側向流和相關免疫測定中的信號放大的製作方法

2023-10-29 01:52:07 1

側向流和相關免疫測定中的信號放大的製作方法
【專利摘要】本發明提供用於增強測試樣品中的抗體檢測的方法、裝置、組合物(例如捕獲複合物)和試劑盒。該方法、裝置和組合物利用可檢測的Fc結合分子，例如蛋白A、蛋白G、和/或Fc特異性抗體放大免疫測定例如側向流測定中檢測抗體的信號。
【專利說明】側向流和相關免疫測定中的信號放大
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求於2011年11月21日提交的美國臨時申請第61/562, 302號的權益， 其通過引用以其整體併入本文。
[0003] 發明背景
[0004] 免疫測定用途廣泛，並常用於鑑定感染原。某些免疫測定依賴於宿主對給定感染 原的免疫反應，例如，通過測定特異性結合該感染原的一種或多種獨特抗原的宿主抗體的 存在。多種類型的免疫測定系統可用於診斷目的，包括大型、自動化的中央實驗室系統和相 對簡易的櫃檯檢測。這些免疫測定採用多種檢測形式，例如凝集反應測定，沉澱素測定，酶 聯免疫測定，直接螢光測定，免疫組化檢測，補體結合測定，血清學試驗，免疫電泳測定以及 側向流和通流試驗（即快速"條（Strip)"檢測）。免疫測定能對多種疾病提供快速、簡便 和高效的診斷。然而，本領域仍存在對具有高靈敏度的改進的免疫測定的需求。
[0005] 發明概述
[0006] 本發明部分基於發現添加可檢測的Fc結合分子（例如蛋白A綴合物，蛋白G綴合 物，第二抗體綴合物）可用於在免疫測定，例如基於抗原的捕獲或夾心型測定中檢測抗體。 這些可檢測的Fc結合分子可單獨或與其他可檢測實體組合用於在免疫測定中檢測抗體。 例如，一旦待測抗體被抗體特異性結合實體（例如抗原）捕獲，這些Fc結合分子可用於檢 測該抗體。在另一個實例中，這些Fc結合分子可用作可檢測信號的第二來源，例如與其他 標記的或可檢測的抗體結合實體（如抗原）組合。
[0007] 該發現可用於本文所述的多種捕獲型測定、相關方法、組合物以及試劑盒。
[0008] 因此，某些實施方式包括用於檢測測試樣品中的抗體的方法，所述方法包含：(a) 使所述測試樣品與第一檢測物接觸以形成包含第一檢測物和所述抗體的第一複合物，其中 第一檢測物包含與第一可檢測實體綴合的Fc結合分子；(b)使第一複合物與固定於表面的 測試區域的捕獲實體接觸，其中所述捕獲實體能夠與所述抗體特異性結合；以及（c)檢測 來自測試區域中的第一可檢測實體的信號的存在，其中所述信號的存在表明測試樣品中存 在所述抗體。在某些實施方式中，第一檢測物固定於表面的綴合區域，其中所述綴合區域與 表面的測試區域不重疊。在【具體實施方式】中，Fc結合分子是蛋白A、蛋白G或二者。在某些 實施方式中，第一檢測物包含各自與可檢測實體綴合的蛋白A和蛋白G。在這些實施方式 中，可根據待測免疫球蛋白的類型調整蛋白A與蛋白G的比率，從而優化信號放大水平。例 如，在一些實施方式中，蛋白A和蛋白G以約10:1至約1:10,更優選約5:1至約1:5的比率 存在。
[0009] 在某些實施方式中，捕獲實體是抗原或抗原性肽。在【具體實施方式】中，所述抗原或 抗原性肽來自選自以下的生物體：心絲蟲，例如犬心絲蟲，犬埃裡希體（Ehrlichia canis)， 伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi),埃氏疏螺旋體（Borrelia afzelii)，伽氏疏螺旋 體（Borrelia garinii)，嗜吞噬細胞無形體（Anaplasma phagocytophilum)，貓白血病毒， 細小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞體病毒，軍團桿菌（Legionella)，腺 病毒，輪狀病毒，貓免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌（Streptococcus)。
[0010] 在某些實施方式中，第一可檢測實體是金屬納米顆粒，金屬納米殼，螢光團或有色 乳膠顆粒。在某些實施方式中，金屬納米顆粒或金屬納米殼選自由金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、 鉬顆粒、鎘顆粒、複合顆粒、金空心球、金塗覆二氧化娃納米殼和二氧化娃塗覆金殼組成的 組。
[0011] 本文提供的某些方法進一步包含使測試樣品與第二檢測物接觸，其中第二檢測物 包含與第二可檢測實體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與抗體特異性結 合。在某些實施方式中，第一和第二檢測物固定於綴合區域，其中綴合區域與表面測試區域 不重疊。在某些實施方式中，綴合區域進一步包含對照檢測物。信號放大水平可通過調整 第一檢測物與第二檢測物的比率來選擇。在某些實施方式中，第一檢測物與第二檢測物的 比率為約20:1至約1:20,更優選約20:1至約1:1。
[0012] 在【具體實施方式】中，第一和第二可檢測實體相同。在更具體的實施方式中，第一和 第二可檢測實體均為金納米顆粒。在其他實施方式中，第一和第二可檢測實體不同。
[0013] 在某些實施方式中，所述表面是側向流測定裝置中的流動通道，微孔板的表面或 分析轉子中的流動通道。
[0014] 如上所述，某些實施方式使用與可檢測實體綴合的第二檢測物，該第二檢測物是 抗原或抗原性肽。在這些及相關實施方式的一些中，抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲， 例如犬心絲蟲，犬埃裡希體，沙費埃裡希體（Ehrlichia chaffeensis)，伊氏埃裡希體，伯 氏疏螺旋體，埃氏疏螺旋體，伽氏疏螺旋體，嗜吞噬細胞無形體，扁平無形體（Anaplasma platys)，貓白血病毒，細小病毒，例如犬細小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道 合胞體病毒，軍團桿菌，腺病毒，輪狀病毒，貓免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌 組成的組的生物體。
[0015] 在某些實施方式中，所述表面是側向流測定裝置中的流動通道或分析轉子中的流 動通道。在【具體實施方式】中，測試樣品是血液、血清或血漿。
[0016] 還包括抗體檢測裝置，其包含上樣區域；綴合區域，其中所述綴合區域包含可移動 的第一檢測物，所述第一檢測物包括與第一可檢測實體綴合的Fc結合分子；以及測試區 域，其中所述測試區域包含能夠與所述抗體特異性結合的固定的捕獲實體；其中所述上樣 區域，綴合區域和測試區域被設置使得在操作中，液體樣品被施加至上樣區域時，與綴合區 域和測試區域流體連通。在某些實施方式中，所述Fc結合分子是蛋白A和/或蛋白G。
[0017] 在某些實施方式中，捕獲實體是抗原或抗原性肽。在【具體實施方式】中，抗原或抗原 性肽來自選自由心絲蟲,例如犬心絲蟲，犬埃裡希體,沙費埃裡希體，伊氏埃裡希體,伯氏疏 螺旋體，埃氏疏螺旋體，伽氏疏螺旋體，嗜吞噬細胞無形體，扁平無形體，貓白血病毒，細小 病毒，例如犬細小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞體病毒，軍團桿菌，腺 病毒，輪狀病毒，貓免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組的生物體。
[0018] 在【具體實施方式】中，第一可檢測實體是金屬納米顆粒、金屬納米殼、螢光團或有色 乳膠顆粒。在【具體實施方式】中，金屬納米顆粒或金屬納米殼選自由金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、 鉬顆粒、鎘顆粒、複合顆粒、金空心球、金塗覆二氧化娃納米殼和二氧化娃塗覆金殼組成的 組。
[0019] 在某些實施方式中，所述裝置進一步包含對照區域，當液體樣品施加至上樣區域 時，該對照區域與液體樣品流體連通。在某些實施方式中，對照區域包含能夠與對照檢測物 特異性結合的固定的結合配偶體。
[0020] 在【具體實施方式】中，第一檢測物包含與第一可檢測實體綴合的蛋白A或蛋白G，且 所述固定的結合配偶體是抗蛋白A或抗蛋白G抗體。
[0021] 某些裝置進一步包含位於測試區域下遊的吸收墊（absorbent pad)。在某些裝置 中，綴合區域位於上樣區域的上遊。在某些實施方式中，綴合區域位於上樣區域的下遊。在 某些實施方式中，上樣區域包含血液分離材料。在某些情況下，綴合區域進一步包含可移動 的第二檢測物，其中第二檢測物包含與第二可檢測實體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原 或抗原性肽能夠與抗體特異性結合。可以調整第一檢測物（例如與第一可檢測實體綴合的 Fc結合分子，如蛋白A和/或蛋白G)與第二檢測物（與第二可檢測實體綴合的抗原/抗原 性肽）的比率，從而選擇期望的信號放大水平。在某些實施方式中，第一檢測物與第二檢測 物的比率為約20:1至約1:20。在其他實施方式中，第一檢測物與第二檢測物的比率為約 20:1 至約 1:1。
[0022] 在【具體實施方式】中，第一和第二可檢測實體相同。在【具體實施方式】中，第一和第二 可檢測實體是金納米顆粒。在其他實施方式中，第一和第二可檢測實體不同。
[0023] 在【具體實施方式】中，例如檢測抗微生物抗體中，所述抗原或抗原性肽來自選自由 心絲蟲，例如犬心絲蟲，犬埃裡希體，沙費埃裡希體，伊氏埃裡希體，伯氏疏螺旋體，埃氏疏 螺旋體，伽氏疏螺旋體，嗜吞噬細胞無形體，扁平無形體，貓白血病毒，細小病毒，例如犬細 小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞體病毒，軍團桿菌，腺病毒，輪狀病毒， 貓免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組的生物體。
[0024] 還包括試劑盒，其包含本文所述的一種或多種檢測裝置和系統，以及使用該裝置 或系統檢測測試樣品中的抗體的說明書。某些試劑盒進一步包含第二檢測物和將第二檢測 物與測試樣品在施加到檢測系統的上樣區域之前組合的說明書，其中所述第二檢測物包含 與第二可檢測實體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體特異性結 合。在某些實施方式中，說明書規定將第二檢測物與測試樣品組合，這樣第二檢測物將以與 第一檢測物特定的比率存在，以實現期望的信號放大水平。
[0025] 還包括檢測測試樣品中的抗體的方法，其包含將測試樣品施加於本文所述的一種 或多種檢測裝置或系統的上樣區域，並檢測來自測試區域中的第一可檢測實體的信號的存 在或不存在。某些方法進一步包含將第二檢測物與測試樣品在施加到檢測系統的上樣區域 之前組合，其中所述第二檢測物包含與第二可檢測實體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原 或抗原性肽能夠與抗體特異性結合。
[0026] 某些實施方式涉及一種或多種捕獲複合物，其包含捕獲實體，測試樣品中的抗體， 以及第一檢測物，其中捕獲實體與所述抗體結合，並且其中第一檢測物包含與第一可檢測 實體綴合的Fc結合分子，並與所述抗體的Fc區域結合。這些及相關實施方式中的一些進 一步包含第二檢測物，其中第二檢測物與所述抗體的可變區特異性結合。在某些實施方式 中，捕獲複合物固定於表面的測試區域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1顯示本發明捕獲複合物的一個實例，其具有被固定於測試表面（例如硝酸纖 維素）的捕獲實體（例如與BSA綴合的抗體特異性抗原）捕獲的感興趣的抗體，與靶抗體 的Fc區域結合的可檢測的Fc結合分子-綴合物（例如蛋白A-或蛋白G-膠體金綴合物）， 以及任選存在的與感興趣的抗體的可變區結合的第二可檢測綴合物（例如抗原-膠體金綴 合物）。
[0028] 圖2顯示側向流裝置的一個實例，以及根據本發明的方法。感興趣的抗體特異性 的抗原性肽與載體蛋白牛血清白蛋白（BSA)連接，產生的BSA-肽綴合物在硝酸纖維素上用 於捕獲。該相同的抗原性肽進一步與膠體金綴合，其在該示例性測定中作為標記。通過向 綴合物混合物中添加蛋白A/G-金綴合物，產生的信號被進一步放大。
[0029] 圖3顯示隨時間的萊姆病特異性的側向流測定的樣品流，其中使用圖2所示的側 向流裝置。在該示例性測定中，一滴血液，血清或血漿（約15_20yL，通過移液管）與四滴 膠體金綴合物溶液（約30 μ L，來自滴瓶）在反應管中混合。生成的反應混合物的一滴轉 移至放置於平坦表面的測試盒的樣品部分。血液分離墊從全血中過濾血細胞（參見圖2)。 血漿（或血清）和伯氏疏螺旋體抗體綴合複合物遷移至包含測試和對照區域的硝酸纖維素 膜。滴加三（3)滴（約60 μ L，來自滴瓶）Chase緩衝液（施加樣品後一分鐘），使全部混合 物通過硝酸纖維素，向上部吸收墊遷移，該吸收墊持續地牽引液體。陽性樣品中存在的伯氏 疏螺旋體特異性抗體已經與金標記的抗原綴合物複合。標記的抗原-抗體複合物向測試線 遷移，此處固定的抗原通過抗體上的第二結合位點捕獲標記的抗原-抗體複合物。綴合混 合物中存在的蛋白A/G-金綴合物與靶抗體的Fc區域結合，並放大測試信號。游離的標記抗 原和剩餘反應混合物前行至對照線，此處蛋白A-金綴合物被包含雞抗蛋白A抗體的對照捕 獲物捕獲。在此情況下，裝置約8分鐘可觀察結果。測試區域的一條紅線和對照區域的第 二條紅線的出現，表明伯氏疏螺旋體抗體的存在。僅對照區域出現一條線表明不存在伯氏 疏螺旋體抗體。如果（a)出現測試線，而未形成對照線，或（b)對照線或測試線均未形成， 則該測試被視為無效。
[0030] 發明詳述
[0031] 本文所用以下術語具有如下意思：
[0032] 本文所用冠詞"一（a) "和"一（an) "是指一個或多於一個（即至少一個）冠詞的 語法對象。以舉例的方式，"元件"是指一個元件或多於一個元件。
[0033] 本文所用的"大約"指數量、水平、數值、數字、頻率、百分比、尺寸、大小、總數、重量 或長度，其變化多達參照數量、水平、數值、數字、頻率、百分比、尺寸、大小、總數、重量或長 度的 30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1%。
[0034] 本說明書自始至終，除非上下文另有要求，詞語"包含（comprise)"，包含 (comprises) "以及"包含（comprising) "將理解為意指包含陳述的步驟或成分，或步驟或 成分的群組，但是並不排除任一其他的步驟或成分，或步驟或成分的群組。
[0035] 本文所用的"由…組成（consisting of)"指包括並且限於，跟隨短語"由……組 成（consisting of)"的無論什麼。因此，短語"由…組成（consisting of)"表明所列舉 的成分為必須的或強制的，並且沒有其他的成分可能存在。本文所用的"基本上由……組 成（consisting essentially of)"指包括任意該短語後所列舉的成分並且限於不幹擾 或促進本公開中針對所列舉的成分的指定的活性或作用。因此，短語"基本上由……組成 (consisting essentially of) "表明所列舉的成分為必須的或強制的，但是其他的成分為 任選的並且取決於它們是否實質地影響所列舉的成分的活性或作用，可以或不可以存在。
[0036] 術語"肽"、"多肽"以及"蛋白質"在本文中可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物及 其變體和合成及天然發生的類似物。因此，這些術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是 合成的非天然存在的胺基酸（例如相應的天然存在的胺基酸的化學類似物）的胺基酸聚合 物，也適用於天然存在的胺基酸聚合物及其天然存在的化學衍生物。
[0037] "增加的"或"提高的"量任選地是"統計學顯著的"量，並且可以包括相對於例如在 無可檢測的Fc結合分子時進行的抗體測試的量或值（例如信號或數值，如反應評分）的約 1. 1、1· 2、1· 3、1· 4、1· 5、1· 6、1· 7、1· 8、1· 9、2· 0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30 或更大倍數 (包括其間大於1的所有整數和小數，例如2. 5、3. 6、3. 7)的增加。"增加的"或"提高的" 值或量也可包括相對於例如在無可檢測的Fc結合分子時進行的抗體測試的量或值的1%、 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%U0%>11%>12%U3%U4%U5%U6%U7%U8%, 19 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %, 90%、95%、100%、200%、300%、400%、500% 或更多的增加。
[0038] 本文引用的所有出版物、專利和專利申請都以其整體通過引用併入本文。
[0039] 方法
[0040] -方面，本發明包括用於檢測測試樣品中的抗體的方法。在某些實施方式中，這些 方法涉及，在相關一部分，使測試樣品與綴合第一可檢測實體的Fc結合分子（即可檢測的 Fc結合分子綴合物）接觸，形成第一複合物，使第一複合物與固定於表面的測試區域的捕 獲實體接觸，其中捕獲實體能夠與所述抗體特異性結合，以及檢測來自測試區域中的可檢 測的Fc結合分子綴合物的信號的存在。其中信號的存在表明測試樣品中存在所述抗體。
[0041] 這些方法的反應物可按任意順序或序列接觸。例如，測試樣品可在施加到表面之 前與可檢測的Fc結合分子綴合物混合，或者這兩種反應物可分別施加到表面，順序地或同 時，在表面上相同或不同的位置。當分別添加時，反應物將在例如通過毛細管或其他作用在 測試表面擴散或流通時彼此接觸。在【具體實施方式】中，可檢測的Fc結合分子綴合物事先固 定於表面的綴合區域，該綴合區域與表面的測試區域不重疊。在某些實施方式中，測試樣品 被施加於表面，通過毛細管或其他作用流過綴合區域和測試區域，從而與Fc結合分子和捕 獲實體接觸。如果樣品中存在感興趣的抗體，其將與可檢測的Fc結合分子和捕獲實體形成 可檢測的複合物。在【具體實施方式】中，Fc結合分子是蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或其 任意組合，例如其混合物或融合蛋白。
[0042] 本文提供的某些方法進一步包含使測試樣品與第二檢測物分子接觸。在這些實施 方式中，第二檢測物可以是任意適合的抗體結合實體，例如與第二可檢測實體綴合併且能 夠與抗體特異性結合的抗原或抗原性肽。如第二檢測物綴合物和第二可檢測實體的組合有 時被稱為"可檢測的抗體特異性抗原綴合物"或"可檢測的抗原綴合物"，其包括肽抗原和非 肽抗原。在某些實施方式中，第一和第二可檢測實體相同，即Fc結合分子綴合物和可檢測 抗原綴合物均與相同類型的可檢測實體（例如金顆粒）綴合。在其他實施方式中，第一和 第二可檢測實體不同。在【具體實施方式】中，第一和第二可檢測實體均為金納米顆粒，生成膠 體金綴合物（CGC)。在這些及相關實施方式中，可檢測的Fc結合分子可被稱為"Fc結合分 子-CGC"，具體的實例包括蛋白A-CGC、蛋白G-CGC、蛋白A/G-CGC、以及蛋白L-CGC。在某些 實施方式中，Fc結合分子是能與測試樣品中的抗體的Fc區域結合的二抗或其片段，第二檢 測物可以是任意適合的抗體結合實體，例如抗原或抗原性肽等。
[0043] 與之前類似，這些方法中的反應物可按任意順序或序列接觸。例如，測試樣品可在 施加到表面之前與可檢測的Fc結合分子綴合物、可檢測的抗原綴合物、或其二者混合，或 者這三個反應物可分別施加到表面，順序地或同時，在表面上相同或不同的位置。當分別添 加時，反應物將在例如通過毛細管或其他作用在測試表面擴散或流通時彼此接觸。
[0044] 在某些實施方式中，Fc結合分子綴合物固定於表面的綴合區域，該綴合區域與測 試區域不重疊，測試樣品和可檢測的抗原綴合物分別或共同施加至表面。在其他實施方式 中，可檢測的抗原綴合物固定於表面的綴合區域，該綴合區域與測試區域不重疊，測試樣品 和可檢測的Fc結合分子綴合物分別或共同施加至表面。在某些實施方式中，可檢測的Fc結 合分子綴合物與可檢測的抗原綴合物均固定於表面的綴合區域，該綴合區域與表面測試區 域不重疊，測試樣品施加至測試區域。在施加至表面後，測試樣品（單獨或與其他反應物結 合）可通過毛細管或其他作用在表面流通或擴散，通過綴合區域（如果存在）和測試區域， 從而與可檢測的Fc結合分子綴合物、可檢測的抗原綴合物和捕獲實體接觸。如果樣品中存 在感興趣的抗體，其將與這些反應物形成一個或多個可檢測複合物，從而表明樣品中抗體 的存在。本領域技術人員會意識到，這些示例性組合併非限制性的，還存在其他可能性。
[0045] 在某些實施方式中，綴合區域進一步包含對照檢測物，例如與Fc結合分子特異性 結合的抗體。其他類型的對照區域對本領域技術人員是顯而易見的。
[0046] 測試樣品通常是獲自對象的生物學樣品，其含有或疑似含有感興趣的抗體，例如 某感染原特異性的抗體。生物樣品優選易於獲得，並可包括源自靜脈血樣品，或甚至源於指 血的血液，血清或血漿。來自其他身體部位的組織或其他體液（例如腦脊髓液（CSF)、唾液、 胃液分泌、粘液、尿、糞便等）已知含有抗體，可用作測試樣品來源。在其他實施方式中，樣 品是提取自身體器官的組織（例如組織勻漿）或細胞裂解物。在某些實施方式中，對象是 野生動物（例如鹿或齧齒動物，如小鼠、花慄鼠、松鼠等）。在其他實施方式中，對象是實驗 室動物（例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、靈長動物等）。在其他實施方式中，對象是家養或野 生動物（例如狗、貓、馬）。在仍其他實施方式中，對象是人。
[0047] 抗體，又稱作免疫球蛋白，是免疫系統的Y形的蛋白，其特異性識別外源物體或抗 原，例如細菌、酵母、寄生蟲和病毒組分。抗體的"Y"的每個尖端包含對抗原上的特定表位 特異性的抗原結合位點，使得這兩種結構精確地相互結合。當暴露於與抗體特異性結合的 抗原（例如微生物抗原）時，該抗體的產量增加。因此，檢測來自對象樣品中的抗原特異性 抗體可表明該對象當前是否接觸，或之前是否曾接觸某一微生物，例如病毒、細菌、真菌或 寄生蟲。
[0048] 可結晶片段區域（Fc區域）是抗體的尾部區域，其與細胞表面的Fc受體和補體系 統的某些蛋白相互作用。在IgG、IgA和IgD抗體同種型中，Fc區域由兩個相同蛋白片段組 成，其源自抗體兩個重鏈的第二和第三恆定區。IgM和IgE的Fc區域的每個多肽鏈中包含 三個重鏈恆定區（C Hg 2-4)。IgG抗體的Fc區域具有高度保守的N-糖基化位點。附著於 該位點的N-聚糖主要是複合物類型的核心巖藻糖化的雙觸角結構。另外，少量的這些N-聚 糖還具有等分的GlcNAc和α-2, 6連接的唾液酸殘基。抗體的Fab區域包含決定抗體靶特 異性的可變區，相比之下，每個物種的所有同類抗體的Fc區域均相同，它們是恆定不變的。 [0049] 抗體的"抗原結合位點"或"結合部分"指免疫球蛋白分子參與抗原結合的部分。 抗原結合位點由重鏈（"H"）和輕鏈（"L"）N末端可變（"V"）區的胺基酸殘基組成。重 鏈和輕鏈V區中的三個高度差異化的區段被稱為"高變區"，其位於更保守的名為"框架區" 或"FR"的兩側區段之間。因此，術語"FR"指天然發現的位於免疫球蛋白高變區之間並與 之鄰近的胺基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個高變區和重鏈的三個高變區在三維空間 上彼此相對分布，形成抗原結合表面。抗原結合表面與被結合抗原的三維表面互補，每條重 鏈和輕鏈的三個高變區被稱為"互補決定區"或"CDR"。
[0050] 典型地，抗體包含全部或部分Fc區域，有助於被Fc結合分子檢測，抗體還可包含 一個或多個抗原結合位點，有助於被抗體特異性結合劑，例如抗原或抗原性肽檢測。抗體可 以屬於例如IgG、IgE、IgD、IgM或IgA類型。通常，檢測IgM和/或IgA抗體，例如用於早 期感染檢測。
[0051] Fc結合分子包括特異性結合抗體的Fc區域或抗體可變區外的任意區域的任意結 合劑。在某些實施方式中，Fc結合分子不是抗體或其抗原結合片段。在其他實施方式中， Fc結合分子是Fc特異性二抗，例如兔抗狗抗體，山羊抗狗抗體。在某些實施方式中，Fc結 合分子是針對測試樣品中待測抗體的二抗。Fc結合分子的一般性實例包括多肽、可溶受體、 adnectin、小肽、肽模擬物、小分子、適體等，其特異性結合免疫球蛋白的Fc區域。Fc結合分 子的具體實例包括蛋白A、蛋白G、蛋白A/G融合蛋白、蛋白L，及其片段和可變體，其保留與 抗體Fc區域特異性結合的能力。
[0052] 蛋白A是40-60kDa的MSCRAMM (識別粘連基質分子的微生物表面成分）表面蛋白， 於金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)細胞壁中被發現，由spa基因編碼。野生型 蛋白A由五個同源的免疫球蛋白結合結構域組成，其摺疊成三螺旋束，並能夠分別與抗體 的F C區域結合。蛋白A與人IgGl和IgG2以高親和性結合，並與人IgM、IgA和IgE以中等 親和性結合。
[0053] 蛋白G是在C型和G型鏈球菌中表達的免疫球蛋白結合蛋白（參見，例如Sjobring et al.，J Biol Chem.266:399 - 405，1991)。蛋白 G 的核磁共振溶液結構（參見 Lian et al·，Journal of Mol. Biol. 228:1219-1234, 1992)和晶體結構（參見 Derrick and Wigley, Journal of Mol. Biol. 243:906-918, 1994)已經解析到了 1 埃。蛋白 A 和蛋白 G 是 本領域熟知的，並以多種綴合和非綴合形式可供商購。
[0054] 還包括全長或野生型蛋白A和蛋白G的功能性變體和片段。在某些實施方式中，變 體多肽包括與蛋白A和/或蛋白G的野生型序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或更多的序列相同性 或相似性的胺基酸序列。功能性片段可以是多肽片段，其為，例如，野生型蛋白A和/或蛋 白 G 的 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、450、500 個或更多的連續或不連續殘基。蛋 白A和蛋白G的變體和片段通常保持與一個或多個免疫球蛋白同種型的Fc區域的特異性 結合。
[0055] 序列相同性百分比具有本領域公認的含義，有多種方法檢測兩個多肽或多核苷 酸序列之間的相同性。參見，例如 Lesk, Ed. Computational Molecular Biology, Oxford University Press,New York, (1988) ；Smith,Ed., Biocomputing:Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993) ；Griffin & Griffin, Eds. , Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994) ；von Heinje,Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987)； 以 及 Gribskov & Devereux, Eds. , Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)。用於比對多核苷酸或多肽的方法被編成電腦程式，包括GCG程序包 (Devereux et al. , Nuc. Acids Res. 12:387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al.，J Molec.Biol.215:403(1990))，以及 Bestfit 程序（Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)，其使用 Smith 和 Waterman 的局部同源 性算法（Adv.App. Math.，2:482-489(1981))。例如，可使用利用FASTA算法的電腦程式 ALIGN，進行仿射空位搜索，空位開放罰分為-12,空位擴展罰分為-2。
[0056] 還涉及包含Fc結合多肽的融合蛋白，包括蛋白A融合和蛋白G融合。Fc結合分 子可與另一個Fc結合分子的整體或部分融合，或與一個或多個異源多肽融合。一個蛋白 A/G融合蛋白的具體實例將蛋白A的4個Fc結合結構域與蛋白G的2個Fc結合結構域結 合（參見例如 Sikkema, J. W. D.，Amer. Biotech. Lab, 7:42, 1989 ;以及 Eliasson et al.，J. Biol. Chem. 263, 4323-4327, 1988)，然而，也可使用其他組合方式。融合配偶體（例如肽或 其他配基）可用於改進純化、改進溶解度、提高多肽在宿主細胞中的表達、輔助檢測、以及 穩定多肽等。融合配偶體的實例包括載體蛋白（例如血清白蛋白，如牛血清白蛋白）、β -半 乳糖苷酶、穀胱甘肽-S-轉移酶、組氨酸標籤等。
[0057] 捕獲實體可以是與感興趣的抗體特異性結合的任意結合劑，該抗體是由本文所述 方法和裝置檢測的靶抗體，例如微生物特異性抗體。典型地，捕獲實體與抗體可變區特異性 結合，因而包含抗體的抗原結合位點特異性的一個或多個表位。在某些實施方式中，捕獲實 體不是抗體或其抗原結合片段。在【具體實施方式】中，捕獲實體是與感興趣的抗體特異性結 合的抗原或抗原性肽。示例性的抗原和抗原性肽如下所述。還包括可溶受體、adnectin、肽 模擬物、小分子、適體等，其與感興趣的抗體即由本文所述方法檢測的抗體特異性結合。
[0058] 如上所述，捕獲實體通常附著或固定於測試表面或底材上，例如固體或半固體支 持物。附著可以是共價或非共價的，並可通過實現共價或非共價結合的與捕獲實體結合的 部分促進所述附著，例如對附著於載體、支持物或表面的組分具有高親和力的部分。例如， 捕獲實體可以與配體（例如生物素）結合，與表面結合的組分可以是相應的配體受體（例 如親和素）。或者，捕獲實體可以與配體受體（例如親和素）結合，與表面結合的組分可以 是相應的配體（例如生物素）。在免疫測定過程中，捕獲實體可在添加包含抗體的樣品之前 或之後附著或固定在測試表面或底材上。
[0059] 在【具體實施方式】中，測試表面是珠、斑點雜交、側向流測定裝置中的流動通道、或 分析轉子中的流動通道。例如，捕獲實體可以附著或固定在多孔膜上，例如PVDF膜（如 Immobilon?膜）、硝酸纖維素膜、聚乙烯膜、尼龍膜、或相似類型的膜。在其他實施方式中， 測試表面或底材是試管或測試孔，例如適用於ELISA或其他夾心類型測定的平板（如微孔 板）中的測試孔。在某些實施方式中，測試表面或底材是傳感器，例如電化學、光學或光電 傳感器。
[0060] 這些測試表面或底材可包含玻璃，基於纖維素的材料，熱塑性聚合物，例如聚乙 烯、聚丙烯、或聚酯，由微粒材料組成的燒結結構（例如玻璃或各種熱塑性聚合物），或由硝 酸纖維素、尼龍、聚碸等組成的澆築膜。測試表面或底材可以是燒結的聚乙烯微粒，俗稱多 孔聚乙烯，例如來自 Chromex Corporation (Albuquerque, NM)，Porex? 等的 0· 2-15 微米的 多孔聚乙烯。所有這些測試表面或底材材料可以適當形狀使用，例如薄膜、片狀、或平板，或 者它們可以塗覆或粘合或層壓於適當的惰性載體，例如紙、玻璃、塑料薄膜、或纖維。
[0061] 將捕獲實體（例如肽）固定在固相上的適當方法包括離子、疏水、共價相互作用 等。與固體或半固體載體、支持物或表面的特異性或半特異性結合可通過捕獲實體實現，其 具有與之結合的使得其與固體或半固體載體、支持物或表面共價或非共價結合的部分。例 如，所述部分可以具有對附著於載體、支持物或表面的組分的親和力。在這種情況下，所述 部分可以是，例如，與肽的胺基酸基團（如6-氨基己酸）結合的生物素或生物素基或其類 似物，而所述組分則是親和素、鏈黴親和素、中性親和素、或其類似物。在另一個可選的情況 下，所述部分具有6個連續的組氨酸殘基（例如6x-His標籤）的胺基酸序列，所述載體包含 負載Ni ++或Co++離子的氨三乙酸（NTA)衍生物。除此之外，適當的載體、支持物和表面包括， 但不限於，珠（例如磁珠，膠體顆粒或納米顆粒，如膠體金，或包含二氧化矽的納米顆粒，乳 膠，聚苯乙烯，聚碳酸酯，或H)VF)，共聚物乳膠，例如苯乙烯二乙烯基苯，羥基化苯乙烯二乙 烯基苯，聚苯乙烯，羧基聚苯乙烯，炭黑珠，未活化的或聚苯乙烯或聚氯乙烯活化的玻璃，環 氧活化的多孔磁玻璃，明膠或多糖顆粒或其他蛋白顆粒。
[0062] 如上所述，抗原和抗原性肽可用作捕獲實體和/或抗體特異性檢測物。選取的抗 原或抗原性肽能夠與靶抗體特異性結合，通常通過該抗體的一個或兩個抗原結合位點。因 此，本文的術語"抗原"指能夠被抗體通過抗體的至少一個抗原結合位點特異性結合的分 子。抗原可以包含一個或多個表位，即特別的抗原連續或非連續區域，其與抗體的抗原結合 位點特異性結合。表位可以是線性表位、順序表位、或構象表位。
[0063] 抗原可以是，例如，肽或其修飾形式，或非肽抗原，例如小分子。如上所述，抗原也 可以包括可溶受體、adnectin、肽模擬物、小分子、適體等，其與感興趣的抗體特異性結合。 [0064] 當用作捕獲實體或"捕獲抗原"時，抗原或抗原性肽通常是非標記的，並固定或附 著於測試表面。對於某些實施方式，捕獲抗原可以與一個或多個異源蛋白，例如牛血清白蛋 白或多抗原性肽（MAPS)融合或綴合或複合，以利於附著到測試表面或其他目的。
[0065]用作抗體特異性檢測物時，抗原或抗原性肽通常與可檢測實體綴合，從而形成"可 檢測抗原綴合物"。在某些實施方式中，這些可檢測抗原綴合物也與一個或多個異源蛋白， 例如牛血清白蛋白或MAPS融合或綴合或複合。如下所述，可檢測抗原綴合物可以設計用於 直接或間接檢測。
[0066] 還涉及包含抗原性肽的融合蛋白。抗原性肽可與具有相同或不同結合特異性（例 如具有一個或多個相同或不同的表位）的一個或多個抗原性肽的全部或部分融合，或與一 個或多個異源多肽融合。融合配偶體（例如肽或其他部分）可用於改進純化、改進溶解度、 提高多肽在宿主細胞中的表達、輔助檢測、穩定抗原性肽、促進在測試表面的固定等。融合 配偶體的實例包括載體蛋白（例如血清白蛋白，如牛血清白蛋白）、β-半乳糖苷酶、穀胱甘 肽-s-轉移酶、組氨酸標籤等。
[0067] 抗原和抗原性肽，以及其他抗體特異性結合劑可來自不同來源。具體的實施方式 包括那些來自微生物來源的，包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲。具體的實例包括來自心絲蟲， 例如犬心絲蟲，犬埃裡希體，伯氏疏螺旋體，埃氏疏螺旋體，伽氏疏螺旋體，嗜吞噬細胞無形 體，貓白血病毒，細小病毒，例如犬細小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞 體病毒，人免疫缺陷病毒（HIV)，軍團桿菌，腺病毒，甲類鏈球菌，貓免疫缺陷病毒（FIV)，輪 狀病毒等的一種或多種的抗原。用於萊姆病抗體檢測的疏螺旋體（Borrelia)抗原的實例 可見於美國申請13/667, 909、美國專利US2011/0136155、以及W02011/063003(均以其整 體通過引用併入本文）。用於埃裡希體抗體檢測的埃裡希體抗原的實例可見於美國申請 61/712, 578、美國專利2011/0124125和TO2011/063235(均以其整體通過引用併入本文）。 [0068] 本文所述的方法使用的抗原性肽可通過合成化學製備（即"合成肽"）。在其他實 施方式中，抗原性肽可用生物方法製造（即通過細胞機器，例如核糖體）。在某些實施方式 中，抗原性肽是分離的。本文所用的"分離的"肽是通過合成或生物學方法製備，然後從用於 製備該肽的化學物質和/或細胞機器中至少部分地純化。在某些實施方式中，分離的肽是 基本純的。本文所用術語"基本純"指分子（例如肽）基本不含細胞物質（蛋白質，脂質，糖 類，核酸等）、培養基、化學物質前體、用於合成該肽的化學物質、或其組合。基本純的肽具有 少於約40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、1%或更少的細胞物質、培養基、其他多 肽、化學物質前體、和/或用於合成該肽的化學物質。相應地，基本純的分子（例如肽）可以 佔感興趣的分子的乾重至少約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%。分 離的肽可在水中，緩衝液中，或是等待重建的乾燥形式，例如，作為試劑盒的一部分。分離的 肽可以藥學上可接受的鹽的形式存在。能夠與本發明的肽形成鹽的適當的酸和鹼為本領域 技術人員所熟知，包括無機和有機酸和鹼。
[0069] 如果感興趣的抗體，或其抗原結合片段與捕獲實體或抗體特異性檢測物以可檢測 的水平反應（例如在側向流測定、蛋白質印跡、或ELISA測定中），並且在相似條件下不與無 關多肽或試劑以統計上顯著的方式可檢測地反應，則被稱為與捕獲實體或抗體特異性檢測 物（例如抗原或抗原性肽）"特異性結合"、"免疫性結合"、和/或"免疫性反應"。術語"特 異性結合"也可指捕獲實體或抗體特異性檢測物對感興趣的抗體比對樣品中的其他抗體具 有更高的親和力（例如更高程度的選擇性）。
[0070] 本文所用的免疫性結合通常指非共價相互作用，其發生在免疫球蛋白分子和該 免疫球蛋白特異性的抗原之間。結合，例如免疫性結合相互作用的強度或親和力可用相 互作用的解離常數（K d)來表示，其中，Kd越小代表親和力越高。可利用本領域已知的方 法對選取的多肽的免疫性結合性能進行定量（參見例如Davies et al.，Annual Rev. Biochem. 59:439-473, 1990)。在某些示例性的實施方式中，抗體對捕獲實體或抗體特異性 檢測物（例如抗原或抗原性肽）具有至少約〇· 〇1、〇· 05、0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、 0· 8、0·9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、40、或501^的親和力。作為另一個實例，捕獲實體或抗體特異性檢測物對抗 體的親和力是對樣品中其他抗體親和力的至少約1. 5倍、2倍、2. 5倍、3倍或更高。
[0071] 相似地，如果Fc結合分子與Fc區域以可檢測的水平反應，並且在相似條件下不與 無關多肽或試劑以統計上顯著的方式可檢測地反應，則被稱為與免疫球蛋白的Fc區域"特 異性結合"。在某些示例性的實施方式中，Fc結合分子對選取的免疫球蛋白同種型的Fc區 域具有至少約 〇· 〇1、〇· 05、0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、或5011]\1的親 和力。某些Fc結合分子相對於其他Fc結合分子，對一個或多個免疫球蛋白同種型具有更 強或更弱的親和力。
[0072] 該親和力或特異性程度可通過多種常規程序來確定，包括，例如競爭結合研究。在 ELISA測定中，陽性反應被定義為比一個對照或一組對照的均值高2或3個標準差的值。
[0073] 如前所示，某些檢測物分子，例如Fc結合分子、抗原、和/或抗原性肽與可檢測實 體綴合。綴合通常通過共價結合實現。可檢測實體包括"直接可檢測實體"，例如金屬納米 顆粒、金屬納米殼、彩色乳膠顆粒、放射性同位素和螢光團，以及"間接可檢測實體"，其經常 依賴於配體-受體相互作用產生信號。在前一情況下，檢測物分子（例如抗原性肽，Fc結 合分子，如蛋白A/G)與直接可檢測實體綴合。在後一情況下，檢測物分子與配體綴合，然後 所述配體與其配體受體相互作用，配體受體與直接可檢測實體綴合，或反之亦然。配體的實 例包括生物素（例如通過半胱氨酸或賴氨酸殘基），脂質分子（例如通過半胱氨酸殘基）， 以及載體蛋白（例如血清白蛋白）。與配體（例如生物素）連接可用於將檢測物與配體受 體（例如親和素，鏈黴親和素或中性親和素）結合。親和素、鏈黴親和素、中性親和素繼而 可與直接可檢測實體（例如可視的信號部分，如膠體金，螢光配基，或酶，例如辣根過氧化 物酶或鹼性磷酸酶）連接。或者，檢測物分子可與配體受體，例如親和素、鏈黴親和素或中 性親和素融合或連接，從而有利於與相應配體的結合，其繼而與直接可檢測實體連接。其他 配體-受體對的實例是本領域熟知的，可類似地使用。
[0074] 直接可檢測實體（或信號配基）的實例包括放射性同位素、螢光團、染料、酶、納米 顆粒、彩色乳膠顆粒、化學發光標記、發光染料、以及其他本文所述和本領域已知的。
[0075] 可用作直接可檢測實體的放射性同位素的實例包括，、，、355、3!1、和 1251。這些放 射性同位素具有不同的半衰期、衰變類型和能級，可對其進行調整以滿足特定方案的要求。 例如， 3H是低能量放射體，其產生較低的背景水平，然而較低的能量也導致放射自顯影和其 他測量的時間較長。
[0076] 可用作直接可檢測實體的螢光團或螢光物的實例包括螢光素、四甲基羅丹明、德 克薩斯紅、以及很多其他的突光團或突光物（例如Haugland, Handbook of Fluorescent Probes_9th Ed.，2002,Molec. Probes，Inc.，Eugene OR ;Haugland，The Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-lOth Ed.，2005,Invitrogen，Carls bad，CA)。還包括發光染料或其他可檢測染料。染料發出的光可以是可見光或不可見光，例 如紫外或紅外光。在示例性實施方式中，染料可以是螢光共振能量轉移（FRET)染料；噸染 料（xanthene dye)，例如螢光素和羅丹明；在α或β位具有氨基的染料（例如萘胺染料， 1-二甲氨基萘基-5-磺酸，1-苯胺基-8-萘磺酸和2-對-甲苯胺基-6-萘磺酸）；含有 3-苯基-7-異氰酸酯香豆素的染料；吖啶，例如9-異硫氰酸酯吖啶和吖啶橙；芘，苯並惡二 唑和芪；含有3-(ε-羧甲基）_3'-乙基_5,5'-二甲基氧雜甲花青（CYA);6_羧基螢光素 (FAM);5^)_ 羧基羅丹明 110(R110);6-羧基羅丹明 6G(R6G);N，N，N'，N'-四甲基-6-羧 基羅丹明（TAMRA);6-羧基-X-羅丹明（R0X);6-羧基-4，，5'-二氯-2，，7'-二甲氧 基螢光素（JOE) ;ALEXAFLU0R? ;Cy2 ;德克薩斯紅和羅丹明紅；6-甲氧基-2'，4, 7, 7'-四 氯螢光素（TET);6-甲氧基-2'，4,4'，5'，7,7'-六氯螢光素（HEX);5-甲氧 基-2'，4，，5，，7，-四氯螢光素（Z0E) ;NAN;NED;Cy3;Cy3.5;Cy5 ;Cy5.5;Cy7;以及 Cy7. 5 ；IR800Cff,ICG,Alexa Fluor 350 ；Alexa Fluor 488 ；Alexa Fluor 532 ；Alexa Fluor 546 ；Alexa Fluor 568 ；Alexa Fluor 594 ；Alexa Fluor 647 ；Alexa Fluor 680,或 Alexa Fluor 750〇
[0077] 非常小的顆粒，稱為納米顆粒，也可用作直接可檢測實體。這些顆粒通常尺寸為 l-1000nm，包括不同的化學結構，例如金和銀顆粒，以及量子點。當被成角度入射的白光輻 射時，40-120nm的銀或金納米顆粒會散射出高強度的單色光。散射光的波長取決於顆粒尺 寸。四到五種緊密接近的不同的顆粒各自會散射出單色光，當其重迭時，會產生特定而唯一 的顏色。衍生納米顆粒，例如銀或金顆粒可與一系列分子結合，包括蛋白質、抗體、小分子、 受體配體和核酸。納米顆粒的具體實例包括金屬納米顆粒和金屬納米殼，例如金顆粒、銀顆 粒、銅顆粒、鉬顆粒、鎘顆粒、複合顆粒、金空心球、金塗覆二氧化娃納米殼和二氧化娃塗覆 金殼。還包括二氧化矽、乳膠、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、rovF納米顆粒、以及任意 這些材料的有色顆粒。
[0078] 量子點也可用作直接可檢測實體。量子點是直徑l_5nm的螢光晶體，可被大範 圍波長的光所激發。被具有適當波長的光激發時，這些晶體發光，例如單色光，其波長取 決於它們的化學成分和尺寸。量子點，例如CdSe、ZnSe、InP、或InAs，具有獨特的光學性 能，這些和類似的量子點可從多種商業渠道獲得（例如，NN-Labs, Fayetteville, AR ;0cean Nanotech, Fayetteville, AR ；Nanoco Technologies, Manchester, UK ；Sigma-Aldrich, St. Louis, M0) 〇
[0079] 檢測信號的存在可通過適於被測定所使用的標記或可檢測實體的任意方式來實 現。例如，檢測步驟可包括可視化地檢查捕獲複合物的顏色變化，或檢查捕獲複合物的物理 化學變化。物理化學變化可以隨著氧化反應或其他化學反應出現。它們可經肉眼，使用分 光光度計等檢測。
[0080] 當信號比陰性對照的信號強時，通常表明感興趣的抗體存在；然而，並非所有的測 試均需要陰性對照。在某些情況下，但也不必然，陽性信號的強度可被量化，當強度相對於 對照在統計上顯著時，表明抗體的存在。在某些情況下，關於具體測試類型的常規知識和經 驗確定何時信號為陽性或陰性，從而表明感興趣抗體的存在或不存在。
[0081] 作為一個實例，來自某些側向流測定裝置的信號可根據反應性評分來測量，分值 為0-5 (包括中間的小數點值），信號越強，越呈陽性，分值越高。陰性對照的分值通常接近 於0,例如約0.25或更低。
[0082] 檢測信號可進行優化，例如，通過調整各反應物的比率。一個實例包括如下調整 ⑴可檢測的Fc結合分子綴合物和（ii)可檢測抗原/抗原性肽綴合物的比率：（i) : (ii) 的比率（例如摩爾比率）為約 1:200、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、 1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、 1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、 16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、或 200:1，包 括中間的所有比率和比率範圍。在某些實施方式中，可檢測的Fc結合分子綴合物與可檢測 抗原/抗原性肽綴合物的比率為約20:1至約1:20,優選約20 :1至約1:1，更優選約16:1 至約2:1。在某些實施方式中，可檢測綴合物中的Fc結合分子是蛋白A、蛋白G、蛋白A/G融 合蛋白、蛋白L、或其片段和變體，其保留與抗體Fc區域特異性結合的能力。
[0083] 在某些實施方式中，蛋白A和蛋白G的混合物被用作Fc結合分子綴合物，其中各 蛋白A和蛋白G分子與可檢測實體綴合。在某些實施方式中，蛋白A和蛋白G均用作可檢測 的Fc結合分子綴合物，可根據待測免疫球蛋白的類型改變蛋白A與蛋白G的比率，從而優 化檢測信號。如上所述，蛋白A和蛋白G對不同免疫球蛋白類型（例如IgG、IgE、IgD、IgM、 或IgA)的Fc區域具有不同的結合親和力。相應地，蛋白A與蛋白G的比率可基於希望檢 測的免疫球蛋白類型進行調整。舉例來說，如果希望主要檢測IgM免疫球蛋白，可以使蛋白 A與蛋白G的比率較低（S卩，相對於蛋白A綴合物，蛋白G綴合物的含量較高）。另一方面， 如果希望主要檢測IgG免疫球蛋白，可以使蛋白A與蛋白G的比率較高（即，相對於蛋白G 綴合物，蛋白A綴合物的含量較高）。蛋白A與蛋白G綴合物的典型比率（例如摩爾比率） 包括，但不限於，1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、 1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、 13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、和20:1。在某些實施方式中，蛋白A綴合物與蛋白 G綴合物的比率為約10:1至約1:10,優選約5 :1至約1:5,更優選約2:1至約1:2。在一個 實施方式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的比率為約1:1。
[0084] 在某些實施方式中，可通過調整蛋白A與蛋白G與可檢測抗原/抗原性肽綴合物 的量的比率，進一步優化檢測信號。例如，在某些實施方式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物 與可檢測抗原/抗原性肽綴合物的比率（例如摩爾比率）可以為約20:20:1至約1:1:20， 約 10:10:1 至約 2:2:1，或約 4:2:1 至約 1:2:1。
[0085] 用抗原檢測特異性抗體的免疫測定實驗方案是本領域已知的。例如，可使用常 規的夾心測定，或常規的競爭測定形式。對於某些適當類型的測定的討論，參見Current Protocols in Immunology (Coligan et al. , editors, John Wiley & Sons, Inc) 〇 在某些 實施方式中，檢測步驟包含進行側向流免疫測定。在某些實施方式中，檢測步驟包含進行 ELISA測定。在其他實施方式中，檢測步驟包含在分析轉子中旋轉樣品。在其他實施方式 中，檢測步驟包含用光化學、光學、或光電傳感器測定樣品。
[0086] 特別有用的測定形式是側向流免疫測定形式。作為一個非限制性實例，包括Fc結 合分子（例如蛋白A和/或G)的報告物或檢測物分子以及任選地抗體特異性抗原被可檢 測實體（例如膠體金）標記，然後乾燥並置於玻璃纖維墊上（上樣墊或綴合墊）。未標記 的抗原或抗原性肽（即捕獲實體）固定於膜上，例如硝酸纖維素或PVDF(聚偏氟乙烯）膜 (例如Immobilon?膜）。當樣品（血液，血清等）溶液被施加到上樣墊（或流經綴合墊） 時，其溶解標記的檢測物，其隨後與樣品中的抗體（如果存在）結合。產生的複合物隨後經 毛細管作用轉運至下一個膜（包含捕獲實體的PVDF或硝酸纖維素）。如果針對捕獲實體的 抗體存在，則其與膜上的檢測物和診斷捕獲實體複合，從而產生信號（例如可見或可視化 的條帶）。
[0087] 作為另一個非限制性實例，樣品墊不附著檢測分子（即可檢測的Fc結合分子，可 檢測的抗原綴合物），即，樣品墊不包含預先固定檢測物分子的綴合區域。所有其他組分與 前述基本相同，未標記的抗原或抗原性肽（即捕獲實體）固定於膜上，例如硝酸纖維素或 PVDF(聚偏氟乙烯）膜（例如Immobilon?膜）。測試樣品（血液，血清等）與一種或多種檢 測物分子預先混合，然後施加到樣品墊上。可替換地，測試樣品和檢測物分子分別地，同時 或順序施加到樣品墊上。其他組合對本領域技術人員是顯而易見的。無論其混合或施加的 順序，樣品中的抗體與檢測物分子產生的複合物隨後通過毛細管作用轉運至下一個膜（包 含捕獲實體的PVDF或硝酸纖維素膜）。如果針對捕獲實體的抗體存在，則其與膜上的檢測 物和診斷捕獲實體複合，從而產生信號（例如可見或可視化的條帶）。
[0088] 在【具體實施方式】中，方法包括使測試樣品與蛋白A和/或蛋白G-膠體金綴合物 (CGC)接觸，形成第一複合物，將第一複合物與固定在硝酸纖維素膜或PVDF膜的測試區域 上的肽抗原接觸，該肽抗原來自微生物來源，與感興趣的抗體特異性結合（例如抗細菌、抗 病毒、抗寄生蟲、抗真菌抗體）。肽抗原可以與BSA綴合或合成為MAPS。測試區域中來自蛋 白A-CGC和/或蛋白G-CGC的信號的存在表明測試樣品中抗體的存在。
[0089] 某些方法進一步包括使測試樣品與肽抗原-CGC綴合物接觸，其包含相同的上述 肽抗原。在某些實施方式中，蛋白A/G-CGC或二抗-CGC或其組合以及肽抗原-CGC以不與測 試區域重疊的方式固定在膜（或單獨但連接的膜）的綴合區域。在其他實施方式中，蛋白 A/G-CGC或二抗-CGC或其組合以及肽抗原-CGC不固定在膜上，而是與測試樣品一起施加在 表面，同時或順序地施加。來自蛋白A/G-CGC和/或二抗-CGC以及肽抗原-CGC的組合信 號表明測試樣品中存在抗體，並且該信號通常比來自單用肽抗原-CGC (即沒有蛋白A-CGC、 蛋白G-CGC或二抗-CGC)進行的測試的信號要強。在【具體實施方式】中，肽抗原是疏螺旋體 抗原（天然存在或合成的，例如與天然存在的抗原相同或相似），測試樣品來自疑似患有萊 姆病的對象。陽性信號表明樣品中存在萊姆病特異性抗體。在其他實施方式中，肽抗原是 埃裡希體抗原（天然存在或合成的，例如與天然存在的抗原相同或相似），對象疑似患有埃 裡希體病，一種由無形小體科，埃裡希體屬和無形體屬的細菌造成的蜱傳播的細菌感染。
[0090] 用於篩查血液製品或其他生理學或生物學液體的另一種測定是酶聯免疫吸附法， 即ELISA。通常在ELISA中，捕獲實體（即抗體特異性抗原）直接或通過捕獲基質（例如抗 體）吸附在微量測試孔表面。然後用適當的試劑，例如牛血清白蛋白（BSA)、熱滅活的正常 山羊血清（NGS)或NL0TT0(脫脂奶粉的緩衝溶液，其還包含防腐劑，鹽及消泡劑）封閉表面 上剩餘的非特異性蛋白結合位點。然後用疑似含有感興趣的抗體的生物樣品孵育測試孔。 樣品可以不經稀釋而施加，或更多時候經稀釋，通常用含有少量（0. 1-5%重量計）蛋白，例 如BSA、NGS或BLOTTO的緩衝溶液。經足夠長時間孵育，使得特異性結合發生後，洗滌測試 孔，去除未結合的蛋白，然後用一種或多種檢測物分子孵育，包括Fc結合分子（例如蛋白 A和/或蛋白G)以及任選的其他抗體特異性抗原（通常與捕獲實體相同），其與酶或其他 標記通過標準程序綴合併溶解在封閉緩衝液中。標記可選自多種酶，包括辣根過氧化物酶 (HRP)、β -半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、葡糖氧化酶等。充足的時間使得特異性結合再次發生， 然後再次洗滌測試孔，去除未結合的綴合物，並添加酶的適宜底物。由此出現顏色，測試孔 內含物的光學密度經可視化或儀器確定（在適宜的波長測量）。臨界0D值可限定為至少 50份血清樣品的平均0D+3標準差（SD)，樣品採集自來自萊姆病並非其地方病的區域的個 體，或以其他常規定義來限定。在非常特定的測定的情況下，可以0D+2SD作為臨界值。進 行ELISA測定的條件是本領域熟知的。
[0091] 本領域技術人員應當理解，任意數量的常規蛋白測定形式，特別是免疫測定形式， 可設計用於本文所述的不同實施方式。本發明並不因此受到具體測定形式選取的限制，並 可包含本領域技術人員已知的測定形式。
[0092] 諸如"包含抗體的樣品"或"檢測樣品中的抗體"的措辭無意排除不包含抗體或未 檢測到抗體的樣品或測定（例如檢測嘗試）。總體來說，本發明涉及確定樣品中是否存在響 應傳染性微生物感染所產生的抗體的測定，無論其是否被檢測。
[0093] 使抗原/肽和抗體反應以便其特異性反應的條件是本領域技術人員所熟知的。 參見，例如 Current Protocols in Immunology (Coligan et al. , editors, John Wiley & Sons, Inc) 〇
[0094] 裝置和糹目合物
[0095] 另一方面，本發明包括用於檢測樣品中的抗體的裝置。某些實施方式包括抗體檢 測裝置或抗體檢測系統，其包含上樣區域、綴合區域和測試區域。綴合區域通常不與測試區 域重疊，然而，上樣區域和這兩個區域經過設置，使得操作中，當施加到上樣區域時，樣品與 綴合區域和測試區域液體流通。通常，測試樣品通過毛細管作用流經或與綴合區域和測試 區域連通。綴合區域包含與第一可檢測實體（即可檢測的Fc結合分子綴合物，例如蛋白A 和/或蛋白G綴合物，或Fc特異性二抗綴合物）綴合的可移動的Fc結合分子，測試區域包 含能與抗體特異性結合的固定的捕獲實體。這些特徵在本文別處有述。
[0096] 在某些實施方式中，裝置進一步包含對照區域，當液體樣品施加至上樣區域時，其 與液體樣品流體連通。同樣的，液體樣品通過毛細管作用流經或與對照區域連通。在某些 實施方式中，對照區域包含能夠與對照檢測物特異性結合的固定的結合配偶體。作為一個 實例，對照區域包含抗蛋白A抗體、抗蛋白G抗體、或能與蛋白A或蛋白G反應的任意哺乳 動物IgG。
[0097] 某些裝置進一步包含位於測試區域下遊的吸收墊。在某些裝置中，綴合區域位於 上樣區域的上遊。在某些實施方式中，綴合區域位於上樣區域的下遊。在某些實施方式中， 上樣區域包含血液分離材料（blood separator material)。
[0098] 在某些情況下，綴合區域進一步包含可移動的第二檢測物，其中第二檢測物包含 與第二可檢測實體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與抗體特異性結合。 在某些實施方式中，第一（例如可檢測的Fc結合分子）和第二（例如可檢測的抗原綴合 物）檢測物具有相同類型的可檢測實體。在其他實施方式中，第一和第二檢測物具有不 同類型的可檢測實體。在【具體實施方式】中，調整第一檢測物與第二檢測物的比率（例如 摩爾比率），從而獲得期望的信號放大水平。例如，第一檢測物（例如可檢測的Fc結合分 子，如蛋白A/蛋白G)與第二檢測物（例如可檢測的抗原綴合物）的比率可以是約1:200、 1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、 1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、 7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、 50 :1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、或200:1，包括中間的所有比率和比率範圍。在某些實 施方式中，可檢測的Fc結合分子綴合物與可檢測抗原/抗原性肽綴合物的比率為約20:1 至約1:20,優選約20 :1至約1:1，更優選約16:1至約2:1。在蛋白A和蛋白G綴合物均被 用作可檢測的Fc結合分子的實施方式中，可如上所述，根據待測免疫球蛋白的類型調整蛋 白A綴合物與蛋白G綴合物的比率，從而優化檢測信號。蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的 適當比率（例如摩爾比率）包括，但不限於，1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、 1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、 8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、和 20:1。在某些實施方 式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的比率為約10:1至約1:10,優選約5 :1至約1:5,更優 選約2:1至約1:2。在一個實施方式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的比率為約1:1。
[0099] 進行特定結合測定尤其是免疫測定的裝置是已知的，並且可以很容易地經過調整 而用於本方法。通常，固相測定比需要分離步驟，例如沉澱，離心、過濾、層析或磁力的異質 測定方法容易操作，因為試劑分離更快，更簡便。固相測定裝置包括微孔板、流通測定裝置 (例如側向流免疫測定裝置）、浸測片（dipstick)、以及免疫毛細管或免疫層析免疫測定裝 置。
[0100] 在某些實施方式中，裝置是側向流免疫測定裝置。在某些實施方式中，裝置是適於 ELISA測定的微孔板。在其他實施方式中，裝置適用於分析轉子。在其他實施方式中，裝置 包含電化學、光學或光電傳 感器。
[0101] 在某些實施方式中，側向流裝置由樣品/血液分離墊、硝酸纖維素膜、以及上部的 置於殼體內的芯（Wick)構成。硝酸纖維素膜具有測試線或區域和任選的對照線或區域，所 述測試線或區域包含捕獲實體，例如未標記的抗體特異性抗原（例如肽抗原或非肽抗原）， 所述對照線或區域含有能與Fc結合分子反應的抗體（如下所述）。疑似含有感興趣的抗體 的樣品可與可檢測的Fc結合分子綴合物預先混合，然後施加到側向流測定裝置。或者不預 先混合，樣品和Fc結合分子可以任意順序，同時或順序施加到測定裝置。
[0102] 可替換地，硝酸纖維素膜如上製備，並進一步具有包含可檢測的Fc結合分子綴合 物的綴合線或區域，其中綴合區域和測試區域不重疊。在某些實施方式中，疑似含有感興趣 的抗體的樣品施加到側向流測定裝置。在其他實施方式中，疑似含有感興趣的抗體的樣品 可與特異性結合抗體（通常與捕獲實體具有相同的結合特異性）的可檢測的抗原綴合物預 先混合，然後施加到側向流測定裝置。與之前類似，不預先混合，樣品和可檢測的抗原綴合 物可以任意順序，同時或順序施加到測定裝置。
[0103] 在某些實施方式中，側向流裝置由樣品/血液分離墊、硝酸纖維素膜、以及上部的 置於殼體內的芯構成（參見例如圖2)。硝酸纖維素膜具有測試線或區域、任選的對照線或 區域、以及綴合線或區域，所述測試線或區域包含捕獲實體，例如未標記的抗體特異性抗原 (例如肽抗原或非肽抗原），所述對照線或區域含有能與Fc結合分子反應的抗體（如下所 述），所述綴合線或區域包含與抗體（通常與捕獲實體具有相同的結合特異性）特異性結合 的可檢測的抗原綴合物。綴合區域和測試區域通常不重疊。疑似含有感興趣的抗體的樣品 可與可檢測的Fc結合分子綴合物預先混合，然後施加到側向流測定裝置。也可以不預先混 合，樣品和Fc結合分子可以任意順序，同時或順序施加到測定裝置。在一個示例性實施方 式中，兩開口裝置也可用於順序施加測試樣品、綴合物和Chase緩衝液。
[0104] 在某些側向流裝置中，硝酸纖維素膜具有測試線或區域、任選的對照線或區域、和 綴合線或區域，所述測試線或區域包含捕獲實體，例如未標記的抗體特異性抗原（例如肽 抗原或非肽抗原），所述對照線或區域含有能與Fc結合分子反應的抗體（如下所述），所述 綴合線或區域包含可檢測的Fc結合分子和與抗體（通常與捕獲實體具有相同的結合特異 性）特異性結合的可檢測的抗原綴合物。然後，疑似含有感興趣的抗體的樣品可被施加到 側向流測定裝置。
[0105] 在一個用於萊姆病特異性抗體檢測的示例性裝置中，側向流裝置由樣品/血液分 離墊、硝酸纖維素膜、以及上部的置於殼體內的芯構成（參見例如圖2)。硝酸纖維素膜具有 測試線或區域以及對照線或區域，所述測試線或區域包含模擬或模仿疏螺旋體抗原（參見 例如美國申請12/948, 209)混合物，所述對照線或區域包含任意蛋白A-或蛋白G-反應免 疫球蛋白（例如，抗蛋白A IgG，鼠、人或其他蛋白A-反應IgG等）。疑似含有伯氏疏螺旋 體抗體的樣品可與膠體金綴合的蛋白A和/或G(蛋白A/G-CGC)，或（ii)蛋白A/G-CGC和 疏螺旋體抗原膠體金綴合物（疏螺旋體抗原-CGC)的混合物混合。然後，該樣品綴合物混 合物可被施加到側向流測定裝置。
[0106] 可替換地，側向流裝置如上構成，但硝酸纖維素墊具有與測試區域分離的一個 或多個綴合區域。所述綴合區域可包括，例如，（i)僅蛋白A/G-CGC，（ii)僅疏螺旋體抗 原-CGC，或（iii)蛋白A/G-CGC和疏螺旋體抗原-CGC組合。此處或本申請其他地方所用 的疏螺旋體抗原、埃裡希體抗原或任意抗原或抗原性肽包括分別模擬或模仿天然疏螺旋體 抗原、天然埃裡希體抗原或任意天然抗原的合成肽混合物。在某些實施方式，例如（i)或 (iii)中，測試樣品單獨施加到側向流裝置上，不進行預先混合。在其他實施方式，例如（i) 中，樣品可與疏螺旋體抗原-CGC預先混合，然後施加到側向流裝置上。在某些實施方式，例 如（ii)中，樣品可與蛋白A/G-CGC預先混合，然後施加到側向流裝置上。然而，這些示例性 的組合併非限制性的，其他可能對本領域技術人員是顯而易見的。
[0107] 在通過樣品/血液分離墊並遷移至任選的綴合線和測試線的過程中，形成捕獲復 合物，其包含蛋白A/G-CGC、樣品中的抗體、以及任選的疏螺旋體抗原-CGC。根據情況（例 如任選地使用疏螺旋體抗原-CGC)，固定的和未標記的疏螺旋體抗原、抗體以及標記的蛋白 A/G-CGC形成複合物或夾心。疏螺旋體抗原-CGC存在時，未標記疏螺旋體抗原、抗體、標記 的疏螺旋體抗原-CGC以及標記的蛋白A/G-CGC形成複合物或夾心。向後一複合物中添加 蛋白A/G-CGC進一步放大了來自標記疏螺旋體抗原-CGC的信號。在某些實施方式中，可如 本文所述且本領域已知，通過調整所有反應物的比率實現放大的增加。
[0108] 在一個用於埃裡希體特異性抗體檢測的示例性裝置中，側向流裝置由樣品/血液 分離墊、硝酸纖維素膜、以及上部的置於殼體內的芯構成。硝酸纖維素膜具有包含埃裡希體 抗原的測試線或區域，以及包含任意蛋白A-或蛋白G-反應性免疫球蛋白（例如抗蛋白A IgG)的對照線或區域。疑似含有埃裡希體（例如犬埃裡希體、沙費埃裡希體，伊氏埃裡希 體）抗體的樣品可與膠體金綴合的蛋白A和/或G(蛋白A/G-CGC)，或（ii)蛋白A/G-CGC 和埃裡希體抗原膠體金綴合物（埃立克體抗原-CGC)的混合物混合。然後，該樣品綴合物 混合物可被施加到側向流測定裝置。
[0109] 可替換地，側向流裝置如上構成，但硝酸纖維素墊具有與測試區域分離的一個或 多個綴合區域。綴合區域可包括，例如，（i)僅蛋白A/G-CGC，（ii)僅埃裡希體抗原-CGC，或 (iii)蛋白A/G-CGC和埃裡希體抗原-CGC組合。在某些實施方式，例如（i)或（iii)中， 測試樣品單獨施加到側向流裝置上，不進行預先混合。在其他實施方式，例如（i)中，樣品 可與埃裡希體抗原-CGC預先混合，然後施加到側向流裝置上。在某些實施方式，例如（ii) 中，樣品可與蛋白A/G-CGC預先混合，然後施加到側向流裝置上。然而，這些示例性的組合 並非限制性的，其他可能對本領域技術人員是顯而易見的。
[0110] 在通過樣品/血液分離墊並遷移至任選的綴合線和測試線的過程中，形成捕獲復 合物，其包含蛋白A/G-CGC、樣品中的抗體、以及可選的埃裡希體抗原-CGC。根據情況（例 如可選的使用埃裡希體抗原-CGC)、固定的和未標記的埃裡希體抗原、抗體以及標記的蛋白 A/G-CGC形成複合物或夾心。埃裡希體抗原-CGC存在時，未標記的埃裡希體抗原、抗體、標 記的埃裡希體抗原-CGC以及標記蛋白A/G-CGC形成複合物或夾心。向後一複合物中添加 蛋白A/G-CGC進一步放大了來自標記的埃裡希體抗原-CGC的信號。在某些實施方式中，可 如本文所述且本領域已知，通過調整所有反應物的比率實現放大的增加。
[0111] 在一個適於ELISA的微孔板的實施方式中，捕獲實體固定在表面，例如96孔ELISA 板或等同固相上，其在鹼性塗覆緩衝液中，以最適濃度4°C孵育過夜，塗覆鏈黴親和素或等 同生物素結合化合物，例如親和素或中性親和素。經過適當次數的標準洗滌緩衝液洗滌後， 最適濃度的生物素化形式的Fc結合分子以及任選的用作捕獲實體的相同抗原溶於常規封 閉緩衝液，被施加到每個測試孔。然後添加樣品，測定過程如本文所述且本領域已知。
[0112] 另一方面，本發明提供與樣品中的抗體檢測相關的組合物。某些實施方式涉及一 種或多種捕獲複合物，其包含捕獲實體、測試樣品中的抗體、以及第一檢測物，其中捕獲實 體與抗體結合，並且其中第一檢測物包含與第一可檢測實體綴合的Fc結合分子，並與抗體 的Fc區域結合。某些實施方式進一步包含第二檢測物，其中第二檢測物與抗體的可變區域 特異性結合。在某些實施方式中，捕獲複合物固定在表面，例如固體或半固體支持物的測試 區域。例如，在某些實施方式中，固體支持物是珠（例如膠體顆粒或納米顆粒）、側向流免疫 測定裝置中的流動通道、分析轉子中的流動通道、或試管或測試孔（例如平板中的）。這些 和相關實施方式的示例參見圖1，包括任選的第二檢測物綴合物和任選的測試表面。
[0113] 在【具體實施方式】中，複合物包含感興趣的抗體（例如抗微生物抗體，如抗病毒、抗 細菌、抗真菌、或抗寄生蟲抗體）、蛋白A-和/或蛋白G-綴合物、固定的抗體特異性抗原、以 及任選的抗原綴合物。在某些實施方式中，蛋白A-和/或蛋白G-綴合物包含金納米顆粒 (例如，蛋白A-CGC或蛋白G-CGC "膠體金綴合物"），抗原綴合物包含金納米顆粒（例如抗 原-CGC)。在某些實施方式中，抗原綴合物或抗原-CGC包含微生物抗原，例如病毒、細菌、真 菌或寄生蟲抗原，如本文所述且本領域已知。在【具體實施方式】中，抗原綴合物或抗原-CGC 包括萊姆病特異性抗原，例如疏螺旋體抗原（如上所述）。在其他實施方式中，抗原綴合物 或抗原-CGC包括埃裡希體病特異性抗原，例如埃裡希體抗原。
[0114] 試劑盒
[0115] 另一方面，發明提供試劑盒。在某些實施方式中，試劑盒包含本文所述的發明的裝 置或系統。在某些實施方式中，試劑盒包含發明的2、3、4、或更多個裝置或系統。
[0116] 用於特定類型測定的試劑也可在發明的試劑盒中提供。因此，試劑盒可包括多種 納米顆粒、珠（例如適於凝集反應或側向流測定）、或平板（例如適於ELISA測定的平板）。 在其他實施方式中，試劑盒包含裝置，例如側向流免疫測定裝置，分析轉子，或電化學、光化 學、或光電傳 感器。多種納米顆粒、珠、平板和裝置可用於進行免疫測定。例如，它們可用於 檢測抗體-肽複合物的形成，所述複合物包含來自樣品的抗體、抗原性肽（標記和/或未標 記）、以及Fc結合分子。
[0117] 在某些實施方式中，抗原（或不同抗原的混合物）與可檢測實體例如金納米顆粒 綴合，該相同抗原（或抗原混合物）也附著或固定於平板、硝酸纖維素測試表面、或其他測 試表面或裝置上，並且Fc結合分子與可檢測實體例如金納米顆粒綴合。在具體試劑盒中， 抗原性肽與金納米顆粒綴合，並任選地與BSA綴合，該相同抗原（不含金顆粒，但任選地與 BSA綴合）固定在硝酸纖維素表面上限定的測試區域或條帶上，蛋白A和/或蛋白G與金納 米顆粒綴合，任選地作為包含側向流測定裝置的試劑盒的一部分。在某些實施方式中，蛋白 A-和/或蛋白G-金顆粒綴合物固定在硝酸纖維素表面上的單獨區域，即綴合區域，其不與 測試區域重疊。
[0118] 另外，試劑盒可包括各種稀釋劑和緩衝液、標記的綴合物或其他用於檢測特異性 結合抗原或抗體的試劑，以及其他信號產生試劑，例如酶底物、輔因子和發色團。試劑盒的 其他組分可由本領域技術人員很容易地確定。這些組分可以包括塗覆試劑，對Fc結合分 子例如蛋白A和/或蛋白G特異性的多克隆或單克隆捕獲抗體，或者兩種或更多種所述抗 體的混合物，按照標準純化或半純化的抗原或抗體的提取物，單克隆抗體檢測物抗體，綴合 有指示分子的抗鼠、抗狗、抗雞或抗人抗體，用於比色比較的指示圖，一次性手套，去汙說明 書，上樣棒或容器，樣品製備杯等。在一個實施方式中，試劑盒包含緩衝液或其他試劑，其適 於構成可形成肽-抗體複合物的反應介質。
[0119] 該試劑盒為臨床實驗室提供便捷、有效的方式，以診斷如本文別處所述且本領域 已知的微生物菌劑，尤其是病原微生物菌劑引起的感染。例如，某些自身免疫性疾病與某些 類型的抗體有關。因此，在已知的疾病相關抗體/抗原組合的範圍內，本發明可提供對該疾 病靈敏而準確的診斷。具體的試劑盒提供對疏螺旋體，例如伯氏疏螺旋體進行檢測，從而輔 助萊姆病診斷。
[0120] 在某些實施方式中，試劑盒進一步包含說明書。例如，在某些實施方式中，試劑盒 包含說明書，其指導如何使用該試劑盒檢測抗體，例如微生物抗原的抗體（例如疏螺旋體 抗原，埃裡希體抗原），或診斷疾病，例如微生物相關疾病（例如萊姆病，埃裡希體病）。在 某些實施方式中，試劑盒包含說明書，其指導如何使用多種珠、平板或裝置（例如側向流裝 置）檢測針對微生物抗原，例如疏螺旋體抗原或埃裡希體抗原的抗體，或診斷微生物相關 疾病，例如萊姆病（萊姆疏螺旋體病）或埃裡希體病。在某些實施方式中，試劑盒提供說明 書，用於將可檢測的Fc結合分子、抗體特異性的可檢測抗原綴合物或抗原性肽綴合物、以 及測試樣品在施加到檢測系統（例如側向流測定裝置，微孔板，分析轉子）的上樣區域之 前，以任意順序組合。在某些實施方式中，試劑盒包括說明書，用於將可檢測抗原綴合物或 抗原性肽綴合物與測試樣品組合，這樣可檢測抗原綴合物或抗原性肽綴合物將以與可檢測 的Fc結合分子特定的比率存在，以實現期望的信號放大水平。試劑盒還可提供說明書，用 於優化緩衝液，優化不同組分（例如Fc結合分子，抗原或抗原性肽，測試樣品）的比率，優 化混合及加樣步驟的順序（例如，加樣前混合所有組分，僅混合某些組分，其他單獨加樣）。
[0121] 本發明的肽、包含肽的組合物和裝置、試劑盒和方法具有多種優點。例如，它們使 得對感興趣抗體的檢測以及相關疾病的診斷簡便、廉價、快速、靈敏和準確，無顯著的假陽 性或背景信號。由此可對抗體含量非常低，甚至其他方式無法檢測的樣品進行準確而靈敏 的診斷。 實施例
[0122] 實施例1 :蛋白A增強萊姆病特異性側向流測定中對抗體的特異性檢測
[0123] 檢測陰性樣品、萊姆病陽性樣品、以及低含量的萊姆病陽性樣品時，通過測試以確 定添加蛋白A-CGC(膠體金綴合物）對萊姆病特異性側向流測定的影響。目的在於保持足 夠的測定靈敏度的同時，就蛋白A-CGC對潛在假信號的影響進行觀察和分級。相對於蛋白 A-CGC陰性對照的不同蛋白A-CGC濃度進行測試。該測試中進行的側向流測定與圖2和3中 所示的相似。結果見下表1，以反應評分示出（數值範圍0-5,較高的數值代表陽性結果）。
[0124] 表1 :測試結果總結（反應評分）
[0125] 低陽性全血低陽性全血Dolly陽性Ddty陽性陰性_345 ^ J ^ ,4. 1:8 稀釋1:8 稀釋全血1:8稀全血1:8稀血漿丨:8 ρ CB25 預先 CB25 預先釋 CB25 預釋 CB25 預稀釋 CB25 7 5： 混合 混& 先混合 先混合 預先混合 Λ 對照：無蛋白 A 0 0.25 1.5 1.5 0.25 0.25 IX 蛋白 A 3.5 3.5 3.5 3.5 0.5 0.5 1:2 稀釋蛋白 A 3.5 3.5 3.75 3.75 0.25 0.25 1:4 稀釋蛋白 A 1.25 1.25 2.25 2.25 0.25 0.25 1:8 稀釋蛋白 A 0.5 0.75 2 2 0.25 0.25
[0126] 如表1所示，添加蛋白A-CGC使所有測試的萊姆病陽性樣品的信號得到放大，尤其 能夠檢測"低"陽性的樣品。沒有蛋白A-CGC時，低陽性的樣品無法檢測，顯示與陰性樣品 類似的反應評分（約〇. 25或更低）。相反，以IX濃度和1:2稀釋添加蛋白A-CGC使信號顯 著放大，反應評分約3. 5。因此，蛋白A-CGC顯著改善萊姆病特異性側向流測定中對靶抗體 的檢測。
[0127] 實施例2 :蛋白A增強應激生物樣品側向流測定中對抗體的特異性檢測
[0128] 通過測試以確定添加蛋白A-CGC (膠體金綴合物）對預先應激的48BSA (牛血清白 蛋白）/DAG IgG綴合物混合物的影響。綴合物混合物在35°C的保溫箱中預先應激15天。 該實驗測試蛋白A-CGC存在或不存在時的應激和非應激樣品。該測試中進行的側向流測定 與圖2和3中所示的相似。結果見下表1，以反應評分示出（數值範圍0-5,較高的數值代 表陽性結果）。結果如下表2所示。
[0129] 表2 :應激樣品對比非應激樣品的測試結果總結
[0130] 樣品 | 陽件J1-0483 陽性」1-0483 ^ -SCA3° ^ -SCA3° -223 Mil UfM. Τ8? ~ 35? T8°C 35°C 第 1 天 225 ?Ο 0 0 第 15 天 3 + 0.75 IT 0 ^ 15 天十蛋白 2,75 1.25 〇 0
[0131] 如上表2所示，相對於不存在蛋白A-CGC，向側向流測定混合物中添加蛋白A-CGC， 使第15天的應激（35°C )生物樣品的信號得到放大，可見反應評分由0. 75增至1. 75。第 15天的非應激樣品（2-8°C )也輕微地受到添加蛋白A-CGC的影響，可見反應評分由2. 25 增至2. 75。同時，陰性樣品不受蛋白A-CGC添加的影響。
[0132] 如果作為參考文獻引述的文獻中的任何定義與本文的定義不一致，以本本文的定 義為準。儘管根據當前優先實施方式對本發明進行了描述，應當理解的是，在不背離發明主 旨的情況下，可進行對本領域技術人員是顯而易見的不同變化和修改。相應地，發明僅由下 述權利要求書限定。
【權利要求】
1. 用於檢測測試樣品中的抗體的方法，其包含： (a) 使所述測試樣品與第一檢測物接觸以形成包含第一檢測物和所述抗體的第一複合 物，其中第一檢測物包含與第一可檢測實體綴合的Fc結合分子； (b) 使第一複合物與固定於表面的測試區域的捕獲實體接觸，其中所述捕獲實體能夠 與所述抗體特異性結合；以及 (c) 檢測來自所述測試區域中的第一可檢測實體的信號的存在，其中所述信號的存在 表明所述測試樣品中存在所述抗體。
2. 權利要求1的方法，其中第一檢測物固定於表面的綴合區域，並且其中所述綴合區 域與表面的測試區域不重疊。
3. 權利要求1的方法，其中所述Fc結合分子是蛋白A和/或蛋白G。
4. 權利要求1的方法，其中所述捕獲實體是抗原或抗原性肽。
5. 權利要求4的方法，其中所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲、犬埃裡希體 (Ehrlichia canis)、沙費埃裡希體（Ehrlichia chaffeensis)、伊氏埃裡希體（Ehrlichia ewingii)、伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi)、埃氏疏螺旋體（Borrelia afzelii)、伽 氏疏螺旋體（Borrelia garinii)、嗜吞噬細胞無形體（Anaplasma phagocytophilum)、扁平 無形體（Anaplasma platys)、貓白血病毒、細小病毒、流感A株、流感B株、禽流感病毒、呼吸 道合胞體病毒、軍團桿菌（Legionella)、腺病毒、輪狀病毒、貓免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病 毒和甲類鏈球菌（Streptococcus)組成的組的生物體。
6. 權利要求1的方法，其中第一可檢測實體是金屬納米顆粒、金屬納米殼、螢光團或有 色乳膠顆粒。
7. 權利要求6的方法，其中所述金屬納米顆粒或金屬納米殼選自由金顆粒、銀顆粒、銅 顆粒、鉬顆粒、鎘顆粒、複合顆粒、金空心球、金塗覆二氧化娃納米殼和二氧化娃塗覆金殼組 成的組。
8. 權利要求1的方法，其進一步包含使所述測試樣品與第二檢測物接觸，其中第二檢 測物包含與第二可檢測實體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體 特異性結合。
9. 權利要求8的方法，其中第一和第二檢測物固定於綴合區域，其中所述綴合區域與 表面的測試區域不重疊。
10. 權利要求2或9的方法，其中所述綴合區域進一步包含對照檢測物。
11. 權利要求8的方法，其中第一和第二可檢測實體相同。
12. 權利要求11的方法，其中第一和第二可檢測實體是金納米顆粒。
13. 權利要求8的方法，其中第一和第二可檢測實體不同。
14. 權利要求8的方法，其中所述表面是側向流測定裝置中的流動通道、微孔板的表面 或分析轉子中的流動通道。
15. 權利要求8的方法，其中所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲、犬埃裡希體、沙 費埃裡希體、伊氏埃裡希體、伯氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、嗜吞噬細胞無形 體、扁平無形體、貓白血病毒、細小病毒、流感A株、流感B株、禽流感病毒、呼吸道合胞體病 毒、軍團桿菌、腺病毒、輪狀病毒、貓免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組 的生物體。
16. 權利要求8的方法，其中第一檢測物與第二檢測物以約20:1至約1:1的比率存在。
17. 權利要求16的方法，其中第一檢測物包含與第一可檢測實體綴合的Fc結合分子， 並且其中所述Fc結合分子是蛋白A和/或蛋白G。
18. 權利要求16的方法，其中第一檢測物包含各自與第一可檢測實體綴合的蛋白A和 蛋白G。
19. 權利要求18的方法，其中蛋白A和蛋白G以約10:1至約1:10的比率存在。
20. 權利要求1的方法，其中所述表面是側向流測定裝置中的流動通道或分析轉子中 的流動通道。
21. 權利要求1的方法，其中所述測試樣品是體液、身體器官提取物、血液、血清或血 漿。
22. 抗體檢測裝置，其包含： 上樣區域； 綴合區域，其中所述綴合區域包含可移動的第一檢測物，所述第一檢測物包括與第一 可檢測實體綴合的Fc結合分子；以及 測試區域，其中所述測試區域包含能夠與所述抗體特異性結合的固定的捕獲實體； 其中所述上樣區域、綴合區域和測試區域被設置使得在操作中，當被施加至上樣區域 時，液體樣品與綴合區域和測試區域流體連通。
23. 權利要求22的檢測裝置，其中所述Fc結合分子是蛋白A和/或蛋白G。
24. 權利要求22的檢測裝置，其中所述捕獲實體是抗原或抗原性肽。
25. 權利要求24的檢測裝置，其中所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲、犬埃裡希 體、沙費埃裡希體、伊氏埃裡希體、伯氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、嗜吞噬細 胞無形體、扁平無形體、貓白血病毒、細小病毒、流感A株、流感B株、禽流感病毒、呼吸道合 胞體病毒、軍團桿菌、腺病毒、輪狀病毒、貓免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組 成的組的生物體。
26. 權利要求22的檢測裝置，其中第一可檢測實體是金屬納米顆粒、金屬納米殼、螢光 團或有色乳膠顆粒。
27. 權利要求26的檢測裝置，其中所述金屬納米顆粒或金屬納米殼選自由金顆粒、銀 顆粒、銅顆粒、鉬顆粒、鎘顆粒、複合顆粒、金空心球、金塗覆二氧化娃納米殼和二氧化娃塗 覆金殼組成的組。
28. 權利要求22的檢測裝置，其中所述裝置進一步包含對照區域，當液體樣品施加至 上樣區域時，所述對照區域與液體樣品流體連通。
29. 權利要求28的檢測裝置，其中所述對照區域包含能夠與對照檢測物特異性結合的 固定的結合配偶體。
30. 權利要求29的檢測裝置，其中所述第一檢測物包含與第一可檢測實體綴合的蛋白 A或蛋白G，所述固定的結合配偶體是抗蛋白A或抗蛋白G抗體。
31. 權利要求22的檢測裝置，其進一步包含位於所述測試區域下遊的吸收墊。
32. 權利要求22的檢測裝置，其中所述綴合區域位於所述上樣區域的上遊。
33. 權利要求22的檢測裝置，其中所述綴合區域位於所述上樣區域的下遊。
34. 權利要求22的檢測裝置，其中所述上樣區域包含血液分離材料。
35. 權利要求22的檢測裝置，其中所述綴合區域進一步包含可移動的第二檢測物，其 中第二檢測物包含與第二可檢測實體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與 所述抗體特異性結合。
36. 權利要求35的檢測裝置，其中第一和第二可檢測實體相同。
37. 權利要求36的檢測裝置，其中第一和第二可檢測實體是金納米顆粒。
38. 權利要求35的檢測裝置，其中第一和第二可檢測實體不同。
39. 權利要求35的檢測裝置，其中所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲、犬埃裡希 體、沙費埃裡希體、伊氏埃裡希體、伯氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、嗜吞噬細 胞無形體、扁平無形體、貓白血病毒、細小病毒、流感A株、流感B株、禽流感病毒、呼吸道合 胞體病毒、軍團桿菌、腺病毒、輪狀病毒、貓免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組 成的組的生物體。
40. 權利要求33的檢測裝置，其中第一可移動檢測物與第二可移動檢測物以約20:1至 約1:1的比率存在。
41. 權利要求40的檢測裝置，其中第一可移動檢測物包含與第一可檢測實體綴合的Fc 結合分子，並且其中所述Fc結合分子是蛋白A和/或蛋白G。
42. 權利要求40的檢測裝置，其中第一可移動檢測物包含各自與第一可檢測實體綴合 的蛋白A和蛋白G。
43. 權利要求42的檢測裝置，其中蛋白A和蛋白G以約10:1至約1:10的比率存在。
44. 試劑盒，其包含權利要求22的檢測系統，以及使用所述系統檢測測試樣品中的抗 體的說明書。
45. 權利要求44的試劑盒，其進一步包含第二檢測物和將第二檢測物與測試樣品在施 加到檢測系統的上樣區域之前組合的說明書，其中所述第二檢測物包含與第二可檢測實體 綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體特異性結合。
46. 權利要求45的試劑盒，其中第一可移動檢測物與第二檢測物以約20:1至約1:1的 比率存在。
47. 權利要求46的試劑盒，其中第一可移動檢測物包含與第一可檢測實體綴合的Fc結 合分子，並且其中所述Fc結合分子是蛋白A和/或蛋白G。
48. 權利要求46的試劑盒，其中第一檢測物包含各自與第一可檢測實體綴合的蛋白A 和蛋白G。
49. 權利要求48的試劑盒，其中蛋白A和蛋白G以約10:1至約1:10的比率存在。
50. 檢測測試樣品中的抗體的方法，其包括將測試樣品施加於權利要求22的檢測系統 的上樣區域，檢測來自測試區域中的第一可檢測實體的信號的存在或不存在。
51. 權利要求50的方法，其進一步包括將第二檢測物與所述測試樣品在施加到檢測系 統的上樣區域之前組合，其中所述第二檢測物包含與第二可檢測實體綴合的抗原或抗原性 肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體特異性結合。
52. 權利要求51的方法，其中第二檢測物被添加至測試樣品，這樣第二檢測物將以與 第一可移動檢測物約20:1至約1:1的比率存在。
53. 捕獲複合物，其包含捕獲實體、測試樣品中的抗體、以及第一檢測物，其中所述捕獲 實體與所述抗體結合，並且其中第一檢測物包含與第一可檢測實體綴合的Fc結合分子並 與所述抗體的Fc區域結合。
54. 權利要求53的捕獲複合物，其進一步包含第二檢測物，其中第二檢測物與所述抗 體的可變區域特異性結合。
55. 權利要求53的捕獲複合物，其中所述捕獲複合物固定於表面的測試區域。
【文檔編號】G01N33/53GK104105965SQ201280057143
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2012年11月20日 優先權日:2011年11月21日
【發明者】C·奎斯科, J·沃克, R·K·梅拉, K·P·阿倫, D·M·布萊利 申請人:愛貝斯股份有限公司