一種載銀貝殼粉抗菌劑的製備方法與流程

2023-12-02 06:26:16 1

本發明屬於抗菌劑的製備技術領域，具體涉及一種載銀貝殼粉抗菌劑的製備方法。

背景技術：

健康是我們最關心的話題之一，細菌作為一種適應力極強的物種，在人類生活的區域，細菌幾乎無處不在。近年來因為細菌引發的感染事件也層出不窮，近一個世紀以來，抗生素被廣泛用於各種抗菌領域，但是近年來隨著人們對抗生素研究的深入，由於使用抗生素有可能使細菌產生耐藥性的弊端。在濫用抗生素引發各種問題的大背景下，抗生素表現出了一定程度的局限性。於是，人們開始把目光投向傳統的一些無機抗菌劑，比如本文提到的金屬離子抗菌劑——納米銀抗菌劑。

隨著近代納米技術的發展，納米級的銀粒子，由於其特殊的性質，受到了很大的關注。單質納米銀體積極小，不易於儲存、使用，現階段將納米銀作為抗菌材料使用的主要是將銀粒子負載在載體上，起到抗菌作用。在醫療方面有納米銀滲透織物(抗菌紗布)對上上燙傷的傷口處理可以抑制感染細菌，效果能夠持續3天，超過了臨床常用的諾氟沙星的效果。在織物上負載納米銀，可以促進傷口的癒合，使受損細胞更快再生與修復，能夠改善創傷周圍組織的微循環，有效地激活並促進組織細胞的生長，使傷口恢復更快，減少留疤的隱患。醫療器械上有載納米級銀的不鏽鋼材料，淨水方面有活性氧化鋁吸附納米銀，處理飲水泳池水以及工業循環水等。納米銀也有運用在塗料上，製成抗菌塗料，根據相關專利文獻記載，塗料暴露在日光下400h，塗料的性能沒有發現變化。

沿海地區貝殼資源豐富，但是大量打撈的同時，留下了很多廢棄貝殼，造成貝殼汙染。但是貝殼卻有著很多不為人所注意的價值，例如作為混凝土骨料製成的混凝土，能夠發揮承重的能力，本發明選用貝殼作為負載材料，也有利用價格低廉，甚至作為廢品的貝殼資源，變廢為寶的考量。貝殼是一種生物礦化作用形成的生物礦物材料，碳酸鈣佔其質量的95％，其餘的5％包括蛋白質，及甲克素等有機基質，貝殼是由碳酸鈣和生物大分子組成的納米複合材料，經適當處理，生物大分子之間的一些基團被破壞，一些活性官能團暴露與表面，表面的一些基團正好為銀的負載提供了場所，同時，部分纖維蛋白溶脹降解，甲殼素轉化為殼聚糖，而殼聚糖也具有一定的抗菌性能。

技術實現要素：

本發明旨在提供一種抗菌效果好、廣譜性抗菌的載銀貝殼粉抗菌劑的製備方法，該製備方法簡單快捷，同時變廢為寶，具有廣泛的市場前景。

本發明具體通過以下技術方案實現：

一種載銀貝殼粉抗菌劑的製備方法，主要包括以下步驟：

步驟一、貝殼粉的製備

1.1取貽貝原料，將貝殼敲打成碎片，浸泡於0.5mol/g氫氧化鈉溶液中12h，超聲振蕩處理10min，以清水衝洗，在60℃條件下烘乾，用中藥粉碎機中粉碎；

1.2將粉碎後的貝殼置於氫氧化鈉溶液中，於60℃的磁力攪拌器上保持1h，反應完成後抽濾分離，並同時用去離子水清洗，乾燥；

1.3將分離得到的貝殼粉進行無氧煅燒，冷卻，煅燒後的貝殼粉呈灰黑色；

1.4將無氧煅燒的貝殼粉進行有氧燒結，冷卻收集，灼燒後的貝殼粉呈白色。

步驟二、載銀貝殼粉的合成

2.1分別取濃度為0.498mg/ml的檸檬酸鈉溶液、濃度為0.5mg/ml的硝酸銀溶液混合併添加得到的貝殼粉，將混合液置於磁力攪拌器上攪拌，冰浴狀態下於磁力攪拌機上攪拌3min；

2.2逐滴滴加濃度為0.22mg/ml的硼氫化鈉溶液，靜置；

2.3反應終止後，取出混合懸液，於2000rpm下離心5min棄去上清液，加入雙蒸水洗滌，離心，將產物置於60℃烘箱乾燥既得載銀貝殼粉抗菌劑。

進一步的，

本發明步驟1.3中無氧煅燒的條件為：550℃，1h。

本發明步驟1.4中有氧燒結的條件為：750℃，1h。

本發明步驟二中，檸檬酸鈉溶液、硝酸銀溶液、硼氫化鈉溶液的體積比為4.5:5:3，優選為檸檬酸鈉溶液4.5ml，硝酸銀溶液5ml，硼氫化鈉溶液3ml。

本發明步驟2.1中，貝殼粉的添加量與硼氫化鈉溶液的質量體積比為0.1g/ml，優選為0.3g。

本發明貝殼粉的製備過程中可不進行步驟1.3和1.4的處理，也可只選擇步驟1.3或1.4的進行處理。

本發明製備載銀貝殼粉抗菌劑的方法中，當貝殼粉的製備過程中不進行步驟1.3和1.4的處理時，可在載銀貝殼粉的合成後進行步驟1.3和/或1.4的處理。

另外，本發明載銀貝殼粉抗菌劑還可通過以下方法製備：

溶液配製同上，在燒杯中加入5.0ml硝酸銀溶液、4.5ml PVP、0.3g貝殼粉，於磁力攪拌器上攪拌混勻，用高壓汞燈正上方照射混合懸液，反應1h，待懸液顏色不再變化時，終止反應，於2000rpm下離心5min棄去上清液，加入雙蒸水洗滌，離心，將產物置於60℃烘箱乾燥既得載銀貝殼粉抗菌劑。

本發明的有益效果為：

本發明使用化學還原法製備出了納米銀顆粒，利用原位還原法製備出負載納米銀的貝殼粉，經試驗證明載納米銀貝殼粉有一定的抑菌作用，符合抑菌劑的標準，通過一定時間的擴散處理(4℃冰箱放置12小時)，可以在一定程度上增強抑菌效果，本發明方法採用二次燒結的工藝處理貝殼粉，使貝殼粉表面有豐富的絨毛狀凹凸的脊，銀被還原出來後可以負載在縫隙中，在一定程度上增大了單位質量銀儲存量，本發明方法所得載銀貝殼粉抗菌劑抗菌效果可以持續48h保持在一定高強度，有很好的持續抗菌效果，同時本發明方法原料在沿海地區資源豐富，成本低，操作工藝簡單，製備出的納米銀抗菌劑能有良好的抗菌性能和釋放能力，可以將載銀貝殼粉抗菌劑運用於化妝品及塗料中等，具有廣泛的市場應用前景。

附圖說明

圖1是二次灼燒氫氧化鈉預處理貝殼粉；

圖2是氫氧化鈉預處理貝殼粉；

圖3是AR貝殼粉結合納米銀後700℃煅燒1h產物；

圖4是紫外還原法二次煅燒貝殼粉。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施例而已，並非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護範圍內。

本發明記載了一種載銀貝殼粉抗菌劑的製備方法，下面具體說明本發明的製備工藝。

1、製備納米銀

實驗有兩種方案：①硼氫化鈉還原法。②紫外照射法

①液相還原法

AgNO3+NaBH4+3H2O＝Ag+NaNO3+B(OH)3+3.5H2

試劑：硝酸銀(常州市國宇環保科技有限公司)硼氫化鈉(Kermel天津市科密歐化學試劑有限公司)二水合檸檬酸三鈉(杭州高晶精細化工有限公司)試劑純度標準均為AR。

儀器：磁力攪拌器(杭州儀表電機公司)UV-Vis-NIR光譜儀(上海儀濤生物儀器有限公司)電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

過程：配置溶液：硝酸銀0.5mg/ml二水合檸檬酸三鈉0.498mg/ml硼氫化鈉0.22mg/ml

實驗使用的水，均為二次去離子水。硝酸銀溶液置於棕色容量瓶中，防止因光照造成反應損失。

取一定量硝酸銀與適量的檸檬酸鈉(試過檸檬酸)，以水定容後移至100ml錐形瓶中。冰浴狀態下於磁力攪拌機上進行攪拌5min同時滴加少量新鮮配置的硼氫化鈉溶液。混合物溶液迅速由無色(可能有些棕色)轉變成灰黑色溶液。抽取樣品使用UV-Vis-NIR光譜儀檢測納米銀粒子的共振吸收峰。當選定檸檬酸三鈉和硼氫化鈉的量為4.5ml、3ml。硝酸銀溶液取5ml時銀納米粒子較小。銀納米粒子吸收峰最小，此時銀的顆粒尺寸也比較小。

改變還原劑硼氫化鈉滴加速度，銀膠體的共振吸收峰也會改變，在一定程度內滴加越快，銀膠體顆粒平均尺寸逐漸變小。反應溫度也會影響銀納米粒子尺寸，溫度較低時，銀納米粒子平均尺寸較小。

②紫外照射法

Ag﹢+R-→Ag+R

R為還原性基團，可直接利用銀鹽的負離子作為還原劑，也可另加還原劑，該方法製備納米銀，各項工藝的條件都有影響，產量不穩定，易造成浪費。

試劑：硝酸銀(常州市國宇環保科技有限公司)二水合檸檬酸三鈉(杭州高晶精細化工有限公司)。

儀器：高壓汞燈(上海季光特種照明電器廠)磁力攪拌器(杭州儀表電機公司)UV-Vis-NIR光譜儀(上海儀濤生物儀器有限公司)電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)

過程：硝酸銀與穩定劑的配比與硼氫化鈉法相同。首先混合硝酸銀與檸檬酸三鈉溶液，置於磁力攪拌器上進行攪拌，並與高壓汞燈下照射，期間遮蔽環境光，減少幹擾。混合液體的顏色由基本無色透明，漸變成淺褐色→棕色→黑色，表明可以反應終結。

2、貝殼粉生產

儀器：中藥粉碎機(溫嶺市奧力中藥機械公司)KQ-500E超聲清洗儀(崑山市超聲儀器有限公司)烘箱(上海三發科學儀器公司)管式爐

選用貽貝粉，貽貝由於其表面含有角質層，通過處理反應去除角質層可以形成一定程度上的空洞或者凹陷。

取適量貽貝原料，大致清洗表面，洗去吸附的雜質，衝洗後，將貝殼敲打成碎片，浸泡於0.5mol/g氫氧化鈉溶液中12小時。超聲振蕩處理10min，大致清洗貝殼表面附著的雜質。以清水衝洗3遍後放入60℃烘箱中乾燥。選取適量貝殼碎片，分批少量放於中藥粉碎機中粉碎，每一批約粉碎3min。粉碎完成後收集裝袋留用。

將貝殼粉置於燒杯中，加入一定濃度的氫氧化鈉溶液(濃度無嚴格要求)置於磁力攪拌器上，設定溫度60℃，保持1h。反應完成後抽濾分離貝殼粉，並同時用去離子水清洗2遍。乾燥留用。

處理目的：為使貝殼粉中的角質層反應，形成空洞，增大銀能負載的面積，一方面也能讓銀更穩固地結合在貝殼粉上。

無氧煅燒Ar：使用管式爐，進行無氧煅燒，550℃1h冷卻後收集裝袋，煅燒後的貝殼粉呈灰黑色。

二次燒結：使用管式爐，將無氧煅燒的貝殼粉進行有氧燒結750℃1h，冷卻後收集裝袋，灼燒後的貝殼粉呈白色。

3、載銀貝殼粉合成

製備納米銀有兩種方案，載銀貝殼粉在合成大方向上也有兩種方案。

①液相還原銀離子法

按照製備納米銀方案的濃度配製各種溶液。在錐形瓶中滴加4.5ml檸檬酸三鈉溶液，與5.0ml硝酸銀溶液，同時放入0.3g貝殼粉。將錐形瓶置於磁力攪拌器上進行攪拌，並且冰浴。攪拌時間約3分鐘，目的是為使溶液能滲透貝殼粉，並混勻。逐滴滴加3ml硼氫化鈉溶液，注意不能滴加過快，否則反應過快，銀無法負載在貝殼粉的空隙，抗菌劑樣品質量下降。

滴加完畢後在攪拌器上靜置片刻，即可終止反應。取出混合懸液，高速離心，2000rpm離心5min(轉速以及時間沒有嚴格規定，能分離固液即可)棄去上清液，加入雙蒸水洗滌，離心，洗滌操作2次，洗淨殘留的雜質。將產物置於60℃烘箱乾燥。取出樣品，於馬弗爐中進行二次煅燒，第一次設定溫度為550℃，時間1h，待冷卻後，第二次煅燒溫度為700℃，時間1h，冷卻後取出裝袋作為樣品留用。

②光化學還原銀離子法

溶液配製同上，作為反應的穩定劑，檸檬酸三鈉可以用PVP代替。準備一個50ml容量的燒杯，在燒杯中加入5.0ml硝酸銀溶液，同時放入4.5ml穩定劑，0.3g貝殼粉，置於磁力攪拌器上進行攪拌混勻。開啟高壓汞燈，正上方照射混合懸液，反應約1h(貝殼的種類不同，反應時間有些許差別)反應時遮光，同時注意汞燈發熱，需要風扇散熱。待懸液顏色不再變化時，終止反應，關閉高壓汞燈。接下來的處理與液相化學還原法相同，煅燒後的樣品裝袋留用。

同時本發明貝殼粉的製備過程中對於貝殼粉二次煅燒的處理工藝也可在載銀貝殼粉的合成後進行。即，最終合成產品分別的反應過程包括以下幾種：

1)貝殼粉硼氫化鈉法結合銀之後二次煅燒

2)貝殼粉紫外照射法結合銀之後二次煅燒

3)二次燒結的貝殼粉硼氫化鈉法結合銀

4)二次燒結的貝殼粉紫外照射法結合銀

5)一次Ar燒結硼氫化鈉法結合銀後進行煅燒。

雖然通過以上合成路徑最終均可以得到本發明合成產品，本發明最終選擇的合成載銀貝殼粉抗菌劑的最佳方法為二次燒結的貝殼粉硼氫化鈉法結合銀法，其主要原因具體見效果試驗。

實施例1抑菌圈實驗

指示菌種：大腸桿菌。

滅菌準備：鑷子、牛津杯(內徑6mm±0.2mm)、培養皿、雙蒸水、氧化鈣對照(AR天津博迪化工有限公司)。

需要儀器設備：生化培養箱(Hitachi日立株式會社)、超淨臺(Thermo Fisher Scientific)。

細菌準備：

取零下20攝氏度凍存的大腸桿菌菌種1:100稀釋於液體培養基，220rpm 37℃搖床活化菌種12-14h。活化完成後將菌液保存於4℃冰箱中。待以後留用。

樣品準備：每種樣品取相同質量，置於EP管中，高溫滅菌後，按照濃度配比滴加滅菌雙蒸水，並且進行超聲擴散處理，使固體顆粒更細緻，更均勻地分布在懸液中。

製備培養基：

實驗用LB固體培養基配方100ml：

酵母提取物：0.5g(BR杭州百思生物技術有限公司)

蛋白腖：1.0g(BR杭州百思生物技術有限公司)

NaCl：1.0g(AR上海試四赫維化工有限公司)

瓊脂粉：1-1.2g(BR杭州百思生物技術有限公司)

PH控制在7.6±0.2

121℃高壓滅菌20min。滅菌結束後於超淨臺中進行無菌操作。實驗的細菌平板採用雙層平板法。(即先使培養基凝固，再在培養基固體上塗布一層菌液。)

樣品處理：根據需要濃度，於滅菌後的樣品中加入一定量的dd水，超聲分散處理，使懸浮顆粒均勻分散。(加水稀釋過程需無菌操作)。

倒平板塗布：每份培養皿中均勻倒入25ml LB固體培養基，待培養基凝固後，在每皿培養基上滴加200μl菌液，再用無菌玻耙把菌液塗布均勻。靜置一段時間，時間長短以菌液被吸收，培養基表面沒有明顯液體為準。

放置牛津杯：在每個培養基上放置4個牛津杯，間距均勻，且超過24mm，與培養皿邊距超過15mm。放置時要一次性放準位置，儘量不要移動。

加入抗菌懸液：待牛津杯安置穩定後，在每個牛津杯中滴加200μl相應濃度的樣品溶液。注意滴加時不要滴到牛津杯外面，滴加後不能移動牛津杯。

擴散及培養：小心移動培養皿，放於4℃冰箱中12h，擴散處理。再將培養皿統一放入37℃細菌培養箱中進行培養24小時。取出培養皿，使用遊標卡尺，用十字交叉法測定抑菌圈的直徑。

實驗使用的抗菌劑稀釋濃度一律為1％，抑菌圈大小數據(單位mm)。

樣品編號：

1：Cao對照組

2：二次煅燒生貝粉對照組

3：貝殼粉硼氫化鈉法結合銀之後二次煅燒

4：貝殼粉紫外照射法結合銀之後二次煅燒

5：二次燒結貝殼粉負載硼氫化鈉法還原納米銀

6：二次燒結的貝殼粉負載紫外照射法還原納米銀

7：一次Ar燒結硼氫化鈉法結合銀後進行煅燒

實驗結果：

表1抑菌圈實驗

由統計數據得知：

在1％濃度下，硼氫化鈉還原銀離子結合納米銀的方法製作成的樣品抗菌能力最強，根據國家衛生局相關文件，「抑菌圈直徑大小在7mm以下的，則視為無抑菌效果，抑菌圈大於7mm的，表現出弱抑菌效果，而抑菌圈直徑在10-20mm的，具有較強的抑制作用。

實施例2最小抑菌濃度測定

從實施例1實驗結果來看，硼氫化鈉還原法製成的抗菌樣品抗菌能力最強，選用此類樣品進行進一步的實驗：

製備菌懸液：取以上實驗活化過的大腸桿菌10μL，37℃搖床培育到對數生長期(約20分鐘)。

配製培養基：

營養肉湯NB培養基配方如下：(100ml)

蛋白腖1.0g(BR杭州百思生物技術有限公司)

牛肉膏0.3g(BR上海生工生物工程有限公司)

NaCl 0.5g(AR上海試四赫維化工有限公司)

PH 7.2±0.2(25℃)

稀釋樣品抗菌劑：取13支滅菌試管，在第一管中加入1.6ml培養基。其餘每管均加入1ml培養基，在第一管加入抗菌樣品原液(1280μg/ml)0.4ml，混勻，吸取1ml至第二管，混勻後再吸取1ml至第三管，以此規律連續倍比稀釋至第12管，並從第12管吸取1ml液體棄去。第13管作為空白對照。各管藥物濃度依次為：256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。，

接種菌液：

在上述試管中，每一管加入20μl等量菌液，混勻。

培養：

塞好塞子之後，將試管置於37℃普通空氣培養箱中進行培養。培養時間18小時。

18h過後，於培養箱中取出試管，觀察細菌生長情況，試管中沒有細菌生長的，樣品濃度最低試管對應的濃度即為樣品的最小抑菌濃度MIC。

實驗結果如表2：

表2細菌生長數量(+表示生長，-表示沒有生長)

從表2可知，樣品的最小抑菌濃度在6--7管的濃度之間，範圍(4--8μg/ml)。

實施例3抑菌率測定

使用固體培養基培養觀察菌落比例的方法，按照LB培養基的配製方法配製培養基，滅菌後，每個培養皿均勻倒25ml培養基，待冷卻後，滴加100μl菌液，用無菌耙鋪平菌液，然後滴加100μl樣本溶液，鋪平，重複3次，將培養基置於37℃培養箱培養24h，觀察菌落數，計算抑菌率。

抑菌率＝(空白對照菌落數-加抗菌樣品菌落數)/空白對照組菌落數。

實驗結果如表3：

表3抑菌率

實驗測量後再將培養基放於37℃培養箱，於36h，48h，60h時分別再次取出觀察細菌生長情況，觀察到48h後加了抗菌劑的培養基菌落仍然可數，60h後菌落數漸漸增多，之後逐漸同無抗菌劑組類似。

實施例4表徵實驗

抗菌劑樣品製備完成後需要對樣品進行表徵實驗，從而確定樣品的一些特殊性質。

1)掃描電子顯微鏡觀測形貌

取少許(微量)樣品置於EP管中，加入2ml無水乙醇，超聲分散約20分鐘，使微量樣品分散，取少量樣品滴於矽片上，待乾燥後，送至掃描電子顯微鏡，拍攝形貌圖片。

如圖1和圖2對比所示，可清楚地發現，經過灼燒處理，貝殼粉顆粒表面生產了絨毛狀的不規則凹凸，利於附著納米銀顆粒，而且可以在一定程度上能夠讓納米銀緩慢釋放出來。

如圖3和圖4對比所示，紫外照射反應過程中，銀離子還原成銀單質，並吸附在煅燒貝殼粉的縫隙中。