治療腫瘤性疾病的組合物和方法

2023-12-07 08:01:46

專利名稱：治療腫瘤性疾病的組合物和方法
治療胂瘤性疾病的組合物和方法 發明背景發明領域
本發明涉及化學和醫藥領域。更具體地，本發明涉及諸如癌症等腫瘤性疾病的治療。 相關技術的描述
在美國，癌症是死亡的主要原因。儘管人們為尋找治療癌 症的新方法付出了顯著的努力，但是主要的治療選擇仍然是單獨或聯 合使用的外科手術、化學治療以及放射治療。然而，外科手術和放射 治療通常僅對相當局限的癌症有用，對於患有播散性疾病的患者作用 有限。化學治療是 一 般用於治療患有轉移癌或諸如白血病等彌散性癌 症的患者的方法。雖然化學治療能夠提供治療益處，但是由於患者的 癌細胞對化學治療劑產生耐藥性，致使它通常不能治癒所述疾病。
因此，存在對治療癌症的另外化學療法的需求。個體研究 人員、學術界以及公司對於鑑定新的、潛在有用的化學治療劑和抗微 生物治療劑做出了持續不斷的努力。
用於治療復發性/難治性多發性骨髓瘤(MM)的硼替佐米 (Bortezomib)/PS-341的成功開發確立了蛋白酶體抑制劑作為有效治療 方案。所述二肽硼酸類似物硼替佐米是有效的、高選擇性的、以及可逆 的蛋白酶體抑制劑，其以26S蛋白酶體複合體為靶並且抑制其功能。 所述26S蛋白酶體是介導細胞內蛋白降解的三磷酸腺苷(ATP)依賴的多 催化蛋白酶。通過識別被26S蛋白酶體的19S調節亞基多遍在蛋白化的蛋白質，以及隨後水解為較小的多肽進行錯誤摺疊或損傷蛋白的蛋白 酶體降解。硼替佐米主要抑制糜蛋白酶的蛋白酶體活性，而不改變胰蛋白酶的或半胱天冬酶(caspase)樣的蛋白酶體活性。除了抑制NF-kB夕卜，
硼替佐米還通過靶向下列對MM生物學具有多效作用l)細胞周期調 節蛋白；2)通過調節漿細胞分化因子X盒結合蛋白-1 (XPB-1)的轉錄活 性的UPR途徑；3) p-53介導的細胞凋亡/MDM2; 4) DNA修復機理； 5)經由內在(半胱天冬酶9介導的)和外在(半胱天冬酶8介導的)細胞 死亡級聯的標準應激反應途徑。具體地，硼替佐米對JNK的活化引發 線粒體細胞凋亡信號細胞色素C(cyto-c)和第二個線粒體來源的半胱 天冬酶活化劑(Smac)從線粒體到胞漿的釋放，然後半胱天冬酶9和半 胱天冬酶3活化。然而，已經觀察到內在抗性和獲得性抗性，並且目 前尚沒有克服硼替佐米抗性的療法。
本發明的一方面是治療腫瘤性疾病的方法，包括對患有腫 瘤性疾病的患者給予式(I)化合物或其藥物可接受鹽或前藥
其中X選自氟、氯、溴或碘，並且其中所述腫瘤性疾病容 易對至少一種其它化學治療劑產生抗性。
本發明的另一方面是治療腫瘤性疾病的方法，包括對患有 肺瘤性疾病的患者聯合給予式(I)化合物或其藥物可接受鹽或前藥與至 少一種其它的化學治療劑，其中X選自氟、氯、溴或碘。
本發明的另一方面是藥物組合物，其包括式(I)化合物或其發明概述 藥物可接受鹽或前藥以及至少一種其它的化學治療劑，其中x選自氟、 氯、溴或石典。
本發明的另一方面是治療肺瘤性疾病的方法，包括對患有 腫瘤性疾病的患者給予協同組合的至少兩種蛋白酶體抑制劑。附圖簡述


圖1顯示NPI-0052對人紅細胞來源的20S蛋白酶體中的 糜蛋白酶樣、半胱天冬酶樣和胰蛋白酶樣蛋白酶體活性的抑制作用。
圖2顯示小鼠中NPI-0052的體內糜蛋白酶樣活性。
圖3描述用NPI-0052 (7 nM)處理MM.1S多發性骨髓瘤 (MM)細胞並且在37 。C下用AdaY(125I)Ahx3L3VS孵育蛋白質提取物後 得到的放射自顯影照片。
圖4描述用NPI-0052處理MM.1S細胞，隨後用丹醯基 -Ahx3L3VS孵育後得到的免疫印跡。
圖5A顯示經過指示劑量的NPI-0052處理24h的不同多發 性骨髓瘤細胞系的細胞存活率。
圖5B顯示用NPI-0052處理從患者處獲得的MM細胞後， 細胞凋亡的DNA斷裂分析。
圖6顯示用NPI-0052處理從患者處獲得的骨髓基質細胞 後，細胞凋亡的DNA斷裂分析。
圖7顯示存在或缺乏IL-6或IGF-I的條件下，用NPI-0052 或Dex處理後，MM.1S細胞存活率的MTT測定。
圖8顯示NPI-0052對VEGF誘導的MM.1S細胞遷移的影響。
圖9顯示NPI-0052對Bcl-2過量表達的MM.1S細胞存活 率的影響。
圖10A和10B描述當對小鼠口服給藥時，NPI-0052對腫 瘤生長的影響。
圖10C顯示當對小鼠口服給藥時，NPI-0052對存活的影 響。
圖10D顯示當對小鼠口服給藥時，NPI-0052對體重的影響。
圖IOE顯示來自NPI-0052處理的以及對照處理的小鼠的 接種位點的組織切片。
圖10F比較當對小鼠靜脈給藥時，NPI-0052和硼替佐米對 腫瘤生長的影響。
圖10G比較當對小鼠靜脈給藥時，NPI-0052和硼替佐米 對存活的影響。
圖11A顯示NPI-0052對用CMXRos孵育的MM.1S細胞 中的線粒體膜電位的影響。
圖11B顯示NPI-0052對用膜可滲透染料二氫乙錠 (dihydroethidium)(HE)染色的MM.1S細月包中的超氧化物產生的影響。
圖IIC描述從用NPI-0052處理的MM.1S細胞得到的線粒 體和胞漿蛋白碎片的免疫印跡。
圖1 ID描述從用NPI-0052處理的MM.IS細胞得到的胞漿 蛋白的免疫印跡，該免疫印跡使用抗半胱天冬酶9 Abs分析。
圖IIE描述從用NPI-0052處理的MM.1S細胞得到的胞漿 蛋白的免疫印跡，該免疫印跡使用抗半胱天冬酶8 Abs分析。
圖11F描述MM.1S或MM.1R細胞的免疫印跡，其中用 NPI-0052對所述細胞進行處理並通過PARP和半胱天冬酶3切割分析 對其細胞凋亡進行評估。
圖12A顯示在存在或缺乏半胱天冬酶3、半胱天冬酶8、 或半胱天冬酶9抑制劑的條件下，NPI-0052或硼替佐米處理後的 MM.IS細胞存活率。
圖12B顯示對於用單獨載體、DN-半胱天冬酶8、以及DN-半胱天冬酶9轉染的細胞，用NPI-0052或硼替佐米處理後的MM.IS 細胞存活率。
圖12C描述胞漿提取物的免疫印跡，該胞漿提取物來自用 地塞米+>或抗Fas MoAb處理的DN-半胱天冬酶8和DN-半胱天冬酶9
轉染的MM.1S細胞。
圖12D顯示對於載體或DN-FADD轉染的細胞，用 NPI-0052或硼替佐米處理後的MM.1S細胞存活率。
圖12E描述線粒體蛋白提取物的免疫印跡，該線粒體蛋白 提取物來自用指示濃度的NPI-0052或硼替佐米處理的MM.IS MM細 胞，該免疫印跡使用抗Bax或抗Hsp60 Abs分析。
圖12F顯示用指示濃度的NPI-0052或硼替佐米處理的野 生型或刪除了 Bax (敲除)的小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)的細胞存活 率。
圖13顯示來自用指示濃度的NPI-0052或硼替佐米處理的 五名健康供者的正常淋巴細胞的存活率。
圖14A顯示對於用單獨載體或Bcl-2轉染的細胞，用 NPI-0052或硼替佐米處理後的MM.IS細胞存活率。
圖14B描述胞漿提取物的免疫印跡，該胞漿提取物來自用 NPI-0052或硼替佐米處理的載體-或Bcl-2轉染的MM.IS細胞。
圖15顯示用指示濃度的NPI-0052、硼替佐米、或NPI-0052 +硼替佐米處理的MM.IS和MM.1RMM細胞的細胞存活率。優選實施方案的詳細描述
在一實施方案中，提供了用於本文所述用途的式(I)化合物formula see original document page 13X(I)其中X可以為氟、氯、溴或碘。在一實施方案中，X為氯。在一實施 方案中，式(I)化合物具有式(II)的立體化學結構xformula see original document page 13(II) ,X=C1時的式(II)化合物在本文中也^皮稱為NPI-0052。式(I)化合物或式 (II)化合物可以來源於海洋革蘭氏陽性放線菌Salinospora的發酵。
在某些實施方案中，提供用於本文所述用途的、本文公開 化合物的前藥、代謝產物、立體異構體、以及藥物可接受鹽。
"前藥"指在體內轉變為母藥的試劑。前藥經常是有用的， 這是因為在某些情況下，它們比起母體藥物更易於給藥。例如，通過 口服給藥，前藥是生物可利用的，而母體藥物則不然。在藥物組合物 中，前藥還可以具有改善的、優於母體藥物的溶解性。前藥的非限制
性例子是以酯的形式("前藥")進行給藥的化合物以輔助跨細胞膜傳送， 這時水溶性不利於遷移，然而隨後 一旦進入細胞內該化合物被代謝水解為作為活性實體的羧酸，此時水溶性是有利的。前藥的另一例子可 以是與酸基團結合的短肽(多胺基酸)，其中該肽被代謝以顯露活性部分。在例如"&s/gw o/ 7Vogn/g^ (前藥的i更計)，(ed. H. Bundgaard， Elsevier, 1985)中描述了用於合適前藥衍生物的選擇和製備的常規方 法，此處通過參考的方式併入其全部內容。
術語"酯類前藥"指本文公開化合物的衍生物，該衍生 物是通過若干個在生理條件下可水解的成酯基團中的任何一個的加成 而形成的。前藥中的酯基團的例子包括pivoyloxymethyl、乙酸基曱基、 2-苯並[c]呋喃酮亞基、2， 3-二氫化茚基和曱氧基曱基，以及其它本領 域已知的這類基團，包括(5-R-2-氧-l,3-二氧雜環戊烯-4-基)甲基基團。 前藥中的酯基團的其它例子可以在例如下列文獻中找到T. Higuchi 和V. Stella, "Pro-drug as Novel Delivery Systems"("作為新穎的遞藥系 統的前藥，，)，第14巻，A.C.S. Symposium Series, American Chemistry Society (1975); 和"Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application"("藥物設計中生物可逆性載體原理和應用")，E. B. Roche 編輯，Pergamon Press: New York, 14-21 (1987)(為包含羧基基團的化合 物提供了用作前藥的酯類的例子)。此處通過參考的方式併入上述每一 參考資料的全部內容。環境時產生的活性種類。' '、
當本文公開的化合物具有至少一個手性中心時，它們可以 以外消旋化合物或對映體的方式存在。應當指出，所有這些異構體及 其混合物都被包括在本發明的範圍中。此外，本文公開化合物的一些 晶形可以以多晶形物的方式存在。這些多晶形物被包括在本發明的一 個實施方案中。此外，本發明的一些化合物可以與水形成溶劑合物(即 水合物)或與常見的有機溶劑形成溶劑合物。這些溶劑合物被包括在本 發明的一個實施方案中。
術語"藥物可接受鹽"指不會對被給藥生物體產生顯著刺 激且不會消除化合物的生物活性和特性的該化合物的鹽。在一些實施 方案中，所述鹽為化合物的酸加成鹽。可以通過化合物與諸如氫滷酸 (例如，鹽酸或氫溴酸)、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸反應得到藥物可 接受鹽。還可以通過化合物與諸如脂肪族或芳香族的羧酸或磺酸等有 機酸反應得到藥物可接受鹽，例如醋酸、琥珀酸、乳酸、蘋果酸、酒 石酸、檸檬酸、抗壞血酸、煙酸、曱磺酸、乙磺酸、對苯磺酸、水楊 酸或萘磺酸。還可以通過化合物與鹼反應形成鹽以得到藥物可接受鹽，例如銨鹽、諸如鈉鹽或鉀鹽等鹼金屬鹽、諸如4丐鹽或鎂鹽等鹼土金屬 鹽、諸如二環己基胺、N-曱基-D-葡糖胺、三羥曱基氨基曱烷、CVC7 烷基胺、環己胺、三乙醇胺、乙二胺等有機鹼鹽、以及與諸如精氨酸、 賴氨酸等胺基酸形成的鹽。
如果藥物製劑的生產涉及將藥物賦形劑和鹽形式的活性 成分均質混合時，那麼使用非鹼性的藥物賦形劑，即酸性或中性的賦 形劑可能是理想的。
在不同的實施方案中，本文公開的化合物可以被單獨使 用、與本文公開的其它化合物聯合使用、或與一種或多種在本文所述 的治療領域中具有活性的其它藥物聯合使用。
本文所使用的術語"卣素原子"是指任意一個元素周期表 第7欄的非放射性原子，即氟、氯、溴或碘，氟和氯是優選的。
術語"酯"指具有式-(R)n-COOR，的化學部分，其中R和R， 獨立地選自烷基、環烷基、芳基、雜芳基(通過環碳鍵合的)以及雜脂 環(通過環碳鍵合的)，並且其中n為0或1。
"醯胺"是具有式-(R)n-C(O)NHR，或-(R)n-NHC(O)R，的化 學部分，其中R和R，獨立地選自烷基、環烷基、芳基、雜芳基(通過 環碳鍵合的)以及雜脂環(通過環碳鍵合的)，並且其中n為0或l。醯 胺可以是連接在本發明的分子上的胺基酸或肽分子，從而形成前藥。
本發明化合物上的任何胺、羥基、或羧基側鏈均可以被酯 化或醯胺化。達到此目標所使用的方法和具體基團為本領域技術人員 已知，並且可以容易地在參考資料中找到，例如Greene和Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis (有才幾合成中的保護基)，3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999,在此通過參考的方式併入其 全部內容。
本文所使用的術語"純化的、，，"基本上純化的、"以及 "分離的"指本文公開的化合物不含其它的、不同的化合物，本發明 化合物在其自然狀態下與所述其它的、不同的化合物相伴隨，使得本 發明化合物包含至少0.5%、 1%、 5%、 10%或20%重量比的給定樣品， 且最優選地包含至少50%或75%重量比的給定樣品。使用方法
如本文介紹的實例所證明，式(I)化合物抑制糜蛋白酶樣、 胰蛋白酶樣、以及半胱天冬酶樣蛋白酶體活性。相反，已經顯示硼替 佐米僅僅抑制糜蛋白酶樣蛋白酶體活性。參見Goldberg, A. L. &Rock, K. (2002) MW 8, 338-40以及Adams, J. (2004) 及ev 4, 349-60;在此通過參考的方式併入其全部內容。另外還證明了式(I)化 合物具有與硼替佐米不同的作用機理。此外，式(I)化合物在不同的多發性骨髓瘤細胞系中誘導細胞凋亡，該細胞系包括但不限於地塞米松 敏感MM.1S、抗地塞米松MM.1R、 RPMI-8226、 OPM2、 U266、以及 抗阿黴素Dox-40。式I化合物還在取自復發的人類多發性骨髓瘤患者 的細胞系中誘導細胞凋亡，所述患者在復發前曾使用地塞米松、硼替 佐米、以及沙利度胺進行多次治療。因此，式(I)化合物對於對包括地 塞米松、阿黴素、硼替佐米/PS-341、以及沙利度胺的其它化學治療劑 具有耐藥性的MM細Jf包是有效的。
因此，在一實施方案中，提供了治療容易對至少一種化學 治療劑產生耐藥性的腫瘤性疾病的方法，該方法包括給予諸如人的患 者式(I)化合物或其藥物可接受鹽或酯類前藥。"對至少一種化學治療 劑產生耐藥性"指對患者給予該化學治療劑無法顯著改善腫瘤性疾病 的症狀。在一些特徵為腫瘤的腫瘤性疾病的實施方案中，"對至少一 種化學治療劑產生耐藥性"指化學治療劑的給藥無法產生可察覺到的 對腫瘤生長的抑制或腫瘤尺寸的減小。"對至少 一種化學治療劑產生 耐藥性"還可以指，當使該試劑暴露於抗性腫瘤細胞時，沒有可察覺
到的細胞凋亡被誘導。"容易"對至少一種化學治療劑抗性，其表示 目前腫瘤性疾病對至少 一種化學治療劑具有耐藥性或由於化學治療劑 的重複給藥將會產生耐藥性。
本文的實例還證明，當式(I)化合物與硼替佐米聯合時，在 MM細胞中引發協同細胞凋亡。因此，可以將式(I)化合物與硼替佐米 /PS-341聯合給藥以實現細胞凋亡，其中使用的每一種試劑的劑量比單 獨給予該試劑時少，因此降低了試劑的毒性。意想不到的是，這些結 果證明通過給予兩種不同的蛋白酶體抑制劑可以獲得協同效果。"協 同的"指兩種或多種試劑的聯合產生的聯合指數(CI)〈 1.0。還證明， 式(I)化合物與非蛋白酶體抑制劑的聯合提供加合效果。"加合的，，指 兩種或多種藥物的聯合產生的CI約等於1。例如，可以根據以下等式 通過Chou陽Talalay方法確定CI: "CI = (D)l/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2 + (D)l(D)2/(Dx)l(Dx)2",其中(D1)和(D)2是聯合使用時具有x效果的 藥物1和藥物2的劑量；並且(Dx)l和(Dx)2是單獨使用時具有相同x 效果的藥物1和藥物2的劑量。
因此，在一實施方案中，提供了治療腫瘤性疾病的方法， 該方法包括將兩種或多種蛋白酶體抑制劑協同聯合給藥。可以聯合的 蛋白酶體抑制劑類型的非限制性例子包括肽硼酸鹽蛋白酶體抑制劑、 肽醛蛋白酶體抑制劑、以及非肽蛋白酶體抑制劑。肽硼酸鹽蛋白酶體 抑制劑的非限制性例子是硼替佐米。肽醛蛋白酶體抑制劑的非限制性 例子是MG-132。非肽蛋白酶體抑制劑的非限制性例子包括omuralide 和式(I)化合物。在一實施方案中，至少一種蛋白酶體抑制劑是式(I)化 合物或硼替佐米。"聯合"給藥指，不管實際上在何時或如何對患者 給藥，可以在他們的血流中同時發現兩種或多種試劑。在一實施方案 中，同時給予所述試劑。在一個這樣的實施方案中，通過在單次劑型 中組合所述試劑完成聯合給藥。在另一實施方案中，順序給予所述試 劑。在一實施方案中，通過相同的途徑，例如口服，給予所述試劑。 在另一實施方案中，通過不同的途徑給予所述試劑，例如一種口服給 藥而另一種靜脈注射給藥(i.v.)。在一個有利的實施方案中，所述兩種 或多種試劑的藥代動力學基本上相同。
在一實施方案中，提供了治療腫瘤性疾病的方法，該方法 包括將式(I)化合物和另 一種化學治療劑聯合給藥。在一實施方案中， 另一種化學治療劑是地塞米松、多柔比星或沙利度胺。在一實施方案 中，另一種化學治療劑是諸如硼替佐米的另一種蛋白酶體抑制劑。在 一實施方案中，提供組合了式(I)化合物與另外的化學治療劑的藥物組 合物。
在一些實施方案中，通過上述任何方法治療的腫瘤性疾病 可能是選自乳腺癌、肉瘤、白血病、卵巢癌、輸尿管癌、膀胱癌、前 列腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胰 腺癌、肝癌、腎癌、內分泌癌、皮膚癌、黑素瘤、血管瘤、以及腦或 中樞神經系統(CNS)癌的癌症。在一實施方案中，所述腫瘤性疾病是 多發性骨髓瘤。藥物組合物
另一方面，本公開涉及藥物組合物，其包括生理可接受的 表面活性劑、載體、稀釋劑、賦形劑、光滑劑、混懸劑、成膜物質、 以及包衣輔助劑或其聯合；以及本文公開的化合物或組合。用於治療 用途的可接受載體或稀釋劑在製藥領域中是公知的，並且在例如 Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明頓製藥學)，18th Ed. , Mack Publishing Co.， Easton， PA (1990))中有描述，在此通過參考的方式併入 其全部內容。在藥物組合物中可以提供防腐劑、穩定劑、染料、甜味 劑、芳香劑、香料等等。例如，可加入作為防腐劑的苯曱酸鈉、抗壞 血酸以及對羥基苯曱酸的酯。此外，可以使用抗氧化劑和混懸劑。在 不同的實施方案中，醇、酉旨、硫酸化脂族醇等等可用作表面活性劑； 蔗糖、葡萄糖、乳糖、澱粉、結晶纖維素、甘露醇、輕質無水矽酸鹽、 鋁酸鎂、鋁酸曱基矽酸鎂、合成矽酸鋁、碳酸鈣、碳酸氫鈣、磷酸氫 鈣、羥曱基纖維素鈣等等可用作賦形劑；硬脂酸鎂、滑石、氫化油等 等可用作光滑劑；椰子油、橄欖油、芝麻油、花生油、大豆油可用作 混懸劑或潤滑劑；作為諸如纖維素或糖等碳水化合物的衍生物的醋酸 鄰苯二曱酸纖維素、或作為聚乙烯的衍生物的乙酸曱酯-異丁烯酸共聚
物可用作混懸劑；且諸如鄰苯二曱酸酯等等的增塑劑可用作混懸劑。
術語"藥物組合物"指本文公開的化合物或化合物的組合 物與其它諸如稀釋劑或載體等化學組分的混合物。藥物組合物輔助對 生物體給予所述化合物。在本領域中存在多種給予化合物的技術，其 包括但不限於口服給藥、注射給藥、氣霧劑給藥、腸胃外給藥和局部 給藥。通過化合物與諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、曱磺酸、 乙磺酸、對曱苯磺酸、水楊酸等等無機酸或有機酸反應也可以得到藥 物糹且合物。
術語"載體"定義為輔助將化合物引入細胞或組織的化合 物。例如二曱亞碸(DMSO)是普遍使用的載體，這是因為它輔助許多有 機化合物向生物體的細胞或組織中的吸收。
術語"稀釋劑"定義為稀釋在水中的化合物，它溶解目的 化合物並且穩定該化合物的生物活性形式。在本領域中，溶解在緩衝 溶液中的鹽被用作稀釋劑。 一種常用的緩衝溶液是磷酸鹽緩衝鹽水， 因為它模擬了人血的鹽狀態。由於緩衝鹽在低濃度時可以控制溶液的 pH值，所以緩衝的稀釋劑很少改變化合物的生物活性。
術語"生理可接受的"定義為不消除化合物的生物活性和 特性的載體或稀釋劑。
可以對人類患者給予本文所描述的藥物組合物本身，或者 給予藥物組合物，其中所述藥物組合物與合適的載體或賦形劑混合。 在"Remington's Pharmaceutical Sciences"(雷明頓製藥學)，Mack Publishing Co. Easton， PA， 18th edition, 1990中可找到本申請化合物的 製劑和給藥技術。
合適的給藥途徑可以例如包括口服、直腸、透膜、局部或 腸內給藥；腸胃外輸送包括肌內、皮下、靜脈、髓內注射，以及鞘內、 直接心室內、腹膜內、鼻內或眼內注射。還可以以緩釋或控釋劑型給 予所述化合物，包括儲庫型注射(depotinjections)、滲透泵、丸劑、透 皮(包括電遷移)貼片等等，用於以預先確定的速率進行延長和/或定時、 脈沖給藥。
本發明的藥物組合物可按已知的方式製造，例如，通過常 規的混合、溶解、粒化、糖錠劑製造、研磨、乳化、包嚢、包封(entrapping) 或壓片過程。
因此，用於本發明用途的藥物組合物可以使用一種或多種 生理可接受的載體以常規方式進行組方，所述載體包含輔助將活性化 合物加工到藥物可接受製劑中的賦形劑和輔助劑。合適的製劑取決於 所選的給藥途徑。可以如本領域中適合併理解的那樣使用任何公知的 技術、載體和賦形劑；例如，在《雷明頓製藥學》中，同上。
可將注射劑製備成下列常^L形式作為溶液或混懸液，在 注射前適合製成溶液或混懸液的固體劑型，或作為乳劑。合適的賦形 劑是，例如水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、谷 氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸等等。另外，如果需要，注射劑藥物組合物可 以含有少量無毒性輔助物，例如溼潤劑、pH緩沖劑等等。生理相容的 緩衝劑包括但不限於Hank溶液、Ringer溶液或生理鹽水緩衝液。如 果需要，可使用吸收增強制劑(例如脂質體)。
對於透膜給藥，在所述製劑中可使用適於通透屏障的滲透劑。
腸胃外給藥的藥物製劑，例如，通過推注或連續輸注，包 括水可溶形式的所述活性化合物的水溶液。此外，可以將所述活性化 合物的混懸液製備為合適的油狀注射懸劑。適合的親脂溶劑或載體包 括諸如芝麻油等脂肪油、或諸如豆油、葡萄柚油或杏仁油等其它有機 油、或諸如油酸乙酯或甘油三酯等合成脂肪酸酯、或脂質體。水性注 射懸液可包含增加該懸液粘度的物質，例如羥甲基纖維素鈉、山梨糖 醇或葡聚糖。任選地，所述混懸液還可以包含合適的穩定劑或增加所 述化合物溶解性以製備高濃度製劑的試劑。注射製劑可以以單位劑型 存在，例如在安瓿或多次劑量容器中，並加入有防腐劑。所述組合物 可以採用油性或水性載體中的混懸劑、溶液或乳劑這樣的形式，並且 可以包含諸如助懸劑、穩定劑和/或分散劑等組方試劑。或者，所述活 性組分可以是粉末形式，用於在使用前與諸如滅菌無熱原水等合適的 載體復溶。
對於口服給藥，通過組合所述活性化合物與本領域/>知的 藥物可接受載體可以容易地組方所述化合物。這樣的載體能夠使本發 明的化合物被組方為片劑、丸劑、糖錠劑、膠嚢、液體、凝膠、糖漿、膏劑(slurry)、混懸液等等，用於接受治療的患者口服攝取。可通過下 述方法獲得用於口服的藥物製劑混合活性化合物和固體賦形劑，任 選地研磨所得混合物，以及加工該顆粒混合物，如果需要，在加入合 適的輔助劑後進行所述加工，以得到片劑或糖錠劑核。合適的賦形劑 特別是諸如糖的填充劑，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維 素製劑，例如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、 西黃蓍膠、曱基纖維素、羥丙基曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉、和/ 或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要可加入崩解劑，例如交聯的聚乙烯 吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或諸如藻酸鈉的藻酸鹽。對糖錠劑核進行合適 的包被。為了這個目的，可使用濃縮的糖溶液，該糖溶液可任選地包 含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝膠(carbopol gel)、聚 乙二醇和/或二氧化鈦、紫膠漆溶液、以及合適的有機溶劑或溶劑混合物。為了識別或表徵活性化合物劑量的不同組合，可向片劑或糖錠劑 包衣中加入染料或色素。為了這個目的，可使用濃縮的糖溶液，該糖 溶液可任選地包含阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝膠、 聚乙二醇和/或二氧化鈦、紫膠漆溶液、以及合適的有機溶劑或溶劑混 合物。為了識別或表徵活性化合物劑量的不同組合，可向片劑或糖錠 劑包衣中加入染料或色素。
可用於口服的藥物製劑包括明膠製成的推入配合(push-fit) 膠嚢，以及諸如甘油或山梨糖醇的明膠和增塑劑製成的軟的、密封的 膠嚢。推入配合膠嚢可包含與諸如乳糖的填充劑、諸如澱粉的粘合劑、 和/或諸如滑石或硬脂酸鎂的潤滑劑，以及任選的穩定劑混合的活性成 分。在軟膠嚢中，活性成分可溶解或懸浮在合適的液體中，例如脂肪 油、液態石蠟、或液態聚乙二醇。另外，可加入穩定劑。所有口服給 藥的製劑的劑量均應適合這種給藥。
對於口腔給藥，所述組合物可以是按常規方法組方的片劑 或錠劑的形式。
對於吸入給藥，使用合適的推進劑，將用於本發明用途的
化合物從增壓包或噴霧器中以噴霧形式方便地輸送，所述合適的推進 劑例如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它 合適氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供閥以輸送計量的量來 確定劑量單位。在吸入器或吹入器中使用的諸如明膠的膠嚢和藥筒可 被組方成包含化合物和諸如乳糖或澱粉等合適粉末基質的粉末混合 物。
本文還公開了在製藥領域中公知的用於包括眼內、鼻內以 及耳內輸送的多種藥物組合物。用於這些用途的適合的滲透劑是本領 域公知的。用於眼內輸送的藥物組合物包括水可溶形式的所述活性化 合物的水性眼用溶液，例如滴眼劑，或以結冷膠(gellan gum)形式 (shedden等人，C""， 7Tzw., 23(3):440-50 (2001 ))或水凝膠形式(Mayer 等人，0; /^fl/mo/og/cfl, 210(2):101-3 (1996));眼用軟膏；眼用混懸液， 例如微粒、懸浮在液體載體介質中的包含藥物的小聚合顆粒(Joshi， A.， /. Ocw/.屍/^maco/., 10(1):29-45 (1994))，脂溶性製劑(Alm等人，/Vog. C//".歷o/.及as.， 312:447-58 (1989))，以及微球(Mordenti， 7bx/co/. Sc/" 52(1):101-6 (1999));以及眼用嵌入劑。在此通過參考的方式併入所有 上述文獻的全部內容。為了穩定性和舒適性，這些合適的藥物製劑最 經常且優選地組方成無菌的、等滲的、和緩衝的。用於鼻內輸送的藥 物組合物還可包括滴劑和噴霧劑，通常將其製備成在許多方面模擬鼻 分泌物以確保維持正常纖毛作用。如在Remington's Pharmaceutical Sciences (雷明頓製藥學),18th Ed" Mack Publishing Co" Easton， PA (1990)中所公開的，在此通過參考的方式併入其全部內容，以及本領 域技術人員所公知的，適合的製劑最經常且優選為等滲的，輕度緩沖 以維持pH 5.5至6.5，並且最經常且優選地包括抗菌性防腐劑和適當 的藥物穩定劑。用於耳內輸送的藥物製劑包括在耳內局部應用的混懸 劑和軟膏。用於這類耳用製劑的常用溶劑包括甘油和水。
化合物也可以;故組方成諸如栓劑或保留灌腸劑的直腸組 合物，例如含有諸如可可脂或其它甘油脂的常規栓劑基質。
除了前述的製劑，化合物還可以被組方成為儲庫型製劑。 可以通過才直入(例如皮下或月幾內)或通過月幾內注射給予這種長效製劑。 因此，舉例來說，所述化合物可以與合適的聚合物或疏水材料(例如可 接受油中的乳劑)或離子交換樹脂組方，或作為微溶衍生物，例如微溶 鹽。
對於疏水化合物，合適的藥物載體可以為包含苯曱醇、非 極性表面活性劑、可與水混溶的有機聚合物、以及水相的共溶劑系統。 常用的共溶劑系統為VPD共溶劑系統，其為3。/ow/v的苯曱醇、8。/。w/v 的非極性表面活性劑聚山梨醇酯80TM、以及65% w/v的聚乙二醇300 且由無水乙醇補足體積的溶液。自然地，共溶劑系統的比例可以有相 當大的改變而不破壞其溶解度和毒性特徵。此外，共溶劑組分可以改 變例如可以使用其它低毒性的非極性表面活性劑代替 POLYSORBATE 80TM;可以改變聚乙二醇的片斷大小；諸如聚乙烯吡 咯烷酮等其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇；以及其它糖或多 糖可代替葡萄糖。
或者，可採用用於疏水性藥物化合物的其它輸送系統。脂 質體和乳劑是疏水藥物的輸送媒介物或載體的公知實例。還可以使用 諸如二曱亞碸等某些有機溶劑，儘管通常要以較高的毒性為代價。另 外，可以使用緩釋系統輸送化合物，例如含有治療劑的固體疏水性聚 合物的半透性基質。已經確定了多種緩釋材料且它們為本領域技術人 員所公知。根據其化學性質，緩釋膠嚢可以釋放化合物數周至超過100 天。根據治療劑的化學性質和生物穩定性，可採用使蛋白質穩定的其 它方案。
可以使用本領域普通技術人員公知的技術給予用於細胞 內給藥的試劑。例如，這類試劑可以被包嚢進脂質體。在脂質體形成 時，在水溶液中存在的所有分子都被包括到水性內部。所述脂質體的 內含物不僅受到保護不受外部微環境的影響，而且因為脂質體與細胞 膜相融合，所以該內含物被有效輸送至細胞的細胞質。可以使用組織 特異性抗體包被脂質體。該脂質體將會被靶向至期望的器官並被選擇 性吸收。或者，可以直接細胞內給予小的疏水性有機分子。
可將另外的治療或i貪斷試劑併入藥物組合物。或者或此 外，藥物組合物可與包含其它治療或"^斷試劑的其它組合物組合。
給藥方法
可以使用4壬何合適的方法對患者給予所述化合物或藥物 組合物。給藥方法的非限制性例子包括，在其它方法中，(a)通過口服 途徑給藥，該給藥包括以膠嚢、片劑、顆粒劑、噴霧劑、糖漿劑或其 它這類形式進行給藥；(b)通過非口服途徑給藥，例如直腸、陰道、尿 道內、眼內、鼻內或耳內，該給藥包括作為水性混懸液、油性製劑等 等或作為滴劑、噴霧劑、栓劑、藥膏、軟膏劑等等；(c)通過皮下、腹 膜內、靜脈內、肌內、皮內、眶內、嚢內、脊柱內、胸骨內等等注射 給藥，包括輸液泵輸送；(d)局部(locally)給藥，例如直接在腎臟區域 或心臟區域中進行注射，例如通過儲庫型植入；以及(e)局部(topically) 給藥；當本領域技術人員認為使本發明的化合物與活組織接觸是適當 的時。
適合給藥的藥物組合物包括含有活性成分的組合物，其中 所述活性成分的含量有效達到其預期效果。劑量中要求的本文公開藥 物組合物的治療有效量將取決於給藥途徑、包括人在內的接受治療的 動物的類型、以及考慮中的特定動物的身體特徵。可以調整劑量以達 到期望的效果，但是這將取決於下列因素體重、飲食、同時的藥物 治療以及醫學領域的技術人員認識到的其它因素。更具體地，治療有 效量指有效防止、減輕或改善疾病症狀，或延長接受治療個體的存活 的化合物量。本領域技術人員有能力確定治療有效量，特別是按照本 文提供的詳細公開。
正如本領域技術人員所顯而易見的，用於體內給藥的劑量 和具體的給藥方式將根據年齡、體重和接受治療的哺乳動物種類、所 使用的具體化合物、以及使用這些化合物的具體用途而變化。本領域 技術人員使用常規的藥理學方法可以完成有效劑量水平，即實現預期 效果所必需的劑量水平的確定。通常，產物的人體臨床應用從較低劑 量水平開始，隨著劑量水平的增加直至達到期望的效果。或者，採用 已確定的藥理學方法，能夠使用可接受的體外研究來建立本方法鑑別 的組合物的有用劑量和給藥途徑。
在非人類動物研究中，潛在產物的應用以較高劑量水平開 始，隨著劑量的減少直至不再實現期望的效果或不良副作用消失。根 據預期效果和治療指徵，劑量範圍可較寬泛。通常，劑量可為約10 微克/公斤至100毫克/公斤體重，優選為約100微克/公斤至10毫克/ 公斤體重。或者，正如本領域技術人員所理解的，劑量可基於患者的 表面積並按照其計算。
各醫師可根據患者的狀況選擇本發明藥物組合物的確切 製劑、給藥途徑和劑量。(參見例如，Fingl等人，1975， "The Pharmacological Basis of Therapetutics，，(治療學的藥理學基礎)，在此通 過參考的方式併入其全部內容，特別參考第l章、第l頁)。通常，對 患者給藥的組合物的劑量範圍可以為約0.5至1000 mg/kg患者體重。 根據患者需要，所述劑量可以是單次的或者在一天或更多天期間兩次 或更多次給予。在對於至少 一些條件已確立了化合物的人用劑量的情 況下，本發明將使用那些相同的劑量，或劑量範圍為約0.1%至500% 的確定的人用劑量，更優選的劑量範圍為25%至250%的確定的人用 劑量。如果沒有確定的人用劑量，如新發現的藥物化合物的情況，可 以從EDso或IDso值，或來自體外或體內研究的其它適當的值推斷合適 的人用劑量，如動物中的毒性研究和效能研究所定性的。
應當指出，根據毒性或器官功能障礙，主治醫師將知道如 何且何時終止、中斷或調整給藥。相反，如果臨床反應不充分(排除毒 性)，則主治醫生也將知道將治療調整至更高水平。在所關注病症的治 療中給藥劑量的大小將隨著待治療的疾病狀態的嚴重程度和給藥途徑 而變化。例如通過標準的預後評^f介方法可以部分評^f介所述疾病狀態的 嚴重程度。此外，所述劑量或可能的劑量頻率也將根據個體患者的年 齡、體重以及反應而變化。與上述討論方案相當的方案可用於獸醫學 中。
雖然通過逐一的藥物分析可以決定確切的劑量，但是在大 多數情況下，關於劑量可以進行一些概括。成人患者的日給藥方案， 例如口服劑量範圍為0.1 mg至2000 mg的各活性成分，優選為1 mg 至500mg,例如5至200mg。在其它實施方案中，使用的靜脈內、皮
下或肌內劑量為各活性成分0.01 mg至100 mg,優選為0.1 mg至60 mg,例如l至40mg。在給予藥物可接受鹽的情況下，劑量可按照遊 離鹼計算。在一些實施方案中，每日給予所述組合物1至4次。或者， 可通過連續的靜脈輸注給予本發明的組合物，各活性成分的劑量優選 為高至每日1000mg。正如本領域技術人員所理解的，在某些情況中， 為了有效且迅速地治療特別迅速發展的疾病或傳染，以超過、或遠遠 超過上述優選的劑量範圍的量給予本發明所述化合物是必要的。在一 些實施方案中，在連續治療期間給予所述化合物，例如一周或數周、 或數月或數年。
可以個別地調整劑量和用藥間隔以提供足以維持調整效 果或最低有效濃度(MEC)的活性部分的血漿水平。每種化合物的MEC 不同，但是可以從體外數據估算。達到MEC所需要的劑量將取決於 個體特徵和給藥途徑。然而，可以^吏用HPLC測定或生物測定來確定 血漿濃度。
還可以使用MEC值確定用藥間隔。應使用在10-90%的時 間內、優選在30-90%的時間內、以及更優選在50-90%的時間內將血 漿水平維持在MEC以上的給藥方案給予組合物。
在局部給藥或選擇性吸收的情況下，藥物的有效局部濃度 可以與血漿濃度無關。
當然，給予的組合物的量取決於被治療的個體，根據所述 個體的體重、痛苦的嚴重性、給藥方式以及開處方醫師的判斷。
可以使用已知的方法對本文公開的化合物的效能和毒性 進行評估。例如，通過在體外測定對細胞系的毒性可以建立具體化合 物或共享某些化學部分的該化合物子集的毒理學，所述細胞系例如哺 乳動物細胞系，且優選人的細胞系。這類研究的結果經常可預測動物 體內，如哺乳動物或更具體地人體內的毒性。或者，使用已知的方法可以測定具體化合物在諸如小鼠、大鼠、家兔或猴的動物模型中的毒 性。可以使用幾種公認的方法確立具體化合物的效能，例如體外方法、 動物才莫型或人體臨床試驗。幾乎對每一類疾病狀態都存在著公認的體 外模型，該疾病狀態包括但不限於癌症、心血管疾病、以及多種免疫 功能障礙。類似地，可以使用可接受的動物模型建立治療這些疾病狀 態的化學物質的效能。當選擇模型確定效能時，本領域所屬技術人員 可在本領域現狀指導下選擇適當的模型、劑量、給藥途徑以及方案。 當然，人體臨床試驗也可以用於確定化合物在人體內的效能。
如果需要，可將所述組合物置於包裝或分配裝置中，該包 裝或分配裝置可以包含一個或多個含有活性成分的單位劑型。所述包 裝例如可以包含金屬或塑料蕩，例如泡罩包裝。所述包裝或分配裝置 可帶有給藥說明書。所述包裝或分配裝置還可以帶有與所述容器相關 的注意事項，該注意事項是由管理藥物生產、使用或銷售的政府機構 規定的，該注意事項反映了所述藥物形式已經由該機構批准用於人類 或獸類給藥。這樣的注意事項，例如，可以是由美國食品和藥物管理 局批准的用於處方藥的標籤，或者是批准的產品說明書。還可以在合 適的容器中製備、放置包含組方在相容藥物載體中的本發明化合物的 組合物，並標記其用於指定的疾病狀態的治療。實施例實施例1——般程序
細胞培養和試劑./人Dr. Steven Rosen (Northwestern University, Chicago, IL)處得到Dex敏感性MM.IS和Dex抗性MM.IR 人MM細胞系。參見Moalli， P. A" Pillay, S" Weiner, D., Leikin, R. & Rosen, S. T. (1992) Blood 79, 213-22和Chauhan, D.， Catley， L.， Hideshima， T., Li， G., Leblanc， R.， Gupta， D., Sattler, M.， Richardson, P.， Schlossman， R. L.， Podar， K,， Weller， E.， Munshi， N. & Anderson, K. C. (2002) Blood 100， 2187-94;在此通過參考的方式併入其全部內容。從 Dr. William Dalton (Moffit Cancer Center, Tampa, FL)處得到 RPMI-8226和多柔比星(Dox)抗性(Dox-40)細胞。從美國典型培養物保 藏中心(Rockville, MD)得到U266和OPM2 MM細胞系。從ATCC (Manassas, VA)購得人腫瘤細胞系DU 145、 HT-29、 Jurkat、 LoVo、 MDA-MB-231、 MIAPaCa-2、 NCI-H292、 OVCAR-3、 PANC畫l和PC-3。
將MM細胞系培養在補充有10。/。熱滅活胎牛血清(FBS)、 100單位/毫 升青黴素、100/ig/m鏈黴素和2mML-穀氨醯胺的RPMI-1640培養基 中。從復發的患者新鮮分離出MM細胞，所述患者在接受包括地塞米 松(Dex)、美法侖、沙利度胺或硼替佐米的多次在先治療後復發。通過 使用CD 138 (粘結蛋白聚糖-l)微磁珠和自動MACS磁性細胞分選儀 (Miltenyi Biotec Inc.， Auburn， CA)的CD 138正向選擇法從患者骨髓樣 本中純化MM細胞。參見Chauhan， D., Catley， L.， Hideshima, T.， Li， G.， Leblanc， R., Gupta， D.， Sattler, M.， Richardson, P.， Schlossman， R. L., Podar， K., Weller， E.， Munshi， N. & Anderson, K. C. (2002) Blood 100, 2187-94;在此通過參考的方式併入其全部內容。從ATCC得到的正常 的人皮膚成纖維細胞CCD-27sk被培養在補充有10。/。熱滅活FBS、 100 單位/毫升青黴素、100 jng/m鏈黴素、4 mM L-穀氨醯胺以及1 mM丙 酮酸鈉的DMEM中。使用不同濃度的式II化合物(X二C1) (Nereus Pharmaceuticals, Inc， San Diego, CA)、硼替佐米或Dex(Sigma Chemical Co， St. Louis, MO)處理細胞。
細胞存活率和凋亡測定.通過溴化3-(4,5-二曱基噻唑)-2-基)-2，5國二苯基四哇(MTT; Chemicon International Inc., Temecula, CA) 測定評估細胞存活率，4艮據生產商的說明書(Roche Molecular Biochemicals , Indianapolis ， IN)以及如 Chauhan, D., Catley， L.， Hideshima, T., Li， G.， Leblanc, R., Gupta, D.， Sattler, M., Richardson, P., Schlossman, R. L， Podar, K., Weller， E.， Munshi, N. & Anderson, K. C. (2002) Blood 100, 2187-94中所述，在此通過參考的方式併入其全部內 容。根據生產商說明書(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)所述， 使用Cell Death Detection ELISAplus定量細胞死亡。實施例2—體外20S蛋白酶體活性測定
如Stein, R. L.， Melandri, F. & Dick, L. (1996) Biochemistry 35， 3899-908和Lightcap, E. S., McCormack, T. A.， Pien， C. S., Chau， V., Adams， J. & Elliott, P. J. (2000) Clin Chem 46， 673-83中所述，測量20S蛋白酶體活性的糜蛋白酶樣活性，在此通過參考的方式包括其全部內 容。從Biomol， Plymouth Meeting, PA獲得純化的人紅細胞來源的20S 蛋白酶體。分別Y吏用Suc-LLVY-AMC, Z-LLE-AMC (Boston Biochem, Cambridge, MA)和Boc-LRR-AMC (Bachem Bioscience, King of Prussia, PA)作為肽底物測定20S蛋白酶體的糜蛋白酶樣、半胱天冬酶樣以及 胰蛋白酶樣活性。使用Fluoroskan Ascent 96孑L自動酶標儀(Thermo Electron, Waltham， MA)測量切割肽底物的螢光。通過使用sigmoidal 劑量響應、變斜率模型(slope model)的Prism (GraphPad Software)計算 EC5Q值。EC5o值被定義為在最大相對螢光的50%被抑制時的藥物濃度。圖i繪出的結果表明，雖然在不同的濃度下，但是式(ii)化合物(xk:i)抑制所有三種蛋白酶體活性。實施例3—小鼠全血細胞中離體20S蛋白酶體活性的分析(單次靜脈給 藥或口服給藥)[oioi]為了直接測定式(n)化合物(x-ci)是否抑制體內蛋白酶體活性，將式(II)化合物(X-Cl)溶解在100% DMSO中並用5%聚乙二醇 硬脂酸酯(Soluto1⑧HS 15;聚乙二醇660 12-羥基硬脂酸酯，BASF, Shreveport， LA)連續稀釋，得到終濃度為2% DMSO。載體對照由2% DMSO和98% (5% Solutol HS 15)組成。在Bolder BioPATH， Inc. (Boulder, CO)，用不同濃度的化合物以10mL/kg的體積、靜脈或口服 給藥方式處理雄性Swiss-Webster小鼠(每組5隻，體重20-25克)。一 組動物未被處理以建立蛋白酶體活性的基線。在給予該化合物90分鐘 後，所述動物被麻醉，並通過心臟穿刺抽血。通過離心收集聚集的全 血細胞，用PBS洗滌，並且在幹水上冷凍，用於確定離體蛋白酶體活 性。使用肽底物suc-LLVY-AMC測定白細胞(WBC)溶胞產物中20S蛋 白酶體的糜蛋白酶樣活性。使用細胞溶胞產物的蛋白濃度標準化相對 螢光單位(RFU)。圖2顯示了單個小鼠的20S蛋白酶體活性，橫線表 示平均活性。基線表示在從未處理小鼠製備的WBC溶胞產物中觀察到的20s蛋白酶體活性。圖2中描述的結果表明，式(ii)化合物(xk:i)以劑量依賴方式抑制白細胞中20S蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性。重要 的是，這些結果證實該化合物口服有效且抑制體內蛋白酶體活性。
實施例4一MM細胞中被引發的蛋白酶體活性變化的測定(體外)
通過使用AdaY125Iahx3L3VS的竟爭試驗確定式(II)化合物 (X二C1)是否影響體外多發性骨髓瘤細胞中的蛋白酶體活性。在本測定 中，AdaY(125I)Ahx3L3VS標記式(II)的化合物(X-C1)未靶向的位點並 通過放射自顯影法可視化，而在放射自顯影照片上無法看見式(II)的化 合物(X-C1)耙向的位點。將MM.IS MM細胞與式(II)化合物(X-Cl) (7 nM)—起孵育30 mins、 lh、 3h、或6h，用玻璃珠進行細胞溶解。在 37 °C下，將60 jtig蛋白質提取物與碘化蛋白酶體抑制劑 AdaY125Iahx3L3VS —起孵育2h。然後通過在還原性樣品緩衝液中煮沸 使蛋白質變性、並在12.5% SDS-PAGE凝膠上分離、然後進行放射自 顯影。如圖3中所見，與對照細胞相比，處理細胞中被 AdaY(125I)Ahx3L3VS標記的蛋白酶體beta-5(j8-5)亞基顯著減少。鑑於 /3-5亞基介導糜蛋白酶樣活性，這些結果表明式(II)化合物(X-C1)與/3-5 亞基結合，從而抑制MM.1S細胞中的糜蛋白酶樣活性。此外，用所述 化合物(7 nM)處理MM.1S細胞6h還降低/3-2亞基(胰蛋白酶活性)和 j8-l亞基(半胱天冬酶樣活性)的標記(數據未顯示)。實施例5—MM細胞中被引發的蛋白酶體活性變化的測定(體內)
通過使用丹醯基-Ahx3L3VS的竟爭試驗進行蛋白酶體活性 的體內測定，丹醯基-Ahx3L3VS共價修飾所有的活性蛋白酶體亞基。 該抑制劑包含丹醯基氨磺醯己醯基半抗原，其可以通過使用抗丹醯基 部分的抗體的免疫印跡被可一見化。用式(II)化合物(X二C1) (7 nM)處理 MM.1S細胞30分鐘、lh或3h,然後在37 。C下，與5 丹醯基 -AhX3L3VS —起孵育lh。通過將細胞在NP-40溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl， 1% NP-40)中將育30分鐘使其溶解，然 後離心5分鐘以除去膜碎片、細胞核和細胞碎片。用12.5% SDS-PAGE 凝膠分離60 蛋白質提取物，然後使用多克隆抗單醯基多克隆Ab (1:7500，兔，Molecular Probes)和與辣根過氧化物酶偶聯羊抗兔二級抗 體(Southern Biotech)進行免疫印跡分析。通過增強的化學發光產生印
跡(Western Lightning, Perkin-Elmer)。如圖4中所見，用式(II)的化合物 (X二C1)處理MM.1S細胞減少了丹醯基Ahx3L3VS對j3-5亞基的標記。 此外，該化合物還減少了丹醯基Ahx3L3VS對和|3-2亞基的標記， 雖然是在較高的濃度下，分別為lnM和20nM。相反，即使用更高劑 量的硼替佐米對MM.1S細胞進行處理，卻不抑制jS-2亞基(數據未顯 示)。綜上所述，這些研究結果證明了式(II)化合物(X-C1)抑制MM細 胞中所有三種蛋白酶體活性的能力。實施例6—對MM細月包存活率的影響
根據生產商的說明書(Roche Molecular Biochemicals， Indianapolis, IN)以及如Chauhan， D., Catley， L., Hideshima, T.， Li, G.， Leblanc， R., Gupta, D., Sattler， M.， Richardson, P., Schlossman， R. L,， Podar, K., Weller, E.， Munshi, N. & Anderson, K. C. (2002) Blood 100， 2187-94中所述，通過溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2-基)-2,5-二苯基四唑 (MTT; Chemicon International Inc., Temecula， CA)測定評估細月包存活率，在此通過參考的方式併入上述文獻的全部內容。圖5A顯示用式(n)化合物(X:C1)處理MM.1S (-■-)、 Dex-抗性MM.1R (-□-)、 RPMI-8226 (- -)、多柔比星抗性Dox-40 (- ■)、 OPM2 (-O-)和U266(-0-)細胞24h 後的細胞存活率。結果為來自三個獨立實驗的平均值士S.D (對於所有 細胞系，P<0.005; n = 3)。觀察到在所有細胞系中細胞存活率的劑量 依賴性顯著降低(ICso範圍7-24 nM)。
還評估了純化的患者MM細胞的細胞存活率。用式(II)化 合物(乂=(31) (10 nM)處理從9名MM復發患者新鮮分離的胂瘤細胞24h 並分析其細胞凋亡，這些患者在接受包括Dex、硼替佐米和沙利度胺 的多次在先治療後復發。如圖5B中所見，如通過DNA斷裂分析所測 量的，在這些細胞中觀察到顯著的細胞凋亡(P < 0.005; n=2)。標示值 為來自三份重複樣品的平均值±標準差。重要的是，所檢查的9名患 者中的4名對硼替佐米治療產生耐藥性，而5名患者對沙利度胺和Dex 治療產生耐藥性。這些數據表明1)式(II)化合物(X-Cl)在對常規治療 和硼替佐米治療敏感和產生抗藥性的MM細胞中誘導細胞凋亡；以及
2)對於MM細胞，該化合物的ICso在納摩爾濃度範圍內。實施例7—對骨髓基質細胞(BMSCs)存活率的影響
MM細胞主要位於骨髓^^環境中且它們與BMSCs的相互 作用誘導細胞因子的產生，該細胞因子介導MM細胞的生長以及對抗 藥物誘導的細胞凋亡。參見Anderson, K. C. (2003) Ca"cer 97， 793-801; 在此通過參考的方式併入其全部內容。因此，測定式(II)化合物(X-Cl) 對來自5名患者MM的BMSCs的影響。如圖6中所見，正如由DNA 斷裂分析所證明的，在這些細胞中，用式(II)化合物(X-Cl)(20nM)處 理BMSCs (患者#1-5) 24h不誘導細胞凋亡。所示的陽性對照是該測定 的內部對照。在相同的實^r中還檢查了來自5名MM患者中的2名患 者的純化MM細胞(CD 138+)。結果為來自三份重複樣品的平均值± 標準差。所述化合物誘導純化的患者MM細胞(CD138陽性)的細胞凋 亡顯著增加(10-12倍)。這些結果表明式(II)化合物(X-C1)直接作用於 MM細胞，而非BMSCs。實施例8 —重組人白介素6 (rhlL-6)和重組人胰島素樣生長因子-I (rhIGF-I)抗細胞凋亡的效果
MM細胞與BMSCs的粘附誘導來自BMSCs的IL-6和IGF-I 分泌，這不僅調節MM細胞的生長，還保護其免受化學治療的傷害。 參見Hardin, J.， MacLeod, S., Grigorieva， I.， Chang, R.， Barlogie， B.， Xiao, H. & Epstein, J. (1994) 84， 3063-70和Chauhan, D.,Kharbanda， S.， Ogata, A., Urashima, M., Teoh, G., Robertson, M.， Kufe, D. W. & Anderson, K. C. (1997) 89， 227-234;在此通過參考的方式併入其全部內容。因此，評價rhlL-6或rhlGF-I是否抑制由式(II)化 合物(X-Cl)誘導的MM細胞的細胞凋亡。在存在或缺乏rhIL-6 (10 ng/ml)或rhlGF (50 ng/ml)的條件下，用式(II)化合物(X:C1) (7 nM)或 Dex (0.5 jtiM)處理MM.1S細胞24h。在第24h採集細胞並通過MTT測 定分析細胞存活率。如圖7中所見，在用所述化合物單獨處理後，細 胞存活率的中值為47 ± 2.3%;用所述化合物+ rhIL-6處理後，其中 值為51.2 ± 3.2% (P = 0,26， Wilcoxon檢驗)、以及用所述化合物+ rhIGF-I處理後，其中值為50.3% ± 2.0% (P = 0.28)。在用Dex處理後， 存活率的中值為51 ±2.1%,以及對於Dex + rhlL-6，則其中值為92士 5.5% (P = 0.05，通過單側Wilcoxon秩和檢驗確定)。結果為三次獨立 實驗的平均值±標準差。這些研究結果表明無論IL-6或IGF-I均不 阻滯式(II)化合物(X-C1)的抗MM活性。相反並如其它研究所示，IL-6 和IGF-I均阻滯Dexi秀導的MM.1S細胞存活率的下降。參見Chauhan， D., Hideshima, T. & Anderson, K. C. (2003) /"〃//emaW 78， 114-20和 Mitsiades, C. S., Mitsiades, N., Poulaki, V.， Schlossman， R.， Akiyama, M.: Chauhan, D.， Hideshima， T., Treon， S. P., Munshi， N. C.， Richardson, P. G. & Anderson, K. C. (2002) O"coge"e 21, 5673-83;在此通過參考的方 式併入其全部內容。因此，數據表明式(II)化合物(X-Cl)克服IL-6和 IGF-I對MM細胞的生長和保護效應，並且表明所述化合物和Dex對 抗MM細胞的不同作用沖幾理。IL-6的高血清水平促成臨床化療抗性和 治療失敗，以及在存在IL-6或IGF-I的條件下，式(II)化合物(X-Cl) 依然誘導MM細胞凋亡能力的報告表明，所述化合物可以克服晚期 MM患者的抗藥性。參見Kyrstsonis, M. C., Dedoussis, G., Baxevanis, C.: Stamatelou， M. & Maniatis, A. (1996) & 92， 420-422;在此通過參考的方式併入其全部內容。實施例9—對細胞血管內皮生長因子(VEGF)誘導的MM遷移的影響
VEGF在骨髓微環境中升高並引發MM細胞的遷移、生長 和血管生成。參見Podar， K.， Tai， Y. T., Lin， B. K., Narsimhan, R. P.， Sattler, M.， Kijima， T., Salgia, R.， Gupta, D., Chauhan, D. & Anderson, K. C. (2002) J傷o/ CAem 277, 7875-81;在此通過參考的方式併入其全部 內容。因此，評估式(II)化合物(X:C1)是否改變VEGF誘導的MM細 胞遷移。在存在或缺乏所述化合物(7 nM或10 nM)的條件下，研究 VEGF誘導的遷移。如先前在Podar， K.， Tai， Y. T., Davies， F. E., Lentzsch， S.， Sattler, M., Hideshima, T.， Lin, B. K.， Gupta, D., Shima, Y., Chauhan, D., Mitsiades, C., Raje， N.， Richardson, P. & Anderson, K. C. (2001)5/ood98， 428-35中所述地分析細胞遷移，在此通過參考的方式 併入其全部內容。如圖8中所示，式(II)化合物(X-C1)顯著(P < 0.05) 降低VEGF誘導的MM.1S MM細胞的遷移。這些研究結果表明所述 化合物可以逆向調節MM細胞向骨髓的歸巢以及它們向外周血的流 出。實施例10—對Bcl2介導的保護效應的影響
Bcl2使包括MM等癌細胞對常規治療產生抗性。參見Cory， S. & Adams, J. M. (2002)胸i ev C匿er 2, 647-56和Gazitt， Y.， Fey， V.， Thomas, C. & Alvarez, R. (1998) / (9"co/13, 397-405;在此通過 參考的方式併入其全部內容。Bcl2能夠適度地減輕硼替佐米誘導的細 胞凋亡。因此，評估Bcl2在MM.lS細胞中的異位表達是否影響對式 (II)化合物(X:Cl)的反應性。用Bcl2構建體穩定轉染MM.1S細胞，並 使用MTT測定分析其細胞存活率的變化。如圖9所示，式(II)化合物 (XK:i)以劑量依賴方式顯著降低了 Bcl2轉染的MM.1S細胞(P < 0.005) 的細胞存活率。雖然如此，與空載體轉染的MM.1S細胞相比，在Bcl2 轉染的細胞中所述化合物誘導的細胞死亡減少了 15 ±1.1%。結果為三 次獨立實驗的平均值±標準差。這些研究結果表明所述化合物能夠克 服Bcl2介導的保護作用。實施例ll一在鼠科動物腫瘤模型中的體內評估
從Frederick腫瘤研究和發展中心(Frederick， MD)得到六周 大的、三重免疫缺陷的beige-nude-xid(BNX)小鼠。所有的動物研究均 根據Dana-Farber癌症研究所的動物倫理委員會批准的實驗方案進行。 每曰觀察小鼠的毒性症狀。在使用異氟烷吸入劑的麻醉狀態下完成最 終取血，並通過C02窒息將動物處死。為了測定式(II)化合物(X-C1) 的體內抗MM活性，用100julRPMI-1640培養基中的3xl07 RPMI 8226 MM細胞對21隻BNX小鼠的平坦部位進行皮下接種。當腫瘤變得可 測量時，將小鼠分配到接受0.25 mg/kg (n = 7)、 0.5 mg/kg (n = 7)的式 (n)化合物(XK^l)的實驗組，或僅接受載體的對照組(11 = 7)。在發展出 可測量的腫瘤後開始藥物治療。 一周兩次口服給予所述藥物(0。25 mg/kg或0.5 mg/kg)。每隔一天用測徑器進行垂直直徑的系列測量以計 算腫瘤體積，使用以下公式4/24x(最短直徑)、(最長直徑)。如果所 述腫瘤》2cm或壞死，則將動物處死。對於腫瘤生長研究，每組中使 用7隻小鼠。
如圖10A-C中所見，用式(II)化合物(X-C1)，而不只用載 體對帶有腫瘤的小鼠的治療顯著抑制了 MM腫瘤生長並延長了這些小 鼠的存活。對照組的所有小鼠均發展出進行性腫瘤，而在70%的接受 治療的小鼠中，觀察到腫瘤完全消退。圖IOB上圖的小鼠接受口服劑 量的單獨載體，而下圖的小鼠接受式(II)化合物(X-C1) (0.25 mg/kg)。 圖10B中的左圖是生長在小鼠右側腹的皮下漿細胞瘤的放大。評估從 治療的第一天直至死亡的存活；當小鼠的腫瘤直逕到達2cm或變為瀕 死狀態時，將小鼠處死(圖IOC)。此外，甚至在治療12周後，也沒有 觀察到神經學的行為變化。小鼠很好地耐受了給予化合物的濃度，沒 有明顯的體重減輕。每周對未治療組和治療組的小鼠進行稱重。圖10D 顯示小鼠體重的平均變化。
第300天的分析顯示在57。/。的式(II)化合物(X-C1)治療的 小鼠中無腫瘤復發(圖IOC)。此外，在接種位點進行的組織學分析證實 了與接受載體治療的小鼠相比，接受式(II)化合物(X-C1)治療的小鼠中 漿細胞消失(圖IOE，分別為右圖和左圖)。這些數據顯示該化合物是口 服有效的、抑制MM腫瘤體內生長並且延長存活。實施例12—體內抗腫瘤活性的比傘支分析
為了比較式(II)化合物(X-C1)和硼替佐米的體內活性，每周 兩次用式(II)化合物(X-C1) (0.15 mg/kg靜脈注射)或硼替佐米(1.0 mg/k靜脈注射)對如上所述的小鼠模型進行治療。兩種試劑都顯著減 輕了腫瘤進展(p〈0.01)並延長了存活(p-0.0137)(圖IOF和IOG)。實施例13—介導抗MM活性的機理
線粒體在逆境中的細胞凋亡誘導中具有關鍵作用。參見
Bossy-Wetzel， E. & Green, D. R. (1999) Mutat Res 434, 243-51和 Chauhan, D. & Anderson, K. C. (2003) Apoptosis 8， 337-43;在此通過參 考的方式併入其全部內容。用式(II)化合物(X-C1) (7 nM)處理未用血清 培養的MM.IS細胞12h並與CMXRos —起孵育20分鐘；在37 °C下， 用在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的親脂陽離子染料CMXRos (Mitotracker Red) (Molecular Probes, Eugene, OR)染色20分鐘；並且通過流式細胞 術測定分析A (線粒體膜電位)的變化。通過用膜可滲透染料二氫乙 錠(HE)對細胞染色15分鐘測量超氧化物((V)的產生。超氧陰離子氧化 HE得到螢光的乙錠，使得能夠通過流式細胞術進行分析。
如圖IIA和11B中所見，由CMXRos陰性細胞(P < 0.005, n = 2)的數目增加所證明，式(II)化合物(X-Cl)降低AiAm，並引發 MM.IS細胞中的02-產生。結果為兩次獨立實驗的平均值±標準差。formula see original document page 36m的改變與線粒體蛋白cyto-c和Smac向胞漿中的釋放相關，由此 引發半胱天冬酶9和半胱天冬酶3。參見Du， C., Fang， M., Li, Y., Li， L. & Wang, X. (2000) Cell 102， 33-42和Liu， X.， Naekyung Kim, C., Yang, J.， Jemmerson， R. & Wang, X. (1996) Cell 86， 147-157;在此通過參考的 方式併入其全部內容。
如圖IIC中所示，式(II)化合物(X-Cl)對MM.IS細胞的處 理引發了線粒體cyto-c(左上圖)和smac(右上圖)的減少，以及這些蛋白 在胞漿部分中的同時增加(分別位於中左圖和中右圖)。用抗Hsp60(左 下圖)和抗微管蛋白(右下圖)Abs再次探針檢測(reprobe)免疫印跡證實 了線粒體提取物的純度和等量的蛋白加樣。線粒體凋亡蛋白cyto-c和 Smac/DIABLO的釋放誘導半胱天冬酶9和半胱天冬酶3的活化。用式 (II)化合物(X-Cl) (7 nM)處理MM.IS細胞24h並收集；通過12.5% SDS-PAGE分離線粒體和胞漿的蛋白部分，並且通過使用抗cyto-c(上 圖)或抗Smac(中圖)Abs的免疫印跡進行分析。作為等量蛋白加樣和線 粒體部分純度的對照，還分別用抗樣(管蛋白(右下圖)和抗Hsp60 Abs(左下圖)再次探針檢測過濾器。印跡是三個獨立實驗的代表。
用式(II)化合物(X=C1) (7 nM)處理MM. 1S細胞24h並收集； 通過12.5% SDS-PAGE分離胞漿蛋白，並且通過使用抗半胱天冬酶8
Abs和抗半胱天冬酶9 Abs的免疫印跡進行分析。如圖IID中所見， 用式(II)化合物(X-C1)處理MM.1S細胞誘導半胱天冬酶9的蛋白水解 切割。此外，所述化合物還活化半胱天冬酶8 (圖IIE)。已知半胱天冬 酶9(線粒體依賴的)和半胱天冬酶8(非線粒體依賴的)都被蛋白水解切 割並活化共同的下遊效應子半胱天冬酶3,導致PARP切割。參見Miller: L. K. (1999) 7>e"& Ce〃說W 9， 323-8;在此通過參考的方式併入其全部 內容。因此，用式(II)化合物(X-Cl)(7nM)處理MM.lS或MM.lRMM 細胞24h並通過PARP和半胱天冬酶3切割分析評估其細胞凋亡。總 蛋白溶胞產物經過SDS-PAGE分析。用抗PARP (上圖)或抗半胱天冬 酶3 (下圖)Abs進行所述溶胞產物的免疫印跡分析。"FL"表示"全 長"並且"CF"表示切割片斷。該數據進一步顯示式(II)化合物(X-C1) 引發半胱天冬酶3和PARP切割(圖IIF)。
使用細胞色素C， Smac，半胱天冬酶8、半胱天冬酶9或 半胱天冬酶3的抗體(Cell Signaling, Beverly, MA)，微管蛋白的抗體 (Sigma， St. Louis, MO), PARP、 Hsp60或Bax的抗體(BD Bioscience Pharmingen， San Diego， CA)進行免疫印跡分析。通過增強的化學發光 顯影印跡(ECL; Amersham， Arlington Heights, IL)。實施例14—與硼替佐米相比MM細l包凋亡的才幾理不同
在存在或缺乏半胱天冬酶9抑制劑(LEHD-FMK)、半胱天 冬酶8抑制劑(IETD-fmk)或半胱天冬酶3抑制劑(Z-Val-Ala-Asp-氟甲 基酮，z-VAD-fmk)的條件下，用式(II)化合物(X-Cl)或硼替佐米處理 MM.IS細胞。如圖12A所示，半胱天冬酶3的抑制明顯消除了式(II) 化合物(X-C1)和硼替佐米誘導的細胞凋亡。結果為四次獨立實驗的平 均值±標準差(P< 0.004)。半胱天冬酶8的阻滯導致由式(II)化合物 (X=C1) (P < 0.005， n = 4)引發的細胞死亡顯著減少，而半胱天冬酶9的 抑制僅中度地阻滯了由所述化合物引發的MM.IS細胞存活率的降低。 相反，在存在半胱天冬酶8或半胱天冬酶9抑制劑(P < 0.005)的條件下， 硼替佐米誘導的MM.IS細胞存活率的減少被同等地阻滯。綜上，這些 數據表明在硼替佐米引發細胞死亡期間，半胱天冬酶8和半胱天冬酶9的活化同等地起作用，而由式(II)化合物(X-C1)引發的細胞凋亡主要 通過半胱天冬酶8的信號傳導途徑進行。
通過使用顯性負調節(DN)方案的遺傳研究證實了這些生 物化學數據。還根據生產商的說明書(Amaxa Biosystems, Germany)， 使用Cell line Nucleofecto kit V瞬時轉染了 MM.1S細胞，轉染中使用 單獨載體、DN-半胱天冬酶8、 DN-半胱天冬酶9、或DN-FADD以及 與僅含有綠色螢光蛋白(GFP)的載體共轉染。轉染後，通過流式細胞術 選擇GFP陽性細胞，用式(II)化合物(X二C1)或硼替佐米處理，並且分析 其存活率。與用DN-半胱天冬酶9轉染的細胞相比，用式(II)化合物 (X=C1) (IC50, 7nM)處理DN-半胱天冬酶8轉染的MM細胞明顯提高了 這些細胞的存活率(圖12B)。相反，用硼替佐米(IC50， 5 nM)處理DN-半胱天冬酶8或DN-半胱天冬酶9轉染的MM.1S細胞將存活率提高到 了相似的程度。在這些細胞中(抗FasMoAb),通過用已知的半胱天冬 酶9誘導物(Dex)和半胱天冬酶8誘導物處理MM.1S細胞證實了 DN 半胱天冬酶8和DN-半胱天冬酶9的功能特異性(Chauhan et al., 1997) (圖12C)。這些數據表明(l)式(II)化合物(X-Cl)誘導的MM細胞凋亡 主要由半胱天冬酶8介導；以及(2)硼替佐米誘導的細胞凋亡需要半 胱天冬酶8和半胱天冬酶9的活化。
接下來測定導致半胱天冬酶8活化的上遊信號傳導途徑的 抑制是否影響對式(II)化合物(X二Cl)或硼替佐米的反應。Fas相關死亡 結構域(FADD)蛋白是死亡誘導信號複合體(DISCs)的重要部分， 一旦 諸如Fas等TNF受體家族成員銜接(engagement),該複合體就組裝， 導致半胱天冬酶8前體的蛋白水解加工和自體活化。由於式(II)化合物 (X-C1)和硼替佐米都引發半胱天冬酶8的活化，所以使用DN-FADD 評估在該過程中FADD在MM細胞中的作用。與空載體轉染的MM.IS 細胞相比，用DN-FADD阻滯FADD顯著降低了式(II)化合物(X-Cl) 誘導的細胞毒性(與在載體轉染的細胞中42% ± 2.0%的存活細胞相比， 在DN-FADD轉染的細胞中具有76%±5.1%的存活細胞；p〈0.05)(圖 12D)。 DN-FADD減少了式(II)化合物(X二C1)誘導的半胱天冬酶8的活 化；然而，仍發現最小限度的半胱天冬酶8的活化(數據未顯示)，這 可能是由FADD之外的半胱天冬酶8的上遊活化物造成的。重要的是， 與載體轉染的細胞相比，用硼替佐米處理DN-FADD轉染的MM.1S 細胞導致存活率僅增長了 16% (與在載體轉染的細胞中39% ± 2.4%的 存活細胞相比，在DN-FADD轉染的細胞中具有55%±4.1%的存活細 胞；p < 0.05)(圖12D)。結合半胱天冬酶8和半胱天冬酶9抑制的研究， 這些數據表明式(II)化合物(XK:i)比硼替佐米更依賴FADD-半胱天冬 酶8信號傳導軸，進一步證實式(II)化合物(XK:i)與硼替佐米在MM細 胞中不同的作用機理。
之前的研究已確立Bax誘導線粒體細胞凋亡的途徑。參見 Wei, M. C.， Zong， W. X., Cheng, E. H., Lindsten， T.， Panoutsakopoulou, V.， Ross, A. J., Roth, K. A., MacGregor， G. R.， Thompson, C. B. & Korsmeyer, S. J. (2001) Science 292, 727-30和Lei, K., Ni腦ual, A., Zong， W. X.， Kennedy, N. J.， Flavell, R. A" Thompson, C. B.， Bar誦Sagi, D. & Davis, R. J. (2002) Mol Cell Biol 22， 4929-42;在此通過參考的方 式併入其全部內容。因此，評估由式(II)化合物(X-C1)誘導的MM細胞 凋亡是否與Bax的變化相關。用式(II)化合物(X二Cl)或硼替佐米處理 MM.1S MM細J包，並且對線粒體蛋白提取物進^^吏用抗Bax或抗 Hsp60 Abs的免疫印跡分析。如圖12E中所見，如果式(II)化合物(X-Cl) 誘導線粒體中Bax水平的任何增加，其增加量也很少。印跡是三個獨 立的實驗的代表。重要的是，硼替佐米引發Bax在線粒體中的顯著聚 積。
用式(II)化合物(X-Cl)或硼替佐米處理帶有野生型Bax或 Bax敲除的小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs) 48h，並通過MTT測定分析其 細胞存活率。如圖12F中所見，式(II)化合物(X-Cl)在Bax (WT)和Bax (敲除)中均減少了存活率，而Bax的缺失導致對硼替佐米的顯著抗性。 結果為三次獨立實驗的平均值±標準差(P<0.05)。這些數據顯示在 由式(II)化合物(X-C1)和硼替佐米誘導的細胞凋亡期間對Bax的不同 需要並且表明這些試劑的不同作用機理。實施例15 —與硼替佐米相比，對正常淋巴細胞的不同影響
在患者中，硼替佐米治療伴隨著毒性。因此，比較式(II)化合物(xK:i)和硼替佐米對正常細胞的影響。用不同濃度的式(n)化合物(X-C1) ( 0-20 nM)和硼替佐米(0-20 nM)處理來自五名健康供者的 淋巴細胞72h,並且通過MTT測定分析細胞毒性。如圖13中所見， 即使在較高的劑量(20 nM)時，式(II)化合物(X-C1)也不顯著降低正常淋 巴細胞的存活率(P = 0.27，來自J-T趨勢檢驗)。結果為三次獨立實驗 的平均值±標準差。相反，即使在6-10nM的較低濃度下，硼替佐米 也顯著降低淋巴細胞的存活率。顯而易見，患者MM細胞達到ICso時的式(n)化合物(XK:i)的濃度對正常淋巴細胞沒有影響，而硼替佐米對MM細胞的IC5。引發正常淋巴細胞的存活率降低50。/。。綜上，這些數 據表明式(II)化合物(X-C1)具有選擇性抗MM活性；並且特別地，與硼 替佐米相比，它對正常細胞的毒性較小。
還研究式(n)化合物(x二ci)或硼替佐米是否改變正常淋巴細胞和皮膚成纖維細胞中的蛋白酶體活性。在這些細胞中，式(II)化合 物(X-C1)和硼替佐米都顯著抑制蛋白酶體活性20 nM的式(II)化合物 (X二C1)或硼替佐米分別引發對糜蛋白酶樣蛋白酶體活性的99%或59 ± 11%的抑制(數據未顯示)。因此，雖然20 nM的式(II)化合物(X-C1)不 在正常淋巴細胞中引發顯著的細胞毒性，然而它降低了這些細胞中的 糜蛋白酶樣蛋白酶體活性。類似地，使用IC50的式(II)化合物(X-C1) (317 nM)或硼替佐米(15 nM)處理正常CCD-27sk成纖維細胞也抑制了 蛋白酶體活性(數據未顯示)。實施例16—與硼替佐米相比，對過量表達Bcl-2的MM細月包的不同影 蟲
在細^^凋亡期間，Bax中和Bcl-2的抗細^^凋亡功能，由 此輔助cyto-c的釋放和半胱天冬酶9的活化。Bcl-2還使包括MM等 癌細胞產生耐藥性，並提供部分保護對抗硼替佐米誘導的殺傷。因此， 評估Bcl-2在MM.1S細胞中的異位表達是否影響式(II化合物(X二C1) 或硼替佐米在MM細胞中引發細胞毒性和線粒體後細胞凋亡信號傳導 的能力。Bcl-2的過量表達促使用兩種試劑處理的細胞的存活率輕度提 高對於式(II)化合物(X二C1),在Bcl-2轉染的細胞中，存活率為50% ±2.6%,而在載體轉染的細胞中，存活率為39%± 1.5%(p<0.05);對於 於硼替佐米，在Bcl-2轉染的細胞中，存活率為61%±2,9%，而在載 體轉染的細胞中，存活率為40%±2.1%^<0,05)(圖14A)。 Bcl-2轉 染子響應硼替佐米的提高的存活率(21%)比Bcl-2轉染子響應式(II)化 合物(X-Cl)的提高的存活率(ll。/。)高(p〈0.04;n-3)(圖14A)。此外， 硼替佐米在對照載體轉染的細胞中引發顯著的半胱天冬酶9切割，該 切割在Bcl-2轉染的細胞中明顯減弱(由光密度法測定，減少到原來的 1/3);相反，Bcl-2的過量表達最小程度地影響式(II)化合物(X-Cl)誘導 的半胱天冬酶9切割(圖14B)。結合存活率的結果，這些研究結果表明 與式(II)化合物(X-C1)相比，Bcl-2提供了對抗硼替佐米的更多保護。實施例17—聯合治療
如圖15中所見，用式(II)化合物(X-C1)和硼替佐米聯合處 理MM. 1S或MM. 1R MM細胞24h誘導了協同的生長抑制。結果為三 次獨立實驗的平均值±標準差(P< 0.005)。通過使用"CalcuSyn"軟 件程序(Biosoft, Ferguson, MO and Cambridge, UK)的等效應圖分析抗 MM試劑式(II)化合物(X-C1)和硼替佐米間的相互作用。從細胞存活率 測定(MTT)中得到的數據被表示為經藥物處理的細胞中生長受影響的 細胞對未經處理的細胞中生長受影響的細胞的分數(FA)。 CalcuSyn程 序基於根據如下等式的Chou -Talalay方法"CI = (D)l/(Dx)l + (D)2/( Dx)2 + (D)l(D)2/(Dx)l(Dx)2",其中(D)l和(D)2為當聯合使用 時具有x效果的藥物1和藥物2的劑量；且(Dx)l和(Dx)2為當單獨使 用時具有相同的x效果的藥物1和藥物2的劑量。當。1=1時，該等 式代表守恆等效應圖並表明加合效應。CI值〈l.O表明協同作用。得到 硼替佐米+NPI-0052的聯合指數(CI)〈 1.0,表明協同作用。此外，最 大的抗MM活性是在同時給予時觀察到的，而不是其它治療方案。低 劑量的聯合的式(II)化合物(XK:i)和硼替佐米不顯著影響正常 PBMNCs的存活率(數據未顯示)。因此使用硼替佐米和式(II)化合物 (X:C1)的聯合治療可以l)使得能夠使用每種試劑的亞毒性濃度；2) 延遲或防止耐藥性的產生；以及3)允許逐步升高這些試劑的協同劑量 以提高細胞凋亡的閥值。
權利要求
1.治療腫瘤性疾病的方法，包括對患有所述腫瘤性疾病的患者給予式(I)化合物或其藥物可接受鹽或前藥其中X選自氟、氯、溴或碘，以及其中所述腫瘤性疾病容易對至少一種其它化學治療劑產生抗性。
2.根據權利要求1所述的方法，其中X是氯'
3.根據權利要求i所述的方法，其中所述式(i)化合物具有式(n)的結構formula see original document page 2
4. 根據權利要求1所述的方法，其中所述腫瘤性疾病是癌症。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中所述癌症選自乳腺癌、肉瘤、 白血病、卵巢癌、輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌、 胃癌、肺癌、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、腎癌、內分泌 癌、皮膚癌、黑素瘤、血管瘤以及腦或中樞神經系統(CNS)癌症。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述癌症選自多發性骨髓瘤、 結腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌以及卵巢癌或黑素瘤。
7. 根據權利要求6所述的方法，其中所述癌症是多發性骨髓瘤。
8. 根據權利要求1所述的方法，其中所述患者是人。
9. 根據權利要求1所述的方法，其中所述其它化學治療劑選自地 塞米松、多柔比星和沙利度胺。
10. 根據權利要求1所述的方法，其中所述其它化學治療劑為蛋 白酶體抑制劑。
11. 根據權利要求IO所述的方法，其中所述其它化學治療劑是硼 替佐米。
12. 治療腫瘤性疾病的方法，包括對患有所述腫瘤性疾病的患者 聯合給予式(I)化合物或其藥物可接受鹽或前藥以及至少一種其它的化 學治療劑formula see original document page 4(I)其中x選自氟、氯、溴或碘。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中X是氯。
14. 根據權利要求12所述的方法，其中所述式(I)化合物具有式(n) 的結構formula see original document page 4(II) 。
15. 根據權利要求12所述的方法，其中所述腫瘤性疾病是癌症。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述癌症選自乳腺癌、肉 瘤、白血病、卵巢癌、輸尿管癌、膀胱癌、前列l^癌、結腸癌、直腸 癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、腎癌、內 分泌癌、皮膚癌、黑素瘤、血管瘤以及腦或中樞神經系統(CNS)癌症。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述癌症選自多發性骨髓 瘤、結腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、以及卵巢癌或 黑素瘤。
18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述癌症是多發性骨髓瘤。
19. 根據權利要求12所述的方法，其中所述患者是人。
20. 根據權利要求12所述的方法，其中所述其它化學治療劑選自 地塞米松、多柔比星和沙利度胺。
21. 根據權利要求12所述的方法，其中所述其它化學治療劑是蛋 白酶體抑制劑。
22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述其它化學治療劑是硼 替佐米。
23. 根據權利要求12所述的方法，其中所述聯合是協同的。
24. 根據權利要求12所述的方法，其中所述聯合是加合的。
25. 藥物組合物，其包含formula see original document page 5式(I)化合物或其藥物可接受鹽或前藥 其中X選自氟、氯、溴或碘；以及 至少一種其它的化學治療劑。
26. 根據權利要求25所述的組合物，其中X是氯。
27. 根據權利要求25所述的組合物，其中所述式(I)化合物具有式 (11)的結構formula see original document page 6(n) 。
28. 根據權利要求25所述的組合物，其中所述其它化學治療劑選 自地塞米松、多柔比星和沙利度胺。
29. 根據權利要求25所述的組合物，其中所述其它化學治療劑是 蛋白酶體抑制劑。
30. 根據權利要求29所述的組合物，其中所述其它化學治療劑是 硼替佐米。
31. 治療腫瘤性疾病的方法，包括對患有所述腫瘤性疾病的患者 給予協同組合的至少兩種蛋白酶體抑制劑。
32. 根據權利要求31所述的方法，其中所述腫瘤性疾病是癌症。
33. 根據權利要求32所述的方法，其中所述癌症選自乳腺癌、肉 瘤、白血病、卵巢癌、輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、結腸癌、直腸 癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、腎癌、內 分泌癌、皮癌、黑素瘤、血管瘤以及腦或中樞神經系統(CNS)癌症。
34. 根據權利要求33所述的方法，其中所述癌症選自多發性骨髓 瘤、結腸直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌以及卵巢癌或黑 素瘤。
35. 根據權利要求34所述的方法，其中所述癌症是多發性骨髓瘤。
36. 根據權利要求31所述的方法，其中所述患者為是人。
37. 根據權利要求31所述的方法，其中至少一種所述蛋白酶體抑 製劑選自硼替佐米和式(I)化合物或其藥物可接受鹽或前藥formula see original document page 7其中x選自氟、氯、溴或碘。
全文摘要
本文公開了治療腫瘤性疾病的組合物和方法。包括有效對抗對常規治療和硼替佐米治療產生耐藥性的多發性骨髓瘤細胞的組合物和方法。此外，顯示使用兩種不同蛋白酶體抑制劑的聯合治療對治療多發性骨髓瘤具有協同作用。
文檔編號A61K31/397GK101155582SQ200580046615
公開日2008年4月2日 申請日期2005年12月2日 優先權日2004年12月3日
發明者凱尼斯·C·安德森, 達明德·肖寒 申請人:達納-法伯癌症研究公司