一種用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液的製作方法

2023-12-01 13:30:01 5

專利名稱：一種用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種家畜人工授精技術改良中冷凍精液的稀釋液，特別涉及一種用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液。
背景技術：
1780年，義大利動物學家Spallanznni將狗的精液放入雪中進行冷凍，室溫融凍後觀察精子的活動狀態，從而開始了0℃以下保存精液的研究。20世紀初，用製冷技術或人工固態氣體進行精液冷凍的研究開始出現，並且逐步引起各國科學家的重視。1908年，Maximov將植物組織和細胞浸在甘油液中，降溫至-22℃，結果發現有部分細胞存活，這是首次採用低溫保護劑的報導。1937年，Bernslain等用9.2％(1M)濃度的甘油液在-21℃保存部分哺乳動物及家禽的精液獲得成功，並且還發現甘油濃度到達18％時會對精子產生毒害作用。1949年，Smith和Polge等用加有甘油的溶液成功地將雞、牛、山羊的精液降溫到了-79℃，同時，他們首次發現了甘油具有低溫保護的性能，對於哺乳動物精液冷凍保存技術的發展做出了重要貢獻。1950年，美國的瑞丁人工授精中心第一次獲得了由冷凍精液人工授精產生的犢牛。1956年，Polge和Rowson通過改變精液的處理程序，提高了凍後精子的存活率和受胎率，凍後精子的復甦率可達70％～80％，並在-79℃下冷凍保存2小時至8天後的精液給38頭母牛輸精，有30頭受胎，受胎率達79％，取得了巨大的成功。家畜精液的冷凍成功為擴大優秀種公畜的利用率和延長精液利用時間奠定了基礎，也為人工授精和低溫生物學的發展提供了廣闊的空間。尤其是牛精液冷凍保存的成功是一項重大的技術創新，對家畜人工授精技術的發展產生了極其深遠的影響。冷凍技術解決了精液長期保存的問題，使精液可以保存數年，甚至十多年之久，精液的利用率得到充分提高。由於冷凍精液在運輸上比較方便，可以充分進行國內和國際間良種公畜精液的交流。不論從時間還是從空間上，都使種公畜的配種效能得到充分發揮，促進了人工授精技術的普及，加速了家畜品種改良的步伐。雖然家畜精液冷凍保存的研究和應用首先開始於牛，但近年來豬、羊、馬等家畜以及特種動物的精液冷凍保存也取得了很大提高和發展。相比之下，牛冷凍精液的人工授精技術已廣泛應用於生產實踐，並且得到了普及。在家畜冷凍精液的稀釋液研製方面，所有稀釋液和保存環境的主要作用都是為了給精子提供足夠的營養物供其代謝所需，防止精子迅速冷凍，進行緩衝以防止PH的變化，維持適當的滲透壓，平衡電解質，抑制細菌的生長，擴大稀釋倍數以增加輸精頭次，提高良種家畜和精液的利用效率。
近年來，隨著我國農業產業結構的調整以及人民生活水平的提高，奶牛的飼養量急劇增加，而我國奶牛的產奶量普遍較低，利用冷凍精液通過人工授精技術改良我國低產奶牛就成為當務之急。但是，由於以前牛冷凍精液的研究比較成功，近年來的研究力度減小，人們仍然利用原來的稀釋液和冷凍方法進行精液稀釋和冷凍，生產實踐中有時導致凍後精子存活率不高，影響人工授精效果。因此，根據目前的趨勢，利用我國豐富的中草藥資源開發新的稀釋液就顯得非常必要，這樣既可以提高精子凍後的存活率，又加快了我國奶牛的改良力度，為加快我國低產奶牛的改良力度，迅速提高當地奶牛的產奶量，增加奶牛業的經濟效益，拉動地方和區域經濟發展具有積極的作用。
中草藥在其生長繁殖過程中，從土壤、空氣和陽光中汲取了自身需要的各種營養，並生產出抗拒不良環境及病原侵害的物質和功能，保持著各種成分結構的自然狀態和生物活性，與地球的各種生物保持著天然的平衡關係，成為對人和動物有益又容易被接受的天然外源性有機物質。天然中草藥中一般含有蛋白質、脂肪、糖、胺基酸、澱粉、維生素、礦物質和微量元素等營養物質。這些營養成分和中草藥含有的其它生物活性物質可以促進動物的生長發育，提高動物產品的產量和質量；許多中草藥具有清熱解毒、補氣活血的功能，可以殺菌、消炎、抗病毒，與抗生素的效果相同。經過多年來眾多研究者對中草藥單味及複方的研究，中草藥在抗菌(特別是對一些耐抗生素及化學合成藥的菌株)、抗病毒、抗腫瘤等方面均具有重要作用；中草藥能夠提高動物機體免疫細胞的數量和功能，刺激機體產生較高水平的抗體，延長抗體的維持時間。近年來，中草藥免疫藥理已受到廣泛重視。研究結果表明，中草藥成分中的有效生物活性物質主要有多糖、甙類、生物鹼、揮發成分、有機酸，它們均具有一定免疫促進和調節作用。邰光遠等用黃芪、白朮、柴胡、金銀花、連翹、木香、厚樸等組方，飼餵生長雛雞，試驗組雞成活率提高17.6％，血液白細胞提高10％，淋巴細胞提高8％，單細胞提高0.85％；外加激素都具有毒副作用和殘留等不良作用，而天然中草藥雖然本身不是激素，卻可以起到「激素樣」的作用，而且還能起到減輕或消除外源性激素的毒副作用；中草藥具有雙向調節作用，對同一臟腑的不同功能狀態能實施趨向平衡狀態的調整作用。例如，有的中藥既可以使DNA合成亢進降至正常，又可使DNA合成抑制調節興奮而恢復到正常的合成狀態；中草藥具有抗應激作用。國內眾多學者已對20多種中草藥進行了研究，發現補氣、助陽、補血、滋陰、安神等中藥有較強的抗應激作用。如西洋參水提液灌胃能明顯延長低壓缺氧和窒息性小鼠的存活時間。同時，許多學者對以補益為主的各種中草藥複方進行了研究，也取得了良好效果；中草藥毒副作用小。天然中草藥所含成分都是有機物，是經過傳統式炮製和科學的配伍，其毒性大大減少或基本消除，而且天然中草藥與化學合成藥物合用，還能降低或消除化學合成類藥物的毒副作用。
目前，關於中草藥對家畜精液品質影響的研究較多，但大多是將中草藥以飼料添加劑的形式進行飼喂，然後測定精液品質的變化。而關於將中草藥直接添加到精液保存稀釋液中的研究很少，幾乎沒有。因此，將中草藥直接添加到稀釋液中，研究中草藥對解凍後的精液品質的影響十分必要，可以填補此項空白，以開發經濟實用的新型中式稀釋液配方，適應我國產業結構調整後奶牛業乃至其他家畜快速繁殖的需要。但是，含有中草藥的精液稀釋液由於研究者較少，並且中草藥的成分相當複雜，其作用機理也不甚清楚，最佳配伍比例的中草藥稀釋液的開發應用還需要不斷深入進行探索，同時也要完善其提取工藝，提高效率，以開發出具有獨特優點的用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液。
我國牛精液冷凍保存的研究始於20世紀60～70年代，雖然起步較晚，但成效顯著，精液冷凍效果好，加之冷凍精液人工授精的諸多優點，目前已在全國各地普及應用，為牛的改良發揮了巨大作用。近年來，為了調整農業產業結構，各地相繼將奶牛業作為拉動地方經濟發展的支柱產業，並從國外大量引進良種奶牛，以改良我國低產奶牛品種。但是，多年來我國奶牛冷凍精液一直沿用原有的冷凍稀釋液配方、冷凍-解凍技術，與國外同類研究相比，我國奶牛冷凍精液的整體水平仍然偏低。
我國中草藥資源極其豐富，性能各異，具有化學合成藥品難以比擬的優點，為開發凍精液的中草藥稀釋液的提供了新的資源途徑。關於中草藥對家畜精液品質的影響，謝成俠、龍翔等利用中草藥添加劑飼餵公豬後，研究其對豬精液品質的影響，具有明顯的改善作用。而對於以中草藥提取液直接添加到精液稀釋液中研究其對家畜冷凍精液效果的研究報導極少，在牛冷凍精液方面幾乎沒有報導。在目前化學藥物研製轉向自然藥物的大趨勢下，化學合成保護液已經有了一定的局限性，因而開發天然中草藥冷凍精液保護液就顯得十分迫切。
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發明內容
本發明的目的在於，提供一種新型的用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液，該中草藥稀釋液旨在通過以淫羊藿為主要成分，同時配伍其他與之有類似效用的中草藥，選用相應的中草藥，並且在稀釋液中以最佳比例進行添加，探索出適宜的牛冷凍精液中草藥稀釋液配方，提高牛冷凍精液解凍以後的活率，以克服現有稀釋液配方效果不穩定，凍精解凍以後存活率較低的缺陷。
為了實現上目的，本發明採取如下的技術解決方案一種用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液，該稀釋液由基礎液和中草藥提取液組成，其中中草藥提取液為基礎液體積份數10％～14％，所述的基礎液中每升含葡萄糖15g、乳糖30g和甘氨酸8g；中草藥提取液由下列重量比的原料提取而成淫羊藿35％～37％、巴戟天27％～30％、菟絲子20％～22％、甘草12％～15％，原料的總和為100％。
實現上述用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液的製備方法，其特徵在於，包括下列步驟1)用電子天平準確稱量葡萄糖15g/L；乳糖30g/L；甘氨酸8g/L，經雙蒸水定容、過濾、滅菌後，冷卻至室溫，配製成基礎液，然後置於2～5℃的冰箱中備用；2)先將配方中的不同中草藥準確稱量後，用10倍量雙蒸水浸泡1小時左右，然後分別將之移入旋轉蒸發器的旋轉蒸煮瓶內，60℃蒸煮1小時後濾出煮液，再加入6倍量雙蒸水蒸煮30分鐘，之後合併兩次提取液，70℃減壓濃縮至原體積的1/5，靜置沉澱後取上清液過濾，將濾液離心、過濾後得到中草藥提取液，置於冰箱備用；3)在稀釋液配製時，將上述中草藥提取液以12％～14％的體積份數混入基礎液中，再按照常規的冷凍方法製作冷凍精液即可。
本發明的用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液，由於在基礎液中添加了中草藥淫羊藿、菟絲子、巴戟天等，而淫羊藿、菟絲子、巴戟天三種中草藥本身所含的各種胺基酸、無機鹽、糖類等營養物質可以保證精子在低溫保存過程中的代謝需要，對牛精液的冷凍和低溫保存，提高牛的繁殖力有著重要的意義。對開發中草藥的新用途和解決抗生素和化學物質的殘留副作用，以及病原微生物的耐藥性等不足也有著重要的意義。
具體實施例方式
本發明的實現可以在奶牛繁育中心、各地家畜改良站或者家畜人工授精中心等應用，將中草藥按照配方要求的劑量購買後，先提取其有效成分，經過過濾、消毒後，在製作冷凍精液時替代部分基礎液(基礎液主要組成成分葡萄糖15g/L、乳糖30g/L、甘氨酸8g/L)，再按照相應的冷凍方法製作冷凍精液即可。
配方基礎液，內含中草藥淫羊藿、巴戟天、菟絲子、甘草；其中草藥的重量比配方為淫羊藿35～37％、巴戟天27～30％、菟絲子20～22％、甘草12～15％，中草藥原料的總和為100％。
在提取中草藥時，先將配方中的不同中草藥準確稱量後，用10倍量雙蒸水浸泡1小時左右，然後分別移入旋轉蒸發器的旋轉蒸煮瓶內，60℃蒸煮1小時後濾出煮液，再加入6倍量雙蒸水蒸煮30分鐘，之後合併兩次提取液，70℃減壓濃縮至原體積的1/5，靜置沉澱後取上清液過濾，將濾液離心、過濾後置於冰箱備用。
在上述中草藥中，淫羊藿、菟絲子和巴戟天在傳統中醫學中歸於滋陰壯陽類藥，臨床多用於治療男子遺精、滑精、陽萎、不育和少腹冷痛、腰膝酸軟等「腎虛」病症。存在於精子尾部軸鞘中的酶和精漿中的糖、蛋白質、有機酸等物質是精子運動所必須的啟動劑和能量來源，因而改變精漿中的微量元素、介質、酶以及酸鹼度、滲透壓等，均可影響精子的活動，獲能過程和穿卵功能。淫羊藿中含有黃酮、木脂素、生物鹼和多糖，此外含有揮髮油、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸等；菟絲子含有樹脂甙、糖類、蛋白質、維生素、β-胡蘿蔔素等多種營養物質；巴戟天含有蒽醌類、蒽醌糖類，其單糖混合物主要為葡萄糖和甘露糖，並含有少量多糖、胺基酸、脂類及有機酸類、生物鹼、黃酮類化合物、微量元素等多種營養物。
淫羊藿、菟絲子、巴戟天三種中草藥對牛精液較好的冷凍效果主要得益於其本身所含的各種化學物質的作用。例如，淫羊藿中含有的3-O-2-L-鼠李糖等，糖類菟絲子中含有的3-O-β-D-半乳糖、7-O-β-D-葡萄糖及β-D-芹糖等，巴戟天醇提物中含有的葡萄糖和甘露糖和水溶性部分中分離出多糖等，在精液冷凍和低溫保存過程中能起到抗凍、耐低溫的保護作用。同時，菟絲子能增加SOD活性，抑制體內過氧化脂質的生成，具有一定的抗衰老、抗氧化作用，對細胞抗衰老具有一定作用，淫羊藿甙也有一定的延緩衰老的作用。淫羊藿、菟絲子、巴戟天不但具有補氣活血、補腎壯陽的功能，還具有殺菌、消炎、抗病毒等作用。淫羊藿還有雌性激素和維生素作用。巴戟天的乙醇浸出液對枯草桿菌有抑制作用，說明巴戟天具有抗炎作用。三種中草藥中含有的各種胺基酸、無機鹽、糖類等營養物質可以保證精子在低溫保存過程中的代謝需要。
另外，在上述配方中加入甘草，具有緩衝藥性的功效，甘草可以延緩其它不利於精子活動物質的釋放，從而延長了精子的存活時間。
因此，基於淫羊藿、菟絲子、巴戟天中所含有的各種化學物質對牛精液冷凍和低溫保存具有顯著的效果，該配方以淫羊藿、菟絲子、巴戟天為主要成分，同時配伍甘草，得到了效果較好的中草藥稀釋液配方，且其中草藥提取液的最佳添加濃度為基礎液的10％～14％。對牛精液的冷凍和低溫保存，提高牛的繁殖力有著重要的意義。對開發中草藥的新用途和解決抗生素和化學物質的殘留，副作用及病原微生物的耐藥性等問題也有著重要的意義。
本發明的中草藥稀釋液，冷凍、解凍後精子活率平均達到0.52，精子頂體完整率最高達到76.80％，畸形率僅14.61％，低溫保存時間長達138小時。
以下是發明人給出的一個具體試驗實施例，試驗選用體質健壯、性慾旺盛的成年荷斯坦種公牛，按種公牛飼養管理要求進行飼養，其採精頻率為每周3次。利用假陰道採集法採集公牛精液，精液採集後，立即在35～37℃下鏡檢。所採集的精液為乳白色或乳黃色，無異味，精子形態正常，活率達到0.7以上方可用於製作冷凍精液。
試驗設置了三個不同配方配方一為淫羊藿20g；配方二為淫羊藿20g、熟地黃20g；配方三為淫羊藿25g、巴戟天20g、菟絲子15g、甘草10g。
上述所有中草藥均購於陝西楊凌后稷藥房。在提取中草藥時，先將不同配方的中草藥準確稱量後，用10倍量雙蒸水浸泡1h左右，然後分別將之移入旋轉蒸發器的旋轉蒸煮瓶內，60℃蒸煮1h後濾出煮液，再加入6倍量雙蒸水蒸煮30min，之後合併兩次提取液，70℃減壓濃縮至原體積的1/5，靜置沉澱後取上清液過濾，將濾液離心、過濾後置於冰箱備用。
用電子天平準確稱量葡萄糖15g/L；乳糖30g/L；甘氨酸8g/L，經雙蒸水定容、過濾、滅菌後，冷卻至室溫，配製成基礎液，置於2～5℃的冰箱中備用。採精前，加入卵黃(240ml/L)、青黴素(10萬單位)配製成I液，I液中加入甘油稀釋(終濃度為3％)，同時按最終體積分數6.25％、12.5％、25.0％和50.0％四種濃度添加中草藥稀釋液，配製成II液。I液和II液需要現用現配。試驗時採用二次稀釋法，先將I液按1∶1的比例緩緩倒入精液中進行等溫稀釋(32～35℃)後，用12～15層紗布包裹後，連同II液放入2～5℃冰箱中平衡1～2h。然後加入II液，使精液與稀釋液之比為1∶2，繼續平衡1～2h。
本試驗選取以淫羊藿為主要成分的三種不同配方的提取液，每個配方均設置四個濃度水平添加於稀釋液中。不同配方及不同濃度的中草藥提取液對牛精子凍後活率、頂體完整率、畸形率、低溫存活時間的影響見表1、表2、表3、表4。以下是對精子活率、畸形率、頂體完整率、低溫存活時間的檢測方法(1)精液解凍後立即在35～37℃的溫度下進行活率檢查。評定時，用玻璃棒蘸取1滴精液，滴於載玻片上，加上蓋玻片，使蓋玻片和載玻片之間充滿精液，然後置於400X～600X顯微鏡下觀察。在顯微鏡視野中，通過對精液上、中、下三層液面精子活動情況綜合觀察，評定精子活率。(2)取一滴解凍後的精液滴在乾淨的載玻片上，用另一載玻片呈45°，將精液抹向另一側，製成抹片。自然風乾後用1～2ml福馬林磷酸鹽緩衝液固定15min，水洗乾燥後用姬姆薩染色90min，然後除去抹片上的染液，風乾後置於1000倍生物顯微鏡下觀察300個以上的精子，記錄精子總數和頂體完整精子數。(3)取一滴解凍後的精液滴在乾淨的載玻片上，然後向該精液滴上加一滴伊紅染色劑，染色3～5min後蓋上蓋玻片，置於400倍顯微鏡下鏡檢，檢查不同視野300個以上精子，記錄精子總數和畸形數，求出精子畸形率。(4)將稀釋後的精液保存在4℃的冰箱內，每4h檢查一次精子活率，直至精子全部死亡為止，記錄精子保存時間。
表1 不同配方中草藥提取液對奶牛凍精活率的影響


注*表示差異顯著(P＜0.05)，**表示差異極顯著(P＜0.01)。下同。
從表1可知，三種不同配方的提取液中，配方三中草藥提取液效果最好，牛精子凍後活率顯著高於其他各組(P＜0.05)，在添加濃度為12.5％時精子活率極顯著地高於其他濃度水平(P＜0.01)；而其添加量為25.0％和50.0％時，精子凍後活率均顯著降低。
表2 不同配方中草藥提取液對牛凍精頂體完整率的影響

從表2可以看出，與對照組相比較，配方三中草藥提取液在添加量為6.25％和12.5％時精子頂體完整率分別顯著高於其它濃度水平(P＜0.05)；無論那個配方，當中草藥提取液添加量為50.0％時均極顯著地降低了精子頂體完整率(P＜0.01)。
表3 不同配方中草藥對奶牛凍精畸形率的影響

從表3可見，配方一和配方二兩組中草藥提取液在添加濃度較低時對精子凍後畸形率的影響不明顯，而添加濃度為25.0％和50.0％時則顯著增大了精子凍後的畸形率；配方三在添加量為6.25％和12.5％時使精子凍後畸形率顯著降低，在添加濃度為25.0％時與對照組沒有差異，但添加量達到50.0％時則非常顯著地增大了精子畸形率(P＜0.01)。
表4 不同配方中草藥對牛精子低溫保存時間的影響

從上表可以看出，本研究的三個配方中草藥提取液中，配方一和配方三在添加比例為6.25％和12.5％時的保存效果最好，與對照組和配方二組相比，差異顯著(P＜0.05)。在同一配方的中草藥提取液中，不同添加比例的影響較大，均以添加水平6.25％和12.5％時的效果較好，精液低溫存活時間長，與高添加量相比差異極顯著(P＜0.01)。
權利要求
1.一種用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液，其特徵在於，該稀釋液由基礎液和中草藥提取液共同組成，其中草藥提取液為基礎液體積份數10％～14％，所述基礎液中每升含葡萄糖15g、乳糖30g和甘氨酸8g；中草藥提取液由下列重量比的原料提取而成淫羊藿35％～37％、巴戟天27％～30％、菟絲子20％～22％、甘草12％～15％，原料的總和為100％。
2.一種實現權利要求1所述的用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液的製備方法，其特徵在於，包括下列步驟1)用電子天平準確稱量葡萄糖15g/L；乳糖30g/L；甘氨酸8g/L，經雙蒸水定容、過濾、滅菌後，冷卻至室溫，配製成基礎液，然後置於2～5℃的冰箱中備用；2)將配方中的淫羊藿、巴戟天、菟絲子、甘草準確稱量後，用10倍量雙蒸水浸泡1小時左右，然後分別將之移入旋轉蒸發器的旋轉蒸煮瓶內，60℃蒸煮1小時後濾出煮液，再加入6倍量雙蒸水蒸煮30分鐘，之後合併兩次提取液，70℃減壓濃縮至原體積的1/5，靜置沉澱後取上清液過濾，將濾液離心、過濾後得到中草藥提取液，置於冰箱備用；3)在稀釋液配製時，將上述中草藥提取液以12％～14％的體積份數混入基礎液中，再按照常規的冷凍方法製作冷凍精液即可。
全文摘要
本發明公開了一種用於牛冷凍精液的中草藥稀釋液，該稀釋液由基礎液和中草藥提取液組成，其中中草藥提取液為基礎液體積份數10％～14％，所述的基礎液中每升含葡萄糖15g、乳糖30g和甘氨酸8g；中草藥提取液從淫羊藿、巴戟天、菟絲子、甘草中提取。淫羊藿、菟絲子、巴戟天三種中草藥其本身所含的各種胺基酸、無機鹽、糖類等營養物質可以保證精子在低溫保存過程中的代謝需要，對牛精液的冷凍和低溫保存，提高牛的繁殖力有著重要的意義。對開發中草藥的新用途和解決抗生素和化學物質的殘留副作用，以及病原微生物的耐藥性等不足也有著重要的意義。
文檔編號A01N65/00GK1729770SQ20051004309
公開日2006年2月8日 申請日期2005年8月11日 優先權日2005年8月11日
發明者李青旺, 胡建宏, 昝林森, 劉永峰 申請人:西北農林科技大學