海兔毒素10的衍生物及其應用的製作方法

2023-12-01 12:22:06 3

本發明涉及海兔毒素10(Dolastatin10)衍生物類細胞毒性藥物的設計合成，及其在抗體藥物偶聯物(Antibody-drugConjugates,ADCs)中的應用。
背景技術：
：作為新型的靶向治療藥物，抗體藥物偶聯物(ADC)近年來得到快速的發展，目前已有三個ADC藥物(Mylotarg，Adcetris，和Kadcyla)通過了美國食品藥品監督管理局(FDA)批准上市，另外還有超過30個ADC藥物處於臨床試驗階段。抗體藥物偶聯物通常由三部分組成：抗體或抗體類配體，高活性細胞毒性藥物，和將配體與細胞毒性藥物偶聯起來的連接子。其作用機制如下：抗體或抗體類配體特異性地識別細胞表面抗原並與之結合；形成的結合物以內吞的方式進入細胞內，同時將高活性細胞毒性藥物帶入；抗體被酶解或連接子自身斷裂，高活性細胞毒性藥物以適當的活性成分形式釋放出來，殺死目標細胞。抗體藥物偶聯物採用的細胞毒性藥物活性非常高，通常比目前在一線應用的化療藥物活性高10-1000倍以上。用於抗體藥物偶聯物的細胞毒性藥物主要作用於細胞微管蛋白和DNA靶點。作用於微管蛋白的細胞毒性藥物抑制細胞的有絲分裂進而導致細胞凋亡，這一類細胞毒性要素主要包括美登素類(Maytansinoids,EP0425235；US5208020,5416064；7276497,7473796,7851432；US2007/0269447,2011/0158991；WO2004/103272,2012/061590)和耳抑素肽類(Auristatins,海兔毒素10的衍生物，US6884869,7498298)。作用於DNA的細胞毒性藥物通過抑制DNA合成，DNA小溝絡合烷基化及斷裂等機制導致細胞凋亡，主要包括阿黴素類(Doxorubicins,BioconjugateChem.2002,13,855-869)，卡奇黴素類(Calicheamicins,US5606040,5770710)，苯並二吡咯類抗生素類(Duocarmycins和CC-1065類,US7129261),以及吡咯並苯二氮卓二聚體類(PBDdimers,WO2005/040170)等。目前上市及臨床試驗階段的抗體藥物偶聯物中，大約70-80％選用耳抑素肽 類和美登素類高活性細胞毒性藥物作為彈頭。美登素類藥物的主要原料，安絲菌素(AnsamitocinP-3)，是通過細菌發酵的方式生產的，對菌株和發酵生產的條件要求較高。耳抑素肽類藥物可以通過全合成的方式製備，因而更適合規模化生產和推廣。耳抑素肽類代表藥物是單甲基耳抑素肽E(MMAE，US6884869)和單甲基耳抑素肽F(MMAF，US7498298)，兩者都是基於dolastatin10化合物進行結構改造得到的五肽類衍生物，而後者是從一種海洋生物海兔體內提取出來的一種具有高活性細胞毒性的化合物。除了上述廣泛應用的MMAE，MMAF以外，針對dolastatin10結構進行的其它改造也有見諸報導。WO2006/132670公開了一種在N端用氨基苯甲酸取代纈氨酸的衍生物。WO2007/008603，WO2007/008848，US2013/0123456，和WO2013/173393公開了一系列針對C端苯丙氨酸側鏈改造的衍生物。WO2011/154359和WO2012/041805公開了一系列針對MMAF化合物N端和C端進行結構改造的衍生物。由於細胞毒性藥物的高活性要求，目前應用於抗體偶聯藥物領域的候選細胞毒性藥物分子的種類和數量比較少，在一定程度上制約了抗體偶聯藥物的發展。因此，本領域迫切需要提供更多具有高活性的細胞毒性藥物。在現有細胞毒性藥物的基礎上，開發新型的細胞毒性藥物，具有非常重要的意義和應用前景。技術實現要素：本發明旨在提供新的海兔毒素10(Dolastatin10)衍生物類細胞毒性藥物及其在抗體藥物偶聯物中的應用。在本發明的第一方面，提供了一種如式Ⅰ所示的化合物，其中：R1,R2選自H,-C1-C8烷基,或者R1,R2連接成環,具有-(CR14R15)n-Z-(CR16R17)m-的結構，其中R14，R15，R16，和R17選自H，-C1-C8烷基；Z選自O,NR18，CR19R20,其中R18，R19，R20選自H,-C1-C8烷基；n，m分別選自 0-8範圍內的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8。R3，R4，R6選自H，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基；R5，R9，R10，R11選自H，-C1-C8烷基；R7，R8選自H，-OH，-C1-C8烷基，或-O-(C1-C8烷基)；R12,R13選自H,-C1-C8烷基,-OR21,-R22X,或者R12,R13連接成環,具有-(CR23R24)p-W-(CR25R26)q-,其中W選自O,NR27,CR28R29；X選自-OH,-NR30R31；p，q分別選自0-8範圍內的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8；R21選自H，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基；R22選自亞烷基，亞烯基，亞炔基，亞芳基，-(CH2CH2O)r-(CH2)s-，或其中任意組合；r，s分別選自0-8範圍內的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8；R23，R24，R25，R26，R27，R28，R29和R30選自H，-C1-C8烷基；R31選自H，-C1-C8烷基，-OR32；其中R32選自H，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基。在另一優選例中，提供了一種如式Ⅱ所示的化合物,其中：R1,R2選自H,-C1-C8烷基,或者R1,R2連接成環,具有-(CR14R15)n-Z-(CR16R17)m-的結構，其中R14，R15，R16，和R17選自H，-C1-C8烷基；Z選自O,NR18，CR19R20,其中R18，R19，R20選自H,-C1-C8烷基；n，m分別選自0-8範圍內的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8。R12,R13選自H,-C1-C8烷基,-OR21,-R22X,或者R12,R13連接成環,具有-(CR23R24)p-W-(CR25R26)q-,其中W選自O,NR27,CR28R29；X選自-OH,-NR30R31；p，q分別選自0-8範圍內的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8；R21選自H，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基；R22選自亞烷基，亞烯基，亞炔基，亞芳基，-(CH2CH2O)r-(CH2)s-，或其中任意組合；r，s分別選自0-8範圍內的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8；R23，R24，R25，R26，R27，R28，R29和R30選自H，-C1-C8烷基；R31選自H，-C1-C8烷基，-OR32；其中R32選自H，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基。在另一優選例中，提供了一種如以下結構式所示的化合物：在另一優選例中，提供了一種如以下結構式所示的化合物：在本發明的第二方面，提供了一種如式Ⅲ所示的化合物，其中：R1，R2，R3，R4選自H，-C1-C8烷基；n，m分別選自2-4範圍內的整數，包括2，3和4。R5，R6，R8選自H，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基；R7，R11，R12選自H，-C1-C8烷基；R9，R10選自H，-OH，-C1-C8烷基，或-O-(C1-C8烷基)；R13，R14選自H，-OH，-OR16，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基；R16選自H，-C1-C8烷基；P選自1-8範圍內的整數，包括1，2，3，4，5，6，7和8；R15選自-C3-C8烷基，芳基，-C3-C8雜環基，-COOH，-C(＝O)NR17R18；R17,R18選自H,-C1-C8烷基,-OH，-OR19，或者R1,R2連接成環,具有-(CR20R21)p-Z-(CR22R23)q-的結構，其中R19，R20，R21，R22和R23選自H，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基；Z選自O,NR24，CR25R26,其中R24，R25和R26選自H,-C1-C8烷基；p，q分別選自0-8範圍內的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8。在另一優選例中，提供了一種如式Ⅳ所示的化合物，其中：n，m分別選自2-4範圍內的整數，包括2，3和4。R1選自H，-C1-C8烷基；R2，R3選自H，-OH，-OR5，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基；R5選自H，-C1-C8烷基；p選自1-8範圍內的整數，包括1，2，3，4，5，6，7和8；R4選自-C3-C8烷基，芳基，-C3-C8雜環基，-COOH，-C(＝O)NR6R7；R6,R7選自H,-C1-C8烷基,-OH，-OR8，或者R6,R7連接成環,具有-(CR9R10)p-Z-(CR11R12)q-的結構，其中R8，R9，R10，R11和R12選自H，-C1-C8烷基，H，-C1-C8烷基，芳基，雜環基，芳烷基，雜芳烷基；Z選自O,NR13，CR14R15,其中R13，R14和R15選自H,-C1-C8烷基；p，q分別選自0-8範圍內的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8。在另一優選例中，提供了一種如以下結構式所示的化合物，在另一優選例中，提供了一種如以下結構式所示的化合物，在另一優選例中，提供了一種如以下結構式所示的化合物，在本發明的第三方面，提供了一種如上所述的本發明提供的化合物所形成的藥學上可接受的鹽，溶劑合物，或鹽的溶劑合物。在本發明的第四方面，提供了一種藥物，其組成包括如上所述的本發明提供的化合物化合物、其藥學上可接受的鹽、其溶劑合物或其鹽的溶劑合物和藥學上可接受的載體。在本發明的第五方面，提供了一種抗體藥物偶聯物，其結構如式Ⅴ所示，L-(A-D)nⅤ其中，L是抗體，抗體片段或蛋白；A是連接子部分；D是如上所述的本發明提供的化合物；n是一個範圍在0-8的整數，包括0，1，2，3，4，5，6，7和8。在本發明的第六方面，提供了如上所述的本發明提供的抗體藥物偶聯物在腫瘤，自身免疫疾病和抗炎症的領域中的應用。據此，本發明提供了新型的具有高活性的細胞毒性藥物。具體實施方式發明人在現有耳抑素肽類細胞毒性藥物分子(AE，MMAE，MMAF等)基礎上，分別針對N端和C端進行創新性的結構改造，從而得到新的高活性的細胞毒性藥物。在此基礎上，完成了本發明。有些結構上帶有羧基的細胞毒性分子，在體外實驗中由於帶有電荷的原因，較難通過細胞膜進入細胞，從而造成其細胞毒性數據失真，無法與其他不帶電荷的細胞毒性分子活性進行對比。鑑於以上原因，本發明中所有的細胞毒性分子活性檢測都通過抗體藥物偶聯物(相同的抗體，例如抗體H；相同的可斷裂連接子，例如vc連接子)的方式，進行體外細胞增殖抑制試驗，進而間接比較其細胞毒性。在此基礎上，也考察了採用不可斷裂連接子(例如MC連接子)時，其抗體藥物偶聯物的細胞毒性。抗體藥物偶聯物H-vc-D,H-MC-D縮略語(Abbreviation)Ab抗體Ac乙醯基ACN乙腈BOC(Boc)叔丁氧羰基BrOP溴化三(二甲基氨基)膦六氟磷酸Bu丁基t-Bu叔丁基℃攝氏度DCM二氯甲烷DEA二乙胺DEPC腈基磷酸二乙酯DIEA二異丙基乙基胺DMFN,N-二甲基甲醯胺DTT二硫蘇糖醇Et乙基EtOAc乙酸乙酯Eq當量Fmoc9-芴甲氧羰醯基g克h小時HATU2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯HOBt1-羥基苯並三唑HOSuN-羥基琥珀醯亞胺HPLC高效液相色譜LC-MS液相色譜-質譜聯用Linker連接子Me甲基MeOH甲醇mAb單克隆抗體min分鐘mL毫升μL微升PE石油醚prep-RP-HPLC製備級反相-高效液相色譜rt室溫Rt保留時間TEA三乙胺TFA三氟乙酸THF四氫呋喃TLC薄層色譜TsCl對甲苯磺醯氯定義本文所用術語「烷基」是指含有伯、仲、叔或環碳原子的飽和烴基，例如甲基，乙基，1-丙基，2-丙基(異丙基)，環己基等。「烯基」是含有伯、仲、叔或環碳原子的不飽和烴基，其中至少含有一個碳-碳sp2雙鍵(C＝C)，如乙烯基，烯丙基等。「炔基」是含有伯、仲、叔或環碳原子的不飽和烴基，其中至少含有一個碳-碳sp三鍵(C≡C)，如乙炔基，炔丙基等。「芳基」是指去除母體芳環系統的一個碳原子上一個氫原子所產生的6-12個碳原子的單價芳族烴基，如苯基，萘基，蒽基，聯苯基等。「雜芳基」是指上述「芳基」骨架上的1個或多個碳原子被雜原子N,O,P和S取代所形成的，如吡啶，噻吩，呋喃等。「雜環」是指母體芳環或非芳環系統中的1個或多個碳原子被雜原子N,O,P和S取代所形成的，如吡啶，噻吩，呋喃，六氫吡啶(哌啶)，四氫呋喃等。「雜環基」指去除上述「雜環」骨架上的一個碳原子或雜原子上的氫原子所形成的烴基，如吡啶基，噻吩基，呋喃基，六氫吡啶基(哌啶基)，四氫呋喃基等。「芳烷基」指連接於末端或sp3碳原子的一個氫原子被芳基取代的脂肪族烷基，如苄基，3-苯基丙基等。芳烷基的烷基部分也可以包括烯基或炔基。「雜芳烷基」指連接於末端或sp3碳原子的一個氫原子被雜芳基取代的脂肪族烷基，如2-吡啶基乙基，3-呋喃基丙基等。雜芳烷基的烷基部分也可以包括烯基或炔基。「亞烷基」是含有直鏈，支鏈或碳環的飽和烴基，因去除母體烷烴的同一或兩個不同碳原子上的兩個氫原子而產生了兩個單價基中心。如亞甲基(-CH2-)，1,2-亞乙基(-CH2CH2-)，1,3-亞丙基(-CH2CH2CH2-)等。「亞烯基」是含有直鏈，支鏈或碳環的不飽和烴基，因去除母體烯烴的同一或兩個不同碳原子上的兩個氫原子而產生了兩個單價基中心。如1,2-亞乙烯基(-CH＝CH-)，1,3-亞丙烯基(-CH2CH＝CH-)等。「亞炔基」是含有直鏈，支鏈或碳環的不飽和烴基，因去除母體炔烴的兩個不同碳原子上的兩個氫原子而產生了兩個單價基中心。如亞乙炔基(-CH≡CH-)，1,3-亞丙炔基(-CH2C≡CH-)等。「亞芳基」是指6-12個碳原子芳族烴基，因去除母體芳環系統的兩個不同碳原子上的兩個氫原子而產生了兩個單價基中心，如1,2-亞苯基，1,3-亞苯基，1,4-亞苯基等。「取代烷基」、「取代烯基」、「取代炔基」、「取代芳基」、「取代雜芳基」、「取代雜環基」、「取代芳烷基」、「取代雜芳烷基」分別指相應「烷基」、「烯基」、「炔基」、「芳基」、「雜芳基」、「雜環基」、「芳烷基」、「雜芳烷基」中一個或多個氫原子各自獨立地被取代基所取代。取代基一般包括但不限於：-X、-OR、-NR2、-NO2、-CN、-SO3R、-CO2R等，其中X是滷原子；R是H,烷基，芳基，雜環基，保護基團或前藥部分。上述亞烷基，亞烯基，和亞炔基也可以被類似地取代。「其中任意組合」是指兩種或多種取代基團以一定的連接方式組合而形成的一個新的取代基，如苄基(苯基+亞甲基)，3-苯基丙基(苯基+1,3-亞丙基)，2-環己基丙基(環己基+1,2-亞丙基)，3-(3-吡啶基)丙基(3-吡啶基+1,3-亞丙基)等。本文所述術語「藥學上可接受的鹽」是指示範性化合物的藥學上可接受的有機鹽或無機鹽。示範性化合物含有至少一個氨基可與酸成鹽。示範性鹽包括但不限於，鹽酸鹽，草酸鹽，檸檬酸鹽，硫酸鹽等。藥學上可接受的鹽可以具有一個或多個帶電原子，因此可具有一個或多個抗衡離子，後者可以是能穩定母體化合物上電荷的任意有機或無機部分。「藥學上可接受的溶劑合物」或「溶劑合物」是指一種或多種溶劑分子和本發明化合物形成的結合物。形成藥學上可接受的溶劑合物的溶劑例子包括但不限於水，乙醇，異丙醇，乙酸等。「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身並不是必要的活性成分，且施用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》(Remington’sPharmaceuticalSciences，MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形劑的充分討論。如本文所用，「抗體」或「抗體單元」在其所屬的範圍內，包括抗體結構的任何部分。這一單元可以結合，反應性關聯，或者絡合一個受體，抗原，或者靶向細胞群體具有的其他受體單元。抗體可以是任何蛋白或蛋白類分子，它可 以結合，絡合，或者與待治療或生物改造的細胞群體的一部分發生反應。本發明中組成抗體藥物偶聯物的抗體最好保持其原有野生狀態時的抗原結合能力。因此，本發明中的抗體能夠，最好專一性地，與抗原結合。涉及的抗原包括，例如，腫瘤相關抗原(TAA)，細胞表面受體蛋白和其他細胞表面分子，細胞存活調節因子，細胞增殖調節因子，與組織生長與分化相關的分子(如已知或預知的具有功能性的)，淋巴因子，細胞因子，參與細胞循環調節的分子，參與血管生成的分子，以及與血管生成有關的分子(如已知或預知的具有功能性的)。腫瘤相關因子可以是簇分化因子(如CD蛋白)。與本發明中所述抗體結合的抗原可以是上述分類中一個或一個子集，而其它的子集則包含其它的具有特殊性質的分子/抗原(與目標抗原相比)。應用在抗體藥物偶聯物中的抗體包括，但不局限於，針對細胞表面受體和腫瘤相關抗原的抗體。這樣的腫瘤相關抗原是業內所熟知的，可以通過業內熟知的抗體製備方法和信息來製備。為了開發可用於癌症診斷與治療的有效的細胞水平目標物，研究人員力圖找尋跨膜或其他腫瘤相關多肽。這些目標物能夠特異性地表達在一種或多種癌症細胞表面，而在一種或多種非癌細胞表面表達很少或不表達。通常，相對於非癌細胞表面而言,這樣的腫瘤相關多肽在癌細胞表面更加過度表達。確認這樣的腫瘤相關因子，可大大提高基於抗體治療癌症的專一靶向特性。腫瘤相關抗原包括，但不局限於，以下列出的腫瘤相關抗原(1)-(36)。為方便起見，為業內所熟知的抗原相關信息標示如下，包括名稱，其它名稱，基因庫登錄號。與腫瘤相關抗原對應的核酸和蛋白序列可參見公開資料庫，例如Genbank。抗體靶向對應的腫瘤相關抗原包括所有的胺基酸序列變種和同種，與參考文獻中確認的序列具有至少70％，80％，85％，90％，或95％的同源性，或者具備與引用文獻中的腫瘤相關抗原序列具有完全一致的生物性質和特徵。腫瘤相關抗原(1)-(36)：(1)BMPR1B(骨形態發生蛋白受體-IB型，Genbank登錄號NM_001203)；(2)E16(LAT1，SLC7A5，Genbank登錄號NM_003486)；(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號NM_012449)；(4)0772P(CA125，MUC16，Genbank登錄號AF361486)；(5)MPF(MPF，MSLN，SMR、巨核細胞強化因子，間皮素，Genbank登錄號NM_005823)；(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶質載運體家族34(磷酸鈉)成員2，II型鈉依賴型磷酸轉運子3b，Genbank登錄號NM_006424)；(7)Sema5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，腦信號蛋白5bHlog，sema結構域，七個血小板反應蛋白重複序列(1型和類1型)，跨膜結構域(TM)和短胞質結構域，(腦信號蛋白)5B，Genbank登錄號AB040878)；(8)PSCAhlg(2700050C12Rik,C530008016Rik,RIKENcDNA2700050C12,RIKENcDNA2700050C12基因，Genbank登錄號AY358628)；(9)ETBR(內皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號AY275463)；(10)MSG783(RNF124,假擬蛋白FLJ20315,Genbank登錄號NM_017763)；(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相關基因1，前列腺癌相關蛋白1，六次跨膜的前列腺上皮抗原2，六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號AF455138)；(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬時受體電勢陽離子通道，亞家族M，成員4，Genbank登錄號NM_017636)；(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤衍生生長因子，Genbank登錄號NP_003203或NM_003212)；(14)CD21(CR2(補體受體2)或C3DR(C3d/EB病毒受體)或Hs.73792,Genbank登錄號M26004)；(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相關β),B29,Genbank登錄號NM_000626)；(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含有磷酸酶錨定蛋白1a的SH2結構域),SPAP1B,SPAP1C,Genbank登錄號NM_030764)；(17)HER2(ErbB2,Genbank登錄號M11730)；(18)NCA(CEACAM6,Genbank登錄號M18728)；(19)MDP(DPEP1,Genbank登錄號BC017023)；(20)IL20Rα(IL20Ra,ZCYTOR7,Genbank登錄號AF184971)；(21)Brevican(BCAN,BEHAB,Genbank登錄號AF229053)；(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank登錄號NM_004442)；(23)ASLG659(B7h,Genbank登錄號AX092328)；(24)PSCA(前列腺幹細胞抗原前體，Genbank登錄號AJ297436)；(25)GEDA(Genbank登錄號AY260763)；(26)BAFF-R(B細胞活化因子受體，BLyS受體3，BR3,Genbank登錄號AF116456)；(27)CD22(B細胞受體CD22-B同種型,Genbank登錄號AK026467)；(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相關α，能夠與Igβ(CD79B)發生共價作用並在表面與IgM分子形成複合物，轉導參與B細胞分化信號的B細胞特異性蛋白，Genbank登錄號NP_001774.1)；(29)CXCR5(伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤受體1，被CXCL13趨化因子活化的G蛋白偶聯受體，在淋巴細胞遷移和體液防禦中發揮作用，在HIV-2感染以及可能在愛滋病，淋巴瘤，骨髓瘤，和白血病中發揮作用，Genbank登錄號NP_001701.1)；(30)HLA-DOB(MHCII類分子的Beta亞基(Ia抗原)，其結合肽並將其呈遞到CD4+T淋巴小細胞，Genbank登錄號NP_002111.1)；(31)P2X5(嘌呤受體P2X配體門控離子通道5，由胞外ATP門控的離子通道，可能涉及突觸傳遞和神經新生，其缺陷可能導致特發性逼尿肌不穩定的病理生理狀況，Genbank登錄號NP_002552.2)；(32)CD72(B細胞分化抗原CD72,Lyb-2,Genbank登錄號NP_001773.1)；(33)LY64(淋巴細胞抗原64(RP105),富含亮氨酸重複的I型膜蛋白(LRR)家族，調節B細胞活化和凋亡，功能的喪失與系統性紅斑狼瘡患者疾病活動增加有關，Genbank登錄號NP_005573.1)；(34)FcRH1(Fc受體樣蛋白1，推定的免疫球蛋白Fc結構域受體，包含C2型類Ig樣和ITAM結構域，可能在B淋巴細胞分化中起作用，Genbank登錄號NP_443170.1)；(35)IRTA2(易位相關免疫球蛋白超家族受體2，推定的免疫受體，可能在B細胞發育和淋巴瘤產生中起作用；由易位導致的基因失調發生在一些B細胞惡性病上，Genbank登錄號NP_112571.1)；(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖，與生長因子的EGF/調蛋白(heregulin)家族和卵泡抑素(follistatin)相關，Genbank登錄號AF179274)。如本文所用，「藥物」或者代號「D」泛指任何具有期望的生物活性，並具有 反應性官能團以便製備本發明所述偶聯物的化合物。期望的生物活性包括，診斷，治癒，緩解，治療，預防人或其它動物的疾病。因此，只要具有必需的反應性官能團，術語「藥物」涉及的化合物包括正式國家藥典，以及例如美國正式同種療法藥典，正式全國處方集，或者其任何增補本等確認的藥物。典型的藥物列於醫師案頭用藥參考(PDR)和美國食品藥品監督管理局(FDA)的橙皮書。隨著新型藥物不斷被發現和發展，本專利規定這些藥物也應納入本發明所述偶聯藥物的前藥。較佳地，藥物是指：一種用於癌症治療的細胞毒性藥物；一種具有期望生物活性的蛋白或多肽，例如一種毒素，如相思子毒素，蓖麻毒素A,假單胞菌外毒素，和白喉毒素；其他合適的蛋白包括腫瘤壞死因子，α-幹擾素，β-幹擾素，神經原生長因子，血小板衍生生長因子，組織型纖酶溶原生長因子，以及生物反應調節製劑，例如淋巴因子，白細胞介素-1(IL-1),白細胞介素-2(IL-2),白細胞介素-6(IL-6),粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),粒細胞集落刺激因子，或其它生長因子。一方面，藥物是美登素(maytansine)或類美登素(maytansinoids)。美登素化合物通過抑制微管蛋白的微管形成來抑制細胞增殖(Science1975,189,1002-1005；US5208020)。類美登素是美登素的衍生物。美登素和類美登素都具有高效的細胞毒性，但是它們在癌症治療的臨床應用上具有很大的局限性，這主要是源於此類分子對腫瘤的低選擇性。但是，這種高細胞毒性促使它們成為抗體藥物偶聯物的首選藥物部分。以下列出了美登素，類美登素，以及在抗體藥物偶聯物應用中經常利用的三個類美登素分子結構。合成類美登素的主要原料是美登醇(maytansinol)，主要由安絲菌素(ansamitocins)水解得到。安絲菌素可以通過發酵的方式製備。安絲菌素衍生物(WO2012/061590)和丙氨醯基美登醇(US2012/0121615)據報導也可作為抗體藥物偶聯物的藥物「彈頭」(這兩類分子結構見下圖所示)。一方面，藥物是耳抑素肽類(auristatins)藥物。耳抑素肽類藥物是海兔毒素10(dolastatin10)的衍生物，而後者是從海洋軟體動物海兔體內分離出來的具有生物活性的多肽(US7498298)。海兔毒素10通過結合微管蛋白(與長春新鹼同樣的結合區域)而抑制微管蛋白聚合。海兔毒素10，耳抑素肽PE，耳抑素肽E都是線性多肽，含有四個胺基酸(其中三個胺基酸是海兔毒素類化合物所獨有的)和C-端醯胺基團。兩個代表性的耳抑素肽類化合物，單甲基耳抑素肽E(MMAE)和單甲基耳抑素肽F(MMAF)，都是抗體藥物偶聯物的首選藥物部分。本發明中一種特別優選的耳抑素肽類(auristatins)藥物是具有本發明提供的結構如式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ所示的化合物，更佳地，是如本發明提供的結構如化合物1-45的化合物。一方面，藥物是Tubulysins類藥物。Tubulysins是從粘細菌中提取出來的一類天然產物，能有效抑制微管蛋白的聚合，因此具有抗細胞有絲分裂的活性，其中TubulysinD的活性最好。TubulysinD是一個複雜的四肽化合物，其結構中含有O-醯基/N,O-縮醛官能團，因此在酸性和鹼性條件下都不穩定。US2011/0021568和US2013/0224228分別披露了一系列tubulysin的類似物，其結構中去除了以上不穩定官能團，同時又具有高細胞活性。一方面，藥物是卡奇黴素類(calichemicins)藥物。卡奇黴素類藥物是抗腫瘤抗生素，通過結合DNA小溝並促使特定位點雙螺旋DNA斷裂，而導致細胞凋亡。卡奇黴素類藥物具有體外亞皮克摩爾級別的高活性，但是它們的低治療指數排除了臨床應用前景。然而這種高活性卻是它們成為抗體藥物偶聯物的理想候選藥物(如吉妥單抗和InotuzumabOzogamicin)。一方面，藥物是阿黴素類(doxorubicins)。阿黴素能夠嵌入DNA雙螺旋結構從而阻斷DNA複製，因此被用作化療藥物。但是由於阿黴素類較低的細胞毒性(針對人源癌細胞系，半數抑制濃度為0.1-0.2微摩爾，而用於抗體藥物偶聯物的細胞毒性藥物活性通常為亞納摩爾級)，導致其在抗體藥物偶聯物中的應用並不普遍。一方面，藥物是苯並二吡咯類抗生素(duocarmycins,CC-1065等)和其它的環丙基吡咯吲哚-4-酮(cyclopropapyrroloind-4-one,CPI)衍生物。這類化合物是有效的DNA小溝結合-烷基化試劑。環丙苯並吲哚-4-酮(cyclopropabenzindol-4-one,CBI)類似物的化學結構更穩定，生物活性更高，而且與它們含有天然CPI烷基化亞基的父系化合物相比更容易合成。一個代表性的CBI衍生物是酚羥基保護衍生物CBI(見下圖)，具有弱化的前藥毒性和增強的水溶性。一方面，藥物是吡咯並苯二氮卓類(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepines，PBDs)或者PBD二聚體類(PBDdimers)。PBD是一類由鏈黴菌產生的天然產物，其獨特特性在於能夠在DNA小溝，確切是在嘌呤-鳥嘌呤-嘌呤序列處，形成非扭曲的共價加和物。應用PBD作為部分小分子策略靶向鎖定DNA序列以及作為新型的抗癌和抗菌藥物引起了越來越多的興趣(Biochemistry2008,47,11818-11829)。應用一個柔性碳鏈連接兩個PBD單元的C8/C8』的羥基基團，所得的二聚體具有增強的生物活性(WO2011/130616)。PBD二聚體被認為是可以產生序列選擇性的DNA損傷，例如倒序的5′-Pu-GATC-Py-3′鏈間交聯，從而導致其生物活性。這些化合物已被證明是高效的細胞毒性藥物，可作為抗體藥物偶聯物的備選藥物。另一方面，藥物並不僅僅局限於上述提到的類別，還包括所有可用於抗體藥物偶聯物的藥物。本文所述術語「連接子」或「抗體藥物偶聯物的連接子」是指一種具有雙官能團或多官能團的分子，可分別與蛋白/抗體分子和藥物分子反應，因此做為一種「紐帶」將蛋白/抗體與藥物分子連接起來。按照在細胞內藥物釋放的機制，「連接子」或「抗體藥物偶聯物的連接子」可被分為兩類：不可斷裂連接子(non-cleavablelinker)和可斷裂連接子(cleavablelinker)。不可斷裂連接子是一種相對比較穩定的連接子，其結構很難在體內環境下降解斷裂。對於含有不可斷裂連接子的抗體藥物偶聯物，其藥物釋放機制為：偶聯物與抗原結合併被細胞內吞後，抗體在溶酶體中被酶解，釋放出由小分子藥物，連接子，和抗體胺基酸殘基共同組成的活性分子。由此帶來的藥物分子結構改變並不減弱其細胞毒性，但由於活性分子是帶電荷的(胺基酸殘基)，從 而導致其較難滲入鄰近細胞。因此，此類活性藥物較難殺死鄰近不表達靶向抗原(抗原陰性細胞)的腫瘤細胞(旁觀者效應,bystandereffect)(BioconjugateChem.2010,21,5-13)。常見的連接子例如MC連接子和MCC連接子等，如下圖所示。可斷裂連接子，顧名思義，可以在目標細胞內斷裂並釋放出活性藥物(小分子藥物本身)。可斷裂連接子可分為兩個主要的類別：化學不穩定連接子和酶不穩定連接子。化學不穩定連接子可以由於血漿和細胞質性質的不同而選擇性的斷裂。這樣的性質包括pH值，穀胱甘肽濃度等。對pH值敏感的連接子，通常又稱為酸斷裂連接子。這樣的連接子在血液的中性環境下相對穩定(pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的內涵體(pH5.0-6.5)和溶酶體(pH4.5-5.0)內將會被水解。第一代的抗體藥物偶聯物大多應用這類連接子，例如腙，碳酸酯，縮醛，縮酮類。由於酸斷裂連接子有限的血漿穩定性，基於此類連接子的抗體藥物偶聯物通常具有較短的半衰期(2-3天)。這種較短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感連接子在新一代抗體藥物偶聯物中的應用。對於穀胱甘肽敏感的連接子，又稱二硫鍵連接子。藥物釋放是基於細胞內穀胱甘肽的高濃度(毫摩爾範圍)與血液中相對較低的穀胱甘肽濃度(微摩爾範圍)差異引起的。對於腫瘤細胞而言尤其如此，其低含氧量導致還原酶的活性增強，因而導致更高的穀胱甘肽濃度。二硫鍵具有熱力學穩定性，因此在血漿中具有較好的穩定性。酶不穩定連接子，如肽連接子，能夠更好地控制藥物釋放。肽連接子能夠被溶酶體內蛋白酶，如組織蛋白酶(CathepsinB)或纖溶酶(在一些腫瘤組織中此類酶含量增加)有效地切斷。這種肽連接被認為在血漿循環中非常穩定，這是因為細胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制劑導致蛋白酶通常在細胞外不具備活性。鑑於較高的血漿穩定性和良好的細胞內斷裂選擇性和有效性，酶不穩定連接子被廣泛用做抗體藥物偶聯物的可斷裂連接子。典型的酶不穩定連接子例如vc等。自殺式連接子一般嵌合在可斷裂連接子與活性藥物之間，或者本身就是可斷裂連接子的一部分。自殺式連接子的作用機制是：當可斷裂連接子在合宜的條件下斷裂後，自殺式連接子能夠自發地進行結構重排，進而釋放與之連接的活性藥物。常見的自殺式連接子如對氨基苄醇類(PAB)等。抗體藥物偶聯物本發明提供的抗體藥物偶聯物由抗體、連接子和藥物組成，所述連接子包括可斷裂連接子組合或不可斷裂連接子。用途本發明提供高活性的細胞毒性藥物，可以廣泛應用於在抗體偶聯藥物領域，做為高活性的「生物飛彈彈頭」。本發明提供基於上述細胞毒性藥物的抗體藥物偶聯物，靶向瞄準特殊的細胞群體，與細胞表面特異蛋白(抗原)結合，結合物內吞進入細胞內，藥物以活性形式釋放到細胞內。本發明提供基於上述細胞毒性藥物的抗體藥物偶聯物，靶向瞄準特殊的細胞群體，與細胞表面特異蛋白(抗原)結合，發生功效；或者在細胞外釋放藥物，藥物滲入細胞內產生功效。本發明提供一種複合物，包括有效劑量的藥物偶聯物和藥學可接受的載體或媒介。本發明提供治療動物體內癌症或其他腫瘤的治療方法，所述方法是給患有癌症或其他腫瘤的動物使用治療有效量的本發明提供的抗體藥物偶聯物。本發明提供治療自身免疫疾病或炎症疾病的治療方法，所述方法是給患有自身免疫疾病或炎症疾病的患者使用治療有效量的本發明提供的抗體藥物偶聯物。本發明提到的上述特徵，或實施例提到的特徵可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特徵可與任何組合物形式並用，說明書中所揭示的各個特徵，可以被任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特徵所取代。因此除有特別說明，所揭示的特徵僅為均等或相似特徵的一般性例子。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。所有反應都是在氮氣保護下進行的(氫化反應除外)，因此在實施例裡不再一一標明。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。本發明下列實施例中採用的通用步驟是：通用步驟A:採用DEPC縮合劑的成醯胺反應將適量的的羧酸和胺(1-2當量比)溶於DCM，然後依次加入DIEA或TEA(2-5eq)和DEPC(1-2eq)。反應液在室溫條件下攪拌直到反應完成(TLC或LC-MS檢測)。將反應液濃縮除去溶劑，殘餘物用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟B:採用HATU縮合劑的成醯胺反應將適量的的羧酸和胺(1-2當量比)溶於DCM，然後依次加入DIEA或TEA(2-5eq)和HATU(1-2eq)。反應液在室溫條件下攪拌直到反應完成(TLC或LC-MS檢測)。將反應液濃縮除去溶劑，殘餘物用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟C:胺基保護基Boc脫保護將帶有Boc保護基的胺基化合物溶於TFA/DCM混合溶液(v/v1:1或其它比例)，反應液在室溫下攪拌直到反應完成(TLC或LC-MS檢測)。將反應液濃縮除去溶劑，所得目標產品的三氟乙酸鹽可以直接用於下一步反應。或者將三氟乙酸鹽用碳酸氫鈉水溶液中和後用有機溶劑萃取，有機相用水洗滌，乾燥， 濃縮後得到粗品，繼續用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟D:胺基保護基Fmoc脫保護將帶有Fmoc保護基的胺基化合物溶於DEA/DCM混合溶液(v/v1:2其它比例)，反應液在室溫下攪拌直到反應完成(TLC或LC-MS檢測)。將反應液濃縮除去溶劑，粗品用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟E:胺基酸/羧酸叔丁酯的合成將胺基酸/羧酸溶於適量的醋酸叔丁酯，並將溶液冷卻至0℃。向溶液中緩慢加入高氯酸(1.5eq)。反應液在室溫下攪拌直到反應完成(TLC或LC-MS檢測)。反應液依次用水和1.0M鹽酸溶液洗滌，將合併後的水相用碳酸鉀溶液調節pH～9，然後用DCM萃取適當次數。合併後的有機相經水相洗滌，乾燥，濃縮，殘餘物用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟F:羧酸叔丁酯脫保護將羧酸叔丁酯溶於TFA/DCM混合溶液(v/v1:1或其它比例)，反應液在室溫下攪拌直到反應完成(TLC或LC-MS檢測)。將反應液濃縮除去溶劑，粗品可直接用於下一步反應，也可用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟G:應用二(對硝基苯)碳酸酯對醇羥基的活化將適量的醇，二(對硝基苯)碳酸酯(2eq)和TEA或DIEA(3eq)依次加入DCM中，反應液在室溫(或適當溫度)下攪拌一定的時間。如果醇沒有反應完全，更多的二(對硝基苯)碳酸酯可以補加並反應更長時間，直到醇全部反應(TLC或LCMS)。將反應液濃縮除去溶劑，粗品用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟H:胺與對硝基苯碳酸酯(活化的醇)反應生成氨基甲酸酯將胺與通用步驟F得到的對硝基苯基碳酸酯(活化的醇)(1-2當量)溶解在DCM中，在室溫下反應直到完成(TLC或LCMS檢測)。將反應液濃縮除去溶劑，粗品用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟I:胺與對硝基苯碳酸酯(活化的醇)反應生成氨基甲酸酯將胺，由通用步驟F得到的對硝基苯碳酸酯(活化的醇)(1-2當量)和HOBt溶解在吡啶/DMF混合溶液中。反應液在室溫下攪拌直到反應完成(TLC或LCMS檢測)。將反應液濃縮除去溶劑，粗品用柱色譜或反相高效液相色譜純化得到目標產品。通用步驟J:抗體藥物偶聯物製備向抗體溶液(10mg/mL，25mM硼酸-硼酸鈉緩衝溶液，25mM氯化鈉，1mM二乙烯三胺五乙酸，pH～8.0)中加入DTT(1-100eq，或較優地，2.7eq用以還原兩對鏈間二硫鍵從而產生4個可供偶聯的半胱氨酸巰基(均值)，儲備液濃度10mM)。反應液於37℃恆溫搖床內孵育2h。反應液經超濾或脫鹽柱除去還原劑，同時將抗體置換到磷酸鹽緩衝溶液PBS(100mM，10mM氯化鈉，1mM二乙烯三胺五乙酸，pH值7.0)；向冷卻至10℃的還原抗體溶液中加入二甲亞碸和連接子-藥物化合物(二甲亞碸儲備液，1-10eq，或較優地，8eq)，並保證反應液中二甲亞碸體積佔比達15％左右。偶聯反應在10℃進行0.5h。向反應液加入過量的半胱氨酸溶液，用以淬滅未反應的連接子-藥物化合物。淬滅反應在10℃進行30min。反應液先經超濾或分離柱除去連接子-藥物-半胱氨酸加合物以及過量的半胱氨酸，然後經由0.2毫米孔徑的過濾裝置除菌，並在4℃條件下保存。通用步驟K:酶聯免疫吸附測定(ELISA)採用間接ELISA方法考察待測抗體或抗體藥物偶聯物與對應抗原的結合能力：將抗原與固相載體(96孔酶標板)連接，形成固相抗原，洗滌除去未結合的抗原；加梯度稀釋的抗體或受檢抗體藥物偶聯物，其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原-抗體複合物，未結合固相抗原的抗體或抗體藥物偶聯物經洗滌除去；加酶標抗抗體，使其與結合在固相抗原上的抗體或ADC抗體結合，未結合的抗抗體經洗滌除去；加入底物溶液，用酶標儀讀取450nm/630nm處的光密度值，繪製曲線，計算EC50。通用步驟L:細胞增殖抑制實驗(CellProliferationInhibitionAssay)通常，抗體或抗體藥物偶聯物的細胞抑制活性是通過以下方法測定的：將表達腫瘤相關抗原或受體蛋白的哺乳動物細胞與抗體或抗體藥物偶聯物在細胞培養基中相接觸；細胞孵育2到5天時間；測定細胞數量，繪製曲線，計算IC50。除非另外說明，所有的無水試劑都是直接從供應商購買的，並保存在氮氣下。購買的所有其它試劑和溶劑都是高純度的，並且使用前不經過進一步純化。核磁共振波譜是在BrukerAvanceIII500兆核磁共振波譜儀上採集的。化學位移(δ)單位是ppm，以四甲基矽烷為參照系(化學位移為0)，偶合常數(J)單位是Hz。液相色譜-質譜聯用分析方法中，低分辨質譜數據是在一臺與惠普Agilent1200高效液相色譜儀接口的Agilent6110(酸法)或6120B(鹼法)質譜儀上採集的。方法一(Method1)：酸法高效液相色譜方法採用沃特世SunfireC18反相色譜柱(4.60×50mm，3.5μm)進行分離，洗脫液梯度為1.4分鐘內5％-95％B相(乙腈，含0.01％TFA)在A相(水相，含0.01％TFA)中，流速為2.3mL/min，柱溫為50℃；方法二(Method2)：鹼法高效液相色譜方法採用沃特世XbridgeC18反相色譜柱(4.60×50mm，3.5μm)進行分離，洗脫液梯度為1.5分鐘內5％-95％B相(乙腈)在A相(水相，含10mM碳酸氫銨)中，流速為2.0mL/min，柱溫為40℃。製備用反相-高效液相色譜純化(prep-RP-HPLC)是在吉爾森(Gilson)儀器上完成的，使用的分離柱為沃特世SunfireC18反相色譜柱(250×19mm，10μm)。方法三(Method3):酸法製備。流動相:A:含0.1％TFA的水相；B:ACN。流速：20mL/min。方法四(Method4):鹼法製備。流動相:A:含10mM碳酸氫銨的水相；B:ACN。流速：20mL/min。使用的細胞系是SK-BR-3人乳腺癌細胞。該細胞系是從ATCC得到的。 Her2抗原購自義翹神州公司(北京)。抗體H(赫賽汀的生物類似物)購自嘉和生物藥業有限公司(上海)。酶標抗抗體購自西格瑪公司(上海)。底物溶液購自Decent生物技術公司(上海)。CellCountingKit-8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒購自Dojindo公司(上海)。關鍵中間體(KeyIntermediates,KIs)本發明中所使用的關鍵中間體如下所示。其中，AE,Fmoc-MMAE,MC,MC-Val-Cit-PABC-PNP,KI-1,KI-2,KI-3,KI-4,KI-5都是按照文獻報導的方法合成的(US5635483,6884869,7498298)。關鍵中間體KI-7的合成合成步驟1將二乙醇胺(4.0g,38.0mmol)和TEA(19.2g,190mmol)溶解於DCM(300mL)中，然後緩慢加入TsCl(26.1g,137mmol)。反應液在室溫下攪拌18h。有機相依次用10％檸檬酸溶液，水，和飽和食鹽水洗滌，然後乾燥，過濾，濃縮得到白色固體47(19.5g)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝2.12min；m/z(ES+)＝568.0(M+H)+。合成步驟2將化合物47(2.0g,3.52mmol)和L-纈氨酸叔丁酯(0.74g,3.52mmol)溶解於DIEA(20mL)中，反應液在127℃下劇烈攪拌18h。濃縮除去溶劑，向殘餘物中加入水(100mL)，然後用乙酸乙酯萃取(40mL×3)。合併後的有機相經水洗，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc15:1)得到淺黃色固體48(1.1g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.45min；m/z(ES+)＝397.3(M+H)+。合成步驟3將化合物48(900mg,2.27mmol)和對羥基苯甲酸(1.04g,7.5mmol)加入到氫溴酸的乙酸溶液(33％，3.9mL)。反應液在室溫下攪拌過夜。向反應液中加入EtOAc(10mL)，繼續攪拌5min。將沉澱過濾收集，用乙酸乙酯(20mL)洗滌。濾餅乾燥後得到白色固體49(500mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method2):Rt＝0.46min；m/z(ES+)＝187.2(M+H)+。合成步驟4將化合物49(500mg,2.69mmol)溶解於1,4-二氧六環/水混合溶液(v/v3:1,20mL)，然後依次加入碳酸氫鈉(1.35g,16.1mmol)和9-芴甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl，829mg,3.22mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜。用10％檸檬酸溶液 調節反應液pH至2～3，然後用乙酸乙酯萃取(20mL×3)。合併後的有機相經飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc3:1，然後DCM/MeOH15:1)。粗品進一步經prep-RP-HPLC(Method3:35％-50％Bin8min→95％B；Rt:5.7-7.1min)純化得到白色固體50(190mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.74min；m/z(ES+)＝409.3(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.75(dd,2H),7.53(d,2H),7.39(d,2H),7.33(d,2H),4.59(d,2H),4.21(t,1H),3.79-3.67(m,4H),3.37-3.02(m,4H),2.25(m,1H),1.18(d,3H),1.04(d,3H)。A:water0.1％TFA,B:ACN35％-50％ACNin8min,followedby95％atrateof20mL/min,rettime:5.7～7.1min合成步驟5將化合物50(280mg,0.69mmol)和KI-1(245mg,0.69mmol)溶於DCM(6mL)，然後依次加入DIEA(265mg,2.06mmol)和DEPC(168mg,1.03mmol)。反應液在室溫下攪拌3h，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc4:1)得到無色油狀物51(280mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.65min；m/z(ES+)N/A。合成步驟6將化合物51(270mg)溶解在DCM(3mL)中，溶液冷卻至10℃。加入三氟乙酸(3mL)，反應液在10℃攪拌4h。濃縮除去溶劑得到粗品(260mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method2):Rt＝1.96min；m/z(ES+)＝693.3(M+H)+。關鍵中間體KI-8的合成合成步驟1將2-氰基乙基甘氨酸(6.5g,50.8mmol)加入到6M鹽酸溶液(50mL),反應液在100℃下攪拌2天。濃縮除去溶劑得到粗品，於50℃真空乾燥得到白色固體52(8.5g)。LC-MS(Method1):Rt＝0.19min；m/z(ES+)＝148.1(M+H)+。合成步驟2將化合物52(8.5g)溶解於MeOH(100mL)中，並將溶液冷卻至0℃。向溶液中滴加二氯亞碸(13.63g,115.6mmol)。反應液加熱回流2h，濃縮除去溶劑得到53粗品(鹽酸鹽,12.5g)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝0.34min；m/z(ES+)＝176.1(M+H)+。合成步驟3將化合物53(12.5g)懸浮於DCM(300mL)中，依次加入TEA(21.64g,214.3mmol)和TsCl(17.7g,92.9mmol)。反應液在室溫下攪拌18h。有機相依次用水，飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜(PE/EtOAc4:1)得到無色油狀液體54(13.0g)。LC-MS(Method1):Rt＝1.48min；m/z(ES+)＝330.0(M+H)+。合成步驟4將化合物54(13.0g)溶解於無水THF(200mL)中，並將溶液冷卻至0℃。在50min內將氫化鋰鋁(2.99g,78.9mmol)分批加入上述溶液，反應液在0℃攪拌3h。加入飽和氯化銨溶液(3mL)淬滅反應，並將反應液濃縮除去溶劑。將殘餘物懸浮於飽和氯化銨溶液(150mL)和異丙醇/氯仿(v/v3:1，150mL)混 合溶液中，過濾除去沉澱，濾液中的水相分離出來，繼續用異丙醇/氯仿(v/v3:1,100mL)萃取。有機相合併後乾燥，濃縮得到淺黃色油狀物55(11.5g)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method2):Rt＝1.61min；m/z(ES+)＝274.2(M+H)+。合成步驟5將化合物55(4.2g)懸浮於DCM(100mL)中，依次加入TEA(6.21g,61.5mmol)和TsCl(7.04g,36.9mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜。有機相依次用水，飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥，和濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜(PE/EtOAc4:1)得到淺黃色油狀物56(3.7g)。LC-MS(Method2):Rt＝2.27min；m/z(ES+)＝599.2(M+NH4)+。合成步驟6將化合物56(3.7g)和L-纈氨酸叔丁酯(1.33g,6.37mmol)加入到DIEA(30mL)中，反應液在127℃下劇烈攪拌18h。濃縮除去溶劑，加入50毫升水，用EtOAc萃取(50mL×3)。有機相合併，水洗，乾燥，濃縮。粗品用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc/DCM15:1:1)得到黃色油狀物57(2.3g)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method2):Rt＝2.47min；m/z(ES+)＝411.3(M+H)+。合成步驟7將化合物57(2.8g,6.82mmol)和對羥基苯甲酸(3.1g,22.5mmol)加入到氫溴酸的乙酸溶液(33％，20mL)中。反應液在室溫下攪拌24h。向反應液中加入EtOAc(200mL),混合液攪拌5min。沉澱過濾，用乙酸乙酯(50mL)洗滌。濾餅經真空乾燥得到白色固體58(氫溴酸鹽，630mg)。LC-MS(Method1):Rt＝0.17min；m/z(ES+)＝201.2(M+H)+。合成步驟8將化合物58(630mg,3.15mmol)溶解於THF/H2O(v/v5:1,12mL)中，隨後依次加入碳酸氫鈉(0.26g,3.15mmol)，TEA(0.95g,9.45mmol)和9-芴甲基琥珀醯亞氨基碳酸酯(Fmoc-OSu,1.38g,4.09mmol)。反應液在室溫下攪拌18h。用10％的檸檬酸調節溶液pH2～3，然後用乙酸乙酯萃取(20mL×3)。有機相經飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥，濃縮。粗品用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH30:1)得到白色固體59(530mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.76min；m/z(ES+)＝423.3(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.75(d,2H),7.55(d,2H),7.40(m,2H),7.33(m,2H),4.72-4.55(m,2H),4.21(m,1H),3.82-3.10(m,9H),2.20-2.08(m, 3H),1.18(t,3H),1.05-1.00(dd,3H)。合成步驟9將化合物59(400mg,0.95mmol)和KI-1(339mg,0.95mmol)溶於DCM(10mL),然後依次加入TEA(287mg,2.8mmol)和DEPC(200mg,1.23mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH40:1)得到白色固體60(610mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.77min；m/z(ES+)＝763.3(M+H)+。合成步驟10將化合物60(610mg)溶於DCM(3mL)中，溶液冷卻至0℃。加入TFA(1.5mL)，反應液在10℃下攪拌4h。濃縮除去溶劑得到粗品(600mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝1.57min；m/z(ES+)＝707.4(M+H)+。實施例1化合物1的合成合成步驟1將DIEA(185mg,1.43mmol)加入到含有AE(350mg,0.48mmol)和二(對硝基苯)碳酸酯(91mg,0.96mmol)的DCM(10mL)溶液中,反應液在室溫下攪拌18h。向反應液中再次加入二(對硝基苯)碳酸酯(142mg,0.46mmol)，混合液繼續攪拌24h。濃縮除去溶劑，殘餘物用矽膠柱色譜純化(EtOAc/PE4:1→DCM/MeOH30:1)得到白色固體61(340mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.66min；m/z(ES+)＝897.5(M+H)+。合成步驟2將化合物61(160mg,0.18mmol)溶於DCM(6mL),然後向溶液中依次加入2-(甲基氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯(67mg,0.36mmol)和DIEA(69mg,0.54 mmol)。反應液在室溫下攪拌18h,濃縮除去溶劑，殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH30:1)得到淡黃色固體62(105mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.33min；m/z(ES+)＝946.7(M+H)+。合成步驟3將化合物62(105mg)溶於DCM(3mL)中，冷卻至10℃，然後加入TFA(3mL)。反應液在10℃下攪拌4h，濃縮除去溶劑。殘餘物溶於EtOAc(20mL)，然後用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌3次。有機相干燥，濃縮得到淡黃色固體1(75mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.38min；m/z(ES+)＝846.6(M+H)+。實施例2化合物2,3,4的合成化合物2，3，4的合成採用與化合物1類似的合成步驟，LC-MS表徵數據見表1。表1實施例3化合物5的合成合成步驟1將1,5-戊二醇(2.0g,19mmol)和TEA(6.72g,66.5mmol)溶於DCM(100mL)中，然後緩慢加入TsCl(8.69g,45.6mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，然後用10％檸檬酸溶液，水，和飽和氯化鈉溶液洗滌。有機相經乾燥，濃縮後得到白色固體63(8.0g)。粗品直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝2.10min；m/z(ES+)＝413.1(M+H)+。合成步驟2將化合物63(4.8g,11.7mmol)，L-纈氨酸叔丁酯鹽酸鹽(2.43g,11.7mmol)加入到DIEA(20mL)中。反應液在127℃下劇烈攪拌18h。冷卻後，將反應液濃縮除去溶劑，殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc5:1)得到黃色油狀物64(2.8g)。LC-MS(Method1):Rt＝1.14min；m/z(ES+)＝242.3(M+H)+。合成步驟3將化合物64(2.8g)溶於DCM(5mL)，然後加入TFA(5mL)。反應液在室溫下攪拌過夜。濃縮除去溶劑，得到棕色固體65(1.2g)，直接用於下一步反應。少量粗品用RP-HPLC純化得到純品，用於核磁波譜分析。LC-MS(Method1):Rt＝0.36min；m/z(ES+),186.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ3.82(d,1H),3.65(d,1H),3.54(d,1H),3.37(t,1H),3.03(t,1H),3.33(m,1H),2.10-1.80(m,5H),1.55-1.40(m,1H),1.17(d,3H),1.06(d,3H)。合成步驟4將化合物65(200mg,50％純度,0.54mmol)，KI-1(194mg,0.54mmol)溶於DCM(9mL)中，然後依次加入DIEA(272mg，2.7mmol)和DEPC(114mg, 0.70mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc5:1)得到無色油狀液體66(250mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.49min；m/z(ES+),526.4(M+H)+。合成步驟5將化合物66(250mg)溶於DCM(3mL)，並將溶液冷卻至0℃。加入TFA(3mL)，反應液在10℃℃下攪拌4h。濃縮除去溶劑得到粗品67(220mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝1.56min；m/z(ES+),470.7(M+H)+。合成步驟6將化合物67(220mg,0.47mmol)和化合物KI-3(160mg,0.47mmol)溶於DCM(8mL)，並冷卻至0℃。向混合液中依次加入TEA(142mg,1.41mmol)和DEPC(99mg,0,61mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH40:1)得到淺黃色固體5(190mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.32min；m/z(ES+),772.5(M+H)+。實施例4化合物6的合成合成步驟1將二乙二醇(2.0g,18.9mmol)和TEA(6.69g,66mmol)溶於DCM(100mL)，然後緩慢加入TsCl(8.63g,45.3mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，然後用10％檸檬酸溶液，水，和飽和氯化鈉溶液洗滌。有機相經乾燥，濃縮後得到白色固體68(8.0g)。粗品直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝2.02min；m/z(ES+)＝415.1(M+H)+。合成步驟2將化合物68(2.95g,7.18mmol)，L-纈氨酸叔丁酯鹽酸鹽(1.5g,7.18mmol)加入到DIEA(15mL)中。反應液在127℃下劇烈攪拌18h。冷卻後，濃縮除去溶劑，殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc5:1)得到黃色油狀液體69(0.9g)。LC-MS(Method1):Rt＝1.33min；m/z(ES+)＝244.3(M+H)+。合成步驟3將化合物69(0.9g)溶於DCM(2mL)，然後加入TFA(2mL)。反應液在室溫下攪拌過夜。濃縮除去溶劑，得到灰色固體70(400mg)，直接用於下一步反應。少量粗品用RP-HPLC純化得到純品，用於核磁波譜分析。LC-MS(Method1):Rt＝0.35,0.43min；m/z(ES+)＝188.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ4.04(s,4H),3.80(d,1H),3.60(brs,2H),3.36(brs,2H),2.37(m,1H),1.20(d,3H),1.08(d,3H)。合成步驟4將化合物70(200mg,50％純度,0.54mmol)和KI-1(194mg,0.54mmol)溶於DCM(9mL)中,然後依次加入DIEA(272mg，2.7mmol)和DEPC(114mg,0.70mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc5:1)得到無色油狀液體71(200mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.74min；m/z(ES+)＝528.4(M+H)+。合成步驟5將化合物71(200mg)溶於DCM(3mL)，並將溶液冷卻至0℃。加入TFA(3mL)，反應液在10℃下攪拌3h。濃縮除去溶劑得到粗品72(190mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝1.22min；m/z(ES+)＝472.4(M+H)+。合成步驟6將化合物72(190mg,0.38mmol)，KI-3(140mg,0.41mmol)溶於DCM(8mL)，並冷卻至0℃。向混合液中依次加入TEA(115mg,1.14mmol)和DEPC(80mg,0.49mmol)。反應液在室溫下攪拌18小時，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH40:1)得到淡黃色固體6(200mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.36min；m/z(ES+)＝774.5(M+H)+。實施例5化合物7的合成合成步驟1將化合物KI-4(200mg,0.48mmol)，二(對硝基苯)碳酸酯(298mg,0.96mmol)溶於DCM(5mL)，然後加入DIEA(124mg,11mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc25:1)得到淺黃色固體73(200mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.28min；m/z(ES+)＝586.3(M+H)+。合成步驟2將化合物73(200mg,0.34mmol)溶於二氯甲烷(6mL)，然後依次加入1-甲基哌嗪(38mg,0.38mmol)和DIEA(49mg,0.38mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，濃縮除去溶劑。殘餘物用prep-RP-HPLC(Method3:40％-60％Bin8min→95％B；Rt:4.2～5.1min)純化得到白色固體74(135mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.01min；m/z(ES+)＝547.3(M+H)+。合成步驟3將化合物74(135mg)加入到DCM(6mL)/TFA(3mL)混合溶液中。反應液在室溫下攪拌18h，濃縮除去溶劑得到淺黃色油狀液體75(112mg)，直接用於下一步反應。合成步驟4將化合物75(112mg,0.25mmol)和KI-6(159mg,0.25mmol)溶於DCM(5mL)，然後依次加入TEA(25mg,0.25mmol)和DEPC(41mg,0.25mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，加入DCM(25mL)稀釋，依次用水和飽和氯化鈉溶液 洗滌，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH20:1)得到白色固體76(210mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.80min；m/z(ES+)＝534.0[1/2(M+2H)]+。合成步驟5將化合物76(86mg,0.081mmol)加入到DEA(1mL)/DCM(3mL)混合溶液，反應液在室溫下攪拌16h。濃縮除去溶劑，殘餘物用prep-RP-HPLC(Method4:40％-60％Bin8min→95％B；Rt:5.1～5.8min)製備得到白色固體7(40mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.97min；m/z(ES+)＝844.5(M+H)+。實施例6化合物8的合成合成步驟1將化合物Fmoc-MMAE(220mg,0.23mmol)和二(對硝基苯)碳酸酯(142mg,0.46mmol)溶於DCM(20mL)，然後加入DIEA(91mg,0.70mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，補加二(對硝基苯)碳酸酯(142mg)後反應過夜。濃縮除去溶劑，殘餘物用矽膠柱色譜純化(EtOAc/PE4:1)得到白色固體77(200mg)。LC-MS(Method1):Rt＝2.41min；m/z(ES+)N/A(M+H)+。合成步驟2將化合物77(70mg,0.063mmol)溶於DCM(6mL)，然後加入嗎啡啉(0.5mL)和DIEA(16mg,0.13mmol)。反應液在室溫下攪拌21h，濃縮除去溶劑。殘餘物用prep-RP-HPLC(Method3:30％-50％Bin8min→95％B；Rt:9-9.8min)純化得到白色固體8(26mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.52min；m/z(ES+)＝831.5(M+H)+。實施例7化合物9-16的合成化合物9-16的合成採用與化合物8類似的合成步驟，LC-MS表徵數據見表2。表2實施例8化合物17的合成合成步驟1將化合物KI-7(80mg,0.12mmol)溶於DCM(6mL)，然後冷卻至0℃，依次加入DIEA(44mg,0.35mmol)，KI-3(41mg,0.13mmol)和DEPC(28mg,0.17mmol)。反應液在室溫下攪拌4h，濃縮除去溶劑，粗品78直接進行下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝1.95min；m/z(ES+)＝995.6(M+H)+。合成步驟2向合成步驟1得到的化合物78粗品中加入DEA(0.5mL)和DCM(1mL)。反應液在室溫下攪拌過夜，濃縮除去溶劑，殘餘物用prep-RP-HPLC(Method4:35％-60％Bin8min→95％B；Rt:4.5-5.5min)純化得到白色固體17(60mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.49min；m/z(ES+)＝773.5(M+H)+。實施例9化合物18的合成合成步驟1將化合物KI-8(287mg,0.41mmol)和KI-3(130mg,0.41mmol)溶於DCM(10mL)，然後將溶液冷卻至0℃，依次加入TEA(207mg,20.5mmol)和DEPC(87mg,0.53)。反應液在室溫下攪拌過夜。有機相依次用水洗滌(10mL×2)，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH30:1)得到白色固體79(200mg)。合成步驟2將化合物79(200mg,0.20mmol)加入到DCM(3mL)/DEA(0.5mL)混合溶液中。反應液在室溫攪拌過夜，濃縮除去溶劑，殘餘物用RP-HPLC(Method3:30％-45％Bin8min→95％B；Rt:5.0-6.0min)純化得到白色固體(110mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.40min；m/z(ES+)＝787.5(M+H)+。實施例10化合物19-21的合成合成原料80b(WO2013/072813)和80c(WO2007/008848)是按照文獻報導的方法(少量改動)合成。化合物21的合成合成步驟1將化合物80c(210mg,1.11mmol)和KI-2(351mg,1.22mmol)溶於DCM(20mL)，並冷卻到0℃。向溶液中依次加入TEA(336mg,3.33mmol)和DEPC(235mg,1.44mmol)。反應液在室溫下攪拌18h，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH10:1)得到淺黃色固體81c(150mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.89min；m/z(ES+)＝459.3(M+H)+。合成步驟2將化合物81c(150mg)溶於DCM(2mL),並將溶液冷卻至0℃。加入TFA(1mL)，反應液在10℃下攪拌3h。濃縮除去溶劑，得到粗品82c(TFA鹽，120mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝1.21min；m/z(ES+)＝359.2(M+H)+。合成步驟3將化合物82c(120mg,0.335mmol)和化合物KI-7(231mg,0.335mmol)溶於DCM(10mL)。將溶液冷卻至0℃，然後依次加入DIEA(216mg,1.68mmol)和DEPC(71mg,0.435mmol)。反應液在室溫下攪拌18h。有機相依次經水洗， 乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH40:1to15:1)得到淺黃色油狀物83c(400mg)。LC-MS(Method1):Rt＝2.12min；m/z(ES+)＝517.5[1/2(M+2H)]+。合成步驟4將化合物83c(400mg,0.387mmol)溶於DCM(1.5mL)，然後加入DEA(0.5mL)。反應液在室溫下攪拌過夜，濃縮除去溶劑。殘餘物用prep-RP-HPLC(Method4:35％-65％Bin8min→95％Bin4min；Rt:4.0-5.0min)純化得到白色固體21(65mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.81min；m/z(ES+)＝811.6(M+H)+。化合物20-21的合成採取與化合物19的合成類似的合成步驟。LC-MS表徵數據見表3。表3實施例11化合物22的合成合成步驟1將化合物KI-7(166mg,0.24mmol)和KI-5(103mg,0.27mmol)溶於DCM(10mL)，冷卻至0℃，然後依次加入DIEA(93mg,0.72mmol)和DEPC(60mg, 0.36mmol)。反應液在室溫下攪拌4h，濃縮除去溶劑。粗品84直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝2.09min；m/z(ES+)＝1065.7(M+H)+。合成步驟2向化合物84粗品中加入DCM(3mL)和DEA(1mL)，反應液在室溫下攪拌過夜。濃縮除去溶劑，殘餘物用prep-RP-HPLC(Method4:40％-70％Bin8min→95％Bin4min；Rt:7.3-8.3min)純化得到白色固體85(60mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.66min；m/z(ES+)＝843.6(M+H)+。合成步驟3將化合物85(8mg)溶於DCM(0.6mL)，然後將溶液冷卻至0℃，加入TFA(0.2mL)。反應液在10℃下攪拌3h，濃縮除去溶劑。殘餘物用prep-RP-HPLC(Method3:20％-30％Bin8.2min→95％Bin4min；Rt:8.2-9.0min)純化得到白色固體22(5mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.36min；m/z(ES+)＝787.5(M+H)+。實施例12化合物23的合成合成步驟1將化合物KI-8(314mg,0.45mmol)和KI-5(173mg,0.45mmol)溶於DCM(10mL)，冷卻至0℃，然後依次加入TEA(135mg,1.34mmol)和DEPC(94mg,0.58mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜，依次經水洗，乾燥，濃縮。粗品用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH30:1)得到白色固體86(200mg)。合成步驟2將化合物86(400mg,0.37mmol)溶於DCM(3mL)/DEA(1mL)混合溶液，反應液在室溫下攪拌過夜。濃縮除去溶劑，殘餘物用prep-RP-HPLC(Method3: 33％-58％Bin8min→95％Bin4min；Rt:7.5-9.5min)純化得到白色固體87(240mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.51min；m/z(ES+),857.5(M+H)+。合成步驟3將化合物87(10mg,0.012mmol)溶於DCM(0.6mL)，然後將溶液冷卻至0℃，加入TFA(0.2mL)。反應液在10℃攪拌2.5h，濃縮除去溶劑。殘餘物用prep-RP-HPLC(Method3:20％-30％Bin8.2min→95％Bin4min；Rt:7.7-8.8min)純化得到白色固體23(5mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.36min；m/z(ES+)＝801.5(M+H)+。實施例13化合物24-30的合成合成步驟1：胺基酸叔丁酯的合成化合物89a的合成將化合物88a(500mg,2.5mmol)溶於醋酸叔丁酯(5mL)，冷卻至0℃。向溶液中緩慢滴加高氯酸(0.21mL，3.76mmol)。反應液在室溫下攪拌12h。有 機相用水(10mL)和1.0M鹽酸(15mL)洗滌，合併水相用10％碳酸鉀溶液調節pH～9，然後用DCM(20mL×3)萃取。將合併的有機相干燥，濃縮，殘餘物用矽膠柱色譜(EtOAc/PE1:5)純化得到無色油狀物89a(430mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.57min；m/z(ES+),256.1(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.61(s,2H),7.47(d,1H),7.38-7.32(m,3H),4.15(m,1H),3.21(m,2H),1.22(s,9H)。化合物89b的合成化合物88b(500mg,2.5mmol)經過與89a合成類似的反應步驟，得到無色油狀物89b(42mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.65min；m/z(ES+),229.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.11(s,1H),8.40(s,2H),7.56(s,1H),4.27(s,1H),3.32–3.19(m,2H),1.32(s,9H)。化合物89c的合成將化合物88c(1.0g,6.71mmol)溶於醋酸叔丁酯(6mL)，冷卻至0℃。向溶液中緩慢滴加高氯酸(0.81mL，10.1mmol)。反應液在室溫下攪拌18h。將白色沉澱過濾，用乙酸乙酯洗滌。濾液濃縮得到無色油狀物89c(130mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝1.17min；m/z(ES+)＝206.1(M+H)+。化合物89d的合成化合物88d(鹽酸鹽，500mg,2.32mmol)經過與89a合成類似的反應步驟，得到無色油狀物89d(340mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.82min；m/z(ES+)＝236.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.36(s,1H),7.33-7.25(m,3H),7.17(d,2H),3.70(s,1H),3.22(m,1H),2.85(m,1H),2.60-2.55(m,2H),1.42(s,9H)。化合物89e的合成化合物88e(260mg,1.45mmol)經過與89a合成類似的反應步驟，得到89e(83mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.62min；m/z(ES+)＝236.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.08(s,2H),7.30-7.19(m,3H),7.14(d,2H),3.06-2.96(m, 4H),2.87(dd,1H),1.37(s,9H)。化合物89f的合成化合物88f(鹽酸鹽，500mg,2.18mmol)經過與89a合成類似的反應步驟，得到無色油狀物89f(320mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.88min；m/z(ES+)＝250.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.03(s,2H),7.34-7.27(m,2H),7.21-7.20(m,3H),3.46(m,1H),2.75-2.60(m,4H),1.83(m,2H),1.41(s,9H)。化合物89g的合成參考文獻報導的方法合成(Tetrahedron2005，61，11132–11140)。LC-MS(Method1):Rt＝1.66min；m/z(ES+)＝236.2(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.33–7.20(m,5H),3.93(dd,1H),3.38(dd,1H),3.16(dd,1H),2.72(s,3H),1.30(s,9H)。化合物24的合成合成步驟2將化合物89a(235mg,0.92mmol)和KI-2(220mg,0.77mmol)溶於DCM(4mL)，然後依次加入DIEA(267μL，1.53mmol)和DEPC(134μL,0.92mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc4:1)得到化合物90a(276mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.36min；m/z(ES+)＝525.3(M+H)+。合成步驟3將化合物90a(276mg,0.53mmol)溶於DCM，並冷卻至0℃。加入TFA(1mL,25eq)，反應液在室溫下攪拌3h，濃縮除去溶劑。殘餘物用飽和碳酸氫鈉溶液中和，然後用DCM萃取(20mL×3)。合併的有機相依次經乾燥，濃縮得到粗品91a(115mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method2):Rt＝1.96min；m/z(ES+)＝425.3(M+H)+。合成步驟4將化合物91a(100mg,0.24mmol)和KI-7(163mg,0.24mmol)溶於DCM(4mL)，然後依次加入DIEA(82μL，0.47mmol)和DEPC(41μL,0.28mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH50:1)得到化合物92a(163mg)。LC-MS(Method1):Rt＝2.21min； m/z(ES+)＝519.4(M+H)+。合成步驟5將化合物92a(163mg,0.15mmol)加入到DEA(1mL)/DCM(3mL)混合溶液。反應液在室溫下攪拌過夜，濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH/NH3·H2O15:1:0.1)得到化合物93a(84mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.35min；m/z(ES+)＝877.5(M+H)+。合成步驟6將化合物93a(2.0mg,0.0023mmol)溶於DCM(0.4mL)，然後加入TFA(0.2mL)。反應液在室溫下攪拌2h，濃縮除去溶劑。殘餘物用prep-RP-HPLC純化(Method3:15％-60％Bin8min→95％Bin4min；Rt:9.6min)得到純品24。LC-MS(Method1):Rt＝1.56min；m/z(ES+)＝821.3(M+H)+。化合物25-30的合成化合物25-30的合成採取與化合物24的合成類似的合成步驟，LC-MS表徵數據見表4。表4實施例14化合物31-46的合成合成步驟1：化合物94a-o的合成化合物94a的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(155mg,0.58mmol)和O-甲基羥胺鹽酸鹽(98mg,1.17mmol)溶於DCM(2mL)，然後依次加入TEA(235mg,2.32mmol)和DEPC(114mg,0.70mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜。濃縮除去溶劑，殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH50:1)得到白色固體94a(133mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.83min；m/z(ES+)＝317.0(M+Na)+。化合物94b的合成採用與94a類似的合成步驟，得到白色固體94b。LC-MS(Method2):Rt＝1.89min；m/z(ES+)＝331.2(M+Na)+。化合物94c的合成採用與94a類似的合成步驟，得到白色固體94c。LC-MS(Method2):Rt＝ 2.06min；m/z(ES+)＝393.0(M+Na)+。化合物94e的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(200mg,0.75mmol)溶於THF(2mL)並冷卻至-10℃，然後向其中加入N-甲基嗎啡啉(83mg,0.82mmol)和氯甲酸甲酯(77mg,0.82mmol)。反應液攪拌20min，加入乙胺(33％水溶液，307mg,2.25mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜，然後濃縮除去溶劑。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH50:1)得到白色固體94e(217mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.92min；m/z(ES+)＝315.3(M+Na)+。化合物94f的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(265mg,1mmol)溶於THF(4mL)並冷卻至-20℃，然後向其中依次加入N-甲基嗎啡啉(101mg,1mmol)和氯甲酸異丁酯(137mg,1mmol)。反應液攪拌3分鐘後，加入甲胺(30％水溶液，220μL,1.3mmol)。反應液在繼續攪拌1h，然後加入5％碳酸氫鈉溶液(4Ml)。室溫下攪拌30min後，用DCM(20mL×3)萃取。合併的有機相用飽和食鹽水洗，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc2:1)得到94f(173mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.85min；m/z(ES+)＝179.2(M+H-100)+。化合物94g的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(150mg,0.57mmol),叔丁胺(42mg,0.57mmol)和TEA(115mg,1.14mmol)溶於THF(5mL)。將溶液冷卻至0℃，然後加入BOP試劑(328mg,0.74mmol)。反應液在0℃攪拌2h，然後升至室溫攪拌過夜。反應用水淬滅，濃縮除去揮發性溶劑。水相用EtOAc萃取(20mL×3)。合併的有機相經飽和食鹽水洗，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(PE/EtOAc3:1)得到94g(137mg)。LC-MS(Method2):Rt＝2.10min；m/z(ES+)＝321.3(M+H)+。化合物94h的合成採用與94a類似的合成步驟，得到白色固體94h。LC-MS(Method2):Rt＝1.99min；m/z(ES+)＝329.3(M+Na)+。化合物94i的合成採用與94a類似的合成步驟，得到白色固體94i。LC-MS(Method2):Rt＝2.11min；m/z(ES+)＝321.3(M+H)+。化合物94j的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(350mg,1.32mmol)和N-羥基琥珀醯亞胺(182mg,1.58mmol)溶於THF(8mL)，並將溶液冷卻至0℃，然後加入DCC(326mg,1.58mmol)。反應液在0℃下攪拌30min，然後升至室溫攪拌6h。過濾除去固體，濾液冷卻至0℃，然後加入二甲胺水溶液(33％，4.9mL,31.7mmol)。反應液在0℃下攪拌30min,然後升至室溫攪拌過夜。濃縮除去易揮發溶劑，水相用乙酸乙酯萃取。有機相依次用5％的檸檬酸，飽和碳酸氫鈉水溶液，和飽和食鹽水洗，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(EtOAc/PE1:4)得到94j。LC-MS(Method2):Rt＝1.96min；m/z(ES+)＝293.2(M+H)+。化合物94k的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(159mg,0.60mmol)溶於DMF(5mL),並冷卻至0℃。向溶液中依次加入化合物93l(150mg,1.20mmol,合成參考文獻J.Chem.Soc.1942,432)，HOBt(122mg,0.90mmol)，EDCI(138mg,0.72mmol)和DIEA(314μL,1.80mmol)。反應液升至室溫攪拌24h，倒入由半飽和氯化銨水溶液和EtOAc組成的混合溶液。有機相分離後，依次用飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥，濃縮得到94k(167mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.95min；m/z(ES+)＝357.2(M+Na)+。化合物94l的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(187mg,0.71mmol)溶於DMF(5mL),並冷卻至0℃。向溶液中依次加入2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇(150mg,0.78mmol)，HOBt(95mg,0.71mmol)和EDCI(135mg,0.71mmol)。反應液升至室溫攪拌24h，濃縮除去溶劑。殘餘物用乙酸乙酯溶解，然後依次經水，1N鹽酸，1N氫氧化鈉溶液，和飽和食鹽水洗滌，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH50:1)得到化合物94l(278mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.67min；m/z(ES+)＝441.3(M+H)+。化合物94m的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(99mg,0.42mmol)溶於DMF(3mL),並冷卻至0℃。向溶液中依次加入14-氨基-3,6,9,12-四氧雜十四烷醇(100mg,0.38mmol)，HOBt(51mg,0.38mmol)和EDCI(73mg,0.38mmol)。反應液升至室溫攪拌24h，濃縮除去溶劑。殘餘物用乙酸乙酯溶解，然後依次經水，1N鹽酸，1N氫氧化鈉溶液，和飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH30:1)得到化合物94m(215mg)。LC-MS(Method1):Rt＝ 1.39min；m/z(ES+)＝485.3(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.49(t,1H),8.20(s,2H),7.33-7.23(m,5H),3.97(m,1H),3.52-3.27(m,20H),3.17-3.15(m,1H),3.01-2.98(m,2H)。化合物94n的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(80mg,0.28mmol)溶於DMF(3mL),並冷卻至0℃。向溶液中依次加入17-氨基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷醇(68mg,0.26mmol)，HOBt(35mg,0.26mmol)和EDCI(50mg,0.26mmol)。反應液升至室溫攪拌24h，濃縮除去溶劑。殘餘物用乙酸乙酯溶解，然後依次經水，1N鹽酸，1N氫氧化鈉溶液，和飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH30:1)得到化合物94n(90mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.40min；m/z(ES+)＝529.3(M+H)+。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.30-7.20(m,5H),4.36(brs,1H),3.75-3.40(m,21H),3.25-2.90(m,6H),1.39(s,9H)。化合物94o的合成將化合物N-Boc-L-苯丙氨酸(44mg,0.17mmol)溶於DMF(3mL),並冷卻至0℃。向溶液中依次加入2-(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙基-1-胺(30mg,0.17mmol)，HOBt(23mg,0.17mmol)和EDCI(32mg,0.17mmol)。反應液升至室溫攪拌24h，濃縮除去溶劑。殘餘物用乙酸乙酯溶解，然後依次經水，1N鹽酸，1N氫氧化鈉溶液，和飽和氯化鈉溶液洗滌，乾燥，濃縮。殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH50:1)得到化合物94o(59mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.90min；m/z(ES+)＝411.3(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.96(t,1H),7.30-7.23(m,4H),7.19(m,1H),6.87(d,1H),4.12(m,1H),3.50(m,6H),3.44-3.39(m,4H),3.26-3.16(m,5H),2.92(dd,1H),2.71(dd,1H),1.29(s,9H)。化合物43的合成合成步驟2將化合物94l(278mg,0.63mmol)溶於DCM(5mL)，並將溶液冷卻至0℃。加入TFA(1.2mL,16mmol)，反應液在室溫下攪拌3h。濃縮除去溶劑，殘餘物用飽和碳酸氫鈉溶液中和，然後用DCM(20mL×3)萃取。合併的有機相經乾燥，濃縮，殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH20:1)得到95l(158mg)。LC-MS(Method1):Rt＝0.98min；m/z(ES+)＝341.1(M+H)+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.91(t,1H),7.27-7.19(m,5H),4.61(s,1H),3.50–3.47(m,10H), 3.41–3.34(m,5H),3.25-3.16(m,2H),2.91(dd,1H),2.60(dd,1H),1.71(brs,2H)。合成步驟3將化合物95l(35mg,0.10mmol)和KI-2(27mg,0.092mmol)溶於DCM(2mL)，然後依次加入DIEA(33μL,0.18mmol)和DEPC(16μL，0.11mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜。加入DCM(20mL),溶液用飽和氯化鈉溶液洗滌，水相用DCM(20mL×2)萃取，合併的有機相經乾燥，濃縮得到粗品96l(83mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝1.47min；m/z(ES+)＝610.4(M+H)+。合成步驟4將化合物96l(83mg,0.14mmol)溶於DCM(3mL)，並將溶液冷卻至0℃。加入TFA(0.30mL,4.1mmol)，反應液在室溫下攪拌3h。濃縮除去溶劑，殘餘物用飽和碳酸氫鈉中和，然後用DCM(20mL×3)萃取。合併後的有機相干燥，濃縮，殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH/NH3·H2O10:1:0.1)得到97l(43mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.08min；m/z(ES+)＝510.4(M+H)+。合成步驟5將化合物97l(43mg,0.084mmol)和KI-7(58mg,0.084mmol)溶於DCM(4mL),然後依次加入DIEA(30μL，0.17mmol)和DEPC(15μL，0.10mmol)。反應液在室溫下攪拌過夜，加入飽和氯化鈉溶液(30mL)，用DCM萃取(20mL×3)。合併的有機相經乾燥，濃縮得到粗品98l(70mg)，直接用於下一步反應。LC-MS(Method1):Rt＝1.63min；m/z(ES+)＝1184.6(M+H)+。合成步驟6向化合物98l(75mg,0.059mmol)中加入DCM(3mL)和DEA(3mL)，反應液在室溫下攪拌過夜。濃縮除去溶劑，殘餘物用矽膠柱色譜純化(DCM/MeOH/NH3·H2O10:1:0.1)得到42(35mg)。LC-MS(Method2):Rt＝1.63min；m/z(ES+)＝962.5(M+H)+。化合物31-41,43-45的合成從化合物94a-k,94m-o起始，採用與化合物42類似的合成方法，得到化合物31-41,43-45。LC-MS表徵數據見表5。表5實施例15連接子-藥物vc-17的合成將化合物MC-Val-Cit-PABA-PNP(43mg)，17(30mg)和HOBt(1mg)加入到吡啶(0.6mL)/DMF(3mL)混合溶液中，反應液在室溫下攪拌24h。產物用prep-RP-HPLC(Method3:35％-55％Bin8min→95％Bin4min；Rt:6.2-7.0min)純化得到白色固體vc-17(22mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.61min；m/z(ES+)＝686.5[1/2(M+2H)]+。實施例16其它連接子-藥物vc-Drug的合成與vc-17採用類似的合成步驟，LC-MS表徵數據見表6。表6實施例17連接子-藥物vc-22的合成合成步驟1將化合物MC-Val-Cit-PABA-PNP(39mg)，85(30mg)和HOBt(1mg)加入到吡啶(0.6mL)/DMF(3mL)混合溶液，反應液在室溫下攪拌24h。產物用prep-RP-HPLC(Method3:40％-70％Bin8min→95％Bin4min；Rt:7.4-8.4min) 純化得到白色固體vc-85(30mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.72min；m/z(ES+)＝721.3[1/2(M+2H)]+。合成步驟2將化合物vc-85(30mg)溶於DCM(2mL)，冷卻至0℃，然後加入TFA(1mL)。反應液在10℃下攪拌4h，濃縮除去溶劑。殘餘物用prep-RP-HPLC(Method3:37％-65％Bin8min→95％Bin4min；Rt:5.0-6.0min)純化得到vc-22(18mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.66min；m/z(ES+)＝693.5[1/2(M+2H)]+。實施例18其它連接子-藥物vc-Drug的合成與MC-vc-17採用類似的合成步驟，LC-MS表徵數據見表7。表7實施例19連接子-藥物MC-22的合成合成步驟1將化合物MC(10mg)和85(30mg)溶於DCM(5mL)，然後依次加入DIEA(14mg)和HATU(27mg)，反應液在室溫下攪拌24h。產物用prep-RP-HPLC(Method3:40％-70％Bin8min→95％Bin4min；Rt:7.4-8.6min)純化得到白色固體MC-85(30mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.75min；m/z(ES+)＝1036.5(M+H)+。合成步驟2將化合物MC-85(30mg)溶於DCM(2mL)，冷卻至0℃，然後加入TFA(1mL)。反應液在10℃下攪拌4h，濃縮除去溶劑。殘餘物用prep-RP-HPLC(Method3:35％-60％Bin8min→95％Bin4min；Rt:5.5-6.5min)純化得到MC-22(20mg)。LC-MS(Method1):Rt＝1.68min；m/z(ES+)＝980.5(M+H)+。實施例20其它連接子-藥物MC-Drug的合成與MC-22採用類似的合成步驟，LC-MS表徵數據見表8。表8實施例21抗體藥物偶聯物的合成採用通用步驟J提供的偶聯方法，所得抗體藥物偶聯物的平均DAR～4。所得抗體藥物偶聯物的細胞增殖抑制實驗(通用步驟L)結果見表9，表10。表9抗體藥物偶聯物IC50(ng/mL)抗體藥物偶聯物IC50(ng/mL)H-vc-125.2H-vc-2410.6H-vc-219.0H-vc-255.9H-vc-37.0H-vc-2641.4H-vc-411.8H-vc-2715.4H-vc-523.0H-vc-2896.8H-vc-661.4H-vc-29648H-vc-734.2H-vc-3011600H-vc-860.8H-vc-314.8H-vc-9606H-vc-325.1H-vc-10N/AH-vc-339.8H-vc-11N/AH-vc-345.1H-vc-1231.7H-vc-356.2H-vc-1319.0H-vc-368.3H-vc-1434.7H-vc-3778.7H-vc-1549.7H-vc-3810.2H-vc-1634.7H-vc-39607H-vc-175.1H-vc-4035.1H-vc-182.0H-vc-414.4H-vc-19N/AH-vc-424.8H-vc-205.7H-vc-434.9H-vc-214.4H-vc-445.1H-vc-222.0H-vc-458.4H-vc-232.9表10抗體藥物偶聯物IC50(ng/mL)抗體藥物偶聯物IC50(ng/mL)H-MC-590.2H-MC-3113.0H-MC-649.0H-MC-3210.8H-MC-73820H-MC-3315.9H-MC-1867.4H-MC-3412.7H-MC-1948.9H-MC-3513.3H-MC-2021.7H-MC-3619.1H-MC-2128.2H-MC-37N/AH-MC-227.1H-MC-389.6H-MC-233.9H-MC-39N/AH-MC-2430.3H-MC-40N/AH-MC-2524.7H-MC-4111.1H-MC-26N/AH-MC-4216.6H-MC-2772.0H-MC-4318.1H-MC-28335H-MC-4417.1H-MC-296960H-MC-4519.3H-MC-3099300結果表明，其中一些抗體藥物偶聯物具有較高的細胞增值抑制活性，其所採用的海兔毒素10的衍生物具有進一步開發應用的前景。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp