一種用於防治作物鐮刀菌病害的枯草芽孢桿菌及其應用的製作方法

2023-12-12 19:35:17 1

一種用於防治作物鐮刀菌病害的枯草芽孢桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於防治作物鐮刀菌病害的枯草芽孢桿菌及其應用。所述枯草芽孢桿菌的保藏號為：CGMCC?No.7727。所述應用是該枯草芽孢桿菌在拮抗鐮刀菌，防治小麥赤黴病、茄科枯萎病、瓜類枯萎病中的應用。與現有技術相比，本發明的枯草芽孢桿菌對鐮刀菌具有高效拮抗作用，能用於由鐮刀菌侵染引起的小麥赤黴病、茄科枯萎病、瓜類枯萎病等的防治，田間防治的防治效率穩定在60%以上。
【專利說明】一種用於防治作物鐮刀菌病害的枯草芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明微生物種質資源的開發與利用領域，具體涉及一種用於防治作物鐮刀菌病害的枯草芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002]鐮刀菌(Fusarium)屬 半知菌亞門真菌,是一類世界性分布的真菌,它不僅可以在土壤中越冬越夏，還可侵染多種植物(糧食作物、經濟作物、藥用植物及觀賞植物)，引起植物的穗腐、根腐、莖腐、莖基腐、花腐等多種病害，寄主植物達100餘種，侵染寄主植物維管束系統，破壞植物的輸導組織維管束，並在生長發育代謝過程中產生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產量和品質。其中以禾穀鐮孢菌、尖孢鐮孢菌引起的病害最為嚴重，給農業生產帶來巨大的經濟損失。
[0003]禾穀鍵抱菌(Fusariumgraminearum Schw.),有性態為 Gibberella zeae Schw.petch.稱玉蜀黍赤黴。該菌能引起田間小麥、大麥等禾本科作物的病害。由禾穀鐮孢菌引起的小麥赤黴病菌不僅影響小麥產量，而且其產生的真菌毒素汙染產品質量，嚴重威脅人畜健康。尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)是一種世界性分布的土傳病原真菌,寄主範圍廣泛，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多種植物枯萎病的發生。鐮刀菌引起的小麥赤黴病、爺科(番爺)、瓜類(西瓜)枯萎病，是生產上防治最艱難的重要病害之一。
[0004]目前，農業生產中防治由鐮刀菌引起的小麥赤黴病、番茄枯萎病、西瓜枯萎病主要以多菌靈、戊唑醇等化學殺菌劑為主。但是，隨著多菌靈等殺菌劑的長期使用已導致使用次數和用藥濃度增加，也提高了病原菌產生對殺菌劑的抗性的風險。同時，由於化學殺菌劑的廣譜性，大量使用不但破壞了微生態環境，而且導致非靶標抗性。
[0005]相對於化學殺菌劑，生物防治劑和天然產物的使用，尤其是微生物殺菌劑的使用具有更加誘人的前景。一方面微生物是地球上最龐大的生物類群，具有廣泛的生物多樣性，還可以通過生物工程技術大幅度提高目標物質的產量，易於實現工業化生產；另一方面，微生物殺菌劑較化學農藥更加安全，易降解，合成成本較低。
[0006]在種類繁多的微生物群體中芽孢桿菌是研究最多的生防菌候選菌，已證明芽孢桿菌屬中的許多種都具有合成抗菌活性物質一抗菌多肽的能力，而且芽孢桿菌可以形成芽孢，細胞壁不含內毒素，除個別種外絕大多數對人畜無害，具有較強的抗逆性和良好的環境適應性及環境友好性，是最理想的微生物殺菌劑資源。
[0007]雖然很多種芽孢桿菌都已被開發用於製備微生物殺菌劑，但由於芽孢桿菌種群即菌株的多樣性，不同芽孢桿菌乃至同一芽孢桿菌的不同菌株均具有不同的抗菌譜、抗菌活性和抗菌特點，篩選具有不同作用對象的高效芽孢桿菌生防菌劑仍是現在乃至今後相對長一段時間內各國科研工作關注的課題。

【發明內容】

[0008]本發明提供了一種枯草芽孢桿菌，該枯草芽孢桿菌對由鐮刀菌引起的小麥赤黴病的防治效果達60%以上。
[0009]—種枯草芽孢桿菌，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),株號為BS101,已於2013年6月18日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCCN0.7727。
[0010]本發明還提供了一種含有所述枯草芽孢桿菌的生防菌劑。該生防菌劑中，所述枯草芽孢桿菌的濃度優選為I X IO9~10lclCFU/mL，更優選為I X 109CFU/mL。
[0011]本發明還提供了一種所述生防菌劑的製備方法，包括:
[0012](I)將所述枯草芽孢桿菌接種於培養液中培養至培養液OD6tltl為0.5~0.8，獲得種子液；
[0013]所述培養液可選用LB液體培養基，其配方為:氯化鈉10g/L，胰蛋白腖10g/L，酵母浸粉5g/L，調節pH值為7.0 ；
[0014](2)將種子液接種於發酵培養基中擴大培養，調節發酵液中枯草芽孢桿菌的濃度至I X IO9~101QCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
[0015]其中，所述種子液的接種量優選為I~2%;所述發酵培養基的配方為:葡萄糖，18 ~22g ;L-穀氨酸，2.4 ~2.6g ;L_ 天門冬醯胺，2.4 ~2.6g ;ΚΗ2Ρ04，0.8 ~1.2g ;MgSO4.7Η20，0.4 ~0.6g ；KC1,0.4 ~0.6g ;酵母粉，0.8 ~1.2g ;L_ 苯丙氨酸，2 ~3 X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 ~6 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 ~0.18 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 ~
0.17X10_3g ;調節 pH 值為 7.0ο
[0016]作為進一步優選，所述發酵培養基的配方為:葡萄糖，20g;L-穀氨酸，2.5g;L-天門冬醯胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ；L-苯丙氨酸，
2X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 X l(T3g ;調節 pH值為7.0。該發酵培養基由Landy培養基改良而來，更有利於本發明所述枯草芽孢桿菌的增殖。
[0017]本發明中，所述擴大培養是在200L發酵罐中進行的，擴大培養的溫度為28~30°C，時間為36~48h ;發酵液pH值維持在7.0，溶氧量20%，通氣量5-7m3/小時，轉速240~260r/min，罐壓0.05-0.1KPa0發酵液出罐後梯度稀釋塗板檢測並調節菌懸液濃度為IXlO9 ~1010CFU/mL。
[0018]本發明還提供了所述枯草芽孢桿菌在拮抗鐮刀菌中的應用。在平板拮抗試驗中，BSlOl菌株對禾穀鐮孢菌、尖孢鐮刀菌的抑菌圈半徑分別20mm、18mm。其中，BSlOl菌株對禾穀鐮孢菌PH-1的EC50為10CFU/mL ；BS101菌株的發酵液上清能強烈抑制禾穀鐮孢菌PH-1孢子的萌發，處理後的孢子不能形成芽管，出現明顯的腫脹、消解等畸形。
[0019]本發明還提供了所述枯草芽孢桿菌在防治`小麥赤黴病中的應用，包括:在小麥齊穗期或揚花初期(揚花約5-20%),將枯草芽孢桿菌菌懸液均勻噴施在小麥穗部；所述枯草芽孢桿菌菌懸液的濃度為IX IO8~109CFU/mL。
[0020]BSlOl菌株能夠顯著抑制禾穀鐮孢菌PH-1在揚麥18和濟麥22品種麥穗上的生長及致病性，防治效果分別可達91.96%，97.05%。經分析，BSlOl菌株在抑制禾穀鐮孢菌PH-1生長的同時，能抑制禾穀鐮孢菌真菌毒素DON (脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)的產生，與對照組相t匕，BSlOl菌株處理後DON毒素含量降低4.5倍，從而防止病害發生。[0021 ] 將BSIOI菌株應用于田間防治小麥赤黴病時，其防治效果穩定在60%以上，顯示出較好的應用前景。
[0022]本發明的枯草芽孢桿菌或生防菌劑還可用於防治由鐮刀菌侵染引起的茄科(如番茄)枯萎病、瓜類(如西瓜)枯萎病。在這方面應用時，將本發明的生防菌劑經兌水稀釋後澆灌至番茄、西瓜等作物的根部，稀釋後枯草芽孢桿菌的菌液濃度為IX IO8~109CFU/mL。
[0023]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0024]本發明的枯草芽孢桿菌對鐮刀菌具有高效拮抗作用，能用於由鐮刀菌侵染引起的小麥赤黴病、茄科枯萎病、瓜類枯萎病等的防治，田間防治的防治效率穩定在60%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為生防菌BSlOl的菌落形態圖；
[0026]圖2a為生防菌BSlOl對禾穀鐮孢菌PH-1的平板拮抗效果圖；其中左側為平板背面，右側為平板正面；
[0027]圖2b為生防菌BSlOl對尖孢鐮刀菌的平板拮抗效果圖；其中左側為平板背面，右側為平板正面；
[0028]圖3a為不同含菌量的BSlOl和PY79平板對禾穀鐮孢菌PH-1的抑制效果圖；其中，箭頭表示WA平板中BSlOl和PY79的含菌量(Log1(lCFU/mL)逐漸變大；「ΡΗ_1」表示PH-1直接接種在不含生防菌的WA平板上生長的菌落；
[0029]圖3b為生防菌BSlOl對禾穀鐮孢菌PH-1的EC50測定結果圖；其中，折線為各生防菌濃度下對應PH-1菌落直徑的點連線，直線為折線的趨勢線；
[0030]圖4生防菌BSlOl的發酵液上清抑制禾穀鐮孢菌菌絲生長的活性測試圖；
[0031]圖5為H20、PY79發酵液上清和BSlOl發酵液上清處理後禾穀鐮孢菌PH-1孢子的萌發示意圖；
[0032]圖6a為光照培養箱內H20、PY79、BSlOl和氰烯菌酯對濟麥22的赤黴病防治效果圖；
[0033]圖6b為光照培養箱內H20、PY79、BSlOl和氰烯菌酯對揚麥18的赤黴病防治效果圖；
[0034]圖7a為H20、PY79、BSlOl和氰烯菌酯處理後麥粒的表面形態圖；
[0035]圖7b為H20、PY79、BSlOl和氰烯菌酯處理後麥粒上DON毒素的含量圖。
【具體實施方式】
[0036]實施例1含BSlOl菌株的生防菌劑的製備
[0037]1BS101菌株的獲取
[0038]BSlOl菌株分離自江蘇省海安縣小麥麥穗上。取小麥麥穗磨碎，80°C水浴10分鐘後塗布於LB平板上；次日挑取菌落進行純化培養。菌株BSlOl在培養基上菌落表面粗糙、不透明，呈現皺縮、白色(見圖1)，能夠形成芽孢，能移動，需氧型。16S rDNA序列如SEQ IDN0.1所示，序列在NCBI中的比對結果顯示與枯草芽孢桿菌的同源性最高。
[0039]2生防菌劑的製備
[0040](I)將BSlOl菌株接種到LB培養液中，於30°C下，180rpm振蕩培養12~16小時後在超淨工作檯中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；
[0041]LB培養液的配方為:氯化鈉10g/L，胰蛋白腖10g/L，酵母浸粉5g/L，調節pH值為
7.0 ；
[0042](2)當培養至OD6tltl值在0.5~0.8之間時，將種子菌液以1:100體積比加入裝有發酵培養液的200L發酵罐中，30°C 250rpm振蕩培養20~24小時，發酵液pH值維持在7.0，溶氧量20%，通氣量5-7m3/小時，罐壓0.05-0.1KPa0發酵液出罐後梯度稀釋塗板檢測並調節菌懸液濃度約為I X 109CFU/mL,獲得生防菌劑。
[0043]發酵培養液的配方為:葡萄糖，20g;L_穀氨酸，2.5g;L_天門冬醯胺，2.5g;KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ;L_ 苯丙氨酸，2X 10_3g ；MnSO4.H2O,5X 10_3g ；CuSO4.5Η20，0.16X 10_3g ；FeS04.7Η20，0.15X10、；調節 pH 值為 7.0。
[0044]實施例2BS101菌株對禾穀鐮孢菌的拮抗活性
[0045]1BS101菌株對禾穀鐮孢菌的平板拮抗活性測定
[0046]採用對峙培養法，將保存於4° C中的禾穀鐮孢菌PH-1 (模式菌)接種到PDA平板上活化，待真菌長滿平板後用滅菌的打孔器從菌落外邊緣均勻的打成直徑為6_的圓形菌塊。將菌絲塊接種在WA平板(WA培養基/L:蛋白腖5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，pH=7.0)的中心，在其四周距中心約25mm處分別接種BS101，試驗以枯草芽孢桿菌模式菌株PY79、清水 及化學農藥氰烯菌酯為對照組。25。C培養，待菌絲長滿平板後記錄抑菌圈的大小。
[0047]根據抑菌圈的大小對BSlOl拮抗禾穀鐮孢菌PH-1、尖孢鐮刀菌的活性進行評估:Omm無抑制作用； 5mm較強的抑制作用。抑制率根據式(I)進行計算:
[0048]抑制率=[(R「R2)/R1] X 100% (I)；
[0049]其中，R1為對照病原菌的菌落半徑；R2為病原菌在細菌方向的菌落半徑。
[0050]檢測結果如圖2a和2b所示。由圖2a可見，BSlOl菌株對禾穀鐮孢菌PH-1菌絲生長具有較強的抑制效果，抑菌圈半徑為20mm，菌絲抑制率為80% ;由圖2b可見，對尖孢鐮孢菌菌絲生長具有較強的抑制效果，抑菌圈半徑為18mm，菌絲抑制率為78% ;清水處理組無拮抗效果。
[0051]2BS101菌株抑制禾穀鐮孢菌菌絲生長的EC50
[0052]向50°C的WA培養基中加入梯度稀釋的BSlOl菌株，使BSlOl的終濃度依次為107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL,製備含生防菌 BSlOl 的 WA 平板。
[0053]在平板中央接種禾穀鐮孢菌PH-1菌碟，25°C培養至無生防菌WA平板上菌絲長滿平板時統計數據並進行分析(見圖3a和圖3b)，測量含各梯度生防菌平板中PH-1菌落的大小，計算半最大效應濃度(EC50 )。
[0054]由圖3b可見，隨著平板中含菌量的升高，對菌絲抑制率增加。統計結果顯示，平板含菌量與抑制率呈現線性關係:
[0055]Υ=-0.25χ+1.975 (R2=0.9346) (2)；
[0056]其中，X為BSlOl菌株濃度Log1(lCFU/mL，Y為處理組中PH-1菌落直徑；R2表示趨勢線的估計值與對應的實際數據之間的擬合程度。
[0057]通過式(2)計算，當平板中BSlOl菌量約為10CFU/mL時，能抑制50%禾穀鐮孢菌菌絲生長，即BSlOl對禾穀鐮孢菌的EC50=10CFU/mL。
[0058]3生防菌劑無菌上清抑制禾穀鐮孢菌菌絲生長的活性
[0059]將實施例1獲得的生防菌BSlOl菌株發酵液，10，OOOrpm,離心IOmin後取無菌上
清。無菌上清經細菌濾器(0.22 μ m)過濾後待用。
[0060]向50°C WA培養基中加入禾穀鐮孢菌PH-1的孢子，至孢子終濃度為IO5個/mL。將含PH-1孢子的WA培養基倒入9cm直徑的平板中，每平板倒入20mL。待冷卻凝固後，用7mm直徑的打孔器在平板的對稱位置打4個孔，每孔分別加入25 μ L製備的無菌上清，以培養液和氰烯菌酯為對照組。25°C靜止培養後觀察抑菌圈。檢測結果如圖4所示。由圖4可見，該無菌上清能有有效抑制菌絲生長，抑制圈半徑為5mm，10倍濃縮無菌上清的抑菌圈半徑為 8mm η
[0061]4生防菌劑無菌上清抑制禾穀鐮孢菌孢子萌發的活性
[0062]在含2%蔗糖的清水、ΡΥ79發酵液上清以及BSlOl發酵液上清中分別加入終濃度為IO4個/mL的禾穀鐮孢菌PH-1的孢子，每個處理組各取IOyL孢子懸浮液置於載玻片上(作5次重複);玻片置於保溼盒中25°C靜止培養，每隔I小時觀察各處理組的孢子萌發情況，計算萌發率。
[0063]由圖5可見，無菌上清能強烈抑制禾穀鐮孢菌孢子的萌發，BSlOl發酵液上清處理的PH-1孢子不能形成芽管，出現明顯的腫脹、消解等畸形。對孢子誘導萌發，6小時、10小時後分別統計各處理組的孢子萌發率，統計結果見表1。
[0064]表1各處理組的禾穀鐮孢菌孢子萌發率
[0065]
【權利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌，其特徵在於，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BS101,保藏號為:CGMCC N0.7727。
2.一種含有權利要求1所述枯草芽孢桿菌的生防菌劑。
3.如權利要求2所述的生防菌劑，其特徵在於，所述枯草芽孢桿菌的濃度為IX IO9~1010CFU/mL。
4.如權利要求2或3所述生防菌劑的製備方法，包括: (1)將所述枯草芽孢桿菌接種於培養液中培養至培養液OD6tltl為0.5~0.8,獲得種子液； (2)將種子液接種於發酵培養基中擴大培養，調節發酵液中枯草芽孢桿菌的濃度至IX IO9~101QCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
5.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述種子液的接種量為I~2%。
6.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述發酵培養基的配方為:葡萄糖，18 ~22g ；L-穀氨酸，2.4 ~2.6g ；L-天門冬醯胺，2.4 ~2.6g ；KH2PO4,0.8 ~1.2g ;MgSO4.7Η20，0.4 ~0.6g ；KC1,0.4 ~0.6g ;酵母粉，0.8 ~1.2g ;L_ 苯丙氨酸，2 ~3 X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 ~6 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 ~0.18 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 ~0.17X10_3g ;調節 pH 值為 7.0ο
7.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述擴大培養的溫度為28~30°C，時間為36~48h。
8.如權利要I所述枯草芽孢桿菌在拮抗鐮刀菌中的應用。
9.如權利要I所述枯草芽孢桿菌在防治小麥赤黴病中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，包括:在小麥齊穗期或揚花初期，將枯草芽孢桿菌菌懸液均勻噴施在小麥穗部；所述枯草芽孢桿菌菌懸液的濃度為IXio8~109CFU/mL。
【文檔編號】A01N63/00GK103667099SQ201310351909
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年8月13日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】陳雲, 尹燕妮, 馬忠華 申請人:浙江大學