微生物發酵生產低溫纖維素酶的方法

2023-10-24 23:51:02 2

專利名稱：微生物發酵生產低溫纖維素酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種低溫纖維素酶微生物發酵生產方法。該發明生產的低溫纖維素酶主要應用於飼料行業、食品加工、中草藥提取、造紙與紡織、原油開採、印染與洗滌、以及其它纖維素酶應用行業。可以提高原料的利用率、轉化率和生產率，降低生產成本，改善並提高產品質量。
背景技術：
纖維素酶是指能降解纖維素生成纖維二糖和葡萄糖等小分子物質的一組酶的總稱，是一種複合的誘導酶，包括多種水解酶(張啟先，微生物學報，1974)。纖維素酶作為生物製劑，已經廣泛應用於飼料、食品加工，中草藥提取，原油開採，造紙及紡織、印染等行業中，但目前使用的纖維素酶主要為中溫纖維素酶。雖然國內外對纖維素酶的研究有40多年，但主要是研究中溫纖維素酶；有關低溫纖維素酶的研究是起步階段，主要是菌種選育和產酶條件優化、生長特性和酶學性質，以及相關基因的克隆等基礎研究(王玢等，山東教育學院學報和海洋科學，2003；曾胤新等，高技術通訊，2005；遊銀偉，微生物學報，2005)；低溫纖維素酶產業化、規模化生產及應用還未見報導。低溫纖維素酶與高溫、中溫纖維素酶相比具有很大的應用優勢，因為低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時間並省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節能方面有相當大的優勢；經過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產品的品質(孫謐等，海洋水產研究，2002)，這將有助於低溫纖維素酶的推廣和使用。低溫纖維素酶的應用將對傳統的農業、食品、醫藥、化工、能源和環保等領域產生深遠的影響，利用微生物發酵生產的低溫纖維素酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加於反芻動物纖維質粗飼料、農產品深加工和中草藥提取等領域中，在8～25℃處理0.5～2小時，可以提高原料的轉化率10.2％～18.5％，降低了生產成本，改善並提高產品質量。可以從根本上擺脫中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。低溫纖維素酶將為人類擺脫生存和發展中所面臨的諸如飢餓、資源、能源危機以及環境汙染等困境提供現實的機遇。低溫纖維素酶具有非常廣闊的開發潛力和應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種微生物發酵生產低溫纖維素酶的方法，該方法主要是微生物經過低溫馴化後，在10～16℃液體發酵生產低溫纖維素酶的方法，這種生產方法獲得的低溫纖維素酶粗酶液活性可以達到180U/ml，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶製劑。當該酶活性為1000U/ml或1000U/g，0.01‰～0.5‰的量應用於反芻動物纖維質粗飼料、農產品深加工和中草藥提取等領域中，在8～25℃處理0.5～2小時，可以提高原料的轉化率10.2％～18.5％。該酶製劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低。可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。
本發明所述的一種微生物發酵生產低溫纖維素酶的方法具體包括以下步驟(1)將產生纖維素酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將低溫馴化後的纖維素酶產生菌在10～16℃逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在10～16℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫纖維素酶結束；(4)將(3)的發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液。
(5)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
本發明中使用的菌種來源於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。纖維素酶產生菌(例如，CGMCC菌種編號3.316或3.3005或3.3010或3.2942或3.3744或3.4033等)，菌株先活化、再經過逐級低溫馴化後發酵生產低溫纖維素酶時按本發明產酶條件進行培養，低溫馴化後的菌株在4℃環境中可保存2個月，用10～25％甘油製成的菌懸液、在零下80℃條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(1)、培養基製備①菌種活化培養基馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②菌種低溫馴化培養基馬鈴薯50.0～100.0g，新華濾紙粉5.0～8.0g，麩皮2.0～6.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③液體種子培養基水稻秸稈粉3.0～5.0g，蛋白腖0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自來水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
④產酶培養基水稻秸稈粉7.0～12.0g，麩皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自來水1.0L，pH值6.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產生纖維素酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的纖維素酶產生菌在10～12℃培養48～72h而後按5％的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積3～5％的接種量接入10L的產酶培養基中，在10～12℃培養120～144h時，即微生物發酵生產低溫纖維素酶結束。
(6)將(5)的發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液。
(7)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的低溫纖維素酶製劑。
實施例二(1)、培養基製備①菌種活化培養基馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②菌種低溫馴化培養基馬鈴薯50.0～100.0g，新華濾紙粉5.0～8.0g，麩皮2.0～6.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③液體種子培養基水稻秸稈粉3.0～5.0g，蛋白腖0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自來水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
④產酶培養基水稻秸稈粉7.0～12.0g，麩皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自來水1.0L，pH值6.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產生纖維素酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的纖維素酶產生菌在12～14℃培養48～72h而後按5％的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積5～7％的接種量接入50L的產酶培養基中，在12～14℃培養96～120h時，即微生物發酵生產低溫纖維素酶結束。
(6)將(5)的發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液。
(7)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的低溫纖維素酶製劑。
實施例三(1)、培養基製備①菌種活化培養基馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②菌種低溫馴化培養基馬鈴薯50.0～100.0g，新華濾紙粉5.0～8.0g，麩皮2.0～6.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③液體種子培養基水稻秸稈粉3.0～5.0g，蛋白腖0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自來水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
④產酶培養基水稻秸稈粉7.0～12.0g，麩皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自來水1.0L，pH值6.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產生纖維素酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環境中生長良好；
(4)按常規方法將低溫馴化後的纖維素酶產生菌在14～16℃培養48～72h而後按5％的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積7～9％的接種量接入100L的產酶培養基中，在14～16℃培養72～96h時，即微生物發酵生產低溫纖維素酶結束。
(6)將(5)的發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液。
(7)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的低溫纖維素酶製劑。
實施例四按實施例一、二和三方法生產的低溫纖維素酶，平均酶活性為800U/ml，如再經過分離和純化，可以得到不同活性、純度和劑型的酶製劑。將活性為1000U/ml或1000U/g的低溫纖維素酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加於反芻動物纖維質粗飼料、農產品深加工和中草藥提取等領域中，在8～25℃處理0.5～2小時，可以提高原料的利用率、轉化率和生產率，降低生產成本，改善並提高產品質量。低溫纖維素酶應用部分實驗結果見下表。

實驗結果表明低溫纖維素酶應用於反芻動物纖維質粗飼料、農產品深加工和中草藥提取等領域中，可以提高原料的利用率、轉化率和生產率，降低生產成本，改善並提高產品質量；同時也說明低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時間並省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節能方面有相當大的優勢；該酶製劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。
權利要求
1.一種微生物發酵生產低溫纖維素酶的方法，其包括以下步驟(1)將產生纖維素酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將低溫馴化後的纖維素酶產生菌在10～16℃逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在10～16℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫纖維素酶結束；(4)將(3)的發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體；收集到的液體即為粗酶液。(5)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
2.根據權利要求1所述的方法，在步驟(5)之後進一步包括將步驟(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養基、液體種子培養基、產酶培養基分別為(1)菌種低溫馴化培養基馬鈴薯50.0～100.0g，新華濾紙粉5.0～8.0g，麩皮2.0～6.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。(2)液體種子培養基水稻秸稈粉3.0～5.0g，蛋白腖0.5～1.0g，Tween80 0.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl30.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自來水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。(3)產酶培養基水稻秸稈粉7.0～12.0g，麩皮1.0～5.0g，Tween80 0.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自來水1.0L，pH值6.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產低溫纖維素酶的方法是將產生纖維素酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好；將低溫馴化後的纖維素酶產生菌在10～ 16℃逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在10～16℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫纖維素酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
文檔編號C12N1/00GK1807610SQ20061000201
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月23日 優先權日2006年1月23日
發明者遲乃玉, 張慶芳 申請人:遲乃玉, 張慶芳