編碼纖溶酶原激活蛋白的dna的製作方法

2023-12-01 16:48:51 3

專利名稱：編碼纖溶酶原激活蛋白的dna的製作方法
技術領域：
本發明是屬於動物健康領域，且涉及疫苗組合物及用於疾病的診斷。更具體地說，本發明涉及抗哺乳動物乳腺炎的疫苗，和具有編碼在製備所述疫苗中有用的纖溶酶原激活蛋白核苷酸序列的多核苷酸分子。
牛乳腺炎造成奶牛奶產量的嚴重損失，導致對牛奶業嚴重的經濟影響。乳腺炎可由一種或更多種細菌病原體所致。估計鏈球菌屬的感染約佔所有牛乳腺炎臨床案例的30％。特別是，估計由乳房鏈球菌的感染約佔牛乳腺炎所有病例的20％。
用於預防和治療動物乳腺炎的傳統方法包括使用衛生的擠奶技術和施用化學抗生素。然而，抗生素的使用被這樣的事實所限制，即含有抗生素殘留物的牛奶常被認為對於人類消費是不安全的並且必須拋棄。治療或預防動物乳腺炎的具體方法包括Stolle等的美國專利5,198,214，其中描述了多價抗乳腺疫苗的使用，該疫苗包括從感染動物乳汁中培養的失活的致乳腺炎病原體。此外，Sordillo等的美國專利5,234,684描述了一種治療或預防母牛乳腺炎的方法，包括向牛施用牛幹擾素γ。
鏈球菌屬種類感染泌乳乳腺的能力依賴於該細菌在分泌物中的生長能力和避免由牛噬中性細胞吞噬的能力(Leigh等.,1990，獸醫學研究49:85-87)。牛奶中大多數氮以蛋白形式存在(Aston，1975，澳大利亞牛奶技術雜誌(Austral.J.Dairy Tech).30:55-59)且，當缺乏蛋白水解時，鏈球菌在牛奶中的生長由於缺乏自由胺基酸而受限制。這由於乳酸鏈球菌(lacticstreptococci)對用於在牛奶中生長的細胞外酪蛋白水解蛋白酶的依賴而更顯重要(Mills和Thomes,1981，N.Zeal牛奶科技雜誌15:43-55)。此外，將奶蛋白裂解成胺基酸的酪蛋白水解酶，纖溶酶的存在增強了細菌在牛奶中生長的能力。
牛奶中含有纖溶酶原，其一般無蛋白水解活性，但通過纖溶酶原激活物的作用可轉變為有蛋白水解活性的纖溶酶。已證實鏈球菌屬的致乳腺炎菌株，如乳房鏈球菌產生能將牛纖溶酶原轉變為纖溶酶的纖溶酶原激活物。該纖溶酶原激活物的活性導致奶蛋白的裂解而釋放自由胺基酸，這反過來又支持了細菌在乳腺中的生長。基於該觀察結果，提出誘導基於免疫的反應，如產生抗鏈球菌纖溶酶原激活物中和抗體的產生可用於保護動物免患乳腺炎。國際專利公開WO 93/14209，(在此引用僅供參考)證實了從乳房鏈球菌培養過濾物中對纖溶酶原激活物(這裡命名為「鏈激酶」)的純化，且進一步教導了基於這種來自鏈球菌纖溶酶原激活物的抗乳腺炎疫苗組合物。
具有編碼纖溶酶原激活物如來自鏈球菌的纖溶酶原激活物核苷酸序列的多核苷酸分子的分離將大大地促進抗乳腺炎疫苗的製備。
本發明提供了一種分離的包括編碼具有生物活性纖溶酶原激活蛋白(這裡命名為「PauA蛋白」，以前命名為「PA」或「鏈激酶」)核苷酸序列的多核苷酸分子。在優選的實施方案中，PauA蛋白是來自導致或有利於哺乳動物乳腺炎的細菌如鏈球菌。在更為優選的實施方案中，鏈球菌的種類為乳房鏈球菌或停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)。
在優選的實施方案中，本發明分離的多核苷酸分子包括這樣的核苷酸序列，其編碼具有與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中約胺基酸位置26(ILe)至約胺基酸位置286(Pro)的胺基酸序列相同的胺基酸序列。在非限制性實施方案中，這種多核苷酸分子分別包括從SEQ ID NO:1中約核苷酸位置195至約核苷酸位置977的多核苷酸分子或SEQ ID NO:3中從約核苷酸位置196至約核苷酸位置978的多核苷酸分子。
在更為優選的實施方案中，本發明分離的多核苷酸分子包括編碼以下胺基酸序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中從約胺基酸位置1(Met)至約胺基酸位置286(Pro)的胺基酸序列。在非限制性實施方案中，這種多核苷酸分子分別包括從SEQ ID NO:1中約核苷酸位置120至約核苷酸位置980的核苷酸序列或從SEQ ID NO:3中約核苷酸位置121至約核苷酸位置981。在進一步的非限制性實施方案中，本發明的多核苷酸分子分別包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
本發明進一步提供了編碼PauA蛋白與本發明多核苷酸分子基本上同源的多核苷酸分子。
本發明進一步提供了包括以下核苷酸序列的多核苷酸分子，該核苷酸序列編碼與本發明多核苷酸分子編碼的PauA蛋白基本上同源的多肽。
本發明進一步提供了這樣的多核苷酸分子，其由編碼PauA蛋白的肽段的核苷酸序列或編碼與本發明多肽基本上同源的肽段的核苷酸序列所組成。在具體但非限制性的實施方案中，本發明提供了由以下核苷酸序列所組成的多核苷酸分子，該核苷酸序列編碼由來自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4胺基酸的子序列所組成的肽段，其中的子序列選自約位置28至約位置286的胺基酸、約位置104至約286的胺基酸、約位置172至約位置286的胺基酸、約位置28至約位置170的胺基酸、約位置104至約位置170的胺基酸、約位置104至約208的胺基酸、約位置172至約位置208的胺基酸、位置約28至約位置103的胺基酸、約位置28至約位置208的胺基酸及約位置149至約位置286的胺基酸。
本發明進一步提供了包括以下核苷酸序列的多核苷酸分子，該核苷酸序列編碼包括的融合蛋白連接上載體或融合部分的本發明PauA蛋白、基本上同源的多肽或肽段。
本發明進一步提供了用作擴增技術中引物及不同疾病診斷探針的寡核苷酸分子。在非限制性實施方案中，本發明的寡核苷酸分子由SEQ ID NOS:13-27及其互補核苷酸序列所組成。在進一步非限制性的實施方案中，本發明的寡核苷酸分子包括SEQ ID NOS:13-27及其互補的核苷酸序列。
本發明進一步提供了且合物及用於重組表達本發明多核苷酸分子的方法，包括重組克隆載體及包括該多核苷酸分子的重組表達載體及以任何所述載體轉化的宿主細胞系。
本發明進一步提供了由本發明多核苷酸分子編碼的重組表達PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段或融合蛋白。
本發明進一步提供了本發明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段或融合蛋白的類似物及衍生物。
本發明進一步提供了用於保護哺乳動物種類成員免患乳腺炎的疫苗，其中包括能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎保護反應的免疫學上有效量的本發明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子及獸醫上可接受的載體。疫苗可任選包括佐劑或其它免疫調節成分。
在非限制性的實施方案中，本發明的疫苗是用於保護哺乳動物種類成員抵抗乳腺炎及任選可折磨哺乳動物的一種或更多種其它疾病或病理狀態的組合疫苗，該組合疫苗包括能在哺乳動物中誘導保護性應答的本發明免疫學有效量的第一種成分，包括PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子；免疫學有效量的第二種成分，包括能夠誘導抵抗能夠折磨哺乳動物的疾病或病理學狀態的抗原；以及獸醫上可接受的載體。
本發明進一步提供了製備用於保護哺乳動物種類成員免患乳腺炎疫苗的方法，包括將能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎保護性反應的本發明免疫學有效量的PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子與獸醫上可接受的載體組合。
本發明進一步提供了接種哺乳動物種類成員防止乳腺炎的方法，包括將本發明的疫苗施用到哺乳動物。
本發明進一步提供了特異性結合本發明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物或衍生物的抗體。
本發明進一步提供了疫苗試劑盒和診斷試劑盒。


圖1根據乳房鏈球菌C216株PauA蛋白的肽段設計的寡聚探針(SEQ IDNos:13-25)。
圖2培養於進一步含有牛纖溶酶原脫脂瓊脂糖平板上的以乳房鏈球菌95-140株PauA基因轉化的大腸桿菌DH5α分離株。清亮區源於纖溶酶原向纖溶酶的激活及隨後奶蛋白的降解。
圖3 pER318和pER319顯示克隆的pauA插入子，其兩側具有HexA和HexB基因。
圖4乳房鏈球菌c216菌株的雙向終止子序列，其相鄰於pauA基因的ORF，位於SEQ ID NO:1中的核苷酸978至1,088處。pauA ORF的終止密碼子下被劃線。
圖5經SDS-PAGE分離並以考馬斯亮藍染色的預誘導和誘導的全細胞沉澱物裂解樣品。1道=分子量標準(RAINBOW Kaleidoscope預染的標準，伯樂實驗室)；2道=預誘導的菌株Pz326(含有質粒pER326，具有信號序列)；3道=後誘導的菌株Pz326；4道=預誘導的菌株Pz328(含有質粒pER328，無信號序列)；5道=後誘導的菌株Pz328；6道=預誘導的菌株Pz330(含有質粒pER330，具有信號序列)；7道=後誘導的菌株P2330；8道=預誘導的菌株P2332(含有質粒pER332，無信號序列)；9=後預導的菌株Pz332；10道=從乳房鏈球菌95-140株純化的PauA蛋白。
圖6經SDS-PAGE分離並用Western印跡分析的預誘導和誘導的全細胞裂解沉澱物樣品。除了10道=乳房鏈球菌菌株95-140外，其餘各道與圖5相同。一級抗體為鼠單克隆抗體EC-3，且二級抗體為交聯到BCIP上的羊抗鼠抗體。
編碼纖溶酶原激活蛋白的多核苷分子本發明供了包括編碼有生物活性纖溶酶原激活蛋白(這裡命名為「PauA蛋白」，以前稱「PA」或「鏈激酶」)核苷酸序列的分離的多核苷酸分子。如這裡所使用的，術語「生物活性」指將哺乳動物纖溶酶原轉變為纖溶酶的能力。由本發明多核苷酸分子所編碼的PauA蛋白可以是與源自任何產生PauA蛋白有機體相同的PauA蛋白，但優選源自導致或有助於哺乳動物種類成員乳腺炎的細菌。在優選的實施方案中，鏈球菌屬細菌，更為優選的乳房鏈球菌或停乳鏈球菌能夠將牛纖溶酶原轉化為纖溶酶。
如這裡所使用的，術語「多核酸分子」、「編碼序列」、「多核苷酸序列」、「開放閱讀框(ORF)，」等意指DNA和RNA分子，其可以是單鏈或雙鏈，且當置於適當調節元件的控制下在合適的宿主細胞表達系統中可被轉錄和翻譯(DNA)，或翻譯(RNA)成相應的PauA蛋白或多肽，它們與PauA蛋白或前述的PauA蛋白或基本上同源的多肽、或融合蛋白或類似物的肽段基本同源。編碼序列的界線一般由存在於5』(氨基)末端的起始密碼子和3』(羧基)端的翻譯終止密碼子所決定。編碼序列可包括但不限於原核序列、cDNA序列、基因組DNA序列，及化學合成的DNA及RNA序列。如這裡所用的，術語「ORF」指編碼本發明的PauA蛋白、基上同源的多肽、肽段、融合蛋白或類似物所需的無任何中間終止密碼子的最少核苷酸序列。
推導的乳房鏈球菌C216和95-140株天然PauA蛋白的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。列於SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的每種推導胺基酸序列的起始25個胺基酸似乎代表由各自PauA基因所編碼的信號序列，該信號序列在細胞加工過程中被去除以產生分泌(成熟)的PauA蛋白。因此，在優選的實施方案中，本發明分離的多核苷酸分子包括編碼PauA蛋白的核苷酸序，該PauA蛋白包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中從約胺基酸位置26(ILe)至約胺基酸位置286(Pro)的胺基酸序列。
兩種不同多核苷酸(DNA)分子編碼序列的核苷酸(第一種編碼乳房鏈球菌C-216株的PauA蛋白，且第二種編碼乳房鏈球菌95-140株的PauA蛋白)分別列於SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:1核苷酸序列具有120-980核苷酸的ORF。SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有121-981核苷酸的ORF。考慮進去肽信號序列的去除，在本發明非限制性多核苷酸分子實施方案中分別包括SEQ ID NO:1中約195～977位置，或SEQ ID NO:3中約196～978位置的核苷酸序列。
在更為優選的實施方案中，本發明的多核苷酸分子包括編碼下面胺基酸序列的核苷酸序列，該胺基酸序列包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中約胺基酸位置1(Met)至約胺基酸位置286(Pro)的胺基酸序列。在進一步非限制性的實施方案中，本發明的多核苷酸分子分別包括SEQ ID NO:1中約核苷酸位置120至約核苷酸位置980的核苷酸序列，或SEQ ID NO:3中從約核苷酸位置121至約核苷酸位置981的核苷酸序列。在進一步非限制性的實施方案中，本發明的多核苷酸分子分別包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
本發明的多核苷酸分子可進一步包括位於這裡所列的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3兩側的核苷酸序列。
本發明進一步提供了分離的多核苷酸分子，其與編碼PauA蛋白本發明的多核苷酸分子基本同源。這裡稱多核苷酸分子所用的術語「基本上同源」指包括下面核苷酸序列的多核苷酸分子(a)與包括以下核苷酸序列的多核苷酸分子編碼相同PauA蛋白的核苷酸序列，即SEQ ID NO:1中核苷酸位置195至核苷酸位置977的核苷酸序列或SEQ ID NO:3中核苷酸位置196至核苷酸位置978的核苷酸序列，但基本同源的多核苷酸分子由於遺傳密碼子的簡併而包括核苷酸序列中一個或更多個沉默突變；和/或(b)與SEQ ID NO:1中核苷酸位置195至核苷酸位置977的核苷酸序列，或與SEQ ID NO:3中核苷酸位置196至核苷酸位置978的核苷酸序列至少有約70％，更為優選至少約80％且最優選至少約90％相同的核苷酸序列，且其在實現本發明中是有用的；和/或(C)與下列DAN分子在適當嚴格條件下雜交的核苷酸序列，該DNA分子包括與SEQ ID NO:1中核苷酸位置195至核苷酸位置977的核苷酸序列或SEQ ID NO:3中核苷酸位置196至核苷酸位置978核苷酸序列互補的核苷酸序列，即在0.5MNaHPO4、7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、1mMEDTA於65℃與濾膜結合的DNA雜交，並於42℃於0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(見Ausubel等(編)，1989，當前分子生物學方法，1卷，GreenPublishing Associates,Inc.,and John WileySons,Inc.,NewYork,atp.2.10.3)，用該核苷酸序列在實現本發明中是有用的。在優選的實施方案中，該基本上同源的多核苷酸分子在高度嚴格的條件下與下面的DNA分子雜交，此DNA分子包括互補於SEQ ID NO:1中核苷酸位置195至977的核苷酸序列或SEQ IDNO:3中核苷酸位置196至978的核苷酸序列的核苷酸序列，即在0.5MNaHPO4、7％SDS 1mMEDTA於65℃與濾膜結合的DNA雜交，並以0.1×SSC/0.1％SDS於68℃洗滌(Ausubel等，1989上述)，且該序列在實現本發明中是有用的。
如這裡所用的，多核苷酸分子「在實現本發明中是有用的」，其中的多核苷酸分子或者(a)編碼具有生物活性的多肽，即，可將哺乳動物的纖溶酶原轉變為纖溶酶；或(b)編碼免疫原性的多肽，即當施用至哺乳動物成員時能夠誘導抗乳腺炎的保護性反應；或(c)編碼當施用至哺乳動物種類成員時能夠誘導PauA蛋白特異性抗體產生的多肽；或(d)可以用作診斷試劑以通過檢測感染哺乳動物組織或體液樣品中病原體-特異性多核苷酸分子的存在而檢測致乳腺炎病原體如乳房鏈球菌對哺乳動物的感染。
本發明進一步提供了包括下面核苷酸序列的多核苷酸分子，該核苷酸序列編碼與本發明多核苷酸分子編碼的PauA蛋白基本上同源的多肽。
這裡對多肽所使用的術語「基本上同源」指包括下面胺基酸序列的多肽(a)與包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4約胺基酸位置26至約286胺基酸序列的PauA蛋白胺基酸序列有至少約50％，優選至少約70％，且最優選至少約80％的相同性，且在實現本發明中是有用的胺基酸序列；和/或(b)或者與包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白的胺基酸序列相同的胺基酸序列，但其中的一個或更多個胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基保守地替代(conservativelysubstituted)，其中的這種保守性替代導致在實現本發明中有用的多肽；和/或(c)或者與包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白胺基酸序列相同的胺基酸序列，但其中的一個或更多個胺基酸被不同的胺基酸殘基非保守地替代，其中的這種非保守性替代導致了在實現本發明中有用的多肽。
保守性胺基酸替代在本領域眾所周知，例如，本發明天然PauA蛋白的一個或更多個胺基酸殘基可用相似電荷、大小或極性的胺基酸殘基保守地替代，得到的多肽在實現本發明中仍然是有用的。進行這種替代的規則包括由Dayhof,M.D 1978，國立生物醫學研究基金會，華盛頓特區，5卷，增刊3及其它文獻，描述的規則。更為具體地說，保守性胺基酸的替代為那些一般發生於側鏈相關的一族胺基酸內的替代。遺傳編碼的胺基酸一般分為四組(1)酸性的=天冬氨酸，穀氨酸；(2)鹼性的=賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性的=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電極性的=甘氨酸，天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同歸為芳香胺基酸。在倒可特定組中一個或更多個替代，如，以異亮氨酸或纈氨酸替代亮氨酸，或以穀氨酸替代天冬氨酸，或從絲氨酸替代蘇氨酸，或任何其它胺基酸殘基以結構上相關的胺基酸殘基的替代一般對得到多肽的功能沒有顯著的影響。
如下表1中6.7部分中所總結的，當比較乳房鏈球菌C216株(SEQ IDNO:2)與95-140株(SEQ ID NO:4)PauA蛋白的推導的胺基酸序列時，觀察到幾種具體的非保守性胺基酸替代的實例。例如，乳房鏈球菌C216株PauA蛋白73位置的胺基酸為天冬氨酸(酸性)，而乳房鏈球菌95-140株的該胺基酸為天冬醯胺(中性，極性)。此外，乳房鏈球菌C216株PauA位置115和124處的胺基酸為穀氨醯胺(中性，極性)，而乳房鏈球菌95-140株該胺基酸為精氨酸(鹼性)。此外，乳房鏈球菌C216株PauA位置211處的胺基酸為亮氨酸(非極性)，而乳房鏈球菌95-140株的該胺基酸為精氨酸(鹼性)。此外，乳房鏈球菌C216株PauA位置242處的胺基酸為組氨酸(鹼性)，而乳房鏈球菌95-140株的該胺基酸為天冬氨酸(酸性)。
如這裡所使用的，多肽「在實施本發明中是有用的」，其中的多肽或者(a)是具有生物活性的，即可將哺乳動物纖溶酶原轉變為纖溶酶；或(b)是具有免疫原性的，即當施用到哺乳動物種類成員時能夠誘導抗乳腺炎的保護性反應；或(c)當施用至哺乳動物種類成員時能夠誘導抗-PauA蛋白特異性抗體的產生，其中的抗體作為診斷試劑是有用的；或(d)可用作診斷式劑以檢測由於感染致乳腺炎病原體如乳房鏈球菌或由於種痘本發明疫苗而存在於哺乳動物血液或血清樣品中的抗-PauA蛋白特異性抗體。
本發明進一步提供了由編碼PauA蛋白肽段或本發明基本上同源多肽的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子。如這裡所使用的，術語「肽段」指由PauA蛋白或本發明基本上同源多肽的胺基酸子序列所組成的多肽，其中的子序列長度短於全長PauA蛋白或基本上同源的多肽，且其在實現本發明中是與上面定義的多肽一樣有用。因此，當全長PauA蛋白或基本上同源的多肽代表具有「n」個胺基酸殘基時，其肽段將是任何短於全長PauA蛋白或基本上同源多肽的多肽，包括具有n-1個胺基酸殘基的多肽，其中的肽段在實現本發明中是有用的。本發明的肽段優選至少長約7-10個胺基酸殘基。在更為優選的實施方案中，該肽段包括代表PauA蛋白表位的胺基酸序列。
在具體但無限制的實施方案中，本發明提供了由以下核苷酸序列所組成的多核苷酸分子，該核苷酸序列編碼由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中下面胺基酸子序列所組成的肽段，包括約胺基酸位置28至約286、約104至286、約172至約286、約28至約170、約104至約170、約104至約208、約172至約208、約28至約103、約28至約208、及約149至約286的子序列。
當編碼的肽段包括一個以上PauA蛋白或其基本上同源多肽的子序列時，可對編碼該肽段的多核苷酸分子進行沒計從而使幾個子序列連到一起並使這些在天然PauA蛋白或基本上同源的多肽中以前不相鄰的子序列在肽段中彼此鄰近。與本發明全長PauA蛋白或基本上同源多肽相比具有一個或更多個內部胺基酸缺失的多肽按照此定義也被認為是肽段，且包括在本發明的範圍之內。此外，可對編碼本發明肽段的多核苷酸分子進行設計從而使包括由此編碼肽段的不同子序列與天然蛋白或基本同源的多肽相比以相互間不同的相對順序進行組織。在優選的實施方案中，該多核苷分子編碼一個或更多個本發明PauA蛋白或基本上同源多肽的子序列，其中的子序列代表一個或更多個能在哺乳動物種類成員中產生中和抗體的PauA蛋白或基本上同源多肽的表位區。本發明也打算包括編碼全長(n)PauA蛋白或其基本上同源多肽的多核苷酸分子，其中的胺基酸子序列相互間順序被重排。
本發明進一步提供了包括編碼融合到多肽載體或融合部分以形成融合蛋白的本發明PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的核苷酸序列的多核苷酸分子。本發明多核苷酸分子編碼的融合蛋白非限制性實例包括β-半乳糖苷酶融合體、trpE融合體、麥芽糖-結合蛋白融合體、穀胱苷肽-S-轉移酶(GST)融合體和多組氨酸融合體(載體區域)。在具體但非限制性的實施方案中，本發明提供了編碼融合到本發明肽段的GST的多核苷酸分子，其所述的肽段由下面SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的子序列所組成，包括約胺基酸位置28至286，約104至286，約172至286，約28至170，約104至170，約104至208，約172至208，約28至103，約28至208，約149至286的胺基酸序列。本領域已知的方法可用於構建具有編碼這些和其它融合蛋白核苷酸序列的多核苷酸分子。
除非另有說明，否則後面提及的「PauA多肽」意在包括本發明前述的PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段及融合蛋白。
本發明進一步提供了與本發明任何前述多核苷酸分子雜交，或與具有與本發明任何前述多核苷酸分子互補核苷酸序列的多核苷酸分子雜交的寡核苷酸分子。這種寡核苷酸分子優選至少長約10至15個核苷酸，但可延伸至SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3中任何子序列的長度，且在中等或高度嚴格條件下可與一種或更多種前述的多核苷酸分子雜交。對於更短的寡核苷酸分子，高度嚴格的條件實例包括以6×SSC/0.5％焦磷酸鈉，對於-14鹼基寡聚體在約37℃洗滌，對於-17鹼基寡聚體於約48℃洗滌，對於-20鹼基寡聚體於約55℃洗滌且對於-23鹼基寡聚體於約60℃洗滌。對於更長的寡核苷酸分子(即大於約100個核苷酸)，對於基本同源的多核苷酸分子，中等和高度嚴格的條件如上述。本領域眾所周知，根據所用的特定寡核苷酸分子，雜交條件可適當調整。
在優選的實施方案中，本發明的寡核苷酸分子在高度嚴格的條件下與由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3核苷酸序列所組成的多核苷酸分子雜交，或與由與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3核苷酸序列互補的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子雜交。
在非限制性的實施方案中，本發明的寡核苷酸分子由SEQ ID NOS:13-27及其互補的核苷酸序列所組成。在進一步非限制性的實施方案中，本發明的寡核苷酸分子包括SEQ ID NOS:13-27及其互補的核苷酸序列。
本發明的寡核苷酸分子可用於多種目的，包括，如在不同疾病診斷中用作擴增編碼PauA蛋白多核苷酸分子的引物，或編碼或用作基因調節中的反義分子。擴增可用於檢測感染動物組織或體液樣品中，如哺乳動物乳汁中編碼PauA蛋白的多核苷酸分子的存在。特異擴增產物的產生表示細菌感染的存在，而沒有擴增產物可表示沒有感染產生。
雖然本領域已知的其它擴增技術，如連接酶鏈式反應也可使用，但擴增可用適當設計的寡核苷酸分子結合標準的技術，如聚合酶鏈式反應技術(PCR)完成。例如，對於PCR，製備包括適當設計的引物、包括待擴增核苷酸序列的模板及適當的PCR酶和緩衝液的混合物並根據標準的方法進行以擴增特異PauA-相關的模板多核苷酸序列。
本發明多核苷酸分子及寡核苷酸分子的製備和操作屬本領域的技術範疇且可根據下面及其它地方描述的重組技術完成，包括Maniatis等.,1989，分子克隆，實驗指南，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel，等，1989，當前分子生物學方法，Green Publishing AssociatesWiley Inter Science，紐約；和Sambrook，等，1989，分子克隆，實驗指南，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，所有文獻在此引用僅供參考。進行PCR的方法在如下及其它文獻中已有描述，如，Innis等(編)，1995，PCR策略，學術出版公司，聖地牙哥；和Erlich(編)，1992，PCR技術，牛津大學出版社，紐約，在此引用僅供參考。
重組表達系統表達載體本發明進一步提供了包括本發明多核苷酸分子的重組克隆載體和重組表達載體。優選構建表達載體從而使該多核苷酸分子編碼序列(以下稱「PauA編碼序列」)與一個或更多個對PauA編碼序列轉錄和翻譯以產生多肽所必需的調節元件可操作地連接。
如本文所使用的，術語「調節元件」包括但不限於本領域已知的編碼可誘導和不可誘導啟動子、增強子、操縱子及其它元件的核苷酸序列，這些序列用於驅動和/或調節多核苷酸編碼序列的表達。同樣，如這裡所用的，PauA編碼序列也與一種或更多種調節元件「可操作地連接」，其中的調節元件有效地調節和使PauA編碼序列轉錄或其mRNA的翻譯或二者兼而有之。
已知有多種表達載體，優選那些含有對指導PauA編碼序列複製、轉錄和翻譯所必需的調節元件的那些表達載體，且它們可用於表達PauA編碼序列。表達載體包括含有用於轉化細菌或酵母PauA編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA和粘粒DNA表達載體；重組病毒表達載體，如含有用於轉染昆蟲細胞PauA編碼序列的杆狀病毒；和重組病毒表達載體，如含有用於轉染動物細胞PauA編碼序列的腺病毒或痘苗病毒，等。
可經加工而含有本發明PauA編碼序列的典型原核表達載體質粒包括pUC8、pUC9、pBR322及pBR329(伯樂實驗室，Richmond,CA)和pPL及pKK223(發碼西亞，Piscataway,NJ)，等其它質粒(among many ofhers)。
用於構建含有與適當調節元件可操作地連接的特定編碼序列的表達載體方法在本領域是眾所周知的，且這些方法可用於實現本發明。這些方法包括體外重組技術、合成技術及體內遺傳重組。見如上面Maniatis等；Ausubel等，1989；及Sambrook等，1989描述的技術。
這些載體的調節元件在它們的長度和特異性上可以不同。根據所用的宿主/載體系統，可使用任何數目合適的轉錄和翻譯元件。例如，當在哺乳動物細胞系統中克隆時，可使用從哺乳動物細胞基因組分離的啟動子，如，小鼠金屬硫蛋白啟動子，或從這些細胞中生長的病毒中分離的啟動子，如，痘苗病毒7.5K啟動子或Moloney鼠肉瘤病毒長末端重複序列。通過重組DNA或合成技術而獲得的啟動子也可用於提供插入序列的轉錄。此外，當特定誘導物存在時，如對於金屬硫蛋白，鋅和鎘存在時，某些啟動子的表達可被提高。
轉錄調節區或啟動子的無限制實例包括，對於細菌的β-gal啟動子、T7啟動子、TAC啟動子、入左右啟動子(入left and right promoters)trp和lac啟動子、trp-lac融合啟動子等；對於酵母的糖酵解酶啟動子，如ADH-Ⅰ和-Ⅱ啟動子、GPK啟動子、PGI啟動子、TRP啟動子等；對於哺乳動物細胞的SV40早期及晚期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子等。
插入PauA編碼序列足夠翻譯也需要特定的起始信號。這些信號一般包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。當整個PauA基因，包括其自身的起始密碼子和相鄰序列，插入到適當的表達載體時，無須額外的翻譯控制信號。然而，當僅有部分編碼序列插入時，外源性翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子可能是需要的。這些外源性翻譯控制信號和起始密碼子可獲自多種天然和合成的來源。此外，起始密碼子必須與PauA編碼序列的閱讀框一致以確保整個插入子的框內翻譯。
融合蛋白表達載體可用於表達包括融合到載體或融合部分的PauA蛋白、基本上同源的多肽或肽段的融合蛋白。純化的融合蛋白可用於，如，產生抗PauA蛋白的抗血清而用作診斷試劑以研究PauA蛋白的生化特性，將PauA融合蛋白加成不同的生物活性，或幫助鑑定或純化表達的PauA蛋白。可能的融合蛋白表達載體包括但不限於編碼β-半乳糖苷酶和trpE融合、麥芽糖結合蛋白融合、穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合及多組氨酸融合(載體區域)的載體插入序列。GST-肽段融合的具體實例已在上面5.1部分中描述過，且本發明提供包括具有編碼每種這些融合核苷酸序列的多核苷酸序列。本領域已知的方法可用於構建編碼這種PauA融合蛋白的表達載體。
可將PauA融合蛋白加工成包括對於純化有用的區域。例如，PauA-麥芽糖-結合的蛋白融合體可用直鏈澱粉樹脂純化；PauA-GST融合蛋白可用穀胱甘肽-瓊脂糖小珠加以純化；且PauA-多組氨酸融合可用二價的鎳樹脂純化。或者，抗載體蛋白或肽的抗體可用於親和層析純化融合蛋白。例如，編碼單克隆抗體靶表位(target epitope)的核苷酸序列可加工成與調節元件可操作連接的表達載體並被定位從而使表達的表位融合到融合蛋白的PauA部分上。例如，編碼FLAGTM表位標記(tag)(國際生物技術公司)的核苷酸序列(一種親水標記肽)可通過標準的技術插入到表達載體中相應於PauA部分氨基或羧基末端的位點。然後可用商業上可得到的抗-FLAGTM抗體檢測和親和純化表達的PauA-FLAGTM表位融合產物。
表達載體也可被加工成含有多接頭序列，該多接頭序列編碼特異的蛋白酶切割位點從而使表達的PauA部分可通過用特異蛋白酶的處理而從載體區域或融合部分釋放出來。例如，融合蛋白載體可包括編碼凝血酶或因子Xa的切割位點的DNA序列等。
PauA編碼序列上遊及閱讀框內的信號序列可用已知方法被加工人表達載體以指導表達蛋白的運輸和分泌。信號序列無限制的實例包括那些來自α-因子、免疫球蛋白、外膜蛋白、青黴素酶、T-細胞受體、以及來自PauA蛋白本身的信號序列等。
為了便於篩選從本發明表達載體轉化或轉染的宿主細胞，可將表達載體加工成進一步包括報告基因或其它可選擇標記的編碼序列。這種編碼序列優選與上述調節元件編碼序列可操作地連接。在實現本發明中有用的報告基因在本領域中已眾所周知且包括那些編碼氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、綠色螢光蛋白、熒火蟲螢光素酶及人類生長激素等的基因。編碼可選擇標記的核苷酸序列在本領域眾所周知，並且包括那些編碼賦予對抗生毒或抗代謝物抗性的核苷酸序列或提供營養缺陷需求的核苷酸序列。這種序列的實例包括那些編碼胸苷激酶活性或對氨甲蝶呤、氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或Zeocin等具有抗性的核苷酸序列。
宿主細胞的轉化本發明進一步提供了以本發明重組克隆或表達載體轉化的宿主細胞及其衍生的細胞系。在實現本發明中有用的宿主細胞可或者為原核的或者為真核的。這種轉化的宿主細胞包括但不限於微生物，如以重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌，或從重組表達載體轉化的酵母；或動物細胞，如以重組病毒表達載體，如杆狀病毒轉染的昆蟲細胞，或以重組病毒表達載體，如腺病毒或痘苗病毒轉染的哺乳動物細胞等。
細菌一般優選作為宿主細胞。一般可用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株，可獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC),Rockville,MD，美國(許可號31343)或商業來源(Stratagene)，或TAP56或LW14株(大腸桿菌Pfizer室內(in-house)株)。雖然也可有效地利用來自如小鼠、倉鼠、牛、猴、或人成纖維細胞系的哺乳動物細胞，但優選的真核宿主細胞包括酵母細胞。可用於表達本發明重組PauA多肽的真核宿主細胞實例包括中國倉鼠卵母細胞(CHO)(如，ATCC許可號CCL61)及NIH SWiss小鼠胚胎細胞NIH/3T3(如.ATCC許可號CRL 1658)。
本發明的重組載體優選轉化或轉染進入基本上均一細胞培養物的一種或更多種宿主細胞中。載體一般根據已知的技術導入宿主細胞，如通過磷酸鈣沉澱、氯化鈣處理、顯微注射、電穿孔、以重組病毒接觸的轉染、脂質體介導的轉染、DEAE-葡聚糖轉染、轉導、接合、或微粒轟擊。轉化子的篩選可通過標準方法進行，如通過篩選表達可選擇標記的細胞，如與重組載體有關的抗生素抗性。
一旦本發明的重組載體導入到宿主細胞內時，可通過標準的技術，如通過Southern雜交分析、限制性酶分析、PCR分析，包括反轉錄酶PCR(rt-PCR)，或通過免疫學分析來確證PauA編碼序列在宿主細胞基因組中或附加的整合和維持以檢測預期的多肽產物。含有和/或表達重組PauA編碼序列的宿主細胞可通過至少4種普通方法中任何一種加以鑑定，這些方法在本領域中眾所周知，包括(ⅰ)DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-反義RNA雜交；(ⅱ)檢測「標記」基因功能的存在；(ⅲ)評估通過在宿主細胞中表達PauA-特異性mRNA轉錄本而測得的轉錄水平；和(ⅳ)通過如免疫分析或PauA生物活性的存在(即將適當的哺乳動物纖溶酶原轉變為纖溶酶)檢測成熟PauA多肽產物的存在。
在非限制性的實例中，重組表達PauA多肽的生物活性可用，如，國際專利公開WO 93/14209中描述的瓊脂糖/去脂奶粉重疊分析(overlay assay)通過檢測牛纖溶酶原至纖溶酶的轉換加以檢測。簡言之，將待測PauA生物活性的製品稀釋到合適的濃度，如，1μg蛋白/ml磷酸緩衝鹽(PBS)(PH7.4)，並加入到切成瓊脂糖(1％w/v在PBS)片的小孔(a well cut into a sheet of agarose)中，其中的瓊脂糖含有OxordTM脫脂牛奶(1％w/v；Uniparn Ltd.,Hampshire,England)和牛纖溶酶原(10-3單位/ml)(Sigma)。通過觀察脫脂牛奶層中清亮區的形成檢測有生物活性PauA多肽的存在，清亮區形成表示牛纖溶酶原轉變為纖溶酶後牛奶蛋白的降解。或者，可使用在下面7.3部分中描述的顯色分析。
重組多肽的表達和特徵描述一旦PauA編碼序列被穩定地導入適當的宿主細胞時，將轉化的宿主細胞克隆擴增，並將得到的細胞在有利於PauA多肽最大產量的條件下培養。這種條件一般包括培養細胞至高密度。當需要誘導表達時，只要表達載體包括可誘導的啟動子，可用適當的誘導條件，如溫度變遷、營養物耗竭、添加義務誘導物(如碳水化合物類似物，例如異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG))、過量代謝副產物的積累等。
收穫和裂解其中含有表達PauA多肽的宿主細胞，並在本領域已知的提取條件下，如4℃或蛋白酶抑制劑存在下或兩者條件下從裂解物中分離和純化產物以最大限度地降低蛋白降解。只要表達的PauA多肽從宿主細胞中分泌，僅可收集耗竭營養物的培養基並從其中分離產物。
用標準方法可適當地從細胞裂解物或培養基中基本上純化或分離表達的PauA多肽，包括但不限於下面方法的任何組合硫酸銨沉澱、大小分離、離子交換層析、HPLC、密度離心及吸附層析。只要表達的PauA多肽顯示出生物學活性，即激活纖溶酶原的能力，可用分析方法，如上述的瓊脂糖/脫脂牛奶重疊分析，或下面7.3部分中所述的顯色分析或通過任何其它檢測纖溶酶原激活的相關分析在純化方法中的每一步監測該製品逐漸增加的純度。如果表達的多肽缺乏生物學活性，可根據，如大小，或與PauA多肽其它特異性抗體的反應性或通過融合標記的存在而對其進行檢測。
因此，本發明進一步提供了在有利於PauA多肽產生的條件下用於製備PauA多肽及從細胞培養物中回收PauA多肽的方法，前者包括培養以重組表達載體轉化的宿主細胞，所述的重組表達載體包括含有編碼下面物質核苷酸序列的多核苷酸分子(a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中約從胺基酸位置26至約286的胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)與PauA蛋白基本同源的多肽；或(c)PauA蛋白或基本上同源多肽的肽段；或(d)包括PauA蛋白、基本上同源的多肽、或融合到融合部分肽段的融合蛋白，其中的多核甘酸分子與控制宿主細胞中多核苷酸分子表達的一種或更多種調節元件可操作地連接。
一旦獲得足夠純度的PauA多肽，其可通過標準的方法加以特徵描述，包括SDS-PAGE、大小排阻層析、胺基酸序列分析、將纖溶酶原轉換為纖溶酶的生物活性等。PauA多肽的胺基酸序列可用標準的肽測序技術加以測定。PauA多肽可進一步用親水分析(見，如.，Hoop和Woods,1981，美國自然科學院院刊78:3824)或類似的計算公式進行特徵描述以鑑定PauA多肽的疏水和親水區。可進行結構分析以鑑定PanA多肽恢復特異二級結構的區域。生物物理方法如X-射線晶體學(Engstrom,1974，生化實驗生物學11:7-13)，計算機模擬(Fletterick和Zoller(編)，1986，於當前分子生物學通訊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)和核磁共振(NMR)可用於作圖及對與PauA多肽和其底物相互作用的位點進行研究。從這些研究獲得的信息可用於設計更為有效的疫苗組合物、篩選僅包括PauA多肽特異部分的疫苗或設計或篩選可阻止天然PauA蛋白對纖溶酶原激活的治療或藥物化合物。
在實現本發明中有用的PauA多肽為(a)具有生物活性的多肽，即可將哺乳動物纖溶酶原轉變為纖溶酶；或(b)具有免疫原性的多肽，即當施用到哺乳動物種類成員時能夠誘導抗乳腺炎的保護性反應；或(c)當施用到哺乳動物種類成員時能夠誘導抗-PauA蛋白特異性抗體的產生的多肽，其中的抗體作為診斷試劑是有用的；或(d)可用作檢測哺乳動物血液或血清樣品中抗-PauA蛋白特異性抗體存在的診斷試劑的多肽，其中的哺乳動物被致-乳腺炎病原體如乳房鏈球菌感染或經本發明的疫苗種痘過而得到。這種多肽，一旦製備，可用本領域已知的常規篩選方法加以鑑定。例如，可用一種這裡描述的生物分析法測定將哺乳動物纖溶酶原轉變為纖溶酶的能力。誘導抗乳腺炎保護性免疫反應的能力可通過下面方法加以鑑定，包括施用PauA多肽至對鏈球菌如乳房鏈球菌所致的乳腺炎易感的哺乳動物種類成員，並測試PauA中和抗體的存在，或種痘動物抵抗隨後以致-乳腺炎病原體感染的能力。通過施用PauA多肽至模型動物，如小鼠、豬、綿羊、山羊、馬、牛等並用標準的技術測試動物的血清轉變可鑑定誘導產生特異性PauA蛋白抗體的能力。用PauA多肽作為診斷試劑的能力可通過以下方法加以測定，包括將每PauA多肽暴露於以前以致-乳腺炎病原體如乳房鏈球菌感染動物的血液或血清樣品中，或以前以本發明疫苗種痘動物的血液或血清樣品中，並用標準技術，如ELISA分析方法測定樣品中PauA蛋白特異性抗體與PauA多肽的結合。
在實現本發明中有用的具體而無限制的PauA多肽實例包括含有SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4中約胺基酸位置26至約286，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中約胺基酸位置1至約286胺基酸序列的蛋白。
在實現本發明中有用的具體而無限制的PauA肽段實例包括由SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4中下面的胺基酸子序列所組成的肽段，包括約28至286，約104至286，約172至286，約28至170，約104至170，約104至208，約172至208，約28至103，約28至208，約149至286的胺基酸。
在實現本發明中有用的具體而無限制的融合蛋白實例包括GST融合蛋白，其中包括融合到由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中下面的胺基酸子序列所組成的肽段上的GST，包括胺基酸位置約28至286，約104至286，約172至286，約28至170，約104至170，約104至208，約172至208，約28至103，約28至208和約49至286的胺基酸子序列。
本發明因此提供了基本上純化或分離的PauA蛋白、其基本上同源的多肽、這種PauA蛋白和基本上同源多肽的肽段，和包括所述的PanA蛋白、基本上同源的多肽或肽段(這裡統稱為「PauA多肽」)的融合蛋白。
PauA的類似物和衍生物本發明進一步提供了前述PauA多肽的類似物和衍生物，其中的這種類似物和衍生物在實現本發明中是有用的、其用途與上述定義的多肽相同。
可在基因水平或蛋白水平或這兩個水平上產生導致類似物產生的操作。在基因水平，如可通過一種或更多種已知的策略在體外修飾編碼PauA多肽的克隆DNA分子以編碼PauA蛋白類似物。這種修飾包括但不限於內切核酸酶消化，創造或毀壞翻譯、起始和/或終止序列，或在長編碼區域內創造變異或其任何組合的突變。見如上面的Maniafis，等，1989；上面的Ausubel等1989及上面的Sambrook等1989。可以使用本領域已知的用於誘變的任何技術，包括但不限於暴露於誘變劑如輻射或化學誘變劑或體外定點誘變(見如，Hutchinson等.,1978，生物化學雜誌253:6551)。
對PauA多肽的操作也可在蛋白水平完成。可用已知的技術完成一種或更多種蛋白的化學修飾，包括但不限於以下任何一種技術以相應的D-胺基酸、胺基酸類似物或胺基酸近似物(mimics)替代天然蛋白的一個或更多個L-胺基酸從而產生如Carbazates或tertiary centers；或特異的化學修飾，如以胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶或V8蛋白酶的蛋白水解切割，或以NaBH4或溴化氰處理或乙醯化、甲醯化、氧化或還原等。
可通過向其中交聯上一個或更多個化學基團而衍生出PauA多肽，這些化學基團包括但不限於乙醯基、二硫橋基團、糖基、脂、和磷酸和/或別的PauA多肽或其它蛋白，如血清蛋白、匙孔血藍蛋白或商業上激活的BSA或多胺基酸(如聚賴氨酸)或多糖(如瓊脂糖凝膠，瓊脂糖或修飾或未修飾的纖維素)等。這種交聯優選通過與多肽N-未端或C-末端和/或胺基酸側鏈共價連接。完成這種交聯反應的方法在蛋白化學領域眾所周知。
在完成本發明中有用的衍生物也包括那些其中的水溶性多聚體如聚乙二醇被交聯到PauA多肽或其類似物或其它衍生物上，因而提供額外所需特性而同時至少部分保留多肽免疫原性的衍生物種類。這些額外所需的特性包括如，增加的水溶液中的溶解性、增加的貯存中的穩定性，增加的對蛋白降解的抗性及增加的體內半壽期。適於交聯劑PauA多肽上的水溶性多聚體包括但不限於聚乙二醇同聚物、聚丙二醇同聚物，乙二醇與丙二醇的共聚物，其中所述的同聚物和共聚物在一末端以烷基，聚氧化乙烯醇(polyoxyethylated polyols)、聚乙烯醇、多糖、聚乙醚(Polyvinyl ethyl ethers)和α,β-聚[2-羥乙基]-DL-天冬醯胺(α,β-poly[2-hydroxyethyl]-DL-aspartamide]。聚乙二醇為特別優選。製備蛋白的水溶性多聚體共軛物方法在本領域是已知的並在下面文獻中有描述，包括美國專利3,788,948；美國專利3,960,830；美國專利4,002,531；美國專利4,055,635；美國專利4,179,337；美國專利4,261,973；美國專利4,412,989；美國專利4,414,147；美國專利4,415,665；美國專利4,609,546；美國專利4,732,863；美國專利4,745,180；歐洲專利(EP)152,847；EP98,110；和日本專利(JP)5,792,435,這些專利在此引用僅供參考。
在實現本發明中有用的類似物和衍生物可用上述用於PauA多肽的方法加以鑑定。
抗乳腺炎疫苗本發明進一步提供了用於保護哺乳動物種類成員抗乳腺炎的疫苗，其中包括免疫學有效量的(a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4約胺基酸位置26至286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)與PauA蛋白基本上同源的多肽；或(c)由PauA蛋白或基本上同源多肽的子序列所組成的肽段；或(d)包括PauA蛋白、基本上同源多肽或融合到融合部分肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白的類似物或衍生物；或(f)包括編碼PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、或類似物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應；和獸醫上可接受的載體。
在無限制的實施方案中，本發明的疫苗包括轉化的宿主細胞，其中含有本發明的表達載體或多核苷酸分子，該表達載體或多核苷酸分子在宿主細胞中表達從而在哺乳動物中產生能夠誘導抗乳腺炎保護性反應的本發明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白或類似物。該宿主細胞可以是本發明的表達載體或多核苷酸分子可以在其中表達的任何細胞且該細胞可以以疫苗形式施用到哺乳動物種類成員。在無限制的實施方案中，這種宿主細胞為大腸桿菌宿主細胞。
如這裡所使用的，術語「免疫學有效量」指免疫原的量，即當施用至哺乳動物時能夠誘導抗乳腺炎的保護性反應的本發明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子。
這裡廣泛使用的術語「能夠誘導保護性反應」包括在哺乳動物中誘導或增加任何基於免疫的對種痘的反應，包括用於保護種痘哺乳動物抵抗乳腺炎的抗體或細胞介導的免疫反應或這兩種反應。這裡使用的術語「保護性反應」和「保護」不限於絕對防止乳腺炎或絕對防止由致-乳腺炎病原體的感染，任意在包括與未種痘感染動物相比由病原體感染程度或速率的下降，或由病原體感染所致的疾病或任何症狀或病情嚴重性的任何下降，包括任何可檢測的牛奶產量的增加或任何可檢測到的防止或延緩牛奶產量的減少。
如這裡所使用的，術語「哺乳動物種類成員」和「哺乳動物」指可用本發明疫苗保護而免遭乳腺炎的任何哺乳動物種類或哺乳動物，包括牛種類(母牛和oxen)以及綿羊、豬、山羊、馬、狗及貓的成員。
本發明的疫苗組合物可根據已接受的習慣用標準的緩衝液、載體、穩定劑、稀釋劑、防腐劑和/或增溶劑配製且也可配製成利於緩釋的形式。稀釋劑可包括水、鹽、葡萄糖、乙醇、甘油等。用於等滲的添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖等。穩定劑包括鋁等。
佐劑可在疫苗中任選使用，其無限制的實例包括PIBI佐劑系統(RIbi公司)、明礬、氫氧化鋁凝膠、水中油(Oil-in water)乳劑如水中鯊烯(Squolene-in-water)，油中水(water-in-oil)乳劑如Freund's完全和不完全佐劑，Block共聚物(CytRx,Atlanta GA),SAF-M(Chiron Emeryville CA),AMPHIGENR佐劑，皂苷，其它純化或半純化的皂苷部分如QuilA(Superfos)或QS-21(劍橋生物技術公司，劍橋馬諸塞薩)，單磷脂A(monophosphoryllipid A)及Avridine脂胺佐劑。疫苗可進一步包括一種或更多種的其它免疫調節劑如白細胞介素、幹擾素、或其它已知細胞因子。
適當的獸醫上可接受的疫苗運載體(vehicle)載體(carriers)及添加劑是已知的，或將對本領域的技術人員是顯而易見的；見，雷明頓的藥物科學，第18版，1990,Mack出版社，在此引用僅供參考。該苗可以貯存於溶液中或凍幹貯存從而在施用前重新調置於無菌稀釋溶液中。
本發明進一步提供了用於免疫原緩釋的疫苗製品。這種緩釋製品的實例包括可與下列生物兼容的多聚體組合物結合使用的免疫原，如，聚(乳酸)、聚(乳-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid))、甲基纖維素、透明質酸、膠原蛋白等。藥物運輸載體中可降解多聚體的結構、篩選和使用已在幾種出版物中綜述過，包括A.Domb等.,1992，用於高技術的多聚體3:279-292，在此引用僅供參考。在M Chasin和R.Langer(編)，1990，「作為藥物運載系統的可生物降解多聚體』位於藥物和製藥科學，45卷，M.Dekker，紐約的文章中也可找到其它有關藥物製備中篩選和使用多聚體的指南，在此引用也僅供參考。作為選擇或另外，本發明疫苗的PauA多肽、類似物、衍生物或多核苷酸可進行微囊化以提高施用和效率。用於微囊化抗原的方法在本領域眾所周知，且包括下述的技術，如，美國專利3,137,631；美國專利3,959,457；美國專利4,205,060；美國專利4,606,940；美國專利4,744,933；美國專利5,132,117；和國際專利公開WO 95/28227，所有文獻在此引用僅供參考。
脂質體也可用於提供本發明任何PauA多肽、類似物、衍生物或多核苷酸分子的緩釋。關於如何製備和使用脂質體製劑的細節可發現於下面的文獻中，包括美國專利4,016,100；美國專利4,452,747；美國專利4,921,706；美國專利4,927,637；美國專利4,944,948；美國專利5,008,050；和美國專利5,009,956，所有文獻在此引用僅供參考。
在無限制的實施方案中，本發明的疫苗可以是用於保護哺乳動物種類成員抗能夠折磨哺乳動物的乳腺炎和任選一種或兩種以上其它疾病或病情的組合疫苗，其中的組合疫苗包括免疫學有效量的第一種成分，該成分包括a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中約胺基酸位置26至286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由Paua或基本上同源的多肽的子序列所組成的肽段；或(d)包括融合到融合部分的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、或融合蛋白的類似物或衍生物；或(f)包括編碼PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類以物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應；免疫學有效量的第二種成份，包括能夠誘導抗能夠折磨哺乳動物疾病或病情的保護性反應的抗原。
根據其誘導抗能夠折磨哺乳動物的乳腺炎、或其它疾病或病情，或抗本領域已知的能夠感染哺乳動物病原體保護性反應的能力篩選該組合疫苗第二種成份的抗原。已知任何在特定哺乳動物種類疫苗組合物中有用的免疫原性組合物可用於該組合疫苗的第二種成份。這些免疫原性的組合物包括但不限於那些提供抗下列病原體保護的種類，包括牛皰疹病毒(症狀，感染性牛鼻氣管炎(rhinotracheitis))、牛吸吸syncitial病毒、牛病毒性腹瀉病毒、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ、鉤端螺旋體屬、彎曲桿菌屬、葡萄球菌屬如金黃色葡萄球菌、鏈球菌屬如無乳鏈球菌或停乳鏈球菌、枝原體屬、克雷伯樂菌屬、沙門氏菌屬、輪犬病毒、冠形病毒、狂犬病、巴斯德氏菌屬、如溶血巴斯德氏菌或多殺巴斯德氏菌、梭菌屬、破傷風類毒素、大腸桿菌、Neospora spp.其它真核寄生蟲等。
包括第二種成分的抗原可任選共價連接到第一種成分的PauA多肽、類似物或衍生物上以製備嵌合分子或融合蛋白。在無限制的實施方案中，第2種成分的抗原包括半抗原，其免疫原性通過交聯到第一種成分的PauA多肽，類似物或衍生物上而有可檢測到的增強。
包括共價連接的組合疫苗的第一和第二種成分抗原的嵌合分子可用本領域已知的一種或更多種技術加以合成。例如，嵌合分子可用商業上可得到的肽合成使用標準的化學合成方法(見，如Merrfield,1985，科學232:341-347)合成製備。或者，按本領域已知的技術單獨合成分離的成分且然後通過化學交聯鍵將其交聯到一起。或者，嵌合分子可用重組DNA技術產生，其中，例如將包括編碼不同嵌合分子抗原核苷酸序列的分離的多核苷酸分子在閱讀框內拼接到一起並在合適的轉化宿主細胞中表達用於隨後嵌合分子的分離。當本發明的疫苗包括多核苷酸分子而不是多肽時，該拼接的多核苷酸分子可用於疫苗組合物中。完成該重組技術的有力指南在下列文獻中提供，包括上面Maniatis等1989；上面的Ausubel等，1989；上面的Sambrook等，1989；上面的Innis等，(編)1995；及上面的Erlich,1992。
如上所述，本發明的疫苗可包括含有本發明表達載體或多核苷酸分子的轉化宿主細胞，其中的表達載體或多核苷酸分子在宿主中表達以產生能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎保護性反應的本發明PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類似物。在進一步無限制的實施方案中，本發明的組合疫苗包括用作與任何除乳房鏈球菌所致乳腺炎以外疾病或病情相關病原體的宿主細胞，其中的疾病或病情可折磨哺乳動物，其中的宿主細胞進一步包括本發明的表達載體或多核苷酸分子，其中的表達載體或多核苷酸分子在宿主細胞中表達以製備本發明PauA蛋白，基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白或類似物，它們能在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應，且其中的宿主細胞用於誘導抗除乳房鏈球菌所致乳腺炎以外疾病或病情的保護性免疫反應。在無限制的實施方案中，這種宿主細胞選自鉤端螺旋體屬、彎曲桿菌屬、葡萄球菌屬如金黃色葡萄球菌、鏈球菌屬如無乳鏈球菌或停乳鏈球菌、支原體屬、克雷伯氏菌屬、沙門氏菌屬、巴斯德氏菌屬如溶血巴斯德氏菌或多殺巴斯德氏菌、梭菌屬、大腸桿菌、Neospora spp.及其它真核寄生蟲。
本發明進一步提供了製備用於保護哺乳動物種類成員抗乳腺炎疫苗的方法，包括將免疫有效量的下面的物質組合a)包括SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4約胺基酸位置26至286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白或基本上同源多肽子序列所組成的肽段；或(d)包括融合到融合部分的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白的類似物或衍生物；或(f)包括編碼PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、或類似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應，與獸醫上可接受的載體。
本發明進一步提供了種痘哺乳動物種類成員以抗乳腺炎的方法，包括施用本發明免疫學有效量的疫苗至哺乳動物。
施用於哺乳動物中免疫原的量依賴於下面的因素，如待種痘動物的種類、年齡、體重、健康及一般身體特徵、以及待施用的特定免疫原性的和疫苗組合物。每種參數最佳劑量的測定可根據如經驗性研究用常規方法完成。特別地關於本發明PauA多肽疫苗至牛種類成員的施用，施用的量將優選從約0.01μg至約100mg多肽，更為優選從約0.1μg至約10mg，且最優選從約1.0μg至約1mg。特別地關於本發明疫苗多核苷酸分子的向牛種類的施用，施用的量將優選從約0.05μg至約500mg多核苷酸，更為優選從約0.5μg至約50mg，且最優選從約5.0μg至約5mg。此外，疫苗的典型劑量體積將從約50μl至約50ml每劑量每隻動物。
也可根據上述因素篩選疫苗的攝入法。動物可在任何合適的時間接種，包括斷奶期或更年輕時期，或剛繁殖前或繁殖期，生產期，斷奶期，或乳腺炎感染第一次開始在牧群中的一個或多個成員中出現。補充施用或加強免疫可能是必須的以完成完全的保護。例如通過測定血清轉換或通過用中和分析測定是否完成充足的免疫保護方法在本領域是已知的。
本發明疫苗可通過任何下面合適的途徑施用，如口腔、鼻內、肌肉內、乳房內(intrammary)、淋巴結內、腹膜內、靜脈內、動脈內、皮下、直腸(rectal)或陰道施用，或幾種途徑結合施用。根據選擇的途徑技術人員將容易地製備疫苗組合物。
本發明進一步提供了用於種痘哺乳動物種類成員抵抗乳腺炎的疫苗試劑盒，包括含有免疫學有效量下面物質的第一隻容器(container):a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中約胺基酸位置26至約286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白或基本上同源多肽子序列所組成的肽段；或(d)包括融合到融合部分的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白的類似物或衍生物；或(f)包括編碼PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白或類似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應；和包括獸醫上可接受的載體或稀釋劑的第二種容器。
抗-PauA抗體的製備本發明提供了結合本發明PauA多肽、類似物或衍生物的多克隆及單克隆抗體。這種抗體可用作親和試劑，用它純化天然或重組PauA多肽；或用如ELISA或Western印跡分析檢測感染哺乳動物如組織切片或細胞、組織或體液樣品中PauA蛋白的存在；或在治療上用於中和感染動物中的天然PauA蛋白活性。
可產生抗本發明PauA多肽、類似物或衍生物中任何一種的抗體。根據已知的方法可用各種宿主動物，包括但不限於牛、馬、兔、山羊、綿羊及小鼠製備抗PauA蛋白特異性的抗體。各種佐劑，如列於上面5.4部分中的佐劑可用於增強抗體的產生。
多克隆抗體可獲自免疫動物並用標準技術測試抗-PauA多肽特異性。或者，用任何提供通過連續細胞系的培養而製備抗體分子的技術可製備PauA多肽的單克隆抗體。這些包括但不限於最初由Kohler和Milstein等所述的雜交瘤技術(自然，1975,256:495497)；人類B-細胞雜交瘤技術(Kosbor,等.,1983，今日免疫學4:72；Cote等，1983，美國自然科學院院刊80:2026-2030)；和EBV-雜交瘤技術(Cole等1985，單克隆抗體和癌症治療，Alan R.Liss.公司，77-96頁)。或者，所述用於製備單鏈抗體的技術(見，如美國專利4,946,778)可用於製備PauA多肽-特異性單鏈抗體。這些出版物在此引用僅供參考。
含有本發明PauA多肽、類似物或衍生物特異性結合位點的抗體片段也包括在本發明範圍內，並可用已知的技術產生。這種片段包括但不限於可通過胃蛋白酶消化完整的抗體分子而產生的F(ab』)2片段，和通過還原F(ab』)2片段二硫橋而產生的Fab片段。或者，可構建Fab表達文庫(Huse等1989，科學，246:1275-1271)從而使對具有PauA多肽、類似物或衍生物所需特異性的Fab片段進行快速鑑定。
用於製備單克隆抗體和抗體片段的技術在本領域眾所周知，且在其它地方有另外描述，包括在Harlow和Lane，1988，抗體實驗指南，冷泉港實驗室；和在J.w.Goding,1986，單克隆抗體原理和實踐，學術出版社，倫敦。所有上述出版物在此引用僅供參考。
反義寡核苷酸和核酶包括能夠結合、降解和/或抑制PauA mRNA翻譯的反義寡核苷酸的寡核苷酸、硫代磷酸及核酶也在本發明的範圍之內。
反義寡核苷酸，包括反義RNA分子和反義DNA分子，通過結合到靶mRNA和阻止蛋白翻譯而直接阻止mRNA的翻譯。例如，可通過磷酸二酯技術合成至少約15個鹼基並互補於編碼PauA多肽DNA序列特定區域的反義寡核苷酸。
核酶為能夠催化特異性RNA切割的酶促RNA分子。核酶作用的機制包括核酶分子與互補靶RNA的序列特異性雜交，然後發生核酸內裂解。特異而有效地催化PauA mRNA序列核酸內裂解的改造的錘頭狀基序核酶(Engineered hammerhead motifribozyme)分子也在本發明的範圍之內。
通過掃描靶分子中核酶的切割位點，包括下面的序列，GUA、GUU和GUC，可開始鑑定在任何潛在RNA靶子中的特異性核酶切割位點。一旦鑑定後，相應於含有切割位點靶基因區域的約15和20個之間的核糖核苷酸的短RNA序列可被評估用於預言結構特徵如可能導致寡核苷酸序列不可適宜的二級結構。也可用，如核酸酶保護分析通過測試其與互補寡核苷酸雜交的可行性而評價侯選靶子的可適宜性。
本發明的反義寡核苷酸和核酶均可用已知的方法加以製備。這些包括用於化學合成的技術如通過固相磷醯胺化學合成。或者，反義RNA分子可通過編碼該RNA分的DNA序列體外或體內的轉錄而產生。這種DNA序列可插入到各種載體中，其中插入有適當的RNA聚合酶啟動子如T7或sp6聚合酶啟動子。
可引入對本發明寡核苷酸的各種修飾作為增加細胞內穩定性和半壽期的手段。可能的修飾包括但不限於添加核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的側翼序列至該分子的5』和/或3』末端，或硫代磷酸或2』-0-甲基而不是磷酸二酯與寡核苷酸骨架連接。
診斷試劑盒本發明進一步提供了診斷試劑盒。在無限制的實施方案中，該診斷試劑盒包括第一種容器，其中含有特異性與天然PauA蛋白抗體結合的本發明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、類似物或衍生物；和第二種容器，其中包括抗-PauA-特異性抗體的二級抗體。二級抗體優選包括可檢測的標記。這種診斷試劑盒用於檢測目前，或以前已被產-PauA有機體如乳房鏈球菌感染或種痘過本發明疫苗後發生血清轉換的哺乳動物。
在進一步無限制的實施方案中，本發明的診斷試劑盒包括第一種容器，其中含有特異性結合天然PauA蛋白的本發明抗體(一組抗體)；和第二種容器，其中含有特異性結合天然PauA蛋白不同表位，或特異性結合一級抗體的二級抗體。該二級抗體優選包括可檢測到的標記。在進一步無限制的實施方案中，診斷試劑盒包括其中含有本發明多核苷酸分子或寡核苷酸分子的容器，這些分子用於特異性擴增病原體如乳房鏈球菌的編碼PauA蛋白的多核苷酸分子。這後兩種試劑盒用於檢測目前以產-PauA有機體如乳房鏈球菌感染的動物。
下面的實施例僅在說明但並不意在限制本發明的範圍。
實施例編碼PauA DNA分子的鑑定與克隆胺基酸序列分析用國際專利公開WO 93/14209中描述的技術從乳房鏈球菌C216株(LatNo.053196w)中純化PauA蛋白，即通過對無細胞培養濾液的硫酸銨沉澱，接著進行大小排阻層析，然後於16％的SDS-PAGE凝膠(Novex，聖地牙哥，加州)中分離，並電印跡至ProBlott(應用生物系統，Fosfer市，加州)用於N-末端Edman測序。將相應於PauA帶(ca.35KDa)的印跡區切下並於ABI494蛋白測序儀(應用生物系統)中進行胺基酸序列分析。對於內部測序，按上述將純化的PauA於16％的SDS-PAGE凝膠中分離並以修飾的銀染(Shevchenko，等1986，分析化學，68:850-858)染色。將PauA帶切下並以DTT還原凝膠薄片，以丙烯醯胺烷基化，並於50％乙腈(NH4HCO3中洗，且真空(invacuo)乾燥。將凝膠薄片以50μl體積中的0.1μg修飾胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)處理，並於37℃孵育過夜。胰蛋白酶切割的肽用下面方法提取兩次，包括在通過RP-HPLC於1×250mm VydacC18柱(Nest Group公司，Southboro,MA)中分離之前於150μl 60％乙腈/NH4HCO3中超聲處理。收集吸收在220nm的肽峰並在ABI 494蛋白測序儀上進行分析。獲得的胺基酸序列列為SEQ ID NOS:5-12。Pep-1(SEQ ID NO:5)和Pep-2(SEQ ID NO:6)在N-末端測序後獲得，而Pep-3至Pep-8(SEQ ID NOS:7-12)從純化PauA的胰蛋白酶酶切處理而獲得。
乳房鏈球菌染色體DNA的分離將乳房鏈球菌C216株和95-140株分別於100ml靜置腦心灌注培養基(BHI，Difco，底特律，MI)中於37℃孵育24小時且然後收穫(7,700xg,20分鐘)。溼細胞沉澱於-20℃貯存待用。將溼細胞沉澱重懸於5ml Tris-Hcl(10mM)/EDTA(1mM)(TE)中洗細胞，收穫(2,000xg,15分鐘)，且重懸於2mlTE中。將洗過的細胞於65℃熱處理20分鐘，於-20℃冰凍過夜，然後通過添加250U變溶菌素(Sigma)、100mg溶菌酶(Sigma)及50μgRNAseA(Sigma)並於37℃孵育105分鐘裂解。加入蛋白酶K(500μg)(Sigma)，且繼續孵育3小時後加入SDS至2％(w/v)的終濃度以完全裂解。將裂解的細胞再於37℃孵育30分鐘，以Tris-飽和的酚提取一次，且以酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)提取兩次。通過添加2.5體積的純乙醇和0.1體積3MNaAc,PH5.2，於-20℃孵育24小時，並離心(15,000xg,15分鐘，4℃)沉澱而沉澱染色體DNA。將DNA以70％的乙醇衝洗，乾燥，重懸於TE中，並通過260nm處的吸收而定量。
乳房鏈球菌PauA基因的部分克隆根據純化乳房鏈球菌PauA的胺基酸測序設計簡併寡核苷酸(圖1)。設計寡核苷酸RA9(SEQ ID NO:14)從而與編碼Pep-1(SEQ ID NO:5)胺基酸11-18的PauA基因部分雜交。設計寡核苷酸ER35(SEQ ID NO:15)和ER36(SEQ ID NO:16)從而與編碼內部Pep-5序列(SEQ ID NO:9)胺基酸13→5的PanA基因部分雜交，且它們的簡併水平不同。
對於PauA基因片段的PCR擴增，寡核苷酸RA9(SEQ ID NO:14)在50μl反應液中或者單獨使用或者與ER35(SEQ ID NO:15)或ER36(SEQ ID NO:16)結合使用，反應液中含1XPC2緩衝液(Ab Peptides，公司，聖路易斯，MO),200μM每種脫氧-NTP,100pMol每種引物，7.5U Klen Taq1(Ab Peptides)和0.15U克隆的Pfu(Stratagene,La Jolla,CA)熱穩定聚合酶。DNA模板為500ng乳房鏈球菌C216株或95-140株純化的染色體DNA。擴增按如下進行變性(94℃5分鐘)；30個循環的變性(95℃30秒)，退火(60℃1分鐘)和聚合(72℃2分鐘)；然後進行最後72℃7分鐘的延伸。
擴增的產物通過於2％(w/v)Nusieve GTG瓊脂糖凝膠(FMC生物產品，Rockland,ME)上的分離加以觀察。僅用RA9(SEQ ID NO:14)與乳房鏈球菌C-216株的DNA作為模板的反應導致特徵性640bp產物的擴增。當RA9(SEQ ID NO:4)與寡核苷酸ER35(SEQ ID NO:15)或ER36(SEQ ID NO:16)在用乳房鏈球菌C216或95-140株染色體DNA作為模板的PCR反應中聯合使用，一般擴增出640bp和560bp的產物。該數據表明簡併的寡核苷酸RA9(SEQ ID NO:14)能夠在PauA區域內結合，並且其結合位置位於Pep-5(SEQ ID NO:9)的C-末端側鏈、ER35(SEQ IDNO:15)和ER36(SEQ ID NO:16)的靶結合區域。
進一步分析從用乳房鏈球菌C216株DNA和RA9(SEQ ID NO:14)(640bp)，或RA9(SEQ ID NO:14)加ER35(SEQ ID NO:15)(640和560bp)反應得到的PCR產物。也對用引物對RA9/ER35(640和560bp)從乳房鏈球菌95-140株DNA擴增而得到的PCR反應產物進行分析以測定是否這些菌株的PauA區域相同。以適當的限制性核酸內切酶(KpnⅠ(RA9)或KpnⅠ加BamHⅠ(RA9/ER35))消化PCP產物後將來自乳房鏈球菌(C216株的640bp和560bp產物以及乳房鏈球菌95-140株的640bp產物分別克隆入PUC18。得到質粒的序列分析證實RA9(SEQ ID NO:14)的結合位點位於寡核苷酸ER35(SEQ ID NO:15)結合位點的3』末端(distal)(即Pep-5(SEQ ID NO:9)內部胺基酸13→5)。此外，擴增自乳房鏈球菌C216株和95-140株的640bp DNA片段內的360個核苷酸區域的比較表明這兩種菌株的部分PauA基因之間存在著很高(99.2％)的核苷酸一致性。序列核查表明了PauAORF內限制性核酸內切酶EcoRⅠ、HindⅢ、SpeⅠ和Sall位點的存在，繼而排除在構建質粒基因組文庫過程中使用這些酶，設計該文庫是為了獲得位於獨特限制性片段中的完整pauA區域。
質粒基團組文庫的構建和篩選10μg乳房鏈球菌c216株和95-140株的染色體DNA分別以限制性核酸內切酶BglⅡ於37℃消化8小時，以酚/氯仿(24∶1)提取，並於-20℃貯存。按供應商(New England Biolabs，Beverly,MA)建議通過以BamHⅠ消化和用小牛腸磷酸酶脫磷酸化而製備1μg質粒載體DNA(pUC18)。將線性、脫磷酸化的載體(0.5μg)連接到5μg Bg(Ⅱ-消化的染色體DNA上，並按供應商(Gibco BRL,Gaithersbug MD)的建議用於轉化大腸桿菌DH5α細胞(Max Efficiency)。
利用去脂奶粉平板分析以幫助檢測PauA的活性。為了在大腸桿菌中文庫篩選的目的，平板分析原料由補充以無脂肪幹奶粉(1％w/v；OxoidTM)、牛纖溶酶原(0.015U/ml；Sigma，目錄號.p-9156)和氨苄青黴素(100μg/ml；Sigma)的BHI瓊脂(Difco)所組成。文庫篩選也用進一步補充0.1mM IPTG以誘導乳糖pUC18啟動子的這些平板進行。此平板分析通過對照平板纖溶酶原的洩漏而允許區分非特異性蛋白酶活性與纖溶酶原依賴性PauA活性。該修改用於確證脫脂奶粉纖溶酶原依賴性的消除以用於經文庫篩選而獲得的推斷性陽性克隆。
篩選在上述脫脂奶粉平板上產生清亮區的轉化大腸桿菌DH5α株的分離子用於進一步分析。圖2顯示了以乳房鏈球菌95-140株DNA轉化的分離子的一個實例。篩選和克隆純化一個含有乳房鏈球菌c216株DNA的分離子和一個含有乳房鏈球菌95-140株DNA的分離子，並通過它們的單個菌落在無纖溶酶原脫脂奶粉平板上生長後失去產生清亮區的能力而證實其表達纖溶酶原依賴性PauA活性的能力。通過每種分離子在含氨苄青黴素(100μg/ml Luria)培養基(Difco)中的培養，然後通將未過濾的培養上清等份點樣至在有無0.015U/ml牛纖溶酶原存在時補充以脫脂牛奶(1％w/v)的Todd-Hewitt瓊脂(Becton-Dickinson和Co.,Cockeysrille,MD)上來確證纖溶酶原的依賴性。這些分離子命名為Pz318，其表達乳房鏈球菌c216株的PauA；和Pz319株，其表達乳房鏈球菌95-140-株的PauA；它們各自的質粒命名為pER318和pER319。
pauA編碼區的初步分析根據對相應於編碼乳房鏈球菌c216株基因部分的PIR-擴增的內部640bp DNA片段的核苷酸序列分析，通過PCR確證文庫篩選獲得質粒中插入子的一致性。這樣，pER318和pER319用作PCR中的模板，單獨用源自pauA的引物RA9(SEQ ID NO:14)或者與ER37(SEQ IDNO:17)或ER40(SEQ ID NO:19)結合使用。50μl反應混合物含有1×PC2緩衝液，200μm每種dNTP，100pMol每種引物，7.5UKlenTaql聚合酶和0.15U克隆的Pfu聚合酶。合成按如下進行變性(95℃5分鐘)；30輪循環變性(95℃30秒)，退火(60℃1分鐘)和聚合(72℃2分鐘)；然後進行最後的7分鐘延伸。所有反應成功地擴增出相應於預期640bp(以RA9擴增)、500bp(以RA9/ER37)和300bp(以RA9/ER40擴增)的擴增產物，其中的DNA片段由pauA基因的已知部分序列所預言。該數據有力地表明存在於pER318和pER319中的插入子能夠編碼有功能活性的pauA。
將質粒pER318和pER319於St.Paul,MN的高級遺傳分析中心進行自動DNA序列分析(ABI型377；應用生物系統)以更為完全地分別測定乳房鏈球菌c216株和95-140株pauA區域的結構。寡核苷酸ER40(SEQ ID NO:19)和ER42(SEQ ID NO:21)源自以前測定的部分pauA核苷酸序列，且用於該640bp區域外的測序。當結合640bp的部分基因序列時，此額外的測序導致全部pauA ORF以及克隆pauA基因兩側區域的初步序列測定。此外，載體特異性的M13正向和反向引物用於測定克隆的乳房鏈球菌DNA區域的終點(end points)。如圖3所示，這些序列分析表明編碼與肺炎鏈球菌HexA和HexB蛋白具有高度同源性的蛋白的基因存在於pER318和pER319中的克隆插入子中。從幾種原核到真核種屬，包括人類中，HexA和HexB蛋白與MutS和MutL同源物分別高度保守。HexA和HexB蛋白在肺炎鏈球菌的轉化和DNA複製過程中的錯配DNA修復中起作用。有趣的是，當在大腸桿菌中過份表達時，HexA賦予顯著的負面表型(Prud homme等，1991細菌學雜誌.173:7196-7203)，由此導致增加的自發突變率。
乳房鏈球菌pauA基因的特異的PCR擴增兩種pauAPCR-擴增的640bp區域的初步測序結果和用質粒pER318和pER319從該區域的向外測序結果用於設計直接從乳房鏈球菌染色體DNA特異性擴增完整pauA基因的寡核苷酸引物。該方法優選根據需要排除由於在大腸桿菌中克隆完整的pauA過程中產生的可能突變而導致測序錯誤的導入。這方面就大腸桿菌中已知其它完整鏈激酶的毒性而言尤為重要，如別的報導(Estrada，等.，1992，生物技術.10:1138-1142)和報導的當在大腸桿菌中表達時由HexA表現出的陰性顯性(negative dominamce)(突變體表型)(Prudhomme等，1991，上述)。
因此，位於完整pauA基因兩側的寡核苷酸ER4S(SEQ ID NO:24)和ER4(SEQID NO:25)用於特異性地擴增編碼乳房鏈球菌c216株和95-140株的1.18kb的區域。對每種菌株進行三份PCR擴增。反應混合物中含有200ng純化的染色體DNA,1×pc2緩衝液,200μm每種dNTP,100pMol引物ER45(SEQ ID NO:24),100pMol引物ER46(SEQ ID NO:25),和7.5UKlen Taq1和0.15U克隆的Pfu熱穩定聚合酶於100μl終樣品體積中。擴增按如下完成變性(94℃5分鐘)；30輪循環的變性(95℃30秒)、退火(50℃1分鐘)及聚合(72℃2分鐘)；然後通過72℃7分鐘的最後延伸以完成目標完整pauA基因區域的擴增。擴增後，收集三份樣品中每種相等的等份(70μl,2.8μg)，並在用DyeDeoxy終止反應於ABI自動DNA測序儀(Lark技術公司，休斯頓，TX)上進行直接序列分析前通過瓊脂糖凝膠電泳純化1.8kb的產物並以玻璃奶基質(Gene CleanTM,Bi0101,.Lafolla,CA)提取。合成寡核苷酸引物APl(SEQ ID NO:13)、ER37(SEQ ID NO:17)、ER39(SEQ ID NO:18)、ER40(SEQ ID NO:19)、ER41(SEQ ID NO:20)、ER42(SEQID NO:21)、ER43(SEQ ID NO:22)、ER45(SEQ ID NO:24)和ER46(SEQ ID NO:25)(圖1)用於測序從乳房鏈球菌C216株和95-140株擴增產物的兩條DNA鏈。來自乳房鏈球菌C216株的1.18kb區域的核苷酸序列列於SEQ ID NO:1中。來自乳房鏈球菌95-140株的1.18kb區域的核苷酸序列列於SEQ ID NO:3中。
pauAORF的分子分析乳房鏈球菌C216株的pauAORF從SEQ ID NO:1的核苷酸120延伸至980，其編碼列於SEQ ID NO:2中的推導的286個胺基酸的蛋白，其具有33,419道而頓的理論分子量。乳房鏈球菌95-140株的pauAORF從SEQ ID NO:3的核苷酸121延伸至981，其編碼列於SEQID NO:4中不同的推導的286個胺基酸的蛋白。根據N-末端序列分析，兩種胺基酸序列的胺基酸1-25似乎在天然pauA的成熟過程中被去除。與該觀察相一致的是該25胺基酸的肽(2,767Da)為疏水性的且帶正電，這正是信號序列的特徵(VonHeijm,1985，分子生物學雜誌.184:99-105)。推導的雙向轉錄終止子(圖4)位於相反的pauA和HexAORFs之間，在c216株序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸978-1,088。預言形成該基莖結構基礎的反向對稱區域從核苷酸1,015延伸至1,032且從核苷酸1,054延伸至1,071。此外，一種幾乎相同的推導的雙向轉錄終止子位於相反的pauA和HexAORFs之間，在95-140株序列(SEQ ID NO:3)的核苷酸979-1,089。預言形成此莖環結構基礎的反向對稱區域從核苷酸1,016延伸至1,033且從核苷酸1,055延伸至1,072。相應的mRNA中計算的用於這些莖環結構結合(association)的自由能約19千卡(Tinoco等.,1973,Nature New Biol.246:40-41)。
序列分析表明在乳房鏈球菌C216株和95-140株的1.18kb片段區域內具有高度的核苷酸一致性。該區域內核苷酸和編碼的胺基酸的差異總結於下表1中。
表1
a單鹼基插入/缺失存在於緊鄰pauA ATB起始密碼子的上遊。
b核苷酸變化為沉默性的或在推導的ORF內不存在。
實施例重組PauA在大腸桿菌中的表達表達質粒的構建設計寡核苷酸引物ER43(SEQ ID NO:22)和ER45(SEQ IDNO:24)(圖1)以特異性地擴增編碼乳房鏈球菌95-140株全長PauA蛋白的完整核苷酸序列。該序列也包括上面6.7部分中所述的自然推導的轉錄終止區，和HexA基因的小的3』部分(SEQ ID NO:3，核苷酸121-1,181)。此外，引物ER44(SEQ ID NO:23)和ER45(SEQ IDNO:24)用於特異性地擴增缺少推導編碼信號序列(胺基酸1-25)的PauA基因的5』截短部分。此截短的DNA片段含有從核苷酸196延伸至1,181的普通3』區域，但預編碼在大腸桿菌中表達後定位於細胞質的PauA蛋白。用200ng純化的乳房鏈球菌95-140株染色體DNA在100μ1反應液中進行3份PCR擴增。樣品也含有1×PC2緩衝液，200μM每種dNTP、100pMol每種引物，7.5UKlenTaql聚合酶和0.15U克隆的Pfu聚合酶。擴增條件如下變性(94℃5分鐘)；30輪變性(95℃30秒)，退火(50℃1分鐘)和聚合(72℃2分鐘)循環；接著進行72℃7分鐘的最後延伸。
以ER43(SEQ ID NO:22)加上ER45(SEQ ID NO:24)或ER44(SEQ ID NO:23)加ER45(SEQ ID NO:24)擴增後，通過合併7μl每種反應混合物以製備21μl的終體積而分別合併這三份樣品。合成的DNA片段於1％(W/V)瓊脂糖中分離並且純化1,001bp(ER44/ER45)和1,073bp(ER43/ER45)的產物(jetSorbTM,GenoMed,Research Triangle Park,NC)。以KpnⅠ和XbaⅠ消化純化的DNA後，將約0.3μg的片段連接到0.5μgKpnⅠ加上XbaⅠ限制性酶切脫磷酸化的pEA181載體DNA。通過Hanahan方法(1983，分子生物學雜誌)將重組質粒轉化入感受態的大腸桿菌TAP56細胞(Pfizer室內株)。細胞於30℃在1mlSOC培養基(GibcoBRL)中培養75分鐘。轉化子培養且維持於≤30℃以防止由於溫度敏感c1857阻遏物的失活所致的PL啟動子的誘導。保存用這種方式分離的兩種菌株用於重組PauA的表達。菌株Pz330帶有質粒pER330，由於以引物ER43/ER45的染色體DNA擴增，其表達全長pauA基因。Pz332株帶有質粒pER332，由於以引物ER44/ER45的擴增，其表達截短的(信號肽去除的)pauA基因。
作為其它的實例，將源自用引物ER43/ER45或ER44/ER45對乳房鏈球菌95-149株染色體DNA擴增的PCR產物與以PstⅠ加上XbaⅠ消化後的PUC191acZα肽進行框內的克隆。得到的質粒，命名為pER326和pER328，分別編碼全長和截短的(信號肽去除的)PauA，並導入大腸桿菌DH52以分別得到Pz326和Pz328株。
重組PauA(rPauA)的表達測試上面7.1部分中四種菌株表達全長重組PauA蛋(rPauA)(即具有信號序列)(Pz326,Pz330)，或信號序列被刪除的rPauA(Pz328,Pz332)。將每種菌株過夜起始培養物培養於搖瓶中，其中具有含氨苄青黴素(100mg/L)或卡那黴素(500mg/L)的Luria培養基，然後1∶10稀釋至新鮮培養基中。4-6小時的階段後，通過添加0.5mM的IPTG(Pz326、Pz328)或通過將溫度從30℃調至42℃(Pz330、Pz332)而誘導培養物。重組蛋白表達的誘導在收穫細胞前2小時進行。收集全細胞沉澱，重懸於Laemmli裂解緩衝液中，且通過SDS-PAGE和Western-印跡分析裂解物。乳房鏈球菌95-140株的細胞沉澱在BHI培養液中培養22小時後以同樣方式獲得且通過Western印跡分析而用於比較。
將預誘導和誘導的全細胞沉澱樣品於14％的聚丙烯醯胺凝膠中分離且或者以考馬斯亮藍染色(圖5)，或以產生的抗乳房鏈球菌C216株天然PauA的鼠單克隆抗體EC-3進行Western印跡(圖6)(詳見WO93/14209關於Mab EC-3)。雖然所示的實施不是最佳表達，在42℃誘導後，用轉化的大腸桿菌Pz330株和Pz332株分別獲得全長和信號序列去除rPanA的顯著產生。在Pz330株中檢測到少量的加工過的rPauA(圖6,7道)，表明乳房鏈球菌PauA的異源信號序列由大腸桿菌分泌器官識別和加工。然而，重組蛋白在Pz330中的表達誘導對細胞生長有害，表明全長rPauA的過度表達可幹擾在異源大腸桿菌宿主中的正常輸出過程。
rPauA的酶切活性用下述測定牛纖溶酶原激活的顯色分析測定rPauA的活性。分析上述大腸桿菌培養物(Pz326、Pz328、Pz330、Pz332)和乳房鏈球菌95-140株全細胞沉澱的等份。活性與在異源宿主中表達的重組蛋白相對量一致。獲得Pz332株的最大滴度(表2)。
表2
a在ELISA平板中第一種稀釋樣品的最佳濃度b按文中所述計算的滴度顯色分析如下進行。用於顯色分析的緩衝試劑由TT緩衝液(0.1％Tween 80,50mM Tris-HCl,pH8.0)，和NaT緩衝液(1.77M NaCl,52mMTris-HCl,pH7.0)所組成。這些緩衝液在室溫穩定且在使用前可貯存達一個月。通過在水中重新水化(rehydration)而製備尿激酶(Sigma目錄號.U-8627)工作貯備液並貯存於-70℃。冷凍工作貯備液的濃度為0.51U/ml，並且用TT緩衝液1∶10稀釋用於0.051U/ml的起始濃度。牛纖溶酶原(Sigma目錄號P-9156)以Super Q H2O)水化至1.5U/ml並貯存於-70℃。底物包括D-ILe-Phe-LysP-硝基醯基苯胺(Sigma目錄號I-6886)和D-Val-Leu-Lys P-硝基醯基苯胺(Sigma目錄號V-0882；Fluka目錄號94680,Fluka化學公司，Ronkonkoma，紐約)。通過在水中重新水化至1mg/ml製備這些底物的工作貯備液並貯存於-70℃。
按如下製備Immulon2分析平板(Dynatech實驗室等.，chantilly,VA)。將TT緩衝液(20μl)和牛纖溶酶原(20μl)預先分裝至Immulon 2平板上。在V-底(V-Bottom)平板(Dynatech實驗室，公司)中，加入TT緩衝液(50μl/孔)至B-H行。將培養基對照陽性對照和樣品加入A行。樣品、培養基對照和陽性對照加入雙重孔中。向適當的孔中或者加入100μl對照或100μl樣品，然後沿著平板進行系統稀釋，將最後一行丟棄50μl。將來自V-底平板每孔的10μl樣品轉移至含有預先分裝的TT緩衝液和牛纖溶酶原的相應Immulon2平板中。將平板蓋好，混合小孔並於37℃孵育2小時以允許牛纖溶酶原的激活。分析對照由尿激酶介導的牛纖溶酶原的激活所組成。
將底物(D-Val-Leu-Lys p-硝基醯基苯胺或D-Ile-Phe-Lys p-硝基醯基苯胺)溫暖至室溫。通過用NaT緩衝液稀釋貯備底物至400μg/ml(1∶2.5稀釋)而製備分析底物，且加入100μl/孔的該分析底物溶液並蓋好平板且混合。然後將平板於37℃孵育2分鐘。活性的PauA催化纖溶酶原至纖溶酶的轉化，這反過來從p-i硝基醯基苯胺中切下三肽，這從A405處檢測到。
用ELISA平板讀數器(分子設備公司.,Palo Alto,CA)以Soft MaxPRO 1.2.0版軟體(分子設備公司)讀數平板。混合分析平板樣品且在405nm測定光譜吸收。有效的測試表明A405處的陽性對照在1.30與1.50O.D之間。
為了估計滴度(排除稀釋因素)(ionverse of the dilution factor),將樣品稀釋系列用以對數刻度的稀釋度布點圖(using a scetter plotgraph of the dilutions in log scale)作圖。樣品穿越基於陽性對照的臨界值(cut-off value)的位點計為準確的滴度。為了測定斷點值，使用了50％的陽性對照(0.051U/ml)平均O.D。例如，如果一樣品0.007穿越臨界線，那麼其稀釋係數將為1/142.86，且其滴度將表示為142.86。此外，如果樣品在0.015處穿越臨界線，則其將具有1/66.67的稀釋係數且滴度將是66.67。
實施例PauA肽段的酶切和免疫學評估重組GST-PauA肽的表達設計寡核苷酸引物ER74(SEQ ID NO:26)和ER75(SEQ IDNO:27)以特異性地擴增編碼包括編碼PauA胺基酸27-286區域的PauA基因。此區域相應於成熟(分泌)PauA的胺基酸2-261。用250ng純化的乳房鏈球菌95-140染色體DNA於每100μl反應中進行2份PCR合成。樣品也含1×PC2緩衝液，200μm的每種dNTP，100pMol每種引物，7.5U KlenTaql聚合酶和0.15U克隆的Pfu聚合酶。擴增條件為變性(94℃,5分鐘)；30輪變性(95℃,30秒)，退火(60℃,30秒)和聚合(72℃,1分鐘)循環；接著進行72℃最後7分鐘的延伸。擴增後，合併兩個樣品，並純化815bp的片段(QiaQuickTM試劑盒，Qiagen,Santa Clarita,CA)以XhoⅠ和NotⅠ消化純化的DNA後，將此片段克隆入pGE5X-2或pGEX5X-3載體DNA(Phermacia生物技術公司，Piscataway,NJ)。得到的重組質粒，pER354和pER355分別含有編碼位於讀框外的(out of phase)具有表達載體N-末端編碼的穀胱甘肽S-轉移酶(GST)的乳房鏈球菌95-140 PauA的胺基酸27-286的區域。
修飾質粒pER354從刪除成熟PanA的COOH端區域同時也在與編碼GST序列載體的融合點恢復框架。通過用XmaⅠ和Agel(消化pER354而第一次在GST-PauA融合點修復框架而構建產生成熟或成熟PauAN-末端片段(即，羧基端刪除)的質粒從製備pER356。此質粒表達在翻譯上融合至編碼PanA胺基酸28-286的26KDaGST肽，且其產物稱為成熟PauA。通過進一步以SpeⅠ、NruⅠ或HindⅢ處理此質粒然後以NotⅠ消化而產生成熟PauA的COOH-端刪除。在以適於產生鈍端的Klenoo片段處理後，重新連接質粒以分別產生pER363,pER364和pER365。這些質粒分別表達融合到編碼PauA胺基酸28-103、28-170、和28-208的26KDa的GST肽，如表3所示。
進一步修飾質粒pER355以刪除PauA的NH2-或COOH-末端區。通過以SalⅠ單獨處理pER355，或以SmaⅠ加Nrul處理然後重新連接以恢復GST-PauA融合連接而產生N-末端刪除。得到的質粒pER358和pER359表達分別融合到編碼PauA胺基酸104-286和172-286上的GST肽。然後通過從NruⅠ或HindⅢ處理pER358接著以NotⅠ消化、Klenow處理且重新連接而製備代表內部PauA肽段的兩種質粒。這些重組質粒，pER366和pER367表達分別融合到編碼PauA胺基酸104-170和104-208上的GST肽。最後，通過從HindⅢ加上NotⅠ消化pER359，接著以Klenow處理且重新連接產生能夠表達融合至小PauA片(編碼PauA的胺基酸172-208)上GST的質粒。此質粒命名為pER368。該編碼的片段和表達為與GST融合蛋白的PauA-特異性肽估計分子量小結於表3。
表3
a菌株命名除在質粒數之前Pz代替pER外與質粒相同。
b胺基酸數目相應於顯示於SEQ ID NO:4中編碼PauA蛋白的胺基酸數目。
c列出融合蛋白PauA部分的分子量，GST約-26KDa。
除了由pER36編碼的外，所有的GST-PauA融合蛋白約在大腸桿菌內表達並按製造商建議(pharmacia)通過親和層析純化。由於由pER363編碼蛋白的表達導致在大腸桿菌中包涵體的形成，在以溶菌酶細胞裂解後純化這些蛋白的團聚物(aggregates)。添加10體積2×RIPA/TET(5∶4v/v)前將細胞於冰中孵育10分鐘。2×RIPA含有20mM Tris(PH7.4)、0.3M NaCl,2％脫氧膽酸鈉、和2％(V/V)Igepal CA-630。TET緩衝液含0.1M Tris(PH8.0)、50mM EDTA，和2％(V/V)TritonX-100。將懸浮的細胞混合物旋轉且於冰上孵育5分鐘。然後處理至懸液不再粘滯。離心(15,000kg,20分鐘)收穫包涵體，重懸於H2O中且貯存於-80℃。
通過蛋白水解切割製備PanA片段將約13ml 0.55mg/ml從乳房鏈球菌95-140株純化的天然PauA(LotNo.9700710A)於4℃在PH8.8的50mM Tris中透析。用YM10膜將存留物濃縮至-2.5ml且攪拌細胞。最終的蛋白濃度為2.64mg/ml。將該濃縮物以120U凝血酶(Bochringer Ingelheim)室溫處理3天，且將消化產物於-20℃冷凍。用Superdex 75柱(16/50)(Pharmacia)從2ml消化產物中完成對其中-16KDa片段的純化。根據SDS-PAGE分析收集和合併適當的餾份。最終蛋白濃度為2.5ml中的0.165mg/ml。N-末端測序表明該16KDa肽代表PauA的羧基端一半部分。獲得的序列(KRVEEPITHP)(SEQ ID NO:28)在乳房鏈球菌95-140株編碼PauA的賴氨酸149開始。因此，此獲得自蛋白水解的肽稱為PauA149-286。
PauA肽段的酶切活性將9種表3中描述的GST-PauA融合蛋白和上面8.2中描述的蛋白酶PauA片段(PauA149-286)與天然PauA用基本上在上面7.3部分中所述的顯色分析進行酶活性的比較。純化GST-PauA28-286融合蛋白的酶活性(滴度=3448)與天然PauA的酶活性(滴度=3256)類似，而剩下的PauA肽段缺乏酶活性。通過存在於純化蛋白製品中PauA特異性蛋白的量來劃分滴度(dividing the titer)計算PauA特異活性。當進行該校正時，天然PauA特異性活性為5.9顯色單位/μg且GST-PauA28-286的特異性活性為1.4。此數據表明重組生產的GST-PauA較純化的天然PauA活性相對較低，但其的確顯示出顯著的酶活性。
小鼠中免疫反應的特徵描述以PauA肽段免疫小鼠用於種痘的鼠模型用於評價按上述製備的PauA肽段的免疫原性。簡言之，且10隻雌性Balb/c小鼠(16-18g)組成的實驗組於0.21和42天免疫。於實驗的0.21、35和56天並獲取血液樣品。合併實驗組這些樣品的血清並進行如下分析，包括與固相天然純化PauA的ELISA反應性及天然PauA顯色活性的血清中和效應。
天然PauA和各種肽段的配製是位於水中(角)鯊烯乳劑運載體中，後者含有Quil A(Superfos)作為免疫刺激劑，其含量為對小鼠無毒性的水平。蛋白以100μl劑量中3-5μl進行配製並皮下施用。對照無-抗原疫苗由Dulbecco's PBS(DPBS；Gibco-BRL)所組成，其中含有載體/免疫刺激劑而無抗原成分。
PauA肽段的免疫原性對獲自上面免疫研究的各種鼠血清進行分析以測定是否產生PauA-特異性抗體，和測定產生抗體的性質。以蛋白酶PauA片段(PauA149-286)和每種GST-PauA融合蛋白免疫後用PauA-特異性Ig ELISA以測定血清的特異性。將100μl純化天然PauA(在國際專利公開WO93/14209中描述，且那裡命名為「鏈激酶」)(PBS中1.8mg/ml)加入ImmulonⅡ平板(Dynatech)上的每孔中並於4℃孵育過夜。將平板內含物傾空(decanted)並將平板吸乾(blotled dry)。通過向每孔中加入PBS中(1％PVA/PBS)的250μl 1％聚(乙烯醇)(87-89％水解；Aldrich化學公司.,Milwaukee,WI)而封閉平板，並於37℃孵育1小時。再次將平板傾空並吸乾。
將實驗血清於1％PVA/PBS中以1∶100稀釋，然後在樣品孔中置100μl進行3倍系列稀釋。陽性對照為PauA-特異性單克隆抗體，EC-3，其中的抗體用固定的蛋白G親和純化過。將此單克隆抗體於1％PVA/PBS中稀釋至2μg/ml，然後將100μl加入到適當的孔中。陰性對照由在1％PVA/PBS中以1∶100稀釋的合併預先種痘小鼠血清所組成。
加入實驗和對照樣品後，將平板輕輕以混合，然後置於37℃1小時。樣品孔以0.05％Tween 20/PBS用自動微板洗板機(EL403型；Bro-TEK儀器公司，Winooski,VT)洗5次。通過添加100μl在1％PVA/PBS中1∶10,000稀釋的交聯單抗鼠Ig(H孔L，鏈，1.0mg/ml,Kirkegaard和Perry實驗室，Gaithersburg,MD)檢測結合的抗體。輕輕敲打平板以混合，於37℃置1小時，並按前述洗板。在室溫顯色15分鐘之前加入100μlABTS(KirkegaardPerry)至平板。用Thermo Max平板讀數器(分子設備公司)和SoftMaxPro1.2版程序(分子設備公司)於405-490nm處對平板進行讀數。去除陽性對照OD405-490 50％稀釋因素計算IgGELISA滴度。
如表4中所示，以每種這9種GST-PauA融合蛋白對小鼠的免疫導致產生PauA-特異性的免疫球蛋白G。以GST-PauA28-286、GST-PauA104-286、或GST-PauA28-170的免疫誘導與天然PauA誘導相當或較之更大的IgGELISA。與重組PauA肽段相比蛋白酶來源的肽、PauA149-286產生相對低的滴度。第三次免疫後，該肽段誘導相當於其最類似校正肽(comparator pepfide)，即GST-PauA172-286約1/10的PauA-特異性滴度。雖然該特定的肽(PauA149-286)誘導低的IgG反應，但預期天然PauA的其它片段將能夠誘導與重組肽顯示的相當的免疫反應。
血清中和活性將來自上面免疫的血清進一步分析以檢測它們是否含有能夠阻止由PauA所致牛纖溶酶原至纖溶酶轉換的抗體。通過在含10％胎牛血清的TEA緩衝液中(TEA/FBS；Novatech公司，Grand Island,NE)對血清樣品進行1∶50的稀釋而完成血清中和反應分析。1升TEA緩衝液由3.34g Tris鹼、3.54g Tris HCl,5.8g NaCl,1.1g EDTA(水合四鈉)、42.2g(L)-鹽酸精氨酸和1.0mlTween80所組成。將緩衝液PH調至8.0，然後於室溫中貯存備用。中和分析使用前將FBS加入到TEA緩衝液中。然後在V-底平板(Dynatech)中以TEA/FBS將TEA/FBS中的血清樣品進行兩倍的系列稀釋。然後將25μl的測試樣品轉移至ImmulonⅡ平板(Dynafech)。將從乳房鏈球菌分離的純化天然PauA(lotNo.9700710A)用TEA緩衝液稀釋至76μg/ml，然後將25μl加入到含有預先分裝有血清的每孔中。將平板緩慢敲打以混勻並於37℃放置1小時。陽性對照為血清陽性中的凍幹IgG部分。將此IgG部分重新水合至3.8mg/ml，於TEA/FBS中進行1∶50稀釋，且轉移至ImmulonⅡ平板。將25μl陽性對照和25μl於TEA/FBS中1∶50稀釋的FBS分裝至適當的孔中。
通過添加底物檢測PauA活性的中和反應。通過以2∶3∶1的比例混合纖溶酶原(1U/ml；P-9156，Sigma)、chomozym(1mg/ml；寶靈曼，Indianapolis,IN)，和TEA緩衝液製備底物，將150μl該底物加入每個樣品孔，輕輕敲打平板以混合且然後於37℃孵育90分鐘。用Thermo Max平板讀數器和Soft Max PRO1.2版電腦程式於405/490nm處對平板讀數。以相當於50％陰性對照稀釋度的倒數計算滴度。
中和反應分析表明幾種肽段均能夠誘導針對天然PauA的中和反應。以重組蛋白GST-PauA28-286、GST-PauA104-286、GST-PauA28-170、或GST-PauA28-208注射小鼠後獲得的血清與以天然PauA注射小鼠而獲得的血清顯示出類似的中和滴度。因此，當注射至小鼠時，這些肽段誘導能夠幹擾純化天然PauA酶活性的抗體的產生。
表4
a數據根據三個不同的研究總結出來且根據研究分組。
兩種對照包括在每個實驗中且列於表底部。
上面引用的所有的專利、專利申請及公開在此引用以其全文作為參考。
本發明範圍不受所述具體實施方案限制，這些方案試圖單獨說明本發明的單個方面。功能上相當的組合物和方法也在本發明的範圍當中。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人ROSEY,EVERETTL.
YANCEY Jr.,ROBERT J.
LEIGH,JAMES A.(ⅱ)發明題目編碼纖溶酶原激活蛋白的DNA(ⅲ)序列數目28(ⅳ)通訊地址(A)地址PFIZER INC(B)街道第42街道東235(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家美國(F)郵編10017(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release＃1.0,1.25版(ⅵ)當前申請數據(A)申請號待指定(B)提交日期(C)分類(ⅷ)律師/代理信息(A)姓名KOLLER,,ALAN L.
(B)註冊號37,371(C)參考/證書號PC9836(ⅸ)通訊信息(A)電話212-573-2118
(B)傳真212-309-4801(2)SEQID NO:1信息(ⅰ)序列特徵(A)長度1180鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特徵(A)名字/關鍵CDS(B)位置120..980(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NOL:1:GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATATCTACTT CAATTTGTTC TAAAATGAAA 60TTATATTCAC TGCTGTTACA TAACTTTGTG ATTATTTAGG ATAAAATAAG GGAGATTTT 119ATG AAA AAA TGG TTT TTA ATA TTA ATG CTT TTG GGA ATA TTT GGT TGT 167Met Lys Lys Trp Phe Leu Ile Leu Met Leu Leu Gly Ile Phe Gly Cys1 5 10 15GCT ACT CAA CCA TCA AAG GTT GCA GCA ATA ACC GGT TAT GAT TCC GAC 215Ala Thr Gln Pro Ser Lys Val Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Asp Ser Asp20 25 30TAC TAC GCT AGA TAT ATT GAT CCC GAT GAA AAT AAA ATA ACA TTT GCC 263Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala35 40 45ATA AAT GTT GAT GGT TTT GTC GAA GGT AGT AAT CAA GAA ATC CTT ATT 311Ile Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile50 55 60AGA GGA ATT CAT CAT GTT TTA ACA GAT CAA AAC CAA AAG ATT GTT ACA 359Arg Gly Ile His His Val Leu Thr Asp Gln Asn Gln Lys Ile Val Thr65 70 75 80AAG GCC GAG TTG TTA GAC GCT ATT AGA CAT CAA ATG GTT CTT CTA CAA 407Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg His Gln Met Val Leu Leu Gln85 90 95TTG GAT TAT TCC TAT GAA CTA GTC GAC TTT GCG CCT GAT GCA CAA TTA 455Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gln Leu100 105 110TTA ACA CAA GAT CGA CGG CTT TTA TTT GCC AAT CAA AAT TTT GAG GAA503Leu Thr Gln Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gln Asn Phe Glu Glu115 120 125TCC GTA TCA CTT GAA GAT ACT ATT CAA GAA TAC CTT TTA AAA GGG CAT551Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr Ile Gln Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His130 135 140GTT ATT CTC AGA AAA CGG GTT GAA GAA CCT ATC ACT CAT CCT ACT GAG599Val Ile Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro Thr Glu145 150 155 160ACT GCT AAT ATT GAG TAT AAA GTT CAA TTC GCG ACT AAA GAT GGG GAA647Thr Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Val Gln Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu165 170 175TTC CAC CCA CTA CCT ATT TTT GTA GAC TAC GGA GAA AAA CAT ATT GGA695Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His Ile Gly180 185 190GAA AAA TTA ACC TCT GAC GAG TTT CGA AAA ATT GCA GAA GAA AAG CTT743Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys Ile Ala Glu Glu Lys Leu195 200 205TTG CAA CTC TAC CCT GAC TAT ATG ATT GAT CAA AAA GAA TAT ACT ATC791Leu Gln Leu Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr Ile210 215 220ATT AAA CAC AAT TCT CTT GGT CAA CTT CCA AGA TAT TAT TCT TAT CAA839Ile Lys His Asn Ser Leu Gly Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Gln225 230 235 240GAT CAT TTC AGC TAC GAA ATT CAA GAT AGG CAA CGT ATC ATG GCT AAG887Asp His Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg Gln Arg Ile Met Ala Lys245 250 255GAC CCA AAA TCC GGA AAA GAA CTC GGT GAA ACT CAA AGT ATT GAT AAT935Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gln Ser Ile Asp Asn260 265 270GTT TTT GAG AAA TAC CTT ATT ACC AAA AAA AGT TAT AAA CCT TAAAGGAAGT 987Val Phe Glu Lys Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro275 280 285ATCCATTAAA TTTTTCTGCA TCACTAAAAA AACACGAGCA TCACTTTCAA AGGGACGGCC 1047TTCGTTAGTA ACGCTAGTGT TTTTATTTTA TTTTTTTCTT TAGATCAAAC AAAACAGTCA 1107TAGCTTCCAT TGGAGTCATA TTCATGACAT CTACTTCTTT AAGTCTATTA ATGATATCTA 1167GAGAGGAATC TCA1180(2)SEQID NO:2信息(ⅰ)序列特徵(A)長度286個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Lys Lys Trp Phe Leu Ile Leu Met Leu Leu Gly Ile Phe Gly Cys1 5 10 15Ala Thr Gln Pro Ser Lys Val Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Asp Ser Asp20 25 30Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala35 40 45Ile Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile50 55 60Arg Gly Ile His His Val Leu Thr Asp Gln Asn Gln Lys Ile Val Thr65 70 75 80Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg His Gln Met Val Leu Leu Gln85 90 95Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gln Leu100 105 110Leu Thr Gln Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gln Asn Phe Glu Glu115 120 125Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr Ile Gln Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His130 135 140Val Ile Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro Thr Glu145 150 155 160Thr Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Val Gln Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu165 170 175Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His Ile Gly180 185 190Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys Ile Ala Glu Glu Lys Leu195 200 205Leu Gln Leu Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr Ile210 215 220Ile Lys His Asn Ser Leu Gly Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Gln225 230 235240Asp His Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg Gln Arg Ile Met Ala Lys245 250 255Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gln Ser Ile Asp Asn260 265 270Val Phe Glu Lys Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro275 280285(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特徵(A)長度1181個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)特性(A)名字/關鍵CDS(B)位置121..981(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:3:GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATATCTACTT CAATTTGTTC TAAAATGAAA60TTATATTCAC TGCTGTTACA TAACTTTGTG ATTATTTAGG ATAAAATAAG GGAGATTTTT 120ATG AAA AAA TGG TTT TTA ATA TTA ATG CTT TTG GGA ATA TTT GGT TGT 168Met Lys Lys Trp Phe Leu Ile Leu Met Leu Leu Gly Ile Phe Gly Cys1 5 10 15GCT ACT CAA CCA TCA AAG GTT GCA GCA ATA ACC GGT TAT GAT TCC GAC 216Ala Thr Gln Pro Ser Lys Val Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Asp Ser Asp20 25 30TAC TAC GCT AGA TAT ATT GAT CCC GAT GAA AAT AAA ATA ACA TTT GCC 264Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala35 40 45ATA AAT GTT GAT GGT TTT GTC GAA GGT AGT AAT CAA GAA ATC CTT ATT 312Ile Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile50 55 60AGA GGA ATT CAT CAT GTT TTA ACA AAT CAA AAC CAA AAG ATT GTT ACA 360Arg Gly Ile His His Val Leu Thr Asn Gln Asn Gln Lys Ile Val Thr65 70 75 80AAG GCC GAG TTG TTA GAC GCT ATT AGA CAT CAA ATG GTT CTT CTA CAA 408Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg His Gln Met Val Leu Leu Gln85 90 95TTG GAT TAT TCC TAT GAA CTA GTC GAC TTT GCG CCT GAT GCA CAA TTA 456Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gln Leu100 105 110TTA ACA CGA GAT CGA CGG CTT TTA TTT GCC AAT CGA AAT TTT GAG GAA504Leu Thr Arg Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Arg Asn Phe Glu Glu115 120 125TCC GTA TCA CTT GAA GAT ACT ATT CAA GAA TAC CTT TTA AAA GGG CAT552Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr Ile Gln Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His130 135 140GTT ATT CTC AGA AAA CGG GTT GAA GAA CCT ATC ACT CAT CCT ACT GAG600Val Ile Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro Thr Glu145 150 155 160ACT GCT AAT ATT GAG TAT AAA GTT CAA TTC GCG ACT AAA GAT GGG GAA648Thr Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Val Gln Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu165 170 175TTC CAC CCA CTA CCT ATT TTT GTA GAC TAC GGA GAA AAA CAT ATT GGA696Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His Ile Gly180 185 190GAA AAA TTA ACC TCT GAC GAG TTT CGA AAA ATT GCA GAA GAA AAG CTT744Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys Ile Ala Glu Glu Lys Leu195 200 205TTG CAA CGC TAC CCT GAC TAT ATG ATT GAT CAA AAA GAA TAT ACT ATC792Leu Gln Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr Ile210 215 220ATT AAA CAC AAT TCT CTT GGT CAA CTT CCA AGA TAT TAT TCT TAT CCA840Ile Lys His Asn Ser Leu Gly Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Pro225 230 235 240GAT GAT TTC AGC TAC GAA ATT CAA GAT AGG CAA CGT ATC ATG GCT AAG888Asp Asp Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg Gln Arg Ile Met Ala Lys245 250 255GAC CCA AAG TCC GGA AAA GAA CTC GGT GAA ACT CAA AGT ATT GAT AAT936Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gln Ser Ile Asp Asn260 265 270GTT TTT GAG AAA TAC CTT ATT ACC AAA AAA AGT TAT AAA CCT TAAATGAAGT 988Val Phe Glu Lys Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro275 280 285ATCCATTAAA TTTTTCTGCA TCACTAAAAA AACACGAGCA TCACTTTCAA AGGGAAGGCC 1048TTCGTTAGTA ACGCTAGTGT TTTTATTTTA TTTTTTTCTT TAAATCAAAC AAAACAGTCA 1108TAGCTTCCAT TGGAGTCATA TTCATGACAT CTACTTCTTT AAGTCTATTA ATGATATCTA 1168GAGAGGAATC TCA1181(2)SEQID NO:4信息(ⅰ)序列特徵(A)長度286個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Lys Lys Trp Phe Leu Ile Leu Met Leu Leu Gly Ile Phe Gly Cys1 5 10 15Ala Thr Gln Pro Ser Lys Val Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Asp Ser Asp20 25 30Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala35 40 45Ile Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile50 55 60Arg Gly Ile His His Val Leu Thr Asn Gln Asn Gln Lys Ile Val Thr65 70 75 80Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg His Gln Met Val Leu Leu Gln85 90 95Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gln Leu100 105 110Leu Thr Arg Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Arg Asn Phe Glu Glu115 120 125Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr Ile Gln Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His130 135 140val Ile Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro Thr Glu145150 155 160Thr Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Val Gln Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu165 170 175Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His Ile Gly180 185 190Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys Ile Ala Glu Glu Lys Leu195 200 205Leu Gln Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr Ile210 215 220Ile Lys His Asn Ser Leu Gly Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Pro225 230 235 240Asp Asp Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg Gln Arg Ile Met Ala Lys245 250 255Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gln Ser Ile Asp Asn260 265 270Val Phe Glu Lys Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro275 280 285(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特徵(A)長度18個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅸ)特徵(A)名字/關鍵肽(B)位置1..18(D)其它信息/標記=Xaa/注「Xaa=Pro或Gly」(ⅹⅰ)序列言息SEQ ID NO:5:Ile Thr Xaa Tyr Asp Ser Asp Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp1 5 10 15Glu Asn(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特徵(A)長度31個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala Ile Asn Val Asp1 5 10 15Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile Arg Gly Ile20 25 30(ⅰ)序列特徵(A)長度12個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Ile Val Thr Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特徵(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅸ)特徵(A)名字/關鍵肽(B)位置1..16(D)其它信息/標記=Xaa/注=「Xaa=未知」(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Asp Gly Glu Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Xaa Tyr Xaa Glu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特徵(A)長度13個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Leu Leu Gln Leu Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特徵(A)長度19個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Leu Leu Gln Leu Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr1 5 10 15Ile Ile Lys(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Tyr Tyr Ser Tyr Gln Asp His Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特徵(A)長度5個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Tyr Leu Ile Thr Lys1 5(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:13:ATCATATAGT CAGGGTAGAG(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:CGGGTACCGW TATATTGATC CWGATGARAA(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:15:GGGGATCCTT TTGATCAATW GGATAATCWG GATA(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:GGGGATCCTT YTGRTCRATW GGRTARTCWG GRTA(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:GTTACAAAGG CCGAGTTGTT AGAC(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:GATTGGCAAA TAAAAGCCGT CGATC(2)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特徵(A)長度22個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CTTCAAGTGA TACGGATTCC TC(2)SEQ ID NO:20信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:GGGGAATTCC ACCCACTACC(2)SEQ ID NO:21信息(ⅰ)序列特徵(A)長度25個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:GACGAGTTTC GAAAAATTGC AGAAG(2)SEQ ID NO:22信息(ⅰ)序列特徵(A)長度48個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:GGGCTGCAGT CATATGAAAA AATGGTTTTT AATATTAATG CTTTTGGG(2)SEQ ID NO:33信息(ⅰ)序列特徵(A)長度44個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:GGGCTGCAGT CATATGATAA CCGGTTATGA TTCCGACTAC TACG(2)SEQ ID NO:24信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:GAGATTCCTC TCTAGATATC A(2)SEQ ID NO:25信息(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATAT(2)SEQ ID NO:26信息(ⅰ)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假定的無(ⅳ)反義無(ⅵ)最初來源(A)有機體乳房鏈球菌(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:GCGGCTCGAG ACCGGTTATG ATTCCGACTA C(2)SEQ ID NO:27信息(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假定的無(ⅳ)反義無(ⅴⅰ)最初來源(A)有機體乳房鏈球菌(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:GTTGCGGCCG CGGATACTTC ATTTAAGGTT TAT(2)SEQ ID NO:28信息(ⅰ)序列特徵(A)長度10個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假定的無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型內部(ⅴⅰ)最初來源(A)有機體乳房鏈球菌(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro1 5 10
權利要求
1．一種分離的多核苷酸分子，包括編碼乳房鏈球菌PauA蛋白的核苷酸序列。
2．權利要求1的分離的多核苷酸分子，其中的PauA蛋白包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4約胺基酸位置26至約胺基酸位置286的胺基酸序列。
3．權利要求2的分離的多核苷酸分子，分別包括SEQ ID NO:1約核苷酸位置195至約核苷酸位置977，或SEQ ID NO:3約核苷酸位置196至約核苷酸位置978的核苷酸序列。
4．權利要求2的分離多核苷酸分子，其中的PauA蛋白包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的胺基酸序列。
5．權利要求4的分離多核苷酸分子，分別包括SEQ ID NO:1約核苷酸位置120至約核苷酸位置980，或SEQ ID NO:3約核苷酸位置121至約核苷酸位置981的核苷酸序列。
6．權利要求5的分離多核苷酸分子，分別包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
7．基本上同源於權利要求3多核苷酸分子的分離多核苷酸分子。
8．一種分離的多核苷酸分子，包括編碼基本上同源於包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4中從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白的多肽的核苷酸序列。
9．一種分離的多核苷酸分子，由下面的核苷酸序列所組成，其編碼SEQ ID NO:2胺基酸序列的肽段或其基本上同源的多肽，或SEQ IDNO:4的胺基酸序列的肽段或其基本上同源的多肽。
10．權利要求9分離的多核苷酸分子，其中的肽段由選自下面區段的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的胺基酸子序列所組成，即胺基酸位置28至約286、約104至286、約172至約286、約28至約170、約104至約170、約104至約208、約172至約208、約28至約103、約28至約208，及約149至約286的子序列。
11．包括編碼融合蛋白核苷酸序列的分離多核苷酸分子，所述的融合蛋白包括:(a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286的胺基酸序列的PauA蛋白；(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)PauA蛋白的肽段或基本上同源的多肽，融合到融合配偶體上。
12．權利要求11的分離多核苷酸分子，其中的融合蛋白選自β-半乳糖苷酶融合體、trpE融合體、麥芽糖結合蛋白融合體，穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合體，和多組氨酸融合體。
13．權利要求11的分離多核苷酸分子，其中的從SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4約胺基酸位置26至約胺基酸位置286的PauA蛋白胺基酸序列分別由SEQ ID NO:1的約核苷酸位置195至約核苷酸位置977的核苷酸序列，或從SEQ ID NO:3的約核苷酸位置196至約核苷酸位置978的核苷酸序列所編碼。
14．權利要求11的分離多核苷酸分子，其中的肽段由選自下面區段的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的胺基酸子序列所組成，即從約28至286、約104至約286、約172至約286、約28至約170、約104至約170、約104至約208、約172至約208、約28至約103、約28至208、及約149至約286的胺基酸子序列所組成。
15．權利要求14的分離多核苷酸分子，其中的融合配偶體是GST。
16．在中等或高度嚴格的條件下與由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3核苷酸序列所組成的多核苷酸分子，或與由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3核苷酸序列互補的核苷酸序列所組成的多核苷酸分子雜交的寡核苷酸分子。
17．權利要求16的寡核苷酸分子，由選自SEQ ID NO:13-27的核苷酸序列及其互補核苷酸序列所組成。
18．權利要求16的寡核苷酸分子，包括選自SEQ ID NO:13-27的核苷酸序列及其互補的核苷酸序列。
19．一種重組表達載體，包括含有編碼下面物質的核苷酸序列的多核苷酸分子(a)包括SEQID NO:2或SEQ ID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)PauA蛋白的肽片段或基本上同源的多肽；或(d)包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源多肽、或肽段的融合蛋白，其中的多核苷酸分子與宿主細胞中控制該多核苷酸分子表達的一個或更多個調節元件可操作地連接。
20．權利要求19的重組表達載體，其中的從SEQ ID NO:2或SEQID NO:4約胺基酸位置26至約胺基酸位置286的PauA蛋白的胺基酸序列分別由包括SEQ ID NO:1的約從核苷酸位置195至約核苷酸位置977，或SEQ ID NO:3的約從核苷酸位置196至約核苷酸位置978的核苷酸序列的多核苷酸分子所編碼。
21．權利要求19的重組表達載體，其中的PauA蛋白的肽段由選自下面區段的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4胺基酸子序列所組成，即胺基酸位置約28至約286、約104至約286、約172至約286、約28至約170、約104至約170、約104至約208、約172至約208、約28至約103、約28至約208、及約149至約286的胺基酸子序列。
22．權利要求19的重組表達載體，其中的融合配偶體為GST。
23．權利要求19的重組表達載體，進一步包括可選擇標記。
24．以權利要求19的重組表達載體轉化的宿主細胞。
25．一種分離的多肽:(a)其為包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)其基本上同源於PauA蛋白；或(c)其為由PauA蛋白子序列或基本上同源多肽子序列所組成的肽段；或(d)其為包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白。
26．權利要求25的多肽，其中的PauA蛋白包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4從約胺基酸位置1至約胺基酸位置286的胺基酸序列。
27．權利要求25的多肽，其中的PauA蛋白肽段由選自下面區段的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4胺基酸子序列所組成，即胺基酸位置約28至約286、約104至約286、約172至約286、約28至約170、約104至約170、約104至約208、約172至約208、約28至約103、約28至約208、及約149至約286的胺基酸子序列所組成。
28．權利要求25的多肽，其中的融合蛋白包括由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4選自下面區段的胺基酸子序列所組成的PauA蛋白肽段，即由胺基酸位置約28至約286、約104至約286、約172至約286、約28至約170、約104至約170、約104至約208、約172至約208、約28至約103、約28至約208、及約149至約286的胺基酸子序列所組成的PauA蛋白肽段。
29．權利要求28的多肽，其中的融合配偶體為GST。
30．用於製備多肽的方法，包括在易於產生表達載體編碼的多肽的條件下培養以權利要求19的重組表達載體轉化的宿主細胞，和從細胞培養物中回收該多肽。
31．多肽的類似物或衍生物，其中的多肽(a)為包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO4的從約胺基酸位置26至約氨酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白；或(c)為由PauA蛋白子序列或基本上同源的多肽所組成的肽段；或(d)為包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源的多肽或肽段的融合蛋白。
32．用於保護哺乳動物種類成員抵抗乳腺炎的疫苗，包括免疫學有效量的(a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白或基本上同源多肽的子序列所組成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白的類似物或衍生物；或(f)包括編碼PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應；和獸醫上可接受的載體。
33．權利要求32的疫苗，進一步包括佐劑。
34．權利要求32的疫苗，其包括含有多核苷酸分子的轉化宿主細胞，其中的多核苷酸分子包括編碼能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類似物的核苷酸序列，其中的多核苷酸分子在宿主細胞中表達以產生PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類似物。
35．權利要求34的疫苗，其中的宿主細胞為大腸桿菌。
36．用於保護哺乳動物種類成員抗乳腺炎和任選一種或多種其它能夠折磨哺乳動物的疾病或病理症狀的組合疫苗，其中的組合疫苗包括免疫學有效量的第一種成分，其包括a)含有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；或b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白子序列所組成的肽段或基本上同源的多肽；或(d)包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的類似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白；或(f)包括編碼PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、或類似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應；包括能夠誘導抗能夠折磨哺乳動物的疾病或病理症狀的保護性反應抗原的免疫學有效量的第二種成分；和獸醫上可接受的載體。
37．權利要求36的組合疫苗，其中的組合疫苗的第二種成分的抗原能夠在哺乳動物中誘導抗疾病，症狀(condition)或選自下面病原體的保護性反應，包括乳腺炎、牛皰疹病毒、牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹瀉病毒、Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型副流感病毒、鉤端螺旋體屬、彎曲桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、枝原體屬、克雷伯氏菌屬、沙門氏菌屬、輪狀病毒、冠形病毒、狂犬病、巴斯德氏菌屬、梭菌屬、破傷風類毒素、大腸桿菌、或Neospora spp。
38．權利要求36的組合疫苗，進一步包括佐劑。
39．權利要求36的組合疫苗，包括用作與乳房鏈球菌導致的乳腺炎以外的疾病或病理症狀有關的病原體的宿主細胞，其中的疾病或病理症狀可折磨哺乳動物，其中的宿主細胞包括含有編碼能在哺乳動物中誘導抗乳腺炎保護性反應的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的多核苷酸分子在宿主細胞中表達以產生PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類似物，且其中的宿主細胞能夠誘導抗除由乳房鏈球菌導致的乳腺炎以外的疾病或病理症狀的保護性免疫反應。
40.權利要求39的組合疫苗，其中的宿主細胞選自鉤端螺旋體屬、彎曲桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、枝原體屬、克雷伯氏菌屬、沙門氏菌屬、巴斯德氏菌屬、梭菌屬、大腸桿菌和Neospora spp。
41.製備用於保護哺乳動物種類成員抗乳腺炎的疫苗的方法，包括組合免疫有效量的a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白子序列或基本上同源多肽所組成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的類似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白；或(f)包括編碼PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類似物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應，與獸醫上可接受的載體。
42.種痘哺乳動物種類成員抗乳腺炎的方法，包括施用權利要求32的疫苗至哺乳動物。
43.用於種痘哺乳動物種類成員抗乳腺炎的試劑盒，包括含有免疫有效量下面物質的第一種容器a)包括SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白子序列或基本上同源多肽所組成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的類似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白；或(f)包括編碼PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或類似物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、多肽、肽段、融合蛋白、類似物、衍生物或多核苷酸分子能夠在哺乳動物中誘導抗乳腺炎的保護性反應；和含有獸醫上可接受的載體或稀釋劑的第二種容器。
44.特異性結合下面物質的抗體a)包括SEQ ID NO:2或SEQID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白的子序列或基本上同源多肽所組成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的類似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白。
45.診斷試劑盒，包括含有下面物質的第一種容器a)包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列的PauA蛋白；(b)基本上同源於PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白子序列或基本上同源多肽所組成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶體上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的類似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白；其中的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、類似物或衍生物特異性地結合抗天然PauA蛋白的抗體；和包括針對抗-PauA蛋白特異性抗體的二級抗體的第二種容器。
46.權利要求45的診斷試劑盒，其中的二級抗體進一步包括可檢測的標記。
47.診斷試劑盒，包括含有特異性結合含有SEQ ID NO:2或SEQID NO:4從約胺基酸位置26至約胺基酸位置286胺基酸序列PauA蛋白的一級抗體的第一種容器，和含有特異性結合PauA蛋白上不同表位或特異性結合一級抗體的二級抗體的第二種容器。
48.權利要求47的診斷試劑盒，其中的二級抗體進一步包括可檢測的標記。
49.診斷試劑盒，包括含有對特異性擴增編碼乳房鏈球菌編碼PauA蛋白多核苷酸分子有用的多核苷酸分子或寡核苷酸分子的容器。
全文摘要
本發明提供了包括編碼乳房鏈球菌纖溶酶原激活(PauA)蛋白、和其基本上同源的多肽、肽段及融合蛋白核苷酸序列的多核苷酸分子。本發明進一步提供了用於重組表達由本發明多核苷酸分子編碼的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段及融合蛋白的組合物和方法。本發明進一步提供了用於保護哺乳動物種類成員抗乳腺炎的疫苗,包括本發明PauA蛋白,基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或多核苷酸分子。
文檔編號C07K19/00GK1209455SQ9810333
公開日1999年3月3日 申請日期1998年6月22日 優先權日1997年6月23日
發明者E·L·羅斯, R·J·楊西, J·A·雷格 申請人:輝瑞大藥廠