用於rna合成的硫代碳保護基團的製作方法

2023-10-10 20:45:04 1

專利名稱：用於rna合成的硫代碳保護基團的製作方法
與相關申請的交叉引用
本申請基於35 U.S.C.§119(e)要求2007年5月10日提交的美國臨時申請No.60/928,722的優先權，所述申請的公開內容通過引用併入本文。
背景技術：
RNA的化學合成是比DNA的化學合成困難得多的任務，因為在化學合成期間必須保護核糖中的2′-羥基。在核苷酸間連接形成的方面和在合成寡核苷酸後2′-保護基團的去除方面，受保護的2′-羥基與核苷酸間磷酸酯的密切近似都表現出問題。另外，RNA中的核苷酸間鍵遠比DNA中的核苷酸間鍵更不穩定。
直到最近，合成RNA的典型途徑才使用了下述核糖核苷單體，所述核糖核苷單體中的5′-羥基通過對酸敏感的二甲氧基三苯甲基(DMT)保護基團保護，所述保護基團可以在單體與增長的寡核糖核苷酸偶聯後在酸性條件下被去除。多種對酸穩定的保護基團已被置於2′-羥基上，以防止酸去保護步驟期間核苷酸間鍵的異構化和切割。這些對酸穩定的保護基團中最常見的似乎是叔丁基-二甲基甲矽烷基，其已知為TBDMS(Ogilvie et al.，1979)。在非常長的時間中，TBDMS作為2′-保護基團的用途主宰著先前用於RNA化學合成的小市場(Usman et al.，1987；Ogilvie et al.，1988)。
然而，使用TBDMS進行的寡核糖核苷酸合成絕不是令人滿意的，並且典型地產生品質較差的RNA產物。因此，TBDMS保護基團從2′-位置上遷移至3′-位置上。另外，在單體(例如5′-O-DMT-2′-O-TBDMS-ribo-3′-O-(β-氰乙基，N-二異丙基)亞磷醯胺)的合成期間，T-甲矽烷基的引入是非位置選擇性的，因此其可以被添加至2′或3′位置上。加上在亞磷醯胺生產期間避免甲矽烷基遷移的額外的化學需要，單體的合成是富有挑戰性和昂貴的。本領域中還公知的是，這些單體的偶聯效率由於2′-TBDMS的位阻而被大幅降低，這不僅影響全場產物的產量和純度，而且也限制可通過該方法實現的寡核糖核苷酸的長度。
對合成的RNA的需求持續增長，這主要歸因於RNA幹擾的發現。因此，期望開發出改進的RNA合成流程，尤其是2′-保護基團，以滿足日益增長的需要。
發明概述 本發明的方面包括2′受保護的核苷單體，其在2′位點上被硫代碳保護基團保護。感興趣的硫代碳保護基團包括但不限於硫代羥基碳酸酯(thiocarbonate)、硫代羰基碳酸酯(thionocarbonate)和二硫代碳酸酯(dithiocarbonate)保護基團，以及硫代氨基甲酸酯(thionocarbamate)保護基團。本發明的方面還包括包含本發明保護基團的核酸，以及使用本發明的保護基團合成核酸的方法。
定義 進一步詳細描述本發明之前，除非另有說明，如下定義本申請中使用的術語。
「核苷酸」或「核苷酸部件(moiety)」是指核酸(無論是DNA或RNA或其類似物)的亞單元以及這些亞單元的類似物，所述亞單元包含磷酸基、糖基和雜環鹼基。其他基團(例如保護基團)可以與核苷酸的任何組分連接。
「核苷」或「核苷部件」是指包含糖基和雜環鹼基的核酸亞單元，以及這些亞單元的類似物。其他基團(例如保護基團)可以與核苷的任何組分連接。
「核苷殘基」是指作為更大分子(例如在多核苷酸、寡核苷酸或核苷亞磷醯胺中的)一部分的具有糖基和含氮鹼基(如在核苷中)的分子。
「核苷酸單體」是指未被結合在更大寡核苷酸鏈或多核苷酸鏈中並且對應於單個核苷酸亞單元的分子；當活化基(activating group)或保護基團對於核苷酸單體的預期用途而言必不可少的時候，核苷酸單體也可以具有這些基團。
術語「核苷」和「核苷酸」旨在包括下述這些部件，這些部件不僅包括已知的嘌呤和嘧啶鹼基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，而且也包括已被修飾的其他雜環鹼基。這類修飾包括甲基化的嘌呤或嘧啶，醯基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其他雜環。這類修飾包括例如二氨基嘌呤及其衍生物，肌苷及其衍生物，烷基化的嘌呤或嘧啶，醯基化的嘌呤或嘧啶，硫醇化的(thiolated)嘌呤或嘧啶等等，或者添加保護基團例如乙醯基、二氟乙醯基、三氟乙醯基、異丁醯基、苯甲醯基、9-芴基甲氧羰基、苯氧乙醯基、二甲基甲脒、二丁基甲脒、N，N-二苯基氨基甲酸酯等等。嘌呤或嘧啶鹼基也可以是前述的類似物；合適的類似物應當是本領域人員已知的，並且描述於有關的文件和文獻中。常見的類似物包括但不限於1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-異戊基腺嘌呤、2-甲基硫-N6-異戊基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-氯鳥嘌呤、8-氨基鳥嘌呤、8-甲基鳥嘌呤、8-硫代鳥嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧甲基氨甲基)-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(2-溴代乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、辮苷(queosine)、肌苷(inosine)、1-甲基肌苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羥基氨基嘌呤、6-硫代嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。
另外，術語「核苷」和「核苷酸」包括不僅含有常規核糖和脫氧核糖，而且含有其他糖的部件。經修飾的核苷或核苷酸也包含在糖部件上的修飾，例如其中一個或多個羥基被滷素原子或脂肪族基團替換，或者被功能化為醚、胺等等。「類似物」是指具有下述結構特徵的分子，所述結構特徵在文獻中被識別為模擬物、衍生物、具有類似的結構或其他類似的術語，並且包括例如包含非天然(自然中通常不存在)核苷酸的多核苷酸、非天然的核苷酸模擬物例如2′-經修飾的核苷、肽核酸、寡聚核苷磷酸酯以及具有添加的取代基例如保護基團或連結基團的任何多核苷酸。
「核苷酸間鍵」或「核苷酸鍵」是指兩個核苷部件之間的化學連結，例如天然存在的核酸中的磷酸二酯連結，或核酸或核酸類似物合成領域中公知的連結。核苷酸間鍵可包含磷酸基或亞磷酸基，並且可包含下述連結，其中磷酸基或亞磷酸基的一個或多個氧原子被取代基修飾或者被另一原子置換，例如硫原子，或單烷基氨基或二烷基氨基的氮原子。
「基團」包括被取代或未被取代的兩種形式。感興趣的取代基包括一種或多種低級烷基、氨基、亞胺基、醯氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硫基、烷基硫基、芳基硫基，或芳基或烷基；芳基、烷氧基、硫烷基、羥基、氨基、醯氨基、磺醯基、硫代、巰基、亞胺基、滷代、氰基、硝基、亞硝基、疊氮基、羧基、硫化物基、碸基、硫氧基(sulfoxy)、磷醯基、甲矽烷基、甲矽烷氧基和硼醯基(boronyl)，或任選地在一個或多個可用的碳原子上被非烴基取代基取代，例如氰基、硝基、滷素、羥基、磺酸基、硫酸酯基、磷酸基、磷酸酯基、膦酸酯基等等。選擇任何取代基，從而不會顯著不利地影響反應產率(例如較之沒有具體的取代基或取代基組合時獲得的反應產率不會降低多於20％(或10％，或5％，或1％))。另外，選擇取代基，使得其與存在的其他基團在化學上相容，並且避免本領域技術人員已知的副反應。例如，不應用鋰基團取代醇，因為醇的羥基和鋰基團是不相容的，並且會與彼此反應。對於本公開中的任何基團而言，每個取代基可包含多達40、35、30、25、20、18、16、14、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3個碳原子。總體而言，對任何基團而言，所有取代基中的碳原子總數在某些實施方式中為80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、18、16、14、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3或更少。
術語「雜環」(″heterocycle″、″heterocyclic″或″heterocyclo″)和「雜環基(″heterocyclic group″)」表示在至少一個含碳環中具有至少一個雜原子的、完全飽和或部分或完全不飽和的環基，包括芳香族的(「雜芳基」)或非芳香族的(例如3到13元單環、7到17元二環、或10到20元三環的環狀體系)。含有雜原子的雜環基的每個環可具有1、2、3或4個選自氮原子、氧原子和/或硫原子的雜原子，其中所述氮和硫雜原子可任選地被氧化，並且所述氮雜原子可任選地被季銨化。雜環基可以在環或環體系的任何雜原子或碳原子上被連接。多環雜環的環可以稠合、橋接和/或通過一個或多個螺節點接合。含氮鹼基是雜環的例子。其他例子包括哌啶基、嗎啉基和吡咯烷基。
術語「被取代的雜環」(″substituted heterocycle″、″substitutedheterocyclic″和″substituted heterocyclo″)和「被取代的雜環基」(″substituted heterocyclic group″)表示被一個或多個基團取代的雜環和雜環基，所述基團優選地選自烷基、被取代的烷基、烯基、氧代、芳基、被取代的芳基、雜環、被取代的雜環、碳環(任選地被取代的)、滷素、羥基、烷氧基(任選地被取代的)、芳氧基(任選地被取代的)、烷醯基(任選地被取代的)、芳醯基(任選地被取代的)、烷基酯(任選地被取代的)、芳基酯(任選地被取代的)、氰基、硝基、醯氨基、氨基、被取代的氨基、內醯胺、脲、氨基甲酸酯、磺醯基等等，其中任選的一對或多對取代基和與之結合的原子一起結合形成3到7元環。
術語「吸電子基團」是指下述部件，其具有吸引相鄰原子上價電子的趨勢(即對相鄰原子而言，該取代基是電負性的)。吸電子能力水平的定量由Hammettσ常數給出。該公知常數描述於許多參考文獻中，例如March，Advanced Organic Chemistry 251-59，McGraw Hill Book Company，New York，(1977)。吸電子基團包括硝基、醯基、甲醯基、磺醯基、三氟甲基、氰基、氯基等等。
術語「給電子基團」是指下述部件，其具有排斥相鄰原子上價電子的趨勢(即相對於相鄰原子而言，該取代基是電負性較弱)。給電子基團包括氨基、甲氧基、烷基(包括C1-6烷基，其可具有線性或支化結構)、C4-9環烷基等等。
本文使用的短語「保護基團」是指下述物類，其防止分子的一部分進行特定的化學反應，但是在所述反應完成後可以從所述分子上去除。「保護基團」以其作為下述基團的常規化學含義使用，所述基團可逆地使官能團在期望反應的特定條件下無活性，如例如Greene，et al.，″ProtectiveGroups in Organic Synthesis，″John Wiley and Sons，Second Edition，1991中所教導。在期望的反應後，保護基團可以被去除，從而使受保護的官能團去保護。所有的保護基團應當是在下述條件下可以去除的(並因此是不穩定的)，所述條件不大量降解所合成的分子。與保護基團相反，「加帽基團(capping group)」永久性地與分子的鏈段鍵合，以預防該鏈段的任何進一步化學轉化。應當注意，被保護基團保護的官能團可以是或不是被稱作保護基團的基團的一部分。
「羥基保護基團」或「O-保護基團」是指其中受保護的基團是羥基的保護基團。「反應位點羥基(reactive-site hydroxyl)」是3′-5′多核苷酸合成期間的末端5′-羥基，或5′-3′多核苷酸合成期間的3′-羥基。「游離的反應位點羥基」是在多核苷酸合成期間能夠進行反應形成(即與亞磷醯胺官能團形成)核苷酸間鍵的反應位點羥基。
「硫代碳保護基團」是指通過羰基或硫羥基羰基部件連結的保護基團，其額外地含有與一個或多個下述基(radical)連結的氧、硫或氮，所述基獨立地選自氫、烴基和被取代的烴基，前題是當所述硫代碳保護基團與所述基通過氮連結時，所述基可額外地選自芳基、被取代的芳基、雜環或被取代的雜環。
術語「同時去保護」是指一種過程，其目的在於在相同的並且基本同時或同時進行的過程中去除不同的保護基團。然而，在本文中使用時，該術語不意味著不同保護基團的去保護精確地在相同時間發生或者以相同的速率或相同的動力學發生。
「磷酸(phospho)」基團包括磷酸二酯、磷酸三酯和H-磷酸酯基團。在磷酸基團或亞磷酸基團的情況下，除被取代的5-元呋喃環以外的化學部件可以與連結在呋喃環和P原子之間的磷酸基團或亞磷酸基團的O連接。
術語「亞磷醯胺基團」是指包含結構-P-(OR13)(NR14R15)的基團，其中R13、R14和R15獨立地為烴基、被取代的烴基、雜環、被取代的雜環、芳基或被取代的芳基。在一些實施方式中，R13、R14和R15可選自低級烷基、低級芳基和被取代的低級烷基和低級芳基(優選地被含有多達18、16、14、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個碳原子的結構取代)。在一些實施方式中，R13是2-氰乙基或甲基，並且R14和R15之一或二者為異丙基。R14和R15可任選地環狀相連。
除非另有說明，本文中使用的術語「烷基」是指具有1到24個(典型地1-12個)碳原子的飽和的直鏈、支化或環狀烴基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、環戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、環己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基，和2，3-二甲基丁基。術語「低級烷基」表示1到6個碳原子的烷基，並且包括例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、環戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、環己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、和2，3-二甲基丁基。術語「環烷基」是指環狀烷基，例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基和環辛基。
另外，術語「烷基」包括「經修飾的烷基」，其表示下述烷基，所述烷基具有1到24個碳原子，並且還具有額外的基團例如一個或多個選自醚-、硫-、氨基-、磷-、氧代-、醚-和醯氨基-的連結基，和/或被一個或多個額外的基團取代，所述額外的基團包括低級烷基、芳基、烷氧基、硫烷基、羥基、氨基、磺醯基、硫代、巰基、亞氨基、滷素、氰基、硝基、亞硝基、疊氮基、羧基、硫化物基、碸、硫氧基、磷醯基、甲矽烷基、甲矽烷氧基，和硼醯基。類似地，術語「低級烷基」包括「經修飾的低級烷基」，其表示下述基團，所述基團具有1到8個碳原子，並且還具有額外的基團例如一個或多個選自醚-、硫代-、氨基-、磷-、酮-、酯-和醯氨基-的連接，和/或被一個或多個下述基團取代，所述基團包括低級烷基、芳基、烷氧基、硫烷基、羥基、氨基、磺醯基、硫代、巰基、亞氨基、滷素、氰基、硝基、亞硝基、疊氮基、羧基、硫化物基、碸、硫氧基、磷醯基、甲矽烷基、甲矽烷氧基，和硼醯基。在本文中使用時，術語「烷氧基」表示取代基-O-R，其中R是上文定義的烷基。術語「低級烷氧基」表示下述基團，其中R是低級烷基。在本文中使用時，術語「硫烷基」是指取代基-S-R，其中R是上文定義的烷基。
除非另有說明，在本文中使用時，術語「烯基」表示2到14個、典型的為2到12個碳原子的，支化的、不支化的或環狀(例如C5和C6的情況)的，含有至少一個雙鍵的烴基，例如亞乙基、乙烯基、烯丙基、辛烯基、癸烯基等。術語「低級烯基」表示2到8個碳原子的烯基，並且特定地包括乙烯基和烯丙基。術語「環烯基(cycloalkenyl)」表示環狀的烯基。
除非另有說明，在本文中使用時，術語「炔基」表示2到24個、典型的為2到12個碳原子的，含有至少一個三鍵的，支化或不支化的烴基，例如乙炔基(acetylenyl)、次乙基(ethynyl)、正丙炔基、異丙炔基、正丁炔基、異丁炔基、叔丁炔基、辛炔基、癸炔基等等。術語「低級炔基」表示2到8個碳原子的炔基，並且包括例如乙炔基和丙炔基，術語「環炔基」表示環狀炔基。
術語「烴基」表示烷基、烯基或炔基。術語「被取代的烴基」表示下述烴基，其在烴主鏈的一個或多個碳上具有代替氫的取代基。這類取代基可包括例如羥基、滷素、羰基(例如羧基、烷氧羰基、甲醯基或醯基)、硫代羰基(例如硫代酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷醯基、膦酸酯、次磷酸酯、氨基、醯氨基、脒、亞胺、氰基、硝基、疊氮基、硫氫基、烷基硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺醯基、磺醯氨基(sulfonamido)、磺醯基、雜環、芳烷基，或芳香族或雜芳族基團。本領域技術人員應當理解，適當時烴鏈上的取代基團可以是其自身是被取代的。例如，被取代的烷基的取代基可包括被取代或未被取代形式的氨基、疊氮基、亞胺基、醯氨基、磷醯基(包括膦酸酯和次磷酸酯)、磺醯基(包括硫酸酯、磺醯氨基、氨磺醯基和磺酸酯)，和甲矽烷基，以及醚、烷基硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸酯和酯)，-CN等等。環烷基可被烷基、烯基、烷氧基、烷基硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CN等等進一步取代。
術語「烷氧基」表示與氧連結的烷基，並可由式R-O-表示，其中R代表烷基。一個例子是甲氧基CH3O-。
術語「芳基」表示5-、6-和7-元單環芳族基團，其包含從0到4個雜原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等等。這些在環結構中具有雜原子的芳基也可以被稱作「芳雜環」或「雜芳族化合物」。術語「芳基」也包括具有兩個或更多環的多環環結構，其中兩個或更多的碳由兩個毗鄰的環共有(所述環為「稠環」)，其中這些環中至少一個是芳香族的(例如其他環可以是環烷基、環烯基、環炔基、芳基和/或雜環)。「低級芳基」含有至多18個碳，例如至多14、12、10、8或6個碳。
芳環可以在一個或多個環位置上被上文針對被取代的烴基所描述的那些取代基取代，所述取代基例如為滷素、疊氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、硫氫基、亞胺基、醯氨基、膦酸酯、次磷酸酯、羰基、羧基、甲矽烷基、醚、烷基硫基、磺醯基、磺醯氨基、酮、醛、酯、雜環、芳香族或雜芳族基團、-CF3、-CN等等。
術語「滷素」(″halogen″和″halo″)是指氟、氯、溴、碘。
本文中使用的「連結基」表示與兩個其他部件鍵合的第一部件，其中所述其他部件通過所述第一部件連結。典型的連結基包括醚(-O-)、氧代(-C(O)-)、氨基(-NH-)、醯氨基(-N-C(O)-)、硫(-S-)、磷(-P-)、酯(-O-C(O)-)。
「經功能化的」是指將材料修飾為具有與材料鍵合的特定部件的過程，例如將分子或底物修飾為具有特定的部件；經過所述修飾的材料(例如分子或支持物)被稱作經功能化的材料(例如經功能化的分子或經功能化的支持物)。
用於描述化學結構、基團或部件時，術語「被取代的」表示所述結構、基團或部件包含一個或多個取代基。在本文中使用時，在用第二基團「取代」第一基團的情況下，第二基團與第一基團連接，從而第一基團的部件(通常為氫)被置換為第二基團。
「取代基」是指在化學結構中代替其他基團的基團。典型的取代基包括非氫原子(例如滷素)、官能團(例如但不限於氨基、硫氫基、羰基、羥基、烷氧基、羧基、甲矽烷基、甲矽烷氧基、磷酸酯等等)、烴基和被一個或多個雜原子取代的烴基。示範性的取代基包括烷基、低級烷基、芳基、芳烷基、低級烷氧基、硫烷基、羥基、硫代、巰基、氨基、亞胺基、滷素、氰基、硝基、亞硝基、疊氮基、羧基、硫化物基、碸、硫氧基、磷醯基、甲矽烷基、甲矽烷氧基、硼醯基和經修飾的低級烷基。
在本說明書通篇中多處使用連字號(hyp)或破折號(dashes)來表示連接(鍵合)，例如在正文中兩個指定的基團與破折號緊密相鄰的情況下，表示所述兩個指定的基團區域彼此連接。相似地，正文中每個指定的基團之間有破折號的一系列指定的基團表明所指定的基團以所示順序彼此連接。並且，正文中與破折號相鄰的單個指定基團表明指定的基團典型地與一些其它的、未指定的基團連接。在一些實施方式中，破折號指出的連接可以是例如相鄰指定基團之間的共價鍵。在說明書通篇中多處，正文中可以描述帶有或不帶有相鄰破折號的基團(例如醯氨基或醯氨基-，還例如烷基或烷基-，進一步還有Lnk(連結基)、Lnk-或-Lnk-)，其中這樣的上下文指明該基團旨在(或具有潛力)與另一基團鍵合；在這樣的情況下，基團的身份由基團名稱表示(無論正文中是否存在相鄰的破折號)。注意，當上下文指明時，單個基團可以與多於一個其它基團連接(例如意在表示是連結時，例如連結基團)。
虛線(例如-------)在說明書和權利要求書的通篇中以與指定的基團緊鄰的方式使用，表示與一些其他的、未指定的基團的連接。
「任選的」或「任選地」表示下文所述的情形可能發生或不發生，因此該描述包括所述情形發生的情況和所述情形不發生的情況。例如，短語「任選地被取代」表示非氫取代基可存在或不存在，並且說明書包括其中存在非氫取代基的結構和其中不存在非氫取代基的結構。在本文中多處，部件可以被描述為存在零次或多次這等同於部件是任選的，並且包括其中存在所述部件的實施方式和其中不存在所述部件的實施方式。如果任選的部件不存在(在結構中存在零次)，則被描述為通過所述任選的部件連結的相鄰基團彼此直接連結。類似地，部件可以被描述為(1)連結兩個相鄰基團的基團，或(2)連結兩個相鄰基團的鍵這等同於部件是任選的，並且包括其中存在所述部件的實施方式和其中不存在所述部件的實施方式。如果任選的部件不存在(在結構中存在零次)，則被描述為通過所述任選的部件連結的相鄰基團彼此直接連結。
「鍵合」在本文中可被用於表明直接或間接的連接。在化學結構的語境中，「鍵合」(或「鍵合的」)可表示化學鍵的存在，所述化學鍵直接接合兩個部件或間接接合兩個部件(例如通過連結基團或分子的任何其它插入部分)。化學鍵可以是共價鍵、離子鍵、配位絡合、氫鍵、範德華力相互作用，或疏水堆積(hydrophobic stacking)，或者可以具有多種類型的化學鍵的特徵。在某些情況下，「鍵合」包括其中直接連接的實施方式，也包括其中間接連接的實施方式。在本發明「部件是游離的」語境中使用時，「游離的」表明部件能夠與所述部件是其一部分的溶液的其它組分反應或者接觸，。
術語「評估」包括任何形式的測量，並且包括測定特徵是否存在。術語「測定」、「測量」、「評價」、「評估」和「測定(assaying)」可互換使用，並可包括定量和/或定性測定。評估可以是相對或絕對的。「評估……的存在」包括測定存在的事物的量，和/或測定其是否存在。
「經分離的」或「經純化的」通常表示物質(化合物、多核苷酸、蛋白質、多肽、肽、染色體等)的分離，使得所述物質佔其所在的樣品的顯著部分(溶劑除外)，即大於典型地以其天然或未分離的狀態存在的物質。典型地，樣品的顯著部分佔樣品(溶劑除外)的至少約1％，至少約5％，至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約50％，優選地至少約80％，或更優選地至少約90％。例如，經分離的RNA的樣品典型地會包含至少約5％總RNA，其中百分比在該語境中如下計算樣品中總RNA的質量(例如以微克表示)除以(總RNA+樣品中其它組分(溶劑除外))的總和質量(例如以微克表示)。純化感興趣的多核苷酸和多肽的技術是本領域公知的，並且包括例如凝膠電泳、離子交換色譜、親和性色譜、流動分選和根據密度沉降。在典型的實施方式中，核苷酸組合物中的一種或多種是經分離的形式；更典型地，在本發明的方法中使用之前，所有三種均以經分離的形式獲得。
術語「預先確定的」表示在使用前其身份已知的要素(element)。例如，「預先確定的序列」是在使用或合成具有所述序列的多核苷酸之前，其身份已知的序列。要素可通過其名稱、序列、分子量、功能或任何其它屬性或標識符而已知。
在本文中使用時，「上遊」是指沿多核苷酸(例如RNA分子)的5′方向。「下遊」是指沿多核苷酸的3′方向。「3′-」和「5′-」具有本領域已知的常規含義。
發明詳述 本發明的方面包括2′受保護的核苷單體，其在2′位點上被硫代碳保護基保護。感興趣的硫代碳保護基包括硫代碳酸酯和二硫代碳酸酯基，以及硫代氨基甲酸酯保護基。本發明的方面還包括包含本發明保護基的核酸，以及使用本發明的保護基合成核酸的方法。
在更詳細描述本發明之前，應當理解本發明不限於所述的具體實施方式
，所述具體實施方式
當然可以變化。還應當理解本文使用的命名法僅用於描述具體實施方式
的目的，並不旨在限制，因為本發明的範圍僅由附帶的權利要求限制。
提供數值範圍時，應理解為該範圍上限和下限之間的每個中間值(除非上下文另有清楚說明，到下限單位的十分之一為止)以及所述範圍內任何其它陳述值或中間值均包括在本發明內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括在較小的範圍內，並且也包括在本發明內，受制於所述範圍內任何明確排除的界限。當所述範圍包括界限之一或二者時，排除這些包括在內的界限之一或二者的範圍也包括在本發明內。
本文中展示了某些範圍，其中數值之前存在術語「約」。術語「約」在本文中用於為其後跟隨的精確數值提供文字支持，以及為接近或大約為該術語後數值的數值提供文字支持。在測定數值是否接近或大約為明確指出的數值時，接近或大約的未指出數值可以是下述數值，所述數值在其存在的語境中提供明確指出的數值的基本等同值。
除非另有說明，本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所述領域的常規技術人員通常理解的相同含義。儘管在本發明的實踐或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料，但是接下來描述了代表性的示範性方法和材料。
本說明書中引用的所有出版物和專利通過引用併入，就好像每個個體出版物或專利被明確和個別地指出通過引用併入一樣，並且其通過引用併入本文，用以公開和描述與所述出版物相關的方法和/或材料。任何出版物的引用是針對提交日之前的公開，並不應當被理解為承認本發明沒有資格以在先發明的方式早於所述出版物。另外，提供的出版物的日期可能與實際
公開日期不同，所述實際
公開日期可能需要被獨立地證實。
注意，在本文和附帶的權利要求中使用時，單數形式(″a″，″an″和″the″)包括複數形式，除非上下文另行明確指出。還應注意，權利要求可被撰寫為排除任何任選的特徵。因此，本聲明旨在用作對於與權利要求特徵的記載相結合的排他性術語如「唯一」、「僅」等等的使用或「否定保證」限定的使用的前例基礎。
應當注意，如在繪製一些化學結構時的常規情況，為了清楚的目的將一些氫基團(hydrido group)從所繪製的結構中省略，但是例如對於完全滿足繪製的結構中碳的價鍵而言必需時，應當理解為所述氫基團存在。
閱讀該公開內容後本領域技術人員會明白，本文描述和例證的每個個體實施方式具有分立的組分和特徵，所述組分和特徵可以容易地與其它若干實施方式之任何的特徵分離或合併，而不偏離本發明的範圍或思想。任何複述的方法可以按照複述的事件的順序完成，或者以邏輯上可能的任何其它順序完成。
用硫代碳保護基團保護的單體 如上文所述，本發明的方面包括2′-硫代碳保護基和單體，所述單體包含保護單體2′氧的硫代碳保護基。硫代碳保護基表示包含與碳原子鍵合的硫原子的保護基，其中所述硫原子可以通過單鍵或雙鍵與所述碳原子鍵合。保護基可包含或不包含其它雜原子，例如氧、氮等。在某些實施方式中，保護基是硫代碳酸酯或二硫代碳酸酯保護基。在其它實施方式中，存在氮原子，例如在本發明的硫代氨基甲酸酯保護基中存在氮原子，這在下文更詳細綜述。這些保護基(除硫代氨基甲酸酯外)不包括作為基的苯基。同樣，本發明的硫代碳保護基不包括苯基硫代羰基碳酸酯、苯基硫代羥基碳酸酯和苯基二硫代碳酸酯，其從本發明中被排除。
本發明的實施方式包括具有2′硫代碳酸酯保護基(其中「硫代碳酸酯」包括二硫代碳酸酯)的核苷單體，例如式(I)所述
其中， BP是受保護或未受保護的雜環； R1和R2各自獨立地選自氫、保護基團和亞磷醯胺基； X和Y獨立地為硫或氧，其中X和Y中的至少之一為硫；且 R3獨立地選自烴基和被取代的烴基。
在其中R3是仲(-CH-R′R″)烴基或被取代的仲(-CH-R′R″)烴基的某些實施方式中，R′和R″各自獨立地選自氫、烴基、被取代的烴基、芳基和被取代的芳基，其中在某些實施方式中，當Y為氧時，R3不是叔烴基，即R3不是
式I所述化合物包括但不限於硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯和硫代羰基碳酸酯。這些化合物的實施方式包括下式Ic和Id和Ie所表示的那些
其中 R3獨立地選自烴基和被取代的烴基，條件是當R3是仲(-CH-R′R″)烴基或被取代的仲(-CH-R′R″)烴基時，R′和R″各自獨立地選自氫、烴基、被取代的烴基、芳基和被取代的芳基，其中僅涉及結構Ie所示化合物時，額外的前提條件是R3不是下述結構所述的叔烴基，
也就是說R3′、R3″、R3′″中的至少之一是H。
合適的R3基團的額外例子可見於2006年3月23日提交的題為″Monomer Compositions for the Synthesis of RNA，Methods of Synthesis，andMethods of Deprotection，″的未決的美國申請No.11/388,112，其公開內容通過引用併入本文。
本發明的另一實施方式中，式I中的R3是甲基、乙基、異丙基或苄基。這類實施方式的例子包括以下結構的化合物
在某些實施方式中，本發明的單體包含2′硫代氨基甲酸酯保護基，例如示於式II中所示結構的化合物中的
其中 BP是受保護或未受保護的雜環； R1或R2各自獨立地選自氫、保護基團和亞磷醯胺基； N為NH2或仲胺(-NH-Z)、仲羥基胺(-NH-O-Z)、叔胺(-N-ZZ″)，其中Z和Z″獨立地選自烴基、被取代的烴基、芳基、被取代的芳基，並且其中Z或Z″可以與N環狀相連，或為叔羥基胺(-N-Z-OZ″)，其中Z和Z″獨立地選自烴基、被取代的烴基、芳基、被取代的芳基，並且其中Z或Z″可以與N環狀相連；和 本發明的氨基甲酸酯保護基包括伯、仲、叔和季硫代氨基甲酸酯。這些化合物的實施方式包括下式IIc和IId和IIe和IIf和IIg和IIh所表示的那些
其中 R3選自烴基、被取代的烴基、芳基、被取代的芳基，其中僅針對IIc的前提條件是R3不是2-(N-醯氨基)取代的苯基； R4和R5獨立地選自烴基、被取代的烴基、芳基、被取代的芳基，條件是R4和R5能夠與N環狀相連。
感興趣的特定化合物包括以下結構所描述的化合物
關於上面的化學式，BP基團是受保護或未受保護的雜環。雜環可選自天然存在的嘌呤和嘧啶鹼基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，或經修飾的嘌呤和嘧啶鹼基，和常見的類似物，例如本文所述的類似物。本文上下文中考慮的某些嘌呤或嘧啶類似物包括2002年12月18日提交的題為″Method of Producing Nucleic Acid Moleculeswith Reduced Secondary Structure″的美國專利申請No.10/324,409中所述的類似物；還有1999年7月20日提交的題為″Method of Producing NucleicAcid Molecules with Reduced Secondary Structure″的美國專利申請No.09/358,141(目前已放棄)中所述的類似物。
在一些實施方式中，雜環選自1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-異戊基腺嘌呤、2-甲基硫-N6-異戊基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、2，2-二甲基鳥嘌呤、8-溴鳥嘌呤、8-氯鳥嘌呤、8-氨基鳥嘌呤、8-甲基鳥嘌呤、8-硫代鳥嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨甲基)尿嘧啶、5-(羧甲基氨甲基)-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、辮苷、肌苷、1-甲基肌苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羥基氨基嘌呤、6-硫代嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。
在一些實施方式中，如多核苷酸合成領域中所普遍已知的，雜環可具有保護基團。在某些實施方式中，雜環保護基團與雜環連接，所述雜環保護基團選自乙醯基、二氟乙醯基、三氟乙醯基、異丁醯基、苯甲醯基、9-芴基甲氧羰基、苯氧乙醯基、二甲基甲脒、二丁基甲脒或N，N-二苯基氨基甲酸酯。
受2′硫代碳保護基團保護的單體的合成 本發明的含有硫代碳保護基的核苷單體可使用任何便利的方案生產。在某些實施方式中，使用下述方案生產本發明的受保護的核苷單體，在所述方案中，將具有式(III)中所示結構的核苷單體與具有結構Q-LG的化合物在足以產生式(IV)結構的2′受保護的核苷單體的條件下接觸，
在所述式(III)中 BP是受保護或未受保護的含氮鹼；且 R1和R2各自獨立地為H、亞磷醯胺基、羥基保護基，或R1和R2連結形成二齒保護基(bidentate protecting group)，例如1，3-四異丙基二矽氧烷(TIPS)基， 在所述結構Q-LG中 Q是硫代碳保護基，例如如上文所述；和 LG是離去基團，例如滷素基團， 在所述式(IV)中
LG可以是任何便利的離去基團。離去或活化基團包括但不限於咪唑、氯、對-硝基苯氧基、五氟苯氧基、O-琥珀醯亞胺基(O-succinimidyl)、三氯甲基、溴和碘。
在某些實施方式中，如下文所舉例說明的，本發明單體的合成使用試劑例如Markewicz TIPS試劑，以將保護基定位於所合成的組合物的2′-OH位點，即提供區域選擇性。在以下的流程圖中，R1是硫代碳保護基。通過5′和3′-羥基的暫時保護，例如通過使用Markewicz二矽氧烷保護基，進行2′-羥基保護基的特異引入。下面流程圖中所示1，3-四異丙基二矽氧烷(TIPS)是暫時二齒保護基，其被用於同時封閉5′和3′羥基，允許區域選擇性地保護2′-羥基。也可以使用其它暫時二齒保護基。隨後使用氟化物離子的溶液去除1，3-四異丙基二矽氧烷基團。
流程

圖1。

因此，本發明的方面包括通過如下製造本發明化合物的方法 使式V的化合物與式C1-C(S)-R3的氯硫代甲酸酯反應產生5′，3′-TIPS-2′-O-(R3-硫代)羰基中間產物， 其中所述式V為
BP是受保護或未受保護的含氮鹼； 其中式C1-C(S)-R3中，R3獨立地選自烴基、被取代的烴基，條件是R3不是叔烴基且當R3是仲(-CH-R′R″)烴基或被取代的仲(-CH-R′R″)烴基時，R′和R″獨立地選自氫、烴基、被取代的烴基、芳基和被取代的芳基； b)用15當量到40當量的HF/吡啶去除5′，3′-四異丙基二矽氧烷保護基，產生2′-O-(R3-硫代)羰基核糖核苷中間產物； c)使步驟b)的中間產物與DMTrCl和5當量到10當量的三甲基吡啶或二甲基吡啶反應，並任選地添加DMAP或NMI，產生5′-O-DMT-2′-O-硫羰基-核糖核苷衍生物； d)使來自步驟c)的中間產物與選自CNEO-P(Cl)-N(iPr)2或(二異丙基)氨基甲氧基氯膦的磷酸化試劑反應，產生5′-O-DMT-2′-O-R3-硫羰基-3′-O-甲基(或-氰乙基)亞磷醯胺。上述反應條件是示例性的，類似的條件和方案包括在本發明的範圍內。
已經顯示，使用本文所述的受保護的2′-羥基化合物和開發用於使TIPS基團去保護的條件，可以以前所未有的效率進行該區域特異性暫時保護。已開發了特異性的組合物和方法來選擇性地使TIPS保護去保護，同時保留2′-保護基。例如，HF/吡啶的使用允許選擇性地將TIPS去保護，同時保留硫代碳保護基。
在選擇性去除TIPS保護基之後或期間，重要的是考慮可能的游離3′-羥基形成環狀碳酸酯的進一步反應。2′位置上的硫代羥基碳酸酯在用HF/吡啶/CH3CN去除TIPS期間不經歷環化。另一方面，當使用HF/TEA代替HF/吡啶/CH3CN時，硫代羥基碳酸酯或碳酸酯在一定程度上環化(見下文流程圖2)。
流程圖2。

儘管該環化是不期望的，但是其產生死端(dead-end)環狀碳酸酯產物，所述產物可容易地與期望的產物分離。該環狀物類的形成因此是一種優選的副反應，並且有益於確保最終單體產物和最後RNA寡核苷酸的完整性。該發現與對於2′-羥基使用矽烷或其它保護性基團不同，所述矽烷或其它保護性基團可從2′-羥基異構化到3′-羥基，並且產生具有可疑的5′到3′連結完整性的RNA產物。在這些使用HF的去保護反應中，也可以使用HF的複合物例如HF-TEMED或HF-TMA。也可以使用其它溶劑例如二噁烷、THF或二氯甲烷，但是在某些條件下這些溶劑可由於環狀碳酸酯的形成而導致硫代羥基碳酸酯基團的部分損失。環狀碳酸酯也可以容易地與想要的產物分離。
可以使用任何便利的途徑保護這些新RNA單體的核鹼基。一種感興趣的途徑在本領域中稱為Jones過程；最初由Ti et.al.J.Am.Chem.Soc104，1316-1319(1982)描述。Jones過程使用三甲基矽烷基氯化物對未保護的核苷暫時矽烷基化，以允許醯滷、活化的羰基或羰基酸酐與核鹼基的環外胺區域特異性地反應。在該反應中，向核苷在吡啶和二氯甲烷的溶液中添加大量過量的三甲基矽烷基氯化物。這導致糖殘基的所有羥基與雜鹼基上的環外胺基一起被三甲基矽烷基化，並且可能與雜鹼基上的亞胺基一起被三甲基矽烷基化。當被矽烷基化時，環外胺基保留其對醯滷、活化的羰基或羰基酸酐的反應性，而糖殘基的羥基被保護免於與相同的試劑反應。這導致環外胺的區域特異性保護。在典型的過程中，通過在碳酸氫鈉的存在下的水性後處理，從羥基部件上去除三甲基矽烷基。這一過程可以被修改為通過添加極性溶劑中的甲苯磺酸來支持非水性的後處理。對使用Markewicz保護基TIPS合成的RNA單體而言，在某些實施方式中，在進行Jones反應之前首先使未受保護的核苷與TIPS基團反應是有利的。在TIPS保護的核苷在有機溶劑中顯著更加可溶的條件下，和作為5′和3′羥基被預先保護的結果，可能使用更小量過量的三甲基矽烷基氯化物。後處理後，來自這些反應的產物為N-受保護的3′，5′-四異丙基二矽氧烷核苷。該化合物隨後可直接與2′-保護基反應。
用R3-硫代羥基碳酸酯、R3-二硫代碳酸酯或R3-硫代羰基碳酸酯保護基保護含氮鹼基還允許RNA的一步法的最終去保護，其中鹼基和2′-羥基被同時去保護，這在下文中更詳細地綜述。
在本發明的一些其他實施方式中，可以通過相應的2′-O-硫代羥基碳酸酯之外的阻斷基團保護含氮鹼基。此處可再次進行RNA的一步法最終去保護，將鹼基和2′-羥基同時去保護。這些種類的核苷單體可以從下述核苷開始合成，所述核苷中含氮鹼基已被例如乙醯基(Ac)、二氟乙醯基、三氟乙醯基、異丁醯基(iBu)、苯甲醯基(Bz)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、苯氧乙醯基(Pac)、4-叔丁基苯氧乙醯基(Tac)、異丙基苯氧乙醯基(iPrPac)、苯氧基羰基、三氟甲氧基羰基、二氟甲氧基羰基、氟甲氧基羰基、三氟乙氧基羰基、4-甲基苯氧基羰基、4-乙基苯氧基羰基、4-異丙基苯氧基羰基、4-叔丁基苯氧基羰基、2-甲基苯氧基羰基、2-乙基苯氧基羰基、2-異丙基苯氧基羰基、2-叔丁基苯氧基羰基、4-甲氧基苯氧基羰基、4-乙氧基苯氧基羰基、4-異丙基氧苯氧基羰基、4-丁氧基苯氧基羰基、2-甲氧基苯氧基羰基、2-乙氧基苯氧基羰基、2-異丙基氧苯氧基羰基、2-丁氧基苯氧基羰基、苄基硫羰基、2-氯苄基硫羰基、4-氯苄基硫羰基、2，4-二氯苄基硫羰基、2-氟苄基硫羰基、3-氟苄基硫羰基、4-氟苄基硫羰基、2-三氟甲基苄基硫羰基、3-三氟甲基苄基硫羰基、4-三氟甲基苄基硫羰基、4-硝基苄基硫羰基、甲基硫羰基、乙基硫羰基、異丙基硫羰基、二甲基甲脒、二丁基甲脒、N，N-二苯基氨基甲酸酯等等保護。
在某些實施方式中，使用相同的試劑例如醯滷、活化的羰基或羰基酸酐，使核鹼基上的環外胺基與2′-羥基同時被保護。在該反應流程中，可將未受保護的核苷溶於無水吡啶中，並首先與1摩爾當量的1，3-二氯-1，1，3，3-四異丙基二矽氧烷反應。試劑特異性地反應，形成3′-5′環狀受保護的核苷，保留外環胺的和2′-羥基部件，可用於在下一步驟中可以與醯滷、活化的羰基或羰基酸酐反應。見下文流程圖3。
流程圖3.
在本發明的一些其它實施方式中，通過除硫代碳酸酯之外的其它阻斷基團來保護含氮鹼基。這些種類的核苷單體可以從下述核苷開始合成，所述核苷中的含氮鹼基已被例如乙醯基、二氟乙醯基、三氟乙醯基、異丁醯基、苯甲醯基、9-芴基甲氧羰基、苯氧乙醯基、二甲基甲脒或N，N-二苯基氨基甲酸酯保護。然後可將核苷與TIPSCl2和二硫代氯甲酸酯或硫代羰基氯甲酸酯反應，並如上文流程圖1中所述進行反應。
帶有R3-硫代羥基碳酸酯、R3-二硫代碳酸酯或R3-硫代羰基碳酸酯保護基的單體可以使用活化的R3-硫代羥基碳酸酯、R3-二硫代碳酸酯或R3-硫代羰基碳酸酯合成。合適的流程的實施方式在下文流程圖4-6中展示 流程圖4.5′-O-DMT-2′-O-烴基硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺尿苷的合成
NMI(N-甲基咪唑) HF/吡啶是由HF/吡啶70/30w/w製成的複合物 根據R，三苯甲基化反應可以是緩慢的，並且可以小量(0.1當量)添加NMI或DMAP以加速反應。
流程圖5.5′-O-DMT-2′-O-烴基硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺-N4-苯氧基羰基胞苷單體
TMSCl＝三甲基矽烷基氯化物 PhC(O)OCl＝氯甲酸苯基酯 pTSO3H＝對-甲苯磺酸 R-C(O)SCl＝硫代氯甲酸酯(乙基硫代氯甲酸酯) DMAP-4，4′-二甲氨基吡啶 HF/吡啶是由HF/吡啶70/30w/w製成的複合物 三甲基吡啶是2，4，6-三甲基吡啶 NMI-N-甲基咪唑 流程圖6.5′-O-DMT-2′-O-烴基硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺-N6-苯氧基羰基腺苷和5′-O-DMT-2′-O-烴基硫代羥基碳酸酯-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺-N4-苯氧基羰基鳥苷的合成 A)環外胺的保護
B)2′-羥基的選擇性保護和3′亞磷酸酯化
為了合成2′-O-叔丁基硫代羥基碳酸酯(BSC)尿苷，例如如果不能獲得其它試劑如叔丁基氯硫代甲酸酯時，可以使用5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-(對-硝基苯基)碳酸酯保護的尿苷作為前體。然後使用2-甲基-2-丙硫化鈉(sodium 2-methyl-2-propanethionate)來代替對硝基苯基碳酸酯，如下文流程圖7中所示
因此，作為不能獲得相應的氯硫代甲酸酯時合成2′-硫代羥基碳酸酯的一般途徑，可能使用相應的硫醇衍生物並使其與光氣反應獲得相應的氯硫代甲酸酯，或者也可能使硫醇與2′O-(對-硝基苯基)碳酸酯保護的核苷反應。
因此，作為合成2′-硫代氨基甲酸酯的一般途徑，可以使二矽氧烷保護的式(V)的核苷與乙腈中的1，1′-硫羰基二咪唑在存在催化量的4-(二甲基)氨基吡啶時反應。這些反應導致受保護的核苷定量轉化為式VI的咪唑硫代氨基甲酸酯和晶體產物。

式VI的化合物與乙腈中1.1當量的氨、伯胺或仲胺在催化量4-(二甲基)氨基吡啶時的反應導致定量轉化為想要的2′-硫代氨基甲酸酯。在苯胺或其它弱親核物質的情況下，可使用1當量的4-(二甲基)氨基吡啶實現完全轉化為相應的硫代氨基甲酸酯。在空間上受約束的弱親核物質(例如二氰乙基胺)的情況下，反應可採用在乙腈中與1當量4-(二甲基)氨基吡啶回流整夜，並且得到的產物可以以70％的產率被分離。這些產物可以被如下轉化為活性RNA合成單體首先用15當量到40當量的HF/吡啶去除5′，3′-四異丙基二矽氧烷保護基，產生2′-O-硫代氨基甲酸酯-核糖核苷中間產物。然後使該中間產物與DMTrCl和5當量到10當量三甲基吡啶NMI反應，產生5′-O-DMT-2′-O-硫代氨基甲酸酯-核糖核苷衍生物；然後可以使產物與選自CNEO-P(Cl)-N(iPr)2或(二異丙基)氨基甲氧基氯膦的磷酸化試劑反應，產生5′-O-DMT-2′-O-硫代氨基甲酸酯-核糖核苷-3′-O-甲基(或-氰乙基)亞磷醯胺。
使用硫代碳保護基的核酸合成 本發明的核苷單體可用於有效地合成核酸，例如核糖核酸。所述合成可以在任一方向上進行從3′到5′或從5′到3′。例如，在3′到5′的方向上，帶有5′-OH和3′-保護基的第一核苷單體與具有3′-亞磷醯胺和5′-保護基的第二核苷單體偶聯。第一核苷單體任選地與固體支持物結合。或者，合成可以在溶液中進行。在偶聯步驟中，5′-OH和3′-亞磷醯胺縮合形成亞磷酸三酯鍵並產生二核苷酸，偶聯步驟後將二核苷酸加帽/氧化，並去除5′-保護基(去保護)。所述二核苷酸可隨後用於同具有3′-亞磷醯胺和5′-保護基的另一核苷單體偶聯。重複這些步驟，直至核酸達到想要的長度和/或序列，並可如上文所述去除2′-保護基。在本發明的一些實施方式中，核苷單體含有被與2′-OH相同的保護基保護的鹼基，因此這些保護基均可同時被去除。
由於去除這些保護基的容易性和效率，2′-羥基上和任選地位於鹼基上的硫代碳保護允許合成以前不可能化學合成的長RNA序列。通過本文公開的方法的實施方式合成的核酸可以長達20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150個核苷酸或更長。另外，根據本發明合成的核酸可以與另一核酸組合，形成更長的核酸。例如，70個鹼基的核酸可以通過化學連接與另一70個鹼基的核酸偶聯。又例如，可以用RNA連接酶連接兩個核酸。在這種情況下，應當在連接前去除2′-保護基。
本發明的合成方法可以在固體支持物上完成，所述固體支持物具有可以鍵合化學實體的表面。在一些實施方式中，合成的多種寡核苷酸直接或間接地與相同的固體支持物連接，並且可形成陣列的一部分。「陣列」是已知單體序列的分離分子的集合，所述每條序列以空間上確定和物理地址可設定的方式排列，從而每條序列的定位是已知的。陣列中能夠含有的分子數或「特徵(feature)」數會很大程度上由基板的表面積、特徵的大小和特徵之間的間隔決定，其中陣列表面可括或不包括無特徵區域代表的局部背景區。陣列的密度可達每cm2具有數十萬或更多的特徵，例如2,500到200,000個特徵/cm2。特徵可與基板共價鍵合或不共價鍵合。可互換使用的「陣列」或「化學陣列」包括可設定地址的區域的任何一維、二維或基本二維(以及三維)排列，所述區域上有與該區域關聯的一個或多個特定化學部件(例如配體，例如生物聚合物，例如多核苷酸或寡核苷酸序列(核酸)、多肽(例如蛋白質)、碳水化合物、脂質等等)。下述情況下陣列是「地址可設定的」陣列具有不同部件(例如不同多核苷酸序列)的多個區域，使得陣列上具體預定位點(即「地址」)上的區域(即陣列的「特徵」或「點」)將檢測具體的靶標或靶標種類(儘管特徵可偶然檢測到該特徵的非靶標)。陣列特徵一般(但不必須)被插入性間隔分開。在陣列的情況下，「靶標」應表示要通過探針(「靶標探針」)檢測的移動相(典型地為流體)中的部件，所述探針在多個區域與基板結合。然而，「靶標」或者「探針」可以是要被二者中的另一個評價的一個(因此，二者之任一可以是要通過與另一個結合來評價的分析物例如多核苷酸的未知混合物)。
在一些其它的實施方式中，合成的寡核苷酸直接或間接與珠子連接。合適的固體支持物可具有多種形式和組成，並來自於天然存在的材料、已經合成修飾的天然存在的材料，或合成材料。合適的支持材料的例子包括但不限於二氧化矽，特氟隆(teflons)，玻璃，多糖例如瓊脂糖(例如來自Pharmacia的

)和葡聚糖(例如也來自Pharmacia的

和

)，聚丙烯醯胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，甲基丙烯酸羥乙基酯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，等等。要在基板表面上合成的寡核苷酸的初始單體一般與連結部件鍵合，所述連結部件又與存在於二氧化矽基板上的表面親水基團例如表面羥基部件結合。在一些實施方式中，使用通用連結子。在一些其它實施方式中，初始單體直接與例如表面羥基部件反應。或者，可以首先根據本發明合成寡核苷酸，在合成後通過本領域已知的任何方法將其與固體基板連接。因此，本發明可用於製備寡核苷酸陣列，其中寡核苷酸在陣列上合成，或者在合成後與陣列基板結合。
考慮到本發明的效率和容易性，可以小規模或大規模進行寡核苷酸合成。因此，在一輪完整的本方法中(一個容器中)製造的寡核苷酸量可少於微克，或者以微克、數十微克、數百微克、克、數十克、數百克或甚至千克計。
在本發明的某些實施方式中，在核糖核酸的合成中，例如在核糖核酸的固相或溶液相合成中，使用本發明的經雙重保護的單體。根據本發明的合成可以在任一方向上進行例如從3′到5′或從5′到3′。例如，在3′到5′方向上，將具有5′-OH和3′保護基的第一核苷單體與具有3′亞磷醯胺基和5′保護基的第二核苷單體偶聯。例如使用固相合成方案進行合成時，第一核苷單體任選地與固體支持物結合。或者該合成可以在溶液中進行。
偶聯步驟中5′-OH和3′-亞磷醯胺部件縮合形成亞磷酸三酯鍵並產生二核苷酸，偶聯步驟後將二核苷酸加帽/氧化，並去除5′-保護基(去保護)。所述二核苷酸可隨後用於與具有3′-亞磷醯胺和5′-保護基的另一核苷單體偶聯。重複這些步驟，直至寡核苷酸達到想要的長度和/或序列。
因此，本發明的方面包括合成核酸的方法，所述方法包括步驟提供具有未受保護的羥基的核苷殘基，和具有2′硫代碳保護基的核苷單體；將核苷殘基與2′硫代碳保護的核苷單體在下述條件下接觸，所述條件足以使2′硫代碳保護的核苷單體與核苷共價鍵合，產生核酸。上述章節描述了合成方案的單個單體加成步驟，其中如所期望地用額外的單體重複上述過程，產生具有期望長度和序列的聚合物。如上文所述，在每個單體加成步驟之間，所述過程可包括使核酸暴露於氧化劑和去保護劑。
除了在核苷單體和寡核苷酸合成中的用途外，可有利地在其它分子中使用硫代碳保護基，所述分子中期望保護1，2或1，3-二醇部件同時最小化環狀碳酸酯形成。例如，硫代碳保護基也可以用於區域選擇性去保護下述醇而不去除保護基，所述醇具有除TIPS之外的矽氧烷保護基，例如TBDMS、三甲基矽烷基、三乙基矽烷基和三異丙基矽烷基。被保護的醇可以是除核苷單體或寡核苷酸之外的分子。
RNA去保護 可使用多種不同的去保護方案。去保護/氧化反應基本上可以在被報導用於合成多核苷酸的條件下進行，如例如Dellinger et al.的美國專利No.6,222,030；Dellinger et al.的美國專利No.7,135,565；Seio et al.(2001)Tetrahedron Lett.42(49)8657-8660中所述的。考慮到本文的公開內容，本領域技術人員應當理解，用於去保護/氧化步驟的條件可根據使用的保護基的性質而變化。為了與本文所述的2′-O上的保護基相容，應當選擇用於同時去保護和氧化步驟的條件(即釋放3′-或5′-羥基保護基所需的條件)，使得在用於3′-或5′-羥基保護基的去保護的條件下，新生的多核苷酸的每個2′-O位點上的保護基保持穩定地與新生的多核苷酸結合。在一些實施方式中，用於去保護/氧化反應的條件包括中性到適度鹼性範圍內的pH。在其它實施方式中，去保護/氧化反應的pH至少約6.0，包括至少約6.5的pH，還包括至少約7.0的pH，進一步還包括至少約7.5的pH。在額外的實施方式中，pH小於約12，包括小於約11的pH，還包括小於約10.5的pH，進一步還包括小於約10的pH。
某些實施方式使用組合的去保護/氧化試劑，可以選擇所述試劑來提供尤其有利的合成條件和特性，如本文所述。在一些實施方式中，組合的去保護/氧化步驟用於在中性或適度鹼性的水性條件下將延伸的多核苷酸鏈與α效應親核體接觸，以去除反應性位點羥基保護基(例如對3′到5′方向上的合成而言為5′端，或對5′到3′方向上的合成而言為3′端)，其中保護基在親核攻擊下是不穩定的。α效應親核體還氧化新形成的亞磷酸三酯鍵，得到磷酸三酯鍵。
去保護/氧化試劑可以是與多核苷酸的合成相容並且具有本文所述特性的任何化合物或化合物的混合物。在一些實施方式中，去保護/氧化試劑包含一定濃度的氧化劑，所述濃度高到足以快速氧化新形成的亞磷酸酯核苷酸間鍵。在某些實施方式中，該濃度至少為0.1％體積/體積，包括至少0.5％體積/體積，還包括至少約1.0％體積/體積，進一步還包括至少約3.0％體積/體積。在這些實施方式中，氧化劑的濃度應當低到足以避免對核鹼基或受保護的核鹼基的可感知(例如每個合成循環少於1％)量的氧化破壞。在某些實施方式中，該濃度少於10％體積/體積，包括少於9％體積/體積，還包括少於7％體積/體積。
在一些實施方式中，在去保護/氧化反應期間的反應混合物中，去保護/氧化試劑在中性到適度鹼性pH下提供了過氧陰離子(peroxyanion)的來源。過氧陰離子的濃度應當與過氧化氫物類的平衡酸解離常數相關。過氧陰離子的濃度在總過氧化氫濃度(即所有過氧化氫物類例如質子化和未質子化形式的總和)的0.01％到99％的範圍內，包括佔總過氧化氫濃度的0.05％到90％的範圍，還包括佔總過氧化氫濃度的0.1％到50％的範圍，進一步還包括佔總過氧化氫濃度的1.0％到30％的範圍。
在某些實施方式中，具有α效應的親核去保護劑是過氧化物或過氧化物的混合物。在一些實施方式中，進行去保護/氧化反應的pH通常在從親核去保護試劑的pKa(即用於形成相應過氧陰離子的pKa)之下約三個pH單位到親核去保護試劑的pKa之上約三個pH單位的範圍內。在其它實施方式中，去保護/氧化反應的pH在從親核去保護試劑的pKa之下約一個pH單位到約pH 11的範圍內。在其它實施方式中，pH會是允許足夠高濃度過氧陰離子形成的範圍，例如從約過氧化物的pKa到約11的pH。過氧化物可以是無機的或有機的。合適的無機過氧化物包括式M+OOH-的過氧化物，其中M+是任何反離子，包括例如H+、Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+等等。在一些實施方式中，使用過氧化鋰或過氧化氫及其經鹼穩定的形式。合適的有機過氧化物包括式ROOH的過氧化物，其中R選自烷基、芳基、被取代的烷基、被取代的芳基和經修飾的烷基。更具體地，有機過氧化物具有式(VI)、式(VII)或式(VIII)的結構
其中R13到R19獨立地選自由氫、烴基、被取代的烴基、芳基和被取代的芳基組成的組。在一些實施方式中，α效應親核體是叔丁基過氧化氫或間氯過氧苯甲酸。例如，已發現間氯過氧苯甲酸(mCPBA)過氧陰離子適用於去除反應性位點羥基上的保護基。
如上文所述，合成循環的步驟可包括偶聯步驟和同時去保護/氧化步驟。在根據本發明合成多核苷酸的方法的一個實施方式中，合成循環的這些步驟可以被重複多次，以產生具有期望的序列的多核苷酸。
在一些實施方式中，在一系列偶聯和去保護/氧化步驟導致具有期望的序列和長度的寡核苷酸後，使得到的寡核苷酸經歷合成後去保護步驟，其中雜環和/或2′-氧上受保護的位點被去保護。例如，與得到的核苷酸的核苷酸亞單元的雜環和/或2′-位點鍵合的保護基可以被去除，提供去保護的寡核苷酸。
根據本發明的一些實施方式提供了用於合成後RNA去保護的方法和組合物，尤其是用於去除2′-苯並二硫雜環戊烷(2′-benzodithiolane，BDT)基團的組合物，例如pH 3.8下的HBF4/TEMED，如下文流程圖8中所示，其中Ac代表硫代碳保護基。

如上文所述，可使用多種方案從合成的聚合物上去除硫代碳保護基。在某些實施方式中，使用含氟化物離子的溶液(例如四烷基氟化銨如四甲銨、四乙銨或四丁銨)直接去除保護基。可將這些鹽以合適的濃度(例如1摩爾的濃度)溶於非質子極性溶劑例如四氫呋喃、二噁烷或乙腈中。在從2′-羥基上對硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯保護基去保護時，不含酸性質子的溶液例如TBAF(四丁基氟化銨)顯著比氫氟酸鹽例如HF/TEMED或HF/TEA(三乙胺)表現更好。最近報導了用TBAF對氨基甲酸酯的去保護(Jacquemard et al.，Tetrahedron 6010039-47(2004))。先前已經證明，通過將水含量保持低於5％顯著地改善了不含氫氟酸的氟化物離子鹽例如TBAF在去矽烷基化反應中的效率(Hogrefe et al，Nucleic Acids Research 21479-41(1993))。還顯示通過降低溶液的水含量，也顯著增強了硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯的去保護效率。這些溶液可含有從2％到10％的水(v∶v)，例如從2％到6％的水，並包括從2％到4％的水。然而，通過向TBAF溶液中添加分子篩來降低這些溶液中的水含量也可以導致TBAF通過室溫下稱作Hoffmann消除的化學反應而分解(Cox et.al.J.Org.Chem.493216-19(1984))。得到的降解產物產生酸性鹽四丁基銨-氫二氟化物(HF2TBA或二氟化物)。不含二氟化物的TBAF溶液顯示比含有二氟化物的溶液更加快速和有效地對硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯保護基進行去保護。可能使用19F氟NMR(Sun and DiMagno，J.AM.Chem.Soc.127，2050-51(2005))測定二氟化物含量，並通過將TBAF溶液在強鹼(例如但不限於氫氧化鈉或碳酸鉀)中儲存或者通過添加叔胺(例如但不限於三乙胺或二異丙基乙胺或四烷基銨氫氧化物，例如四丁基銨氫氧化物(TBAOH)等等)將其消除。用於對2′-羥基上的硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯或硫代羰基碳酸酯保護基進行去保護的TBAF溶液在某些實施方式中含有少於30％，例如少於5％和在某些實施方式中少於2％的二氟化物。
在某些實施方式中，TBAOH自身起到能夠對2′-硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯保護基去保護的試劑的作用。事實上，已發現甚至在溶液中存在大於10％水含量時，用過量四烷基銨氫氧化物處理的TBAF溶液在這些新的2′-保護基的去保護中也高度有活性。然而，如果以與二氟化物等同的摩爾數向含二氟化物的TBAF溶液中添加TBAOH，則為了在硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯的去保護中具有高度活性，得到的去保護溶液水含量應當較低。這些TBAF/TBAOH溶液可含有2％到10％的水，例如從2％到6％的水，並包括從2％到4％的水。如果向TBAF溶液中添加超過二氟化物含量的TBAOH，則得到的溶液在硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯或硫代羰基碳酸酯或硫代氨基甲酸酯保護基的去保護中是高度活性的，與水含量無關。因此總結到 如果[TBAOH]～[HF2TBA]，則TBAF/TBAOH中的[H2O]＜5％ 如果[TBAOH]＞[HF2TBA]，則TBAF/TBAOH中的[H2O]＜30％ 然而，對RNA上2′-羥基的去保護中能夠使用的水和四烷基銨氫氧化物的過量二者存在限制。如果極性非質子溶劑去保護溶液的水含量在存在過量四烷基銨氫氧化物時變得過高，則得到的RNA產物可以通過本領域公知的一般鹼機制而被降解。在某些實施方式中，這些溶液的水含量為30％或更少，例如為10％或更少，並且包括5％或更少。類似地，如果極性非質子溶劑溶液中四烷基銨氫氧化物的濃度變得過高，則RNA產物也可以被降解。應當以30％或更少，例如25％或更少並且包括20％或更少的濃度，將四烷基銨氫氧化物溶解。也可以在極性非質子溶劑中稀釋單獨的(即不含TBAF的)TBAOH，使硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯、硫代羰基碳酸酯或硫代氨基甲酸酯保護基從2′-羥基去保護。然而，與含有相同稀釋濃度TBAOH的TBAF溶液相比，去保護速率較低。將RNA暴露於稀釋的TBAOH溶液在若干天后和2′-硫代羥基碳酸酯保護基完全去保護後導致部分RNA降解。含有過量TBAOH的1摩爾TBAF溶液(即相同稀釋的TBAOH濃度下[TBAOH]＞[HF2TBA])在數小時內給予RNA的完全去保護。另外，將RNA暴露於該TBAOH/TBAF溶液中若干天未產生任何能夠觀察到的期望RNA產物的降解。因此，TBAF溶液似乎具有加速去保護反應和保護RNA主鏈免於降解的兩種作用。我們還鑑定了代替TBAF以1摩爾溶於極性非質子溶劑中並添加TBAOH的其它四烷基銨鹽既能夠加速硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯、硫代羰基碳酸酯或硫代氨基甲酸酯保護基的去保護又能夠保護RNA主鏈免於降解，所述四烷基銨鹽例如四丁溴化銨和四丁銨乙酸鹽，所述極性非質子溶劑例如但不限於二噁烷、THF和乙腈。這些四烷基銨鹽應當以0.1摩爾或更大的濃度，例如0.25摩爾或更大的濃度並且包括0.5摩爾或更大的濃度溶於極性非質子溶劑溶液中。
本發明的實施方式包括用於下述溶液的組合物，所述溶液用於使包含2′-O-硫代羰基碳酸酯基、-二硫代碳酸酯基、-硫代羥基碳酸酯基或2′-O-硫代氨基甲酸酯保護基的RNA去保護。這類組合物包括含有受控量強鹼和受控量水的TBAF，條件是當[TBAOH]～[HF2TBA]時，TBAF/TBAOH溶液可耐受2％到10％的水，例如從2％到6％的水，並且包括2％到4％的水，當[TBAOH]＞[HF2TBA]時，TBAF/TBAOH溶液可含有30％或更少的水，例如10％或更少的水，並且包括5％或更少的水，所述強鹼例如但不限於TBAOH、NaOH、碳酸鉀、四烷基銨氫氧化物和無機氫氧化物，例如但不限於LiOH、CsOH。
其它組合物包括以1摩爾濃度溶於極性非質子溶劑中的四烷基銨鹽，例如四丁基按溴化物(TBAB)和四丁基銨乙酸鹽(TBAA)，所述極性非質子溶劑例如但不限於二噁烷、THF和乙腈。向這些溶液中添加可溶於極性非質子溶劑中的強鹼加速硫代羥基碳酸酯、二硫代碳酸酯、硫代羰基碳酸酯或硫代氨基甲酸酯保護基的去保護同時保持RNA主鏈免於降解，所述強鹼例如但不限於TBAOH、四烷基銨氫氧化物和無機氫氧化物，例如但不限於LiOH、CsOH。
本發明的又一實施方式包括本文所述的組合物RNA去保護溶液，其包含10％到30％(v/v)的溶於MeOH或H2O中的1M強鹼(選自四烷基銨氫氧化物和無機氫氧化物)溶液，所述強鹼溶液被添加到溶於極性非質子溶劑(選自THF、二噁烷和乙腈)中的1M四丁基銨鹽(選自TBAF、TBAB和TBAA)溶液中，所述RNA去保護溶液中的最終水含量少於20％(v/v)，更優選地少於10％，最優選地少於5％。
在其它實施方式中，可以在不導致RNA鏈破壞的條件下，使用胺使硫代羰基碳酸酯和硫代氨基甲酸酯去保護。

如所公知的，在鹼性條件下，RNA通過涉及2-羥基的轉酯基反應經歷切割和降解[Journal of Organic Chemistry，1991.56(18)p.5396-5401；Journal of the American Chemical Society，1999.121(23)p.5364-5372；Chemical Reviews，1998.98(3)p.961-990.]。水性溶液中RNA 2′-羥基的pKa可根據鹽濃度和鹼基序列而變化，但是典型地在13左右[Journal ofthe American Chemical Society，2001.123(12)p.2893-2894.；J Org Chem，2003.68(5)p.1906-10.]。(質子化的)氨的pKa約為9.2，這意味著典型地用於從合成製備的寡核苷酸上去除保護基的水性氫氧化銨溶液具有大於12的pH。在這些高pH下，大量2′-羥基被去保護，並且公知的鹼催化的轉酯基反應導致主鏈切割。

在典型的水性條件下，更強的鹼例如甲胺(pKa 10.6)或三乙胺(pKa 10.6)會促進RNA主鏈切割，甚至比氨更容易。寡核苷酸合成典型地在鹼基上使用下述保護基，所述保護基用胺鹼例如氨或甲胺的水性溶液去除。在RNA的情況下，期望在該過程中2′-羥基保護是完整的，從而避免鹼催化的主鏈切割。
然而，先前針對胺鹼和2′-羥基描述的pKa是用於水性條件的。已知存在有機溶劑時弱酸和鹼的電離常數可顯著改變[J Biochem Biophys Methods，1999.38(2)p.123-37.]。有機分子在雙極性非質子溶劑中、尤其是在二甲基亞碸中的酸度已被廣泛研究。在水中pKa為4.7的乙酸在DMSO中是pKa為12.3的更弱酸。在水中pKa約為15的甲醇在DMSO中pKa為～28。通常，對於離子化為帶電陰離子物類的中性化合物(例如離子化為烷氧基陰離子的羥基)而言，減少溶劑的介電性通常導致下式酸平衡常數的降低(pKa的提高)
因此，苯酚在水(介電常數＝78)中pKa約為10，而在DMSO(介電常數＝47)中pKa約為16，在乙腈(介電常數＝36)中pKa約為27[J.Phys.Chem.，1965.69(9)p.3193-3196；J.Am.Chem.Soc，1968.90(1)p.23-28；Journal of Organic Chemistry，2006.71(7)p.2829-2838]，這是16個數量級的改變。因此在乙腈中苯酚是非常弱的酸(相應的陰離子是非常強的鹼)。應當明白，溶劑的介電常數不是影響化合物pKa的唯一變量。溶劑鹼性、極性、氫鍵和其它特異和非特異性相互作用能夠影響溶劑的溶解能力，並且對溶解的溶質的pKa具有顯著影響。
對於解離成中性化合物的帶電化合物而言，例如對質子化的胺的解離而言，減少溶劑的介電性通常僅導致相對小量的pKa改變。

因此，(質子化的)三乙胺在水中的pKa約為11，而在DMSO中pKa約為9，在乙腈中pKa約為18。在乙腈中，三乙胺是比水中稍微更強的鹼(從水中到乙腈中的δpKa為～7)，而在DMSO中其實際為更弱的鹼。
結果，可以在有機溶劑中使用胺對RNA進行2′-去保護。用於降解RNA的鹼催化的機製取決於鹼將羥基去保護至下述程度的能力，所述程度足以使環化和切割反應可以以顯著的速率發生。在對2′-羥基去質子化的胺鹼水溶液的情況下，存在約4個pKa單位的差異，所述差異足夠接近，從而濃縮的胺鹼溶液能夠顯著地使羥基去質子化。然而，使用有機溶劑時，2′-羥基的pKa提高得比胺鹼顯著更多。在溶劑例如乙腈中，常規胺例如氨或甲胺不是足以對2′-羥基去保護的強鹼。事實上，在乙腈中胺鹼甚至不足以強到對苯酚去質子化。儘管氨在乙腈中是更強的鹼(從水到乙腈時共軛酸的pKa從9.2提高到16.5，δpKa約為7)[J.Am.Chem.Soc，1968.90(1)p.23-28.]，苯酚變成相對更弱的酸，其pKa從約10提高到27(δpKa為～17)。苯酚和氨的酸鹼對在水中具有少於1個pKa單位的pKa差異，在乙腈中具有約10個pKa單位的pKa差異。脂肪族羥基例如RNA的2′-羥基在乙腈中的真實pKa被提高至難以測量的點(計算給出約35的pKa)。在乙腈和許多其它有機溶劑中，胺鹼與脂肪族醇之間溶劑介導的平衡以超過10個數量級有利於兩種中性物類，並且RNA的降解不會以可感知的速率發生。

因此，將RNA暴露於胺鹼的有機溶劑溶液是對RNA的環外胺保護基以及2-羥基保護基二者進行去保護的一種實踐方法。在一些有機溶劑中胺鹼的親核性甚至被增強，並且因此去保護速率甚至被增強。環外胺和2′-羥基的去保護可以同時或相繼進行。只要溶液不含有足以顯著改變胺與羥基的有利的pKa差異，並且適當選擇保護基，則RNA的降解相對於去保護速率而言會非常低。
在其它實施方式中，期望避免試劑液體溶液的遞送。胺鹼例如氨或甲胺在室溫和壓強下是氣體，並且許多胺鹼在這些條件下具有顯著的蒸汽壓。它們可以作為氣體或作為氣體混合物的組分被遞送，所述氣體混合物中其它組分是惰性氣體例如氮或氬。
在氣相中，胺的鹼度和醇的酸度也是對RNA的穩定性有利的。(甲胺的質子親合力約為214kcal/摩爾，而醇(例如乙醇)的氣相酸度約為370kcal/摩爾)。然而應當明白，在氣相遞送的情況下，任何實際的化學反應和平衡很可能受固相表面以及吸附的溶劑(包括水)的不定量和殘餘量的影響。我們已顯示胺的氣相遞送是液相遞送的有效替代方式，並且有時是優選的替代方式。或者，胺鹼可以作為溶於有機溶劑(例如乙腈或二噁烷)的胺溶液的氣相頂空組分被遞送。在這種情況下，有機溶劑蒸汽也會被遞送，並且在某些條件下會在固體支持物上凝結。另一種替代方式是添加純胺，但是保持液體不直接與樹脂本體接觸。這可以例如如下實現將液體添加至器皿中，其中通過使樹脂位於分離的容器中而不與液體接觸，或者將小量純胺添加至相對更大量的樹脂中，從而僅部分地溼潤樹脂。胺(例如氨和甲胺)僅在壓強下為液體，並且會自發蒸發進入氣相，直至(在閉合體系中)達到平衡。胺(例如丙胺和丁胺)是在室溫下具有顯著蒸汽壓的液體，並且會蒸發至更少的程度。另一種替代性的遞送方法是在有機溶劑中添加胺，但是保持液體溶液不直接與樹脂本體接觸。這會與純胺遞送表現相似，但是如通過溶劑的蒸汽壓所決定的，得到的氣相也會含有有機溶劑蒸汽。在純胺遞送的情況下，這可以在閉合的體系中完成，並且胺和溶劑會與氣相達成平衡，或者可使用惰性氣體流或溶劑蒸汽在開放體系中建立動態平衡。
在另一實施方式中，存在在合適的有機溶劑中或者在氣相中遞送胺鹼溶液的顯著優點，所述優點是儘管將RNA與固體支持物表面共價連接的連結子可以被鹼例如氨切割，但是RNA自身不會脫離樹脂。在許多有機溶劑(例如異丙醇和乙腈)中，RNA不是可感知地可溶，和/或會保持被固體支持物吸附或與之結合。這與用胺的水溶液或DMSO溶液處理固體支持物相反，所述處理引起連結子的切割並隨後將RNA溶解進水或DMSO溶液中。
在一個實施方式中，可以用胺將硫代羰基碳酸酯和硫代氨基甲酸酯從2′-羥基上切割而不導致想要的RNA的破壞。
在一個實施方式中，受硫代氨基甲酸酯保護的2′-羥基的去保護既取決於切割條件又取決於硫代氨基甲酸酯的結構。通常存在切割硫代氨基甲酸酯的大量可能的機制，在下文以用作合適胺鹼的氨為例示出。所示的第一種機制針對含有仲氮的硫代氨基甲酸酯，這示出了通過形成異硫氰酸酯而進行的鹼催化的反應[Canadian Journal of Chemistry-Revue Canadienne DeChimie，2005.83(9)p.1483-1491]。

第二種機制示出了下述反應，所述反應涉及氨對羰基的攻擊，隨後形成硫代羰基尿素和醇[Bulletin of the Korean Chemical Society，2006.27(1)p.143-146]。

當R＝乙基時酸性氫的pKa被評估為約為13.6[Canadian Journal ofChemistry-Revue Canadienne De Chimie，2005.83(9)p.1483-1491]。使用相對弱的鹼例如氨時，能夠降低氮pKa的R基團會有利於生成陰離子中間產物的反應，所述R基團通過共振或吸電子誘導效應穩定氮上的負電荷。然而，穩定氮上負電荷的R基團也會減緩陰離子中間產物分解成為異硫氰酸酯。下述R基團以及用於攻擊親核體的低位阻會有利於隨後形成硫氫基尿素和醇的競爭機制，所述R基團的負電荷足以將羰基活化為親核攻擊。在叔氮化合物的情況下，不可能有競爭異硫氰酸酯機制，並且化合物被親核攻擊時僅可氨解。

上述機制的一種可能的初始產物[Bulletin of the Korean ChemicalSociety，2006.27(1)p.143-146]是下文示出的四面體中間產物。

這樣的中間產物提示，一個或多個質子轉移步驟在2′-羥基的排出和產物形成發生之前發生。合適的給質子物類的存在和反應性或者溶劑的介導可能對反應發生而言是重要的。
下文示出的一種替代性的共振的4-中心過渡態也可以是可能的，並且顯示與乙腈中芳基N-乙基硫代氨基甲酸酯的氨解一起作用[Journal ofOrganic Chemistry，2005.70(14)p.5624-5629]。

對於共振機制，使過渡態穩定化的保護基和攻擊性親核體的結構修飾是至關重要的。
在又一個實施方式中，可以使用胺將硫代羥基碳酸酯轉化為氨基甲酸酯。通過使用伯胺或仲胺替換硫醇，可以將2′-O-硫代羥基碳酸酯轉化為穩定的經修飾的2′-核苷酸或寡核苷酸。

核酸產物 本發明的方面還包括本發明方法的核酸產物。本發明方法的核酸產物(例如RNA)大小可以變化，在某些實施方式中長度範圍從2到200或更多個單體單位，例如長度為2到100或更多個單體單位，包括長度為2到50或更多個單體單位。在某些實施方式中，產物核酸的大小範圍為長度從2到25個單體單位，例如長度為15到25個單體單位，例如長度為17到23個單體單位，包括長度為19、20、21或22個單體單位。
在某些實施方式中，本發明的核酸產物具有式(VI)的結構
其中 BP是如上文所定義的受保護或未受保護的含氮鹼基； Q是硫代碳保護基，例如如上文所述； R12選自由氫、烴基、被取代的烴基、芳基和被取代的芳基組成的組；且 m是大於1的整數。
在額外的實施方式中，核酸具有下文式IXa到IXc的結構
在另外的實施方式中，核酸具有下文式X的結構
其中上述結構中的變量如上文定義。
應用 根據本發明的方法生產的產物核酸可用於多種應用，包括研究、診斷和治療應用。例如，產物核酸可用於研究應用，例如作為探針、引物等。關於診斷應用而言，產物核酸也可用作探針、引物，或診斷方案中使用的其它藥劑。關於治療應用而言，產物核酸可用作基因治療應用、幹擾RNA(即iRNA或RNAi)應用等等中的任何DNA、RNA或其它核酸治療劑，例如反義核酸。
根據合成的核酸所針對的應用，核酸在其合成後可以或不可以用一些方式修飾。同樣，在某些實施方式中，產物核酸在合成後不被進一步修飾。還在其它實施方式中，核酸在其合成後以一些方式被修飾。
可以根據期望對產物核酸進行多種不同的修飾。例如，當產物核酸是幹擾核糖核酸(iRNA)時，多種合成後修飾可以是期望的。iRNA試劑可以被進一步修飾從而與配體結合，所述配體被選擇為促進穩定性、藥劑(例如膽固醇)的分布或細胞攝入。主要為了iRNA實施方式方面的便利，描述以下合成後修飾。然而，這類修飾容易適應DNA實施方式，並且以下的描述同樣包括這類實施方式。
可以根據期望，在從支持物上切割核酸之前或之後進行以下修飾。
未經修飾的RNA是指一種分子，其中核酸的組分(即糖、鹼基以及磷酸部件)是與天然存在的(例如人體中天然存在的)相同或基本相同的。本領域將罕見或不常見的，但是天然存在的RNA稱作經修飾的RNA，見例如Limbach et al.，(1994)Nucleic Acids Res.222183-2196。在本文中使用時，通常被稱作經修飾的RNA的這類罕見或不常見的RNA(顯然因為這些典型地是轉錄後修飾的結果)屬於術語未經修飾的RNA的範圍內。在本文中使用時，經修飾的RNA是指下述分子，其中核酸的一個或多個組分(即糖、鹼基和磷酸部件)與天然中存在的不同，例如與人體中存在的不同。儘管它們被稱作經修飾的「RNA」，但是它們因為修飾而當然包括不是RNA的分子。核苷代用品是下述分子，其中核糖磷酸主鏈被替換為非核糖磷酸構造，所述構造允許鹼基以正確的空間關係存在，從而雜交與使用核糖磷酸主鏈(例如帶電荷的核糖磷酸主鏈模擬物)觀察到的雜交基本相似。本文中討論了上述每種的例子。
本文所述的修飾可以被摻入本文所述的任何雙鏈RNA和RNA樣分子中，例如iRNA試劑中。可以期望修飾iRNA試劑的反義鏈和正義鏈之一或二者。因為核酸是亞單元或單體的聚合物，所以下文所述的許多修飾發生於核酸內重複的位置上，例如對鹼基或磷酸部件或磷酸的非連結性O的修飾。在一些情況下，修飾會發生在核酸中所有受試位置上，但是在許多情況下，事實上在大部分情況下則不會。舉例而言，修飾可僅發生在3′或5′末端位置上，可僅發生於末端區域，例如在末端核苷酸位置上，或者鏈的最後2、3、4、5或10個核苷酸中。修飾可發生於雙鏈區域、單鏈區域或二者中。例如，非連結性O位置上的硫代磷酸酯修飾可僅發生於一個或兩個末端上，可僅發生於末端區域中，例如末端核苷酸上的位置上或者鏈的最後2、3、4、5或10個核苷酸中，或者可發生於雙鏈和單鏈區域中，尤其是末端上。類似地，修飾可發生於正義鏈、反義鏈或二者上。在一些情況下，正義鏈和反義鏈會具有相同的修飾或相同種類的修飾，但是在其它情況下正義鏈和反義鏈會具有不同的修飾，例如在一些情況下可能期望僅修飾一條鏈，例如正義鏈。
向iRNA中引入修飾的兩種主要目的是它們對生物學環境中降解的穩定化，和對藥理特性(例如藥物動力學特性)的改善，這在下文進一步討論。對糖、鹼基或iRNA試劑主鏈的其它合適的修飾描述於2004年1月16日提交的PCT申請No.PCT/US2004/01193中。iRNA試劑可包含非天然存在的鹼基，例如2004年4月16日提交的PCT申請No.PCT/US2004/011822中所述的鹼基。iRNA試劑可包含非天然存在的糖，例如非碳水化合物環狀載體分子。用於iRNA試劑中的非天然存在的糖的示範性特徵描述於2003年4月16日提交的PCT申請No.PCT/US2004/11829中。
iRNA試劑可包含適用於提高核酸酶抗性的核苷酸間鍵(例如手性硫代磷酸酯鍵)。另外，或者替代性地，iRNA試劑可包含用於提高核酸酶抗性的核糖模擬物。用於提高核酸酶抗性的示範性的核苷酸間鍵和核糖模擬物描述於2004年3月8日提交的PCT申請No.PCT/US2004/07070中。
iRNA試劑可包含用於寡核苷酸合成的與配體綴合的單體亞單元和單體。示範性的單體描述於2004年8月10日提交的美國申請No.10/916,185中。iRNA試劑具有ZXY結構，例如2004年3月8日提交的PCT申請No.PCT/US2004/07070中描述的ZXY結構。iRNA試劑可與兩性部件絡合。適用於iRNA試劑的示範性兩性部件描述於2004年3月8日提交的PCT申請PCT/US2004/07070中。
在另一實施方式中，iRNA試劑可以與具有模塊絡合物的遞送劑絡合。絡合物可包含與以下中的一個或多個(例如兩個或更多，包括所有三個)連結的運載劑(a)縮合劑(例如能夠例如通過離子或靜電相互作用來吸引(例如鍵合)核酸的試劑)；(b)融合劑(例如能夠融合和/或通過細胞膜轉運的試劑)；和(c)靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如與特定細胞類型結合的凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體。與遞送劑絡合的iRNA試劑描述於2004年3月8日提交的PCT申請No.PCT/US2004/07070中。
iRNA試劑可具有不規範的配對，例如在iRNA雙鏈體的正義和反義序列之間的配對。不規範的iRNA試劑的示範性特徵描述於2004年3月8日提交的PCT申請No.PCT/US2004/07070中。
iRNA試劑可具有增強的對核酸酶的抗性。為了增強核酸酶抗性和/或與靶標的親合力，iRNA試劑(例如iRNA試劑的正義和/或反義鏈)可包含例如2′-經修飾的核糖單位和/或硫代磷酸酯鍵。例如，2′-羥基(OH)可以被修飾或被大量不同的「氧」或「脫氧」取代基替換。
「氧」-2′-羥基修飾的例子包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R＝H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙烯二醇(PEG)，O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；「封閉的」核酸(LNA)，其中2′-羥基例如通過亞甲基橋與相同核糖的4′碳連接；O-AMINE和氨基烷氧基、O(CH2)nAMINE(例如AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、雜環基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基或二雜芳基氨基、乙二胺、多聚氨基)。值得注意的是僅含有甲氧基乙基(MOE)(OCH2CH2OCH3，PEG衍生物)的寡核苷酸顯示可與經充分的硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸相比的核酸酶穩定性。
「脫氧」修飾包括氫(即脫氧核糖，尤其與部分ds RNA的懸突相關)；滷素(例如氟)；氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、雜環基、芳基氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基、二雜芳基氨基或胺基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、雜環基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、雜芳基氨基、或二雜芳基氨基)；-NHC(O)R(R＝烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)，氰基；巰基；烷基-硫-烷基；硫代烷氧基；和烷基、環烷基、芳基、烯基和炔基，其可任選地被例如氨基官能團取代。
提高抗性的一種方式是鑑定切割位點並修飾這類位點從而抑制切割，如2004年5月4日提交的美國申請No.60/559,917中所述。例如，二核苷酸5′-UA-3′、5′-UG-3′、5′-CA-3′、5′-UU-3′或5′-CC-3′可起到切割位點的作用。因此，可通過修飾5′核苷酸實現增強的核酸酶抗性，得到例如至少一個5′-尿苷-腺嘌呤-3′(5′-UA-3′)二核苷酸，其中所述尿苷為2′-經修飾的核苷酸；至少一個5′-尿苷-鳥嘌呤-3′(5′-UG-3′)二核苷酸，其中所述5′-尿苷是2′-經修飾的核苷酸；至少一個5′-胞苷-腺嘌呤-3′(5′-CA-3′)二核苷酸，其中所述5′-胞苷是2′經修飾的核苷酸；至少一個5′-尿苷-尿苷-3′(5′-UU-3′)二核苷酸，其中所述5′-尿苷是2′-經修飾的核苷酸；或至少一個5′-胞苷-胞苷-3′(5′-CC-3′)二核苷酸，其中所述5′-胞苷是2′-經修飾的核苷酸。iRNA試劑可包含至少2個、至少3個、至少4個或至少5個這類二核苷酸。在某些實施方式中，iRNA試劑的所有嘧啶都帶有2′-修飾，並且因此iRNA試劑具有增強的對內切核酸酶的抗性。
為了最大化核酸酶抗性，可以與一個或多個磷酸連結子修飾(例如硫代磷酸酯)組合使用2′修飾。所謂的「嵌合」寡核苷酸是含有兩種或更多不同修飾的寡核苷酸。
寡核苷酸主鏈中包含呋喃糖也能減少內切核酸切割(endonucleolyticcleavage)。可以通過包含3′陽離子基團，或者通過用3′-3′鍵轉化3′-端的核苷來進一步修飾iRNA試劑。在另一種替代方式中，可以用氨基烷基例如3′C5-氨基烷基dT封閉3′端。其它3′綴合物可抑制3′-5′外切核酸切割(exonucleolytic cleavage)。儘管不受理論束縛，但是3′綴合物(例如萘普生或布洛芬)可通過立體阻斷外切核酸酶與寡核苷酸的3′端結合而抑制核酸外切切割。甚至小的烷基鏈、芳基或雜環綴合物或經修飾的糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)也能夠阻斷3′-5′-外切核酸酶。
類似地，5′綴合物能夠抑制5′-3′外切核酸切割。儘管不受理論束縛，但是5′綴合物，例如萘普生或布洛芬，可以通過立體阻斷外切核酸酶與寡核苷酸的5′-端結合而抑制核酸外切切割。甚至小的烷基鏈、芳基或雜環綴合物或經修飾的糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)也能夠阻斷3′-5′-外切核酸酶。
當雙鏈體iRNA試劑在至少一個末端包含單鏈核苷酸懸突時，iRNA試劑可具有提高的對核酸酶的抗性。在一些實施方式中，核苷酸懸突包含1到4個未配對的核苷酸，在其它實施方式中，包含2到3個未配對的核苷酸。在一個實施方式中，與末端核苷酸對直接相鄰的單鏈懸突的未配對的核苷酸含有嘌呤鹼基，並且末端核苷酸對是G-C對，或最後四個互補核苷酸對中至少兩個是G-C對。在其它實施方式中，核苷酸懸突可具有1或2個未配對的核苷酸，並且在示範性的實施方式中，核苷酸懸突是5′-GC-3′。在某些實施方式中，核苷酸懸突位於反義鏈的3′-端。在一個實施方式中，iRNA試劑在反義鏈的3′-端包含基序5′-CGC-3′，從而形成2-核苷酸懸突5′-GC-3′。
因此，iRNA試劑可包含修飾，從而抑制受試者體內存在的例如核酸酶(例如內切核酸酶或外切核酸酶)造成的降解。這些單體在本文中稱作NRM，或核酸酶抗性促進單體，其相應的修飾稱作NRM修飾。在許多情況下，這些修飾同樣會調控iRNA的其它特性，例如與蛋白質相互作用的能力，或者第一和第二序列彼此形成雙鏈體或者與另一序列(例如靶分子)形成雙鏈體的能力，所述蛋白質例如為轉運蛋白，例如血清白蛋白或RISC家族成員。
可以向iRNA試劑中或iRNA試劑的序列中引入一種或多種不同的NRM修飾。NRM修飾可以在序列中或iRNA試劑中使用多於一次。
NRM修飾包括僅可置於末端的一些修飾，和能夠位於任何位置的其它修飾。能夠抑制雜交的一些NRM修飾僅可用於末端區域，而不能位於靶向受試序列或基因的切割位點中或者序列的切割區域中，尤其是不能位於反義鏈上。它們可以在正義鏈中任何位置使用，條件是保持ds iRNA試劑的兩條鏈之間充分雜交。在一些實施方式中，期望將NRM置於切割位點中或者正義鏈的切割區域中，因為其能夠最小化脫靶沉默(off-targetsilencing)。
在某些實施方式中，NRM修飾應當有差異地分布，這取決於它們是包含在正義鏈還是反義鏈上。如果包含在反義鏈上，則不應在進行RISC介導的切割的區域中插入幹擾或者抑制內切核酸酶切割的修飾，所述區域例如為切割位點或者切割區域(如Elbashir et al.，2001，Genes and Dev.15188中所述，其通過引用併入本文)。靶標的切割發生於20或21個核苷酸反義鏈的中間，或者與反義鏈互補的靶mRNA上第一核苷酸上遊約10或11個核苷酸處。在本文中使用時，切割位點是指靶mRNA上或者與之雜交的iRNA試劑鏈上，切割位點任一側的核苷酸。切割區域表示任一方向上切割位點的1、2或3個核苷酸以內的核苷酸。
這些修飾可被引入下述序列的末端區域，例如末端位置上或者末端的2、3、4或5個位置上，所述序列靶向或者不靶向受試者中的序列。
可以例如通過引入配體(例如系鏈配體(tethered ligand))來影響和改造iRNA試劑的特性，包括其藥理學特性。可以將多種實體例如配體與iRNA試劑系鏈，例如與配體-綴合的單體亞單元的運載體系鏈。下文在配體-綴合的單體亞單元的語境中描述了例子，但是所述例子僅是優選的，實體可以偶聯在iRNA試劑的其它位點上。
感興趣的配體是通過介入的系鏈直接或間接與運載體(例如共價)偶聯的配體。在某些實施方式中，配體通過介入的系鏈與運載體結合。當配體-綴合的單體被結合進伸長鏈中時，配體或系鏈的配體可存在於配體-綴合的單體上。在一些實施方式中，可以在向伸長鏈中摻入「前體」配體-綴合的單體亞單元之後，將配體摻入「前體」配體-綴合的單體亞單元中。例如，具有例如氨基-末端系鏈(例如TAP-(CH2)nNH2)的單體可以被摻入生長的正義或反義鏈中。在隨後的操作中，即將前體單體亞單元摻入鏈中以後，可以隨後通過將配體的親電子基團與前體配體-綴合的單體亞單元系鏈的末端親核基團偶聯，將具有親電子基團(例如五氟苯基酯或醛基)的配體與前體配體-綴合的單體結合。
在某些實施方式中，配體改變iRNA試劑的分布、靶向或壽命，所述iRNA試劑是其中摻入所述配體的iRNA試劑。在優選的實施方式中，配體提供了與不含這類配體的物種相比針對選定的靶標增強的親和力，所述靶標例如分子，細胞或細胞類型，區室，例如細胞或器官區室，機體的組織、器官或區域。
感興趣的配體能夠改善轉運、雜交和特異性特性，並且也可以改善以下的核酸酶抗性得到的天然或經修飾的寡聚核糖核苷酸，或包含本文所述單體任何組合的多聚體分子，和/或天然或經修飾的核糖核苷酸。配體通常可包含例如用於增強攝取的治療性修飾劑；例如用於監測分布的診斷性化合物或報告子基團；交聯劑；賦予核酸酶抗性的部件；和天然或不常見的核鹼基。一般性例子包括親脂分子，脂質，凝集素，類固醇(例如熊果醇、hecigenin、薯蕷皂苷元(diosgenin))，萜類(例如三萜類，例如菝葜皂苷元(sarsasapogenin)，木栓酮(Friedelin)、表木栓烷醇(epifriedelanol)衍生的石膽酸)，維生素，碳水化合物(例如葡聚糖，普魯蘭糖(pullulan)，甲殼質，殼聚糖，菊糖，環糊精或透明質酸)，蛋白質，蛋白質結合劑，整聯蛋白靶向分子，多聚陽離子，肽，多胺，和肽模擬物。
配體可以是天然存在的或重組的或合成的分子，例如合成的聚合物，例如合成的多聚胺基酸。多聚胺基酸的例子包括以下多聚胺基酸多聚賴氨酸(PLL)，多聚L-天冬氨酸，多聚L-穀氨酸，苯乙烯-馬來酸酐共聚物，多聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物，二乙烯醚-馬來酸酐共聚物，N-(2-羥丙基)異丁烯醯胺共聚物(HMPA)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚氨酯，聚(2-乙基丙烯酸)，N-異丙基丙烯醯胺聚合物，或聚磷雜吖嗪(polyphosphazine)。多胺的例子包括聚氮丙啶(polyethylenimine)，多聚賴氨酸(PLL)，精胺，亞精胺，多胺，假肽-多胺，擬肽多胺，樹狀聚體多胺，精氨酸，脒，魚精蛋白，陽離子部件，例如陽離子脂質，陽離子卟啉，多胺的季鹽，或α螺旋肽。
配體也可包含靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如促甲狀腺激素、促黑激素、表面活性劑蛋白A、粘蛋白碳水化合物、糖基化的多聚胺基酸、轉鐵蛋白、二磷酸酯(bisphosphonate)、多聚穀氨酸酯、多聚天冬氨酸酯，或RGD肽或RGD肽模擬物。
配體可以是蛋白質，例如糖蛋白，脂蛋白，例如低密度脂蛋白(LDL)，或白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或肽，例如對共配體具有特異親和力的分子，或者抗體，例如與特定細胞類型(例如癌細胞、內皮細胞或骨細胞)結合的抗體。配體也包括激素和激素受體。它們也可以包含非特異性肽的物類，例如輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺、多價甘露糖或多價果糖。配體可以例如為脂多糖，p38MAP激酶的活化劑或者NF-κB的活化劑。
配體可以是能夠提高iRNA吸收進入細胞的物質，例如藥物，所述提高例如通過破壞細胞的細胞骨架，例如通過破壞細胞的微管、微絲和/或中間絲來實現。藥物可以例如是泰克松(taxon)、長春新鹼、長春鹼、松胞菌素(cytochalasin)、諾考達唑、Japlakinolide、紅海海綿素A、鬼筆毒環肽、Swinholide A、Indanocine或Myoservin。
在一個方面中，配體是脂質或基於脂質的分子。這樣的脂質或基於脂質的分子結合血清蛋白質，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA結合配體允許綴合物分布至靶組織，例如肝組織，包括肝的實質細胞。能夠結合HSA的其它分子也可以被用作配體。例如，可以使用Neproxin或阿司匹林。脂質或基於脂質的配體能夠(a)提高對綴合物降解的抗性，(b)提高進入靶細胞或細胞膜的靶向或轉運，和/或(c)能夠被用於調節與血清蛋白質例如HSA的結合。
基於脂質的配體可以被用於調控，例如控制綴合物與靶組織的結合。例如，與HSA更強烈結合的脂質或基於脂質的配體會更不可能被靶向腎，因此更不可能從體內清除。更不強烈結合HSA的脂質或基於脂質的配體可被用於將綴合物靶向腎。還感興趣的是WO/2005/023994中描述的脂質修飾；其公開內容通過引用併入本文。
在另一方面中，配體是被靶細胞(例如增殖細胞)吸收的部件，例如維生素或營養物。它們尤其適用於治療特徵為不想要的細胞增殖，例如惡性或非惡性類型的、例如癌細胞的細胞增殖的病症。示範性的維生素包括維生素A、E和K。其它示範性維生素包括B族維生素，例如葉酸，B12，核黃素，生物素，吡哆醛或者癌細胞吸收的其它維生素或營養物。
在另一方面中，配體是細胞滲透劑、螺旋細胞滲透劑。在一些實施方式中，試劑是兩性的。一種示範性的試劑是肽，例如tat或觸角足(antennapedia)。如果所述試劑是肽，則其可以被修飾，包括肽基模擬物、反轉異構體(invertomers)、非肽或假肽鍵，和D-胺基酸的使用。螺旋試劑可以是α-螺旋劑，其可具有親脂相和疏脂相。
在某些實施方式中，iRNA試劑是5′磷酸化的，或者在5′初始末端包含磷醯基類似物。反義鏈的5′-磷酸修飾包括可與RISC介導的基因沉默相容的修飾。合適的修飾包括5′-單磷酸酯((HO)2(O)P-O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-鳥苷帽(7-甲基化或未甲基化)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)，和任何經修飾或未經修飾的帽結構。其它合適的5′-磷酸修飾會是技術人員已知的。
可以修飾正義鏈，從而使正義鏈失活並防止形成活性RISC，從而可能降低脫靶效應。這可以通過防止正義鏈5′-磷酸化的修飾完成，例如通過用5′-O-甲基核糖核苷酸修飾來完成(見Nykanen et al.，(2001)ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA interferencepathway.Cell 107，309-321.)。也可以使用防止磷酸化的其它修飾，例如用H而不是O-Me簡單地取代5′-OH。或者，可以對5′-磷酸酯添加巨大的龐大基團，使其成為磷酸二酯鍵。
需要時，可以將本文所述的核酸(例如iRNA、DNA等)試劑配製為用於施用給受試者，例如腸胃外施用，例如通過注射、口、局部施用至眼等。同樣，可以將核酸與可藥用的介質組合，提供藥物組合物。為了易於解釋，在這一章節中主要關於未經修飾的iRNA試劑討論配製物、組合物和方法。然而，應當理解這些配製物、組合物和方法可以用其它iRNA試劑(例如經修飾的iRNA試劑)實踐，並且這類實踐屬於本發明。
經配製的iRNA試劑組合物可呈現多種狀態。在一些例子中，組合物至少部分是結晶、均一的結晶和/或無水的(例如少於80％、50％、30％、20％或10％的水)。在另一例子中，iRNA試劑是水相，例如處於包含水的溶液中，該形式是通過吸入施用的優選形式。水相或者結晶組合物可以被摻入遞送介質例如脂質體(尤其是用於水相)或顆粒(例如微粒可適用於結晶組合物)中。通常以與預期的施用方法相容的方式配製iRNA試劑組合物。
iRNA試劑製劑可以與另一試劑組合配製，所述另一試劑例如為另一治療性試劑或穩定iRNA試劑的試劑，例如與iRNA試劑絡合形成iRNP的蛋白質。還有其它藥劑包括螯合劑例如EDTA(例如用以去除二價陽離子例如Mg24)，鹽，RNAse抑制劑(例如光譜特異性的RNAse抑制劑，例如RNAsin)等等。
在一個實施方式中，iRNA試劑製劑包含另一iRNA試劑，例如能夠介導關於第二基因的RNAi的第二iRNA試劑。還有其它製劑可包含至少三種、五種、十種、十二種、十五種或成百中或更多不同的iRNA物類。在一些實施方式中，試劑指向相同的基因，但是指向不同的靶序列。
可以通過與適當的、可藥用的介質(即載體或稀釋劑)組合，將核酸配製為藥物組合物，並且可以將核酸配製為固體、半固體、液體或氣體形式的製劑，例如片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑。同樣，藥劑的施用可以以多種方式實現，包括口、頰、直腸、腸胃外、腹膜內、皮內、經皮、氣管內等等施用。
在藥物劑型中，藥劑可以單獨施用，或者與其它有藥物活性的化合物適當地關聯以及組合施用。以下的方法和賦形劑僅用於舉例而不以任何方式限制。
對口服製劑而言，藥劑可以單獨使用或者與製造片劑、粉末、顆粒或膠囊的適當添加劑組合使用，例如與常規的添加劑例如乳糖、甘露醇、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉組合；與粘合劑例如微晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠組合；與崩解劑例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉組合；與潤滑劑例如滑石或硬脂酸鎂組合；和需要時與稀釋劑、緩衝劑、溼潤劑、防腐劑和調味劑組合。
可以通過將藥劑溶於、分散於或乳化於水性或非水性溶劑中，將藥劑配製為用於注射的製劑，所述溶劑例如植物油或其它類似的油，合成的脂肪酸甘油酯，高級脂肪酸或丙二醇的酯；並且在需要時含有常規添加劑，例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑。
藥劑可以在要通過吸入施用的氣霧劑配製物中使用。本發明的化合物可以被配製進加壓的可用推進劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
另外，可以通過將藥劑與多種基質混合來製造栓劑，所述基質例如乳化基質或水溶性基質。本發明的化合物可以通過栓劑被直腸施用。栓劑可包含介質例如可可脂、碳蠟和聚乙二醇，所述介質在體溫下融化但是在室溫下固化。
可以提供用於口或直腸施用的單位劑型例如糖漿劑、酏劑和懸浮液，其中每個劑量單位(例如茶匙、湯匙、片劑或栓劑)含有預定量的含有一種或多種抑制劑的組合物。類似地，用於注射或靜脈內施用的單位劑型可在組合物中包含抑制劑，所述組合物為無菌水、生理鹽水或另一可藥用運載體中的溶液。
在本文中使用時，術語「單位劑型」是指適合用作人和動物受試者的單位劑量的物理離散的單位，每個單位含有以下述用量計算的預定量的本發明化合物，所述用量足以與可藥用的稀釋劑、運載體或介質一起產生期望的效果。本發明的新單位劑型的規格取決於使用的具體化合物和要達到的效果，以及與宿主中每種化合物相關的藥物效應動力學。
可藥用的賦形劑例如介質、佐劑、運載體或稀釋劑是公眾容易獲得的。另外，可藥用的輔助物質例如pH調節劑和緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、溼潤劑等等是公眾容易獲得的。
也可以通過其它途徑，包括微注射或泡囊的融合，向組織或宿主細胞中引入核酸。也可以使用快速注射進行肌內施用，如Furth et al.(1992)，Anal Biochem 205365-368所述。核酸可以被包裹在金微粒上，並通過粒子轟擊設備或「基因槍」皮內遞送，如文獻中所述(見例如Tang et al.(1992)，Nature 356152-154)，其中用DNA包裹金微粒，然後將其轟擊進皮膚細胞中。感興趣的其它核酸遞送方案包括但不限於以下中所述方案感興趣的美國專利，包括5,985,847和5,922,687(其公開內容通過引用併入本文)；WO/11092；Acsadi et al.，New Biol.(1991)371-81；Hickman etal.，Hum.Gen.Ther.(1994)51477-1483和Wolff et al.，Science(1990)2471465-1468；等。見例如上文所述病毒介導和非病毒介導的遞送方案。相應地，感興趣的是用於這類遞送方法中的藥物介質。
通過所述方法的實施方式產生的核糖核酸可用於多種不同的應用，包括但不限於差別基因表達分析，基因沉默應用，核酸文庫生產應用和治療性應用(例如在反義RNA、siRNA的生產等中)。根據本發明的實施方式生產的RNA的這類應用類型的其它細節在2004年10月8日提交，並且在2006年4月13日作為US-2006-0078889-A1公布的題為″Array-BasedMethods for Producing Ribonucleic Acids，″的未決美國專利申請No.10/961,991中提供；其公開內容通過引用併入本文。
試劑盒 還感興趣的是用於實踐本發明的某些實施方式的試劑盒。在某些實施方式中，試劑盒包含至少2種不同的受保護的單體，例如根據本發明的2′硫代碳保護的核苷單體，其中試劑盒可包含具有相同核鹼基的單體，或者包含不同核鹼基例如A、G、C和U的單體。試劑盒還可包含本發明方法中使用的另外的試劑，例如緩衝液、氧化劑、加帽劑、切割劑等。
一個特異的實施方式包含四種這類核苷單體，分別包括腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶。腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶中每種任選地被例如相同的硫代碳保護基保護，所述硫代碳保護基保護核苷的2′-OH。核苷單體任選地包含5′-保護基(例如DMT)、3′-保護基，和/或亞磷醯胺基團。試劑盒還可包含用於RNA合成後去保護的試劑，例如TBAF，tBuOOH，H2O2，HF，HF-吡啶，HF-TEMED HF-TEA，吡啶，TEMED，純烷基胺，有機溶劑中的胺，純胺或溶劑體系中的混合物，和/或TEA或TBAH。
一些其它試劑盒實施方式包含適用於製備核苷單體前體的組分。所述試劑盒可包含TIPSCl2和二硫代氯甲酸酯或硫代羰基氯甲酸酯。試劑盒還可包含試劑例如HF、吡啶、CH3CN、含DMT的封閉劑(例如DMT氯化物)和/或CH3OP(NiPr2)2。試劑盒可包含例如上文所述的去保護劑/組合物。試劑盒還可包含未受保護的核糖核苷單體，例如腺苷、尿苷、尿苷和/或胞苷。
在某些實施方式中，試劑盒還會包含實踐受試方法的說明書或獲得所述說明書的手段(例如指導使用者進入提供說明書的網頁的網站URL)，其中這些說明書可以印刷在基材上，其中所述基材可以是以下的一個或多個包裝插入頁、包裝、試劑容器等等。在受試試劑盒中，一種或多種組分可根據便利或者期望而存在於相同或不同的容器中。
以下的實施例例證了本發明化合物的合成，並且不旨在限制附帶的權利要求中公開的本發明的範圍。
實施例 I.多種2′-硫代羥基碳酸酯單體的合成。
A.5′-O-DMT-2′-O-硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺尿苷的合成
NMI(N-甲基咪唑) HF/吡啶是由HF/吡啶70/30w/w製成的複合物 根據R，三苯甲基化反應可以是緩慢的，並且可以小量(0.1當量)添加NMI或DMAP來加速反應。為了合成2′-O-叔丁基硫代羥基碳酸酯(BSC)尿苷，可以使用受5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-(對硝基苯基)碳酸酯保護的尿苷作為前體。如下文所述，2-甲基-2-丙硫化鈉可被用於置換對硝基苯基碳酸酯。
作為其中相應的氯硫代甲酸酯不可得的合成2′-硫代羥基碳酸酯的一般途徑，可能使用相應的硫醇衍生物，並使其與光氣反應獲得相應的氯硫代甲酸酯，或者也可能使硫醇與2′O-(對硝基苯基)氧羰基保護的核苷反應。
B.5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-叔丁基硫羰基(BSC)尿苷的合成 將5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-(對-硝基苯基)碳酸酯保護的尿苷(15mmole)與吡啶共同蒸發3次，然後用真空泵乾燥4小時。添加無水吡啶(150mL)和2-甲基-2-丙硫化鈉(24mmole)，將混合物在室溫下攪拌16小時。使用己烷與EtOAc(0-30％)的梯度，通過柱色譜純化產物。產率76.4％；ESI MS609(M+Li)，637(M+Cl) C.5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-乙基硫羰基(ESC)尿苷的合成 將5′，3′-O-(T四異丙基而矽氧烷-1，3-二基)尿苷(15mmole)與吡啶共蒸發3次，然後用真空泵乾燥12小時。添加無水吡啶(150mL)和氯硫代甲酸乙酯(ethyl chlorothioformate)(18mmole)，並將混合物在室溫下攪拌16小時。使用含氯仿梯度(50-100％)的己烷，通過柱色譜純化產物。
產率74.3％ ESI MS581(M+Li)，609(M+Cl) D.受TIPS 2′-O-硫羰基保護的尿苷的去除 小心地將氟化氫-吡啶複合物(HF∶Py 7∶3，7mL)倒入冰冷的吡啶(8mL)在乙腈(46.5mL)中的溶液中。然後將由此形成的吡啶-HF試劑(32mL)轉移至含有被5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-碳酸酯保護的尿苷(10mmole)中，並將混合物在室溫下攪拌2小時。用50％的氯化鈣水溶液(300mL)淬滅反應。用EtOAc萃取粗產物(3-5次)，並用無水Na2SO4乾燥。過濾後將有機層濃縮至乾燥，並用真空泵處理16小時。
產率85-100％； ESI MS BSC類似物361(M+1)，383(M+Na)，399(M+K) ESC類似物333(M+1)，355(M+Na)，371(M+K) E.5′-O-DMT 2′-O-硫羰基保護的尿苷3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺 將2′-O-硫代羥基碳酸酯保護的尿苷(3mmole)用真空泵乾燥6小時。添加無水THF(30mL)、2，4，6-三甲基吡啶(22.5mmole)和二甲氧基三苯甲基氯化物(3.3mmole)，將混合物在室溫下攪拌直至TLC(CHCl3/MeOH 9∶1)顯示核苷底物完全消失(16-24小時)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(3mmole)和1-甲基咪唑(1.5mmole)，並在10-15分鐘內向反應混合物中緩慢添加N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯(N，N-diisopropylmethyl phosphonamidicchloride)。然後將反應混合物再攪拌2小時。真空去除溶劑，並使用含EtOAc(0-50％)梯度的己烷，通過柱色譜純化粗產物。
產率60-65％ ESI MS ESC單體802(M+Li)，830(M+Cl) BSC單體830(M+Li)，858(M+Cl) 31P NMR(CDCl3) ESC單體152.33，151.72 F.5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-乙基硫羰基(ESC)N4-苯氧基羰基胞苷的合成 通過與無水吡啶共同蒸發，乾燥5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)核糖胞苷(10mMole，4.85g)。將該化合物溶於100ml無水吡啶中，並添加三甲基氯甲矽烷(5當量，50mMole，6.34ml)。將混合物在室溫下攪拌2小時並添加氯甲酸苯酯(phenylchloroformate)(1.2當量，12mMole，1.51ml)。將反應在室溫下攪拌2小時。通過添加2ml甲醇淬滅過量的氯甲酸酯，通過飽和的碳酸氫鈉水溶液稀釋反應。用二氯甲烷萃取該溶液。然後在硫酸鈉上乾燥有機層，並蒸發至乾燥。
將該反應的粗產物在160ml二氯甲烷和30ml THF中的5.7g對甲苯磺酸中稀釋。將反應在室溫下攪拌15分鐘。通過添加200ml飽和的碳酸氫鈉水溶液，淬滅反應。用二氯甲烷萃取該溶液，將有機層在硫酸鈉上乾燥並蒸發至乾燥。
通過與無水吡啶共同蒸發來乾燥粗產物，將其溶於100ml無水吡啶中，並添加氯硫代甲酸乙酯(1.7當量，1.76ml)和DMAP(0.1當量，0.122g)。將反應在室溫下攪拌過夜，然後通過碳酸氫鈉的飽和水溶液稀釋。用二氯甲烷萃取該混合物，將有機層在硫酸鈉上乾燥，並蒸發至乾燥。通過柱色譜純化粗產物(環己烷/乙酸乙酯75/25)。獲得呈泡沫狀的產物(4g，4步驟後60％)。
1H NMR 400MHz(CDCl3)8.2(s，1H)；7.45-7.2(m，5H)；5.95(s，1H)；5.55(d，1H)；4.35(m，1H)；4.3(d，1H)；4.2-3.95(m，2H)；2.95-2.8(m，2H)；1.3(t，3H)；1.15-0.95(m，27H)G 質譜ESI700.2274[M+Li]+ G.2′-O-乙基硫羰基N4-苯氧基羰基胞苷 通過與無水乙腈共同蒸發來乾燥5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-乙基硫代羥基碳酸酯N4-苯基氨基甲酸酯胞苷(2.57g，5.7mmole)，然後稀釋於40ml無水乙腈中並添加HF/吡啶(30當量HF，4.33ml)，並將反應在室溫下攪拌5小時。通過添加CaCl2溶液淬滅氟化物，並用二氯甲烷萃取產物。將有機層在硫酸鈉上乾燥並蒸發至乾燥。
將粗產物與無水乙腈共同蒸發，然後溶於40ml無水THF中，並向反應中添加10當量(7.55ml)的2，4，6-三甲基吡啶。添加DMTC1(1.2當量，2.31g)，並將反應在室溫下攪拌3小時。再添加0.5當量的2，4，6-三甲基吡啶(3.3ml)、0.5當量(0.22ml)的N-甲基咪唑和2.5當量(2.75ml)的N，N-二異丙基甲基-膦醯胺氯。將反應在室溫下攪拌4小時。用飽和的碳酸氫鈉水溶液稀釋混合物，並用二氯甲烷萃取。將有機層在硫酸鈉上乾燥並蒸發至乾燥。通過柱色譜純化粗產物(環己烷/乙酸乙酯/吡啶75/25/5到20/75/5)。獲得呈淡黃色泡沫狀的期望產物(1.64g，3步驟後31％)。
31P NMR 400MHz(CD3CN)151.709-151.325 質譜ESI921.332[M+Li]+ H.環外腺苷基氨基的保護 將5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)腺苷(3.9mMole，2g)與無水吡啶共同蒸發兩次。將該化合物溶於20ml無水吡啶中，並添加三甲基氯甲矽烷(5當量，19.6mMole，2.48ml)。將混合物在室溫下攪拌30分鐘，並添加氯甲酸苯酯(2當量，7.84mMole，0.98ml)。將反應在室溫下攪拌2小時。然後向反應中添加5ml水，並在室溫下將混合物再攪拌2小時。然後用飽和的碳酸氫鈉水溶液稀釋反應。用二氯甲烷萃取該溶液。然後在硫酸鈉上乾燥有機層，並蒸發至乾燥。通過柱色譜純化粗產物(CH2Cl2到CH2Cl2MeOH 90/10)。獲得呈白色泡沫的產物(0.62g，25％) 1H NMR 400MHz(CDCl3)9.85(s，1H)；8.75(s，1H)；8.2(s，1H)；7.4-7.2(m，5H)；6.05(s，1H)；5.05(m，1H)；4.65(d，1H)；4.15-4(m，4H)；3.75(s，1H)；1.15-0.95(m，27H) I.5′-O-DMT-2′-O-乙基硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺-N6-苯氧基羰基腺苷的合成 通過與無水吡啶共同蒸發來乾燥5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)N6-苯氧基羰基腺苷(0.62g，1mMole)，並將其溶於5ml無水吡啶中。添加氯硫代甲酸乙酯(1.7當量，2mMole，0.208m)和DMAP(0.1當量，0.012g)。將反應在室溫下攪拌過夜，然後用飽和的碳酸氫鈉水溶液稀釋。用二氯甲烷萃取粗反應混合物。將有機層在硫酸鈉上乾燥並蒸發至乾燥。
通過與乙腈共同蒸發來乾燥粗產物，然後將其稀釋於5ml無水乙腈中。添加HF/吡啶(30當量HF，0.375ml)，並將反應在室溫下攪拌5小時。通過添加CaCl2淬滅氟化物，並用二氯甲烷萃取產物。在硫酸鈉上乾燥有機層並蒸發至乾燥。
通過與無水乙腈共同蒸發來乾燥粗產物，然後添加5ml THF和10當量(1.35ml)的2，4，6-三甲基吡啶。添加DMTC1(1.2當量，0.4g)，並將反應在室溫下攪拌2小時。再添加5當量的2，4，6-三甲基吡啶(0.7ml)和0.5當量(0.039ml)的N-甲基咪唑和2.5當量(1.45ml)的N，N-二異丙基甲基-膦醯胺氯。將反應在室溫下攪拌2小時。用飽和的碳酸氫鈉水溶液稀釋混合物，並用二氯甲烷萃取。將有機層在硫酸鈉上乾燥並蒸發至乾燥。通過柱色譜(己烷/乙酸乙酯/吡啶75/20/5到20/75/5)純化粗產物。獲得程白色泡沫的預期產物。
31P NMR 400MHz(CDCl3)152.925-152.040 J.5′-O-DMT-2′-O-硫羰基-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺N4-硫羰基胞苷、N4-硫羰基尿苷和N6-硫羰基腺苷的合成。

II.單體上不同2′-硫代羥基碳酸酯基團的切割/去保護研究 使用THF中的四丁基氟化銨(TBAF)1M的溶液切割多種2′-硫羰基保護基團。似乎所有的硫代羥基碳酸酯被該溶液切割，並且如所預期的，具有更大烷基的硫代羥基碳酸酯具有提高的半衰期。
III.多種2′-硫代羰基碳酸酯和二硫代碳酸酯單體的合成。
A.5′，3′-TIPS-2′五氟苯氧基硫代羰基-尿苷的合成 將5′，3′TIPS-尿苷(5mmol)與吡啶共同蒸發兩次並溶於DCM/Py(9ml/4ml)溶液中。添加DMAP(122mg，1mmol)並將溶液浸入水浴(20℃下)中。緩慢(在1分鐘內)添加氯硫羰基甲酸五氟苯基酯(Pentafluorophenyl chlorothionoformate)(1.6mL，10mmol)，並將反應攪拌5小時，之後添加水。將溶液用DCM萃取兩次，用水洗滌兩次，乾燥(Na2SO4)，過濾並濃縮。在矽膠色譜上純化粗產物(EtOAC/己烷)，得到標題化合物(64％產率)。質量計算值712.17，觀察值719.18[M+Li]+，746.2[M+Cl]-。
B.用於合成硫代羰基碳酸酯和二硫代碳酸酯的一般方法 將3′，5′-TIPS 2′-O-五氟苯基氧硫代羰基尿苷與1，4-二噁烷共同蒸發兩次，溶於THF(3ml)中並置於氬氣下。添加相關的醇鹽(alkoxide)/硫代醇鹽(2.1當量)，並將反應混合物攪拌1小時，其中添加std aq的NaHCO3，並將溶液用EtOAc萃取兩次，用水洗滌一次並用鹽水洗滌一次，在Na2SO4上乾燥，濃縮並通過矽膠色譜(EtOAc/己烷)純化。
IV.多種硫代氨基甲酸酯保護的單體的合成。
A.5′-O-DMT-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺-2′-O-嗎啉代硫代氨基甲酸酯尿苷的合成。
在500ml裝有膠塞(serum stopper)的圓底燒瓶中，將10mmol，4.8g的3′-5′-四異丙基二矽氧烷尿苷(ChemeGenes)溶於100ml無水乙腈中。向反應中添加1.9克1，1′-硫羰基二咪唑(Aldrich)和0.2克4-(二甲基)氨基吡啶。使用熱風槍(heat gun)加熱反應並攪拌，直至試劑溶解並且溶液澄清。允許反應攪拌過夜(12小時)。12小時後，反應混合物是晶體的漿體。通過濾過中號燒結玻璃漏鬥來分離晶體。將產物用冷乙腈洗滌，並在真空下乾燥。TLC分析證實，產物是提供5.97克產物(100％)的單一物類。ESI-Q-TOF質譜分析證實產物是5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-硫羰咪唑，質量為M+1，597.12m/e。通過使用熱風槍加熱，將產物重溶於100ml無水乙腈中。向反應中添加11mmol嗎啉。將反應用塞子塞住並攪拌3小時。TLC分析證實了從起始材料到更高級產物(higher running product)的點到點轉化。通過蒸發乙腈得到玻璃體，分離該產物。ESI-Q-TOF質譜分析證實產物為5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-嗎啉代-硫代氨基甲酸酯，質量為M+1，615.21m/e。將氟化氫-吡啶複合物(HF∶Py 7∶3，7mL)小心地倒入冰冷的乙腈(46.5mL)中的吡啶(8mL)溶液中。然後將由此形成的吡啶-HF試劑(32mL)轉移至具有5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-嗎啉代-硫代氨基甲酸酯保護的尿苷(10mmole)的燒瓶中，並將混合物在室溫下攪拌2小時。用5％的氯化鈣水溶液(300mL)淬滅反應。用EtOAc萃取粗產物(3-5次)，並用無水Na2SO4乾燥。過濾後將有機層濃縮為粘稠的油，得到由TLC示為單個點的3.5克(94％產率)產物，其通過ESI-Q-TOF質譜證實為2′-嗎啉代-硫代氨基甲酸酯保護的尿苷，其質量為M+1，373.10m/e。將2′-O-嗎啉代硫代氨基甲酸酯保護的尿苷(9.4mmole)溶於無水THF(95mL)中，添加2，4，6-三甲基吡啶(70.5mmole)和二甲氧基三苯甲基氯化物(11.75mmole)，並將混合物在室溫下攪拌，直至TLC(CHCl3/MeOH 9∶1)顯示核苷底物的完全消失(16-24小時)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(9.4mmole)和1-甲基咪唑(4.5mmole)，並在10-15分鐘內向反應混合物中緩慢添加N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯(23mmol)。然後將反應混合物再攪拌2小時。真空去除溶劑，並使用含EtOAc(0-50％)梯度的己烷，通過柱色譜純化粗產物。
B.5′-O-DMT-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺-2′-O-硫代嗎啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯尿苷的合成。
在500ml裝有膠塞的圓底燒瓶中，將10mmol，4.8g的3′-5′-四異丙基二矽氧烷尿苷(ChemeGenes)溶於100ml無水乙腈中。向反應中添加1.9克1，1′-硫羰基二咪唑(Aldrich)和0.2克4-(二甲基)氨基吡啶。使用熱風槍加熱反應並攪拌，直至試劑溶解並且溶液澄清。允許反應攪拌過夜(12小時)。12小時後，反應混合物是晶體的漿體。通過濾過中號燒結玻璃漏鬥來分離晶體。將產物用冷乙腈洗滌，並在真空下乾燥。TLC分析證實，產物是提供5.97克產物(100％)的單一物類。ESI-Q-TOF質譜分析證實產物是5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-硫代羰基咪唑，質量為M+1，597.12m/e。通過使用熱風槍加熱，將產物重溶於100ml無水乙腈中。向反應中添加11mmol硫代嗎啉-1，1-二氧化物(TCI America)和1.1mmol 4-(二甲基)氨基吡啶。將反應用塞子塞住並攪拌12小時。12小時後，反應混合物是晶體的漿體。將產物用冷乙腈洗滌，並在真空下乾燥。TLC分析證實了產物是提供6.61克產物(99％)的單一物類。ESI-Q-TOF質譜分析證實產物為5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-O-硫代嗎啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯，質量為M+1，664.21m/e。將氟化氫-吡啶複合物(HF∶Py7∶3，7mL)小心地倒入冰冷的乙腈(46.5mL)中的吡啶(8mL)溶液中。然後將由此形成的吡啶-HF試劑(32mL)轉移至含有被5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)2′-O-硫代嗎啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯保護的尿苷(10mmole)的燒瓶中，並將混合物在室溫下攪拌2小時。用5％的氯化鈣水溶液(300mL)淬滅反應。用EtOAc萃取粗產物(3-5次)，並用無水Na2SO4乾燥。過濾後將有機層濃縮為粘稠的油，得到通過TLC示為單個點的3.4克(80％產率)產物，其通過ESI-Q-TOF質譜證實為2′-O-硫代嗎啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯保護的尿苷，其質量為M+1，422.10m/e。將2′-O-硫代嗎啉代-1，1-二氧化物硫代氨基甲酸酯保護的尿苷(8.0mmole)重溶於無水THF(80mL)中，添加2，4，6-三甲基吡啶(60mmole)和二甲氧基三苯甲基氯化物(10.0mmole)，並將混合物在室溫下攪拌，直至TLC(CHCl3/MeOH 9∶1)顯示核苷底物的完全消失(16-24小時)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(8.0mmole)和1-甲基咪唑(4.0mmole)，並在10-15分鐘內向反應混合物中緩慢添加N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯(20mmol)。然後將反應混合物再攪拌2小時。真空去除溶劑，並使用含EtOAc(0-50％)梯度的己烷，通過柱色譜純化粗產物。
C.5′-O-DMT-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺-2′-O-二甲基羥氨基硫代氨基甲酸酯尿苷的合成。
在500ml裝有膠塞的圓底燒瓶中，將3′-5′-四異丙基二矽氧烷尿苷(ChemeGenes)，10mmol，4.8克溶於100ml無水乙腈中。向反應中添加1.9克1，1′-硫羰基二咪唑(Aldrich)和0.2克4-(二甲基)氨基吡啶。使用熱風槍加熱反應並攪拌，直至試劑溶解並且溶液澄清。允許反應攪拌過夜(12小時)。12小時後，反應混合物是晶體的漿體。通過濾過中號燒結玻璃漏鬥來分離晶體。將產物用冷乙腈洗滌，並在真空下乾燥。TLC分析證實，產物是提供5.97克產物(100％)的單一物類。ESI-Q-TOF質譜分析證實產物是5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-硫代羰基咪唑，質量為M+1，598.12m/e。將產物懸浮於100ml無水乙腈中。向反應混合物中添加11mmol N，O-二甲基羥氨基鹽酸化物(Aldrich)、15mmol二異丙基乙胺和1.1mmol 4-(二甲基)氨基吡啶。使用熱風槍加熱反應以溶解試劑，產生澄清的溶液。將混合物用塞子塞住並攪拌12小時。12小時後，將反應混合物蒸發為油，並在真空下乾燥。TLC分析證實了產物是提供5.9克產物的單一物類。ESI-Q-TOF質譜法分析證實產物是5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-O-二甲基羥氨基硫代氨基甲酸酯，質量為M+1，590.24m/e。將氟化氫-吡啶複合物(HF∶Py 7∶3，7mL)小心地倒入冰冷的吡啶(8mL)在乙腈(46.5mL)中的溶液中。然後將由此形成的吡啶-HF試劑(32mL)轉移至含5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-O-二甲基羥氨基硫代氨基甲酸酯保護的尿苷(10mmole)的燒瓶中，並將混合物在室溫下攪拌2小時。用5％的氯化鈣水溶液(300mL)淬滅反應。用EtOAc萃取粗產物(3-5次)，並用無水Na2SO4乾燥。過濾後將有機層濃縮為粘稠的油，得到通過TLC示為單個點的3.1克(86％產率)產物，其通過ESI-Q-TOF質譜證實為2′-O-二甲基羥氨基硫代氨基甲酸酯保護的尿苷，質量為M+1，348.09m/e。將2′-O-二甲基羥氨基硫代氨基甲酸酯保護的尿苷(8.7mmole)重溶於無水THF(90mL)中，添加2，4，6-三甲基吡啶(61mmole)和二甲氧三苯甲基氯化物(10.0mmole)，並將混合物在室溫下攪拌直至TLC(CHC13/MeOH 9∶1)顯示核苷底物完全消失(16-24小時)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(9.0mmole)和1-甲基咪唑(4.5mmole)，並耗時10-15分鐘緩慢地向反應混合物中添加N，N-二異丙基甲基磷醯胺酸氯化物(22mmol)。然後將反應混合物再攪拌2小時。真空去除溶劑，並使用己烷與EtOAc(0-50％)梯度通過柱色譜純化粗製產物。
D.5′-O-DMT-3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺-2′-O-苯氨基硫代氨基甲酸酯尿苷的合成。
在500ml裝有膠塞的圓底燒瓶中，將10mmol，4.8g的3′-5′-四異丙基二矽氧烷尿苷(ChemeGenes)溶於100ml無水乙腈中。向反應中添加1.9克1，1′-硫羰基二咪唑(Aldrich)和0.2克4-(二甲基)氨基吡啶。使用熱風槍加熱反應並攪拌，直至試劑溶解並且溶液澄清。允許反應攪拌過夜(12小時)。12小時後，反應混合物是晶體的漿體。通過濾過中號燒結玻璃漏鬥來分離晶體。將產物用冷乙腈洗滌，並在真空下乾燥。TLC分析證實，產物是提供5.97克產物(100％)的單一物類。ESI-Q-TOF質譜分析證實產物是5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-硫代羰基咪唑，質量為M+1，598.12m/e。將產物重溶於100ml無水乙腈中。向反應混合物中添加11mmol苯胺，和11mmol 4-(二甲基)氨基吡啶。為反應裝上回流冷凝器並加熱回流12小時。12小時後，將反應混合物蒸發為油，並在真空下乾燥。TLC分析證實產物以約80％的產率與2，2-脫水尿苷一起存在。使用甲醇/亞甲基氯化物梯度(0-5％)在矽膠上純化產物。ESI-Q-TOF質譜分析證實產物為5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-O-苯氨基硫代氨基甲酸酯，質量為M+1，621.33m/e。小心地將氟化氫-吡啶複合物(HF∶Py 7∶3，7mL)倒入吡啶(6.5mL)在乙腈(37.2mL)中的冰冷溶液中。然後將由此形成的吡啶-HF試劑(25mL)轉移至含有被5′，3′-O-(四異丙基二矽氧烷-1，3-二基)-2′-O-二甲基羥氨基硫代氨基甲酸酯保護的尿苷(8mmole)的燒瓶中，並將混合物在室溫下攪拌2小時。用5％的氯化鈣水溶液(300mL)淬滅反應。用EtOAc萃取粗產物(3-5次)，並用無水Na2SO4乾燥。過濾後將有機層濃縮為粘稠的油，得到通過TLC示為單個點的2.4克(81％產率)產物，其通過ESI-Q-TOF質譜證實為2′-O-苯氨基硫代氨基甲酸酯保護的尿苷，其質量為M+1，379.18m/e。將2′-O-苯氨基硫代氨基甲酸酯保護的尿苷(6.4mmole)重溶於無水THF(65mL)中，添加2，4，6-三甲基吡啶(45mmole)和二甲氧基三苯甲基氯化物(8.0mmole)，並將混合物在室溫下攪拌，直至TLC(CHCl3/MeOH 9∶1)顯示核苷底物完全消失(16-24小時)。一次性添加2，4，6-三甲基吡啶(6.4mmole)和1-甲基咪唑(3.2mmole)，並在10-15分鐘內向反應混合物中緩慢添加N，N-二異丙基甲基膦醯胺氯(16mmol)。然後將反應混合物再攪拌2小時。真空去除溶劑，並使用含EtOAc(0-50％)梯度的己烷，通過柱色譜純化粗產物。
V.用於固體支持物上寡聚尿苷合成的一般步驟 所有的合成使用來自Glen Research的dT-Q-CPG柱，根據標準RNA循環以1microM的規模進行。為了偶聯步驟，將亞磷醯胺和四唑輸送至合成柱並保留10分鐘。
完成所有合成步驟後，並且為了去除磷酸部件上的甲基保護基，用1M 2-氨基甲醯基-2-氰亞乙基-1，1-二硫化二鈉在DMF(1mL)中的溶液在室溫下處理寡核糖核苷(仍然與CPG連接)30分鐘，然後用水洗滌再用乙腈洗滌，並通過氬乾燥。
對含有硫代氨基甲酸酯的2′-受保護的寡聚核苷而言，可以在室溫下使用一個小時無水乙腈中20％二乙胺切割氰乙基磷酸酯保護基。
通過用THF(1mL)中的1M TBAF溶液處理，從固體支持物上切割寡聚物並進行2′-去保護。重要的是注意TBAF溶液必須被乾燥至少於5％水含量。對U4T五聚體而言，去保護在1小時(ESC保護)和6小時(BSC保護)內完成。
用0.1M TEAA淬滅反應，使用標準過程在Poly-pak盒上脫鹽，並蒸發至乾燥。將得到的反應產物溶於水中，並通過HPLC分析[ODS-Hypersil(5m)，柱4.0x250，流速1.5mL/min，40分鐘內50mM TEAB中0-20％MeCN(線性梯度)]。
在一些情況下，通過在室溫下用TEMED/HF/MeCN混合物(2∶1∶7，1mL)處理40分鐘，將寡聚物從固體支持物上切割(而不進行2′-去保護)。如前文所述將反應淬滅、脫鹽和分析。
對硫代羰基碳酸酯和硫代氨基甲酸酯保護基而言，使用無水胺將寡聚核苷從支持物上切割並去保護。典型的條件是室溫下以80psi的無水氣態氨處理6到24小時；室溫下以30psi的無水甲胺處理1到6小時；溶於乙腈中的氨處理6到24小時；溶於苯酚中的乙二胺處理6到12小時；純1，3-丙二胺處理4到16小時；純嗎啉，處理16到48小時；無水乙腈中的羥甲基胺處理4到12小時。
將氣態胺排出並用無水氬氣流洗滌固體支持物。然後將固體支持物置於真空中2到12小時，然後通過HPLC分析使用緩衝的水溶液從支持物上衝洗的寡核苷酸[ODS-Hypersil(5m)，柱4.0x250，流速1.5mL/min，在40分鐘內50mM TEAB中0-20％MeCN(線性梯度)]。使用3到10倍體積的乙腈，從支持物上衝洗溶於無水溶劑中的一種或多種無水純胺。用無水氬氣流洗滌得到的支持物。然後將固體支持物置於真空下2到12小時，然後通過HPLC分析使用緩衝的水溶液從支持物上衝洗的寡核苷酸[ODS-Hypersil(5m)，柱4.0x250，流速1.5mL/min，在40分鐘內50mMTEAB中0-20％MeCN(線性梯度)]。
VI.在固體支持物上合成3′-TU(2′ESC)CPOC(2′ESC)APOC(2′ESC)-CPOC(2′ESC)APOC(2′ESC)的混合序列 合成使用來自Glen Research的dT-Q-CPG柱，根據標準RNA循環以1microM的規模進行。為了偶聯步驟，將亞磷醯胺和四唑輸送至合成柱並保留10分鐘。
在該寡核糖核苷酸合成中使用的亞磷醯胺為U2′ESC 2′O-乙基-硫羰基5′-O-DMT 3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺尿苷；CPOC2′ESC(2′O-乙基硫羰基5′-O-DMT 3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺N4-苯氧基羰基胞苷)和APOC2′ESC 2′O-乙基硫羰基5′-O-DMT 3′-O-[甲基-(N，N-二異丙基)]-亞磷醯胺N4-苯氧基羰基胞苷) 在完成所有合成步驟後，並且為了去除磷酸部件上的甲基保護基，用1M 2-氨基甲醯基-2-氰亞乙基-1，1-二硫化二鈉在DMF(1mL)中的溶液在室溫下處理30分鐘，然後用DMF洗滌、再用甲醇之後用乙腈洗滌，並通過氬乾燥。
通過用1M TBAF在THF(1mL)中的溶液過夜處理，從固體支持物上切割寡聚物並進行2′-去保護，所述溶液中添加了MeOH中10％(v/v)的1M TBAOH。
用0.1M TEAA淬滅反應，使用標準過程在Poly-pak盒上脫鹽，並蒸發至乾燥。將得到的反應產物溶於水中，並通過HPLC分析[ODS-Hypersil(5m)，柱4.0x250，流速1.5mL/min，40分鐘內50mM TEAB中0-20％MeCN(線性梯度)]。
VII.去保護 通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁氟化銨溶液的水含量，發現所述水含量為4.3％。使用-60℃下溶液的19F NMR測定出10％的二氟化物濃度。將溶液在無水氫氧化鈉顆粒上儲存9天，水含量降至3.1％，二氟化物含量降至1％。該溶液顯示在1小時內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁氟化銨溶液的水含量，發現所述水含量為4.3％。使用-60℃下溶液的19F NMR測定出10％的二氟化物濃度。將溶液在無水碳酸鉀上儲存9天，水含量降至3.7％，二氟化物含量降至0％。該溶液顯示在1.5小時內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁氟化銨溶液的水含量，發現所述水含量為4.3％。使用-60℃下溶液的19F NMR測定出10％的二氟化物濃度。向溶液中添加10％(體積/體積)水中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。通過Karl-Fisher滴定測定的最終水濃度為12％，使用19F NMR測定的二氟化物濃度為0％。該溶液顯示在3小時內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁氟化銨溶液的水含量，發現所述水含量為4.3％。使用-60℃下溶液的19F NMR測定出10％的二氟化物濃度。向溶液中添加10％(體積/體積)甲醇中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。通過Karl-Fisher滴定測定的最終水濃度為3.2％，使用19FNMR測定的二氟化物濃度為0％。該溶液顯示在45分鐘內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁氟化銨溶液的水含量，發現所述水含量為4.3％。使用-60℃下溶液的19F NMR測定出10％的二氟化物濃度。向溶液中添加20％(體積/體積)甲醇中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。通過Karl-Fisher滴定測定的最終水濃度為3.4％，使用19FNMR測定的二氟化物濃度為0％。該溶液顯示在30分鐘內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁溴化銨溶液的水含量，發現所述水含量為1.8％。向溶液中添加10％(體積/體積)水中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。該溶液顯示在1.2小時內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁溴化銨溶液的水含量，發現所述水含量為1.8％。向溶液中添加20％(體積/體積)水中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。該溶液顯示在45分鐘內使RNA五聚體完全去保護，然而具有一些降解產物。
通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁溴化銨溶液的水含量，發現所述水含量為1.8％。向溶液中添加20％(體積/體積)甲醇中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。該溶液顯示在30分鐘內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析THF中1.0摩爾四丁銨乙酸鹽溶液的水含量，發現所述水含量為2.2％。向溶液中添加20％(體積/體積)甲醇中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。通過Karl-Fischer滴定分析的最終水濃度為2.4％。該溶液顯示在30分鐘內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析二噁烷中1.0摩爾四丁銨乙酸鹽溶液的水含量，發現所述水含量為1.8％。向溶液中添加20％(體積/體積)甲醇中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。通過Karl-Fischer滴定分析的最終水濃度為2.1％。該溶液顯示在1.5小時內使RNA五聚體去保護。
通過Karl-Fischer滴定分析乙腈中1.0摩爾四丁銨乙酸鹽溶液的水含量，發現所述水含量為1.6％。向溶液中添加20％(體積/體積)甲醇中的1.0摩爾四丁銨氫氧化物。通過Karl-Fischer滴定分析的最終水濃度為1.8％。該溶液顯示在30分鐘內使RNA五聚體去保護。
A.在2′-乙基硫代羥基碳酸酯保護的化合物上，使用DMSO中的TBAF對RNA寡核苷酸去保護。
TU20 HPLC 分析
ESI-Q-TOF質譜
M(測量值)6364.0 M(U20T，計算的最強峰值)6364.6
TU40 HPLC分析
B.使用氣態氨使TU4 2′-硫代氨基甲酸酯去保護 2′-硫代羰基嗎啉代氨基甲酸酯
在80psi下用氣態氨處理 HPLC分析
ESI-Trap質譜
在30psi下用氣態甲胺處理 HPLC分析
ESI-Trap質譜
C.2′-硫代羰基硫代嗎啉代-1，1-二氧化物氨基甲酸酯
在80psi下用氣態氨處理 HPLC分析
ESI-Trap質譜
在30psi下用氣態甲胺處理 HPLC分析
ESI-Trap質譜
縮寫 在本公開中，以下的縮寫具有以下的含義。
未定義的縮寫具有它們被普遍接受的含義。
℃＝攝氏度 hr＝小時 min＝分鐘 sec＝秒 μM＝微摩爾 mM＝毫摩爾 M＝摩爾 ml＝毫升 μl＝微升 mg＝毫克 μg＝微克 DMAP＝4，4′-二甲基氨基吡啶 DMT＝二甲氧基三苯甲基 NMI＝N-甲基咪唑 TBAF＝四丁基氟化銨 TBAOH＝四丁基銨氫氧化物 TBAA＝四丁基銨乙酸鹽 TBAB＝四丁基溴化銨 TBDMS＝叔丁基二甲基甲矽烷基 TIPS＝1，3-四異丙基二矽氧烷 TEA＝三乙胺 TEAA＝三乙基銨乙酸鹽 TEAB＝三乙基銨碳酸氫鹽 TEMED＝N，N，N′，N′-四甲基乙二胺 RP-HPLC＝反相高效液相色譜 參考文獻 Beigelman L，and Serebryany V，Nucleosides，Nucleotides，and NucleicAcids 221007-1009(2003). Capaldi et al，Nucleic Acids Research 22(12)2209-2216(1994). Greene，et al.，″Protective Groups in Organic Synthesis，″John Wiley andSons，Second Edition(1991). Hogrefe et al.，Nucleic Acids Research 21(20)4739-4741(1993). March，Advanced Organic Chemistry，McGraw Hill Book Company，NewYork(1977).Pages 251-259. Markiewicz WT，J.Chem Research(S)24-25(1979). Ogilvie et al.，Can.J.Chem.572230-2238(1979). Ogilvie et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855764(1988). Rao et al.，J.Chem.Soc，Perkin Trans.243-55(1993). Reese CB，Org.Biomol.Chem.3(21)3851-68(2005). Sakatsume et al.，Tetrahedron 478717-8728(1991). Scaringe et al.，Nucleic Acids Research 18(18)5433-5441(1990). Usman et al.，J.Am.Chem.Soc.1097845(1987). 儘管已經就清楚理解的目的通過闡述和舉例比較詳細地描述了前述發明，但是根據本發明的教導，對本領域常規技術人員而言顯而易見的是，可以進行某些改變和修飾而不偏離附帶的權利要求書的精神和範圍。
因此，前文僅闡述了本發明的原理。應當明白，本領域技術人員應當能夠進行多種安排，所述安排儘管不是本文所明確描述或顯示的，但是體現了本發明的原理並且包括在本發明的精神和範圍中。另外，本文引用的所有例子和有條件的語言原則上旨在幫助讀者理解本發明的原理和發明人為了改進現有技術所做貢獻的概念，並且應當被理解為不限於這些明確引用的例子和條件。另外，本文敘述原理、方面的所有陳述和本發明的實施方式及其特定實施例旨在包括其結構和功能的等同物。另外，這類等同物旨在包括目前已知的等同物和未來開發的等同物，即開發的實現相同功能的任何元件，與結構無關。因此，本發明的範圍不旨在局限於本文顯示和描述的示範性實施方式。相反，本發明的範圍和思想體現在附帶的權利要求書中。
權利要求
1.包含2′羥基硫代碳保護基團的核苷單體。
2.根據權利要求1的核苷單體，其中所述2′羥基硫代碳保護基團是硫代碳酸酯保護基團。
3.根據權利要求2的核苷單體，其中所述核苷單體具有如下結構
其中
BP是受保護或未受保護的雜環；
R1或R2各自獨立地選自氫、保護基團和亞磷醯胺基；
X和Y獨立地為硫或氧，其中X和Y中的至少之一為硫，且
R3獨立地選自烴基和被取代的烴基。
4.根據權利要求1的核苷單體，其中所述2′羥基硫代碳保護基團是硫代氨基甲酸酯保護基團。
5.根據權利要求4的核苷單體，其中所述核苷單體具有如下結構
其中
BP是受保護或未受保護的雜環；
R1或R2各自獨立地選自氫、保護基團和亞磷醯胺基；
N為仲胺(-NH-Z)或叔胺(-N-ZZ″)，其中Z和Z″獨立地選自烴基、被取代的烴基、芳基、被取代的芳基，並且其中Z或Z″能夠與N環狀連結。
6.合成核酸的方法，所述方法包括
(a)提供具有未受保護的羥基的核苷殘基和2′受保護的核苷單體，其中所述2′受保護的核苷單體包含2′硫代碳保護基團；和
(b)在允許所述核苷單體與所述核苷殘基共價鍵合的條件下將所述核苷殘基與所述核苷單體接觸並產生所述核酸。
7.根據權利要求6的方法，其中所述方法還包括使所述核酸暴露於氧化劑和去保護劑。
8.根據權利要求7的方法，其中所述方法還包括將所述接觸步驟至少重複一次。
9.根據權利要求8的方法，其中所述方法還包括去除所述2′羥基保護基團。
10.根據權利要求6的方法，其中所述核苷殘基與固體支持物共價鍵合。
11.根據權利要求10的方法，其中所述方法還包括從所述固體支持物上切割所述核酸，產生游離的核酸。
12.根據權利要求11的方法，其中所述方法還包括化學修飾所述游離核酸，產生經修飾的核酸。
13.根據權利要求12的方法，其中所述方法還包括將所述經修飾的核酸與可藥用的載體組合。
14.根據權利要求10的方法，其中所述方法還包括化學修飾所述核酸，產生經修飾的核酸，然後從所述固體支持物上切割所述經化學修飾的核酸。
15.包含以下結構的核酸，
其中
BP是受保護或未受保護的含氮鹼基；
Q是硫代碳保護基團；
R12選自由氫、烴基、被取代的烴基、芳基和被取代的芳基組成的組；以及
m是大於1的整數。
全文摘要
本發明的方面包括在2′位點上被硫代碳保護基團保護的2′受保護的核苷單體，例如式(I)。感興趣的硫代碳保護基團包括硫代羥基碳酸酯、硫代羰基碳酸酯、二硫代碳酸酯，以及硫代氨基甲酸酯。本發明的方面還包括包含本發明保護基團的核酸，以及使用本發明的保護基團合成核酸的方法。
文檔編號A61K31/7072GK101784556SQ200880024107
公開日2010年7月21日 申請日期2008年5月9日 優先權日2007年5月10日
發明者道格拉斯·J·德林傑, 安傑斯卡·施爾扎拉, 約翰·特納爾, 約爾·麥爾森, 佐爾譚·庫皮哈, 佛納多·法瑞拉, 馬文·H·卡魯特斯, 傑拉爾丁·F·德林傑 申請人:安捷倫科技有限公司, 科羅拉多大學董事會