福馬林固定組織的蛋白質抽提的製作方法

2023-12-09 00:10:36 1

專利名稱：福馬林固定組織的蛋白質抽提的製作方法
福馬林固定組織的蛋白質抽提
本發明涉及溶解，隨後定量測定蛋白質，特別是來自福馬林固定的生物學 樣品中的完整全長蛋白質的方法。
在許多國家，用福馬林固定組織然後進行組織病理學檢測是一種標準方法， 其目的是為了，例如區分健康組織和患病組織。幾十年來， 一直收集福馬林固定
和石蠟包埋(FFPE)的組織，其是許多診斷研究的來源。可使用來自大多數器官、不 同患病階段、治療前/期間/後的組織。FFPE組織的優點在於可以高度保留形態。 然而由於發生交聯，不能準確的研究大分子(DNA、 RNA、蛋白質)。根據目前的觀 點，福馬林固定的組織不適用於常規且可靠地分離足量的蛋白質，以用於隨後定 量(例如，Espina等，2003)。因此，人們正尋求替代福馬林固定組織隨後定量 測定大分子的方法。其中，這裡述及的是冷凍組織(低溫切片)和目前討論的實驗性 方法，例如70%乙醇(如Ahram等，2003)。冷凍物質是優良的大分子來源，但該 組織的收集、加工和儲存是昂貴的。這些實驗性固定方法是維持大分子的形態和完 整性的良好折衷方法；然而，它們在回顧性硏究中沒什麼大作用。
在大型回顧性和前瞻性研究中，必須在蛋白質水平檢驗人基因組項目所鑑定 的候選分子的臨床適用性。以前認為不可能用福馬林固定的物質進行DNA和 RNA分析。如今，這種分析是慣常的，甚至在雷射支持組織顯微切片後也可行。 同樣的物質也適用於蛋白質分析。分離核酸的方法與分離蛋白質的方法極為不同。 例如，蛋白質分離中不用蛋白酶，因為這樣蛋白質會被消化，從而不再完整。對於 這點，可認為表達病理學方法(WO 2004/080579 A2)是精確的，其聯用蛋白酶和 熱效應來分離蛋白水解片段-即，肽。然後通過質譜法分析這些片段。因此，表 達病理學方法與本文所述方法不同。充分的熱處理可破壞蛋白質交聯鍵(福爾馬 林所造成的)。
以下是該方面的已知例子。
(1)染色質免疫沉澱(ChiP). ChiP是能檢測靶蛋白在體內是否與某些DNA序 列結合的方法。用福馬林固定完整的細胞從而導致DNA-蛋白質發生交聯以及蛋
白質-蛋白質發生交聯。然後裂解細胞，切割DNA將其分裂成較小的片段。然後用 該靶蛋白的抗體免疫沉澱DNA-蛋白質複合物。然後加熱使DNA-蛋白質連接鍵斷 裂，用蛋白酶破壞蛋白質。最後，用聚合酶鏈式反應(PCR)確認用特定的抗體是否 共同免疫沉澱了某DNA序列。在這裡，熱作用是使福馬林導致的交聯斷裂的原 理。
(2)抗原回收.抗原經過福馬林固定後常喪失其免疫反應性。因此，使用許 多抗體的免疫組織學研究只在一定範圍內可能。目前可行的方法能恢復大多數抗原 的免疫反應性(抗體回收)。其中的原理是在組織切片脫石蠟和再水化後，加熱水溶 液中的組織。然而，定量測定免疫組織化學反應只在一定範圍內可能。
製備生物分子裂解液的方法見WO 2004/080579 A2，該方法在緩衝液系統中 再次加熱福馬林固定的組織樣品，然後用蛋白水解酶處理以降解該組織。
然而，目前沒有方法能用現代方法定量且靈敏地可靠研究福馬林固定組織 中的完整蛋白質。免疫組織化學(IHC)(測定組織切片中各細胞的免疫反應性和分配) 是目前研究福馬林固定組織中蛋白質的唯一方法。然而，IHC只能在一定範圍內 定量。福馬林固定確實良好地維持了組織的形態，但導致蛋白質彼此和與其它大 分子，例如DNA嚴重交聯。以前從福馬林固定的組織分離蛋白質的努力(例如 Ahram等，2003)不成功，因為這些方法得到的蛋白質產率一般很差，不可靠，只 限於蛋白質印跡研究(例如，Ikeda等，1998)並且經常不能檢測或定量測定完整的 蛋白質。Ikeda等描述了實際上適用於分離FFPE組織的蛋白質的方法，但該方 法不能定量分離。其原因是6(TC的溫育步驟明顯不足以定量分離蛋白質。必須 能定量測定最小的固定組織樣品，例如生物活檢樣品中的蛋白質。採用目前的 方法不能從這種樣品中分離足夠量的蛋白質，例如用於蛋白質陣列測定。因此， 這些方法不適用於日常常規臨床方法來測定疾病標記。不只是蛋白質印跡對於 從福馬林固定的組織定量測定蛋白質的要求增加，臨床或研究也是。目前開 發的高通量方法，例如蛋白質陣列正變得極其重要。目前認為用蛋白質陣列不 能檢測福馬林固定組織中的完整蛋白質(Espina等，2003)。
因此，本發明(要解決)的問題是提供一種改進的方法從福馬林固定的生物學 樣品中提取蛋白質。
通過以下方法從福馬林固定的生物學樣品定量提取蛋白質解決了該問題，
該方法是在足以釋放蛋白質的溫度下在緩衝液中溫育生物學樣品，其中所述緩衝液 含有去汙劑和無蛋白水解活性的化合物，先加熱緩衝液中的生物學樣品，然後在高
於6(TC的溫度下再次溫育。本發明的其它改進之處見各從屬權利要求。
本文描述的發明涉及從固定的生物學樣品，例如組織樣品中提取蛋白質用於 隨後的分析，特別是定量測定蛋白質的明顯優化方法，該方法與目前臨床和實驗性 研究的高通量方法，例如蛋白質陣列相容。這樣則易於通過抗體檢測分析和定量測 定不同疾病狀態或過程的樣品。
出乎意料的是，本發明從福馬林固定組織提取蛋白質的方法能提供優良的
結果並避免了現有技術水平的缺點。以前使用的技術明顯無法成功，因為(a)樣品 的加熱太簡單(例如，只在10(TC加熱.50秒)；或(b)使用蛋白酶(不能分離完整的蛋 白質)；或(c)實際上使用了去汙劑，但隨後未充分加熱樣品(例如，不超過60'C， 嬰兒蛋白質產率過低)。只有採用本文所述的方法，即例如(a)使用不含蛋白酶的緩 衝液，(b)使用去汙劑和(c)較高的加熱溫度(高於6(TC，長於50秒)才能以出乎意 料的方式獲得足夠量的完整蛋白質而用於隨後的精確定量測定。
檢測分離的完整蛋白質的其它方法可以是，例如蛋白質印跡、蛋白質陣列、 免疫沉澱、SELDI-TOF質譜法、ELISA和2-D凝膠電泳。
下文根據聚體的實施例進一步說明了本發明。


圖1顯示了本發明方法臨床應用的一個例子。
圖2舉例顯示在高於6CTC的溫度下溫育組織樣品提高了蛋白質產率。通過 蛋白質印跡顯示與本發明方法O60。C，例如80。C，右圖)相比，60。C(左圖)培育 樣品後a-微管蛋白的產率(完整蛋白，50kDa)。
圖3顯示了從福馬林固定的組織提取後兩種蛋白質(E-鈣粘蛋白，a-微管 蛋白)的相關性。
圖4顯示了蛋白質印跡(檢測蛋白質的完整性，證明抗體特異性)和形式最 簡單的反相蛋白質陣列(斑點印跡)之間的相關性。
圖5顯示了用含有不同還原劑的緩衝液提取FFPE切片後p-肌動蛋白的相 關性。
採用本發明方法可檢測和定量測定一種完整的蛋白質或幾種完整的蛋白 質。能可靠地分離和定量測定來自完全不同的細胞區室(compartment),例如細
胞核、細胞質或細胞膜的蛋白質。可以稀釋分離的完整蛋白質，即獲得系列稀 釋液，從而能建立內標曲線。這樣能確保蛋白質的檢測和定量測定發生在線性 區域中。如果需要，可以預先採用蛋白質印跡檢測蛋白質以確保所用的檢測試 劑，例如抗體之間不發生交叉反應(蛋白質印跡中只有大小正確的一條特異性 條帶)。通過本文所述方法分離可定量的完整蛋白質以最佳方式補充了日常常規 臨床方法中早已實施的免疫組織化學分析的結果。因此，首次能在固定的組織 中精確且靈敏地定量測定完整的蛋白質(本發明要解決的問題)和蛋白質的細胞 分配(免疫組織化學)。現在可以以前未有報導的精確性臨床測定已知的疾病標
記，例如乳腺癌患者的Her2/neu。此外，可用常規蛋白質方法，例如質譜法分 析分離的完整蛋白質從而能在健康和患病組織之間比較性地鑑定新的疾病標 記。也可採用本發明方法檢測動物組織。動物模型已可用於許多人類疾病，例 如腫瘤疾病。通常用福馬林固定動物組織，石蠟包埋，然後進行組織病理學 檢測。可用本發明分離蛋白質的方法精確、靈敏並有效地定量測定該模型中已 知和新的疾病標記，例如通過蛋白質陣列。本發明(要解決)的另一問題是提供 一種應用包(一種"試劑盒")，使用這種應用包能可靠且高產率地分離福爾馬 林固定的人或動物生物學樣品，例如組織中的完整蛋白質。該應用包的組分至 少有，例如(a)不含蛋白酶的緩衝液系統和(b)去汙劑。隨該應用包附有從福爾 馬林固定組織分離蛋白質的詳細方案(說明書)。
本發明可用於臨床研究和基礎定向研究。更重要的是，本文所述的從福爾馬 林固定組織分離蛋白質的方法可優選整合入日常常規臨床方法。這樣，可採用顯著 更精確的診斷和治療方法。
圖l顯示了常規福馬林固定組織中完整蛋白質的臨床應用的一個例子。這 樣，可以檢測即使是經化學修飾的蛋白質，例如磷酸化或糖基化的蛋白質。迄 今為止，僅在臨床上用過免疫組織化學臨床以檢測福馬林固定物質中的蛋白 質。定量測定蛋白質的本發明方法能提供已知和新疾病標記表達的補充信息， 其精確性是常規臨床方法尚未知曉的。
通過構建蛋白質陣列，定量蛋白質組研究正變成常規臨床方法的一部分。然 而，由於蛋白質產率不佳，目前不能用這些高通量方法檢測福馬林固定的組織樣 品。本發明方法解決了該缺陷。本文描述了可整合入本發明方法的用於檢測蛋白質
的微陣列的三種示範性方案。1.所謂的夾心免疫陣列(抗體陣列I).在這種形式的 陣列中，將蛋白質結合分子，例如抗體與固體表面偶聯。抗體特異性地結合按照所 述方法分離的蛋白質(抗原)，然後可用為檢測而作了標記的第二種特異性的抗原結 合抗體來檢測。2.抗原捕捉陣列(抗體陣列II).該方案也將蛋白質結合分子，例如 抗體與固體表面偶聯。將按照本發明方法分離的蛋白質與檢測試劑，例如螢光染料 偶聯，然後先用抗體進行特異性結合。這樣可直接檢測所結合的蛋白質。通過比較 不同組織，例如腫瘤組織和正常組織的分離蛋白質，可利用不同螢光染料(例如，
Cy3和Cy5)比較性地顯示感興趣蛋白質的相對量。3.直接蛋白質陣列(directprotein array,反相蛋白質陣列).在此方法中，將按照所述方法分離的蛋白質直接滴加到 合適的表面，例如硝化纖維素或PVDF上，用特異性抗體(用第二檢測抗體)直接或 間接檢測結合的蛋白質。信號擴增方法(例如，DAKO的CSA)能非常靈敏且特異性 地檢測溶液中的蛋白質。此方法與已知的斑點印跡非常類似。
本發明提供定量測定福馬林固定的組織樣品中蛋白質的方法。該項技術首 次在接近臨床條件下精確地測定了組織樣品中的疾病標記。出乎意料地發現，對於 小組織樣品(例如，生物活檢)研究中所需的固定組織中完整蛋白質的高產率而言， 聯用以前未獲成功的技術至關重要。例如，以前的方法先將組織樣品加熱至IO(TC， 然後在6(TC長時間加熱。發現延長樣品在6(TC的加熱時間不足以獲得高產率的蛋 白質。將樣品加熱至高於6(TC，例如8tTC，得到的溶解蛋白質含量明顯較高(圖 2)。相應地，本發明方法可由以下步驟構成
(a) 切割福馬林固定的和石蠟包埋的組織樣品塊；
(b) 除去各切片的石蠟；
(c) 通過手工或雷射顯微切片將要研究的組織區域從組織切片上切下(任選可 研究整個組織)；
(d) 將切下的組織片轉移至含有去汙劑但不含蛋白水解活性化合物的緩衝液 中。不使用蛋白酶，例如胰蛋白酶或蛋白激酶K以確保蛋白質的完整性；
(e) 首先加熱緩衝液中的樣品(加熱至95'C-10(TC)。培育時間可以不同，例如 5分鐘-40分鐘。加熱時間可取決於例如樣品的大小；
(f) 然後在高於60'C的溫度(例如，8(TC)溫育樣品。高於6(TC的溫育時間可以 不同，例如l小時-6小時。然而，高於60'C的最長溫育時間應不超過16小時；
(g)現在溶液中完整蛋白質的含量足夠可以進行，例如定量測定。
本發明方法的另一優選實施方式使用含有DTT的提取緩衝液。使用DTT作 為還原劑公認對於分離的完整蛋白質的產率特別有益。該實施方式的優點尤其在於 獲得的裂解液可以直接定量測定，特別適用於本領域技術人員已知的市售可得的蛋 白質定量測定試驗，例如Pierce的BioRad DC⑧或BCA試驗⑧並可用於進一步 分析。可以不稀釋樣品，從而避免檢測的不精確並確保在隨後的分析(例如，蛋 白質印跡)中使用相同量的蛋白質。
圖1顯示了本發明方法臨床應用的一個例子。福馬林固定的組織中完整蛋 白質的高產率使得可首次整合常規獲得的生物活檢或解剖物質的組織學、免疫組織 學和定量蛋白質表達。例如，該方法能在不同疾病階段(惡化前、侵襲性)或治療前 後通過蛋白質陣列精確檢測疾病標記。
圖2顯示了通過在高於60。C的溫度溫育組織樣品提高蛋白質產率的例子。比 較了在60。C (左圖)與用本發明方法&6(TC，例如，80°C，右圖)溫育樣品後通過蛋 白質印跡檢測的a-微管蛋白(完整的蛋白質，50kDa)產率。
圖3顯示了從福馬林固定的組織提取後兩種蛋白質(E-鈣粘蛋白、a-微管蛋 白)的相關性。兩種蛋白質的信號強度彼此良好相關，即從福馬林固定的組織分 離後完整的蛋白質彼此相關(定量的)。採用蛋白質印跡分析正常結腸組織的蛋白質 裂解液的不同稀釋液(1:2-1: 16)。為了說明，顯示了從載玻片上刮下前後的組織(箭 頭)。Unverd.=未稀釋的樣品。
圖4顯示了蛋白質印跡(檢測蛋白質的完整性，證明抗體特異性)和形式最 簡單的反相蛋白質陣列(斑點印跡)之間的相關性。採用蛋白質印跡和斑點印跡檢
測正常結腸組織的蛋白質裂解液的不同稀釋液(1:2-1:64)。對於光密度評估，在各
情況下，百分比值相對於未稀釋的樣品作圖(下圖X未稀釋的樣品=ioo%)。 Negative,陰性對照(提取緩衝液)；Positive,陽性對照(深凍結腸組織的蛋白質裂解 液)。
圖5顯示了用含有不同還原劑的緩衝液提取FFPE切片後P-肌動蛋白的相 關性。(A)用兩種提取緩衝液EB(含有p-巰基乙醇)和EB2(含DTT)分離正常腦 組織的完整蛋白質。採用斑點印跡通過(3-肌動蛋白免疫染色(immunocolouration) 分析蛋白質裂解液的稀釋液。信號強度良好相關。(B)用市售可得的蛋白質定
量試劑盒測定用提取緩衝液EB2製備的蛋白質裂解液的蛋白質濃度。(C)根據 用蛋白質定量試劑盒定量的蛋白質和斑點圖中的相關性，採用SDS-PAGE分離 各20嗎的兩種蛋白質裂解液，採用蛋白質印跡測定P-肌動蛋白的含量。兩份 樣品的信號強度良好相關並能定量。
本發明所稱的緩衝液或緩衝液系統涉及具有1.0-9.0範圍內特定pH值的緩衝液。
本領域技術人員已知且適用於細胞裂解的所有去汙劑可用作本發明方法的去 汙劑。特別是SDS、脫氧膽酸鈉、CHAPS、 Triton XIOO、 Nonidet P40或吐溫20
可用作去汙劑。
去汙劑的濃度可以是，例如0.1-10%。特別優選的濃度範圍在約1-5%之間。 此夕卜，緩衝液可含有額外的還原劑，例如1,4-二硫-DL-蘇糖醇、DTE、 TCEP 或MEA。
本發明所稱的蛋白質水解活性化合物應理解為包括所有蛋白質切割化合 物，例如蛋白質水解酶，如蛋白酶，特別是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋 白酶、胃蛋白酶、鏈黴蛋白酶和內切蛋白酶Lys-C。此外，本發明所稱的蛋白 質水解活性化合物也包括適合於切割蛋白質的非酶促物質，例如溴化氰 (bromocyan)。
本發明所稱的生物學樣品可以是完整的生物體、組織切片、組織樣品、體液、 細胞或病毒物質。本發明方法優選使用組織樣品和/或細胞培養物。這些樣品可以 是人或動物的生物學樣品，但也可以是細菌、病毒或單細胞生物的樣品。 優選用福馬林固定生物學樣品和/或用福馬林固定並用石蠟包埋。 因此，本發明描述了從福馬林固定的生物學樣品提取蛋白質的方法，該方 法在足以釋放蛋白質的溫度下用緩衝液溫育生物學樣品，所述緩衝液含有去汙劑和 無蛋白水解活性的化合物，首先加熱緩衝液中的生物學樣品，然後在高於6(TC的 溫度再次溫育。
生物學樣品優選在緩衝液中加熱5-40分鐘。特別優選加熱生物學樣品20分鐘 -16小時。
本發明的特別優點是所釋放的蛋白質基本上完整。
20。
緩衝液優選含有額外的還原劑，例如1，4-二硫-DL-蘇糖醇、DTE、 TCEP或 MEA。
當生物學樣品是用福馬林固定和石蠟包埋的樣品時，在提取蛋白質之前要 脫石蠟。
本發明方法的優點是可以進一步級分提取的蛋白質。 具體地說，可用一個或多個步驟級分提取的蛋白質。 另一優點是隨後可以定量測定蛋白質。
優選通過Lowry或BCA方法定量測定蛋白質，也可採用其它定量測定方法， 特別是蛋白質陣列。
然後可用多蛋白水解酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白激酶K、木瓜 蛋白酶、胃蛋白酶、鏈黴蛋白酶、內切蛋白酶Lys-C、內切蛋白酶Glu-C-或糖 苷酶(如內切糖苷酶H、 N-糖苷酶F、神經氨酸酶(neuroaminidase))或磷酸酶進一 步處理提取的蛋白質。
這些蛋白質優選可用於至少一種生物化學試驗。
例如，優選的生物化學試驗是蛋白質陣列，例如微陣列，特別是夾心免疫陣
列、抗原捕捉陣列或直接蛋白質陣列。
生物化學試驗優選用於測定一種或幾種診斷或臨床相關的標記蛋白質。 因此能相互比較至少兩種生物學樣品的標記蛋白質。例如，因而能區分患病
和健康(對象)。此外，也可在較高的多重水平(multiplexlevel)進行該試驗以分析一
種或多種相關標記。
特別優選的生物學樣品是組織樣品，例如用石蠟包埋的福馬林固定樣品。
特別優選的緩衝液不含有蛋白酶，如蛋白水解活性化合物。
此外，本發明提供從福馬林固定的樣品中定量提取完整蛋白質的試劑盒，
其裝有
(a) 不含蛋白水解活性化合物的緩衝液系統，和
(b) 去汙劑。
試劑盒優選裝有SDS、脫氧膽酸鈉、CHAPS、 Triton X100、 Nonidet P40或
吐溫20作為去汙劑。
特別優選的緩衝液不含有蛋白酶，如蛋白水解活性化合物。 具體實施例
實施例l:從福馬林固定的組織提取蛋白質
下文詳細描述了本發明的典型蛋白質提取方法。圖2顯示了本發明方法相對 於標準方法的明顯改進之處(蛋白質產率高)。有經驗的操作者在一定程度上可以改 變該方案的一個或其它步驟。可以使用在一定程度上組成和pH不同的緩衝液。然 而，使用去汙劑，例如SDS，在95'C-10(TC加熱樣品和隨後在高於6(TC的溫度(例 如，8(TC)溫育是至關重要的；此外不可使用蛋白酶。各熱處理的時間和緩衝液的 體積可以不同。組織的手工切碎也可以不同。例如，可採用機械方法(例如，使用 研棒)或超聲進行。本文列出了典型的時間和體積。圖3顯示了福馬林固定組織 的兩種蛋白質的相關性結果。圖4顯示了含有福馬林固定組織的完整蛋白質 的第一種蛋白質陣列(反相蛋白質陣列，斑點印跡)。
典型過程
1. 用同樣的石蠟塊製備2X10pm切片
2. 使切片脫石蠟
2.1. IO分鐘二甲苯，重複2X
2.2. 10分鐘100%乙醇
2.3. 10分鐘96%乙醇
2.4. 10分鐘70%乙醇
2.5. 將切片轉移至蒸餾水中
3. 從蒸餾水中取出切片，簡單幹燥(但不應幹透)
4. 用套管刮下組織區域
5. 將套管上的組織轉移入100 提取緩衝液(EB)* (每1.5 ml反應容器2 個切片的組織)
6. 用特氟隆研棒在提取緩衝液中充分研磨，置於冰上
7. 旋振，置於冰上
8. 重複步驟6-7—次
9. 利用注射器小心抽吸溶液數次10. 旋振，置於冰上
11. 旋振，置於冰上(如果泡沫很多，短時離心)
12. 20分鐘，100。C (水浴) 13.2小時，80°C (搖床，750 rpm)
14. 離心15分鐘，4°C， 12500 rpm
15. 將上清液轉移入新鮮的1.5ml反應容器-〉準備蛋白質裂解
*製備提取緩衝液(EB): T-PER (Pierce)/Lammlil:2
a. 5X Lammli緩衝液母液(不含溴苯酚藍)10 ml每批 2.5 ml 1.25 M Tris/HCl (pH 6.8)
4.5 ml甘油
2.8 ml P-巰基乙醇
1 g SDS
用蒸餾水加至10 ml
b. 2XLammli緩衝液1000 pi 5 XLammli緩衝液+ 1500 pi蒸餾水
c. 對於5ml提取緩衝液 2.5 ml T-PER (Pierce)
+ 2.5 ml 2XLSmmli緩衝液
+ '/2完全Mini蛋白酶抑制劑藥片(Bayer)
-201:冷凍等份試樣
實施例2:用另一種提取緩衝液EB2從FFPE組織提取蛋白質
本發明方法的另一實施方式使用DTT(l，4-二硫-DL-蘇糖醇)。例如，在用 BioRad公司的DC蛋白質測定試劑盒⑧或Pierce的Micro BCA測定試劑盒⑧定
量測定分離的蛋白質中優選使用DTT(圖5)。
SDS濃度和在IO(TC和8(TC的相應溫育時間不變。該實施方式的優點是能用 不含會干擾測定的組分(在這裡是還原劑)的市售蛋白質定量試劑盒直接測定待用 蛋白質裂解液的濃度。線性區域內能更好的檢測蛋白質濃度，如果合適的話，隨後 必須稀釋樣品，只是因為蛋白質含量高。這樣可以獲得更精確的檢測結果，從而可 將各含量的蛋白質用於下遊應用。
1. 從同樣的石蠟塊上切下2X10^im的切片，轉移至反應容器中
2. 使切片脫石蠟
2.1. 10分鐘二甲苯，重複2X
2.2. 10分鐘100%乙醇
2.3. 10分鐘96%乙醇
2.4. 10分鐘70%乙醇
3. 加入100^提取緩衝液(EB2)*
4. 旋振，置於冰上
5. 小心地將溶液抽入移液管數次
6. 旋振，置於冰上(如果泡沫很多，短時離心)
7. 20分鐘，IO(TC (水浴)
8. 2小時，80。C (搖床，750 rpm)
9. 離心15分鐘，4°C， 12500 rpm
10. 將上清液轉移入新鮮的1.5ml反應容器+準備蛋白質裂解
11. 用市售蛋白質定量試劑盒定量測定
另一種提取緩衝液2(EB2) 90 mM Tris/HCl (pH 6.8) 20%甘油 2 % SDS
1 mM DTT (1,4-二硫-DL-蘇糖醇) -20^冷凍等份試樣
權利要求
1.從福馬林固定的生物學樣品提取蛋白質的方法，該方法是在足以釋放所述蛋白質的溫度下，在緩衝液中溫育所述生物學樣品，其特徵在於，所述緩衝液含有去汙劑，不含蛋白水解活性化合物，首先加熱所述緩衝液中的所述生物學樣品，然後在高於60℃的溫度再次溫育。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，將所述生物學樣品在所述緩衝 液中加熱5-40分鐘。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，將所述生物學樣品溫育 20分鐘到16小時。
4. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所釋放的蛋白質是 完整的。
5. 如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述去汙劑是SDS、 脫氧膽酸鈉、CHAPS、 TritonX100、 Nonidet P40或吐溫20。
6. 如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述緩衝液還含有 還原劑，例如1,4-二硫-DL-蘇糖醇、DTE、 TCEP或MEA。
7. 如權利要求l-6中任一項所述的方法，其特徵在於，當所述樣品是用石 蠟包埋的福馬林固定樣品時，先使該生物學樣品脫蠟再提取蛋白質。
8. 如權利要求l-7中任一項所述的方法，其特徵在於，提取後進一步級分 所述蛋白質。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，用一個或多個方法步驟級分提 取的蛋白質。
10. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特徵在於，隨後定量測定提 取的蛋白質。
11. 如權利要求IO所述的方法，其特徵在於，採用Lowry或BCA方法定量測定蛋白質。
12. 如權利要求1-11中任一項所述的方法，其特徵在於，用蛋白水解酶， 例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白激酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈黴蛋 白酶、內切蛋白酶Lys-C、內切蛋白酶Glu-C-或糖苷酶-如內切糖苷酶H、 N- 糖苷酶F、神經氨酸酶)或磷酸酶處理提取的蛋白質。
13. 如權利要求1-12中任一項所述的方法，其特徵在於，所述蛋白質用於 至少一種生物化學試驗。
14. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述生物化學試驗是蛋白質 陣列，例如微陣列，特別是夾心免疫陣列、抗原捕捉陣列或直接蛋白質陣列。
15. 如權利要求13或14所述的方法，其特徵在於，所述生物化學試驗用 於測定一種或幾種診斷或臨床相關的標記蛋白質。
16. 如權利要求15所述的方法，其特徵在於，相互比較至少兩個生物學樣 品的標記蛋白質。
17. 如權利要求l-16中任一項所述的方法，其特徵在於，所述生物學樣品 是組織樣品。
18. 如權利要求1-17中任一項所述的方法，其特徵在於，所述蛋白水解活 性化合物是蛋白酶。
19. 從福馬林固定的樣品中定量提取完整蛋白質的試劑盒，其裝有(a) 不含蛋白水解活性化合物的緩衝液系統，和(b) 去汙劑。
20. 如權利要求19所述的試劑盒，其中去汙劑是SDS、脫氧膽酸鈉、CHAPS、 Triton XI00、 Nonidet P40或吐溫20。
21. 如權利要求20所述的試劑盒，其特徵在於，所述蛋白水解活性化合物是 蛋白酶。
全文摘要
本發明涉及能溶解，隨後定量測定福馬林固定生物學樣品中的完整蛋白質的方法。該方法能提取這些樣品的全長蛋白質，隨後對其進行分析。
文檔編號C07K1/36GK101180310SQ200680017361
公開日2008年5月14日 申請日期2006年5月10日 優先權日2005年5月19日
發明者K·-F·貝克, P·普羅斯維斯基 申請人:恰根有限公司