TNF-α、0.I ~5ΚΕ / mL0K-432和I %~5 %自體血漿或AB血漿吹打混勻DC細胞，按I~2 X IO6 / mL種植於培養瓶皿中；
[0082]第2 組:採用 GT-T551 / AIM V / X-VIVO、1000u / mL TNF-α 和 I %~5% 自體血漿或AB血漿吹打混勻DC細胞，按I~2Χ IO6 / mL種植於培養瓶皿中；
[0083]兩組均在5% CO2、37 °C條件下孵育培養24~48小時；
[0084](2)收集刺激成熟的DC細胞，進行流式檢測，結果如圖4、圖5和表1所示。
[0085]由圖4可見，第I組的DC細胞CCR-7的表達明顯高於第2組；
[0086]由圖5可見，第I組的DC細胞的細胞成熟標誌物⑶40、⑶80、⑶83、⑶86均高於第2組；
[0087]由表1可見，第I組的DC細胞IL_12p70分泌量明顯高於第2組；
[0088]表1
[0089]
M|IL-12p70 分泌量(ng 7 mL)
TNF- α 和 0Κ-432 (第 I 組)~10.3 + 2.4
【權利要求】
1.一種用於製備貼壁單個核細胞的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒含有如下成分:CD14單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成的培養瓶皿。
2.根據權利要求1所述的用於製備貼壁單個核細胞的試劑盒，其特徵在於，所述的CD14單克隆抗體為含CD14單克隆抗體1-10 μ g / mL的包被液；所述的CD14單克隆抗體選自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種類型。
3.—種貼壁單個核細胞的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)用CD14單克隆抗體包被培養瓶皿；所述的培養瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料製成； (2)從外周血、臍帶血或骨髓中獲取單個核細胞； (3)用培養基將步驟(2)獲得的單個核細胞吹打混勻，按2~5X1O6 / mL的濃度種植於步驟(1)用⑶14單克隆抗體包被好的培養瓶皿中，5% C02、37°C條件下孵育2-6個小時；然後吸棄上清，輕柔洗滌後即獲得貼壁單個核細胞。
4.根據權利要求3所述的貼壁單個核細胞的製備方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述的用CD14單克隆抗體包被培養瓶皿的方法為:將含1-10 μ g / mL的CD14單克隆抗體的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯製成的培養瓶皿中，將培養瓶皿用錫箔紙包住以避光，平放，4°C孵育過夜；步驟(2)中，所述的外周血為採自正常人或腫瘤患者的外周血；步驟(3)中，所述的培養基為GT-T551 / AIM V / X-VIVO0
5.一種用於將貼壁單個核細胞製備成未成熟DC細胞的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒含有如下成分:
500 ~1000U / mL GM-CSF、500 ~1000U / mL IL-4 和 500 ~1000U / mL IFN-α 。
6.一種將貼壁單個核細胞製備成未成熟DC細胞的方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)將單個核細胞貼壁2~4小時後，吸棄上清，用生理鹽水、D-Hanks液或PBS輕輕衝洗培養瓶皿壁，吸棄上清，加入原體積的培養基、500~1000U / mL GM_CSF、500~1000U /mLIL-4、500~1000U / mL IFN-α和1~5%自體血漿或AB血漿，在5% C02、37°C條件下孵育培養； (2)第2~4天，補加一倍體積的培養基、500~1000U/ mL GM_CSF、500~1000U /mL IL-4、500~1000U / mL IFN-α和1~5%自體血漿或AB血漿，在5% C02、37°C條件下孵育培養； (3)第4~6天，貼壁細胞分化為未成熟的DC細胞；收集懸浮生長的未成熟DC細胞。
7.一種用於將未成熟DC細胞製備成成熟DC細胞的試劑盒，其特徵在於，含有如下成分:
500 ~1000U / mLTNF-α 和 0.1 ~5KE / mL 0K-432。
8.一種將未成熟DC細胞製備成成熟DC細胞的方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)第I天，將未成熟DC細胞按I~2X 1O6 / mL的濃度種植於培養基中，加入腫瘤細胞裂解蛋白；放至5% CO2、37 °C條件下孵育培養； (2)第2~3天，往步驟⑴中的DC細胞培養基中加入500~1000U/ mL TNF- a、.0.1~5KE / mL 0K-432和1%~5%自體血漿或AB血漿，吹打混勻，放至5% C02、37°C條件下孵育培養24~48小時； (3)收集刺激成熟的DC細胞。
9.根據權利要求8所述的用於將未成熟DC細胞製備成成熟DC細胞的方法，其特徵在於，所述的腫瘤細胞裂解蛋白的終濃度為50~100 μ g / mL。
10.利用權利要求8 或9所述的方法製備得到的成熟DC細胞在製備抗腫瘤細胞製劑中的應用。
【文檔編號】A61K35/28GK103602634SQ201310579065
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】羅昀, 曾鋼, 張立媛, 王敏傑 申請人:山東迪博生物技術有限公司