口蹄疫雜交瘤細胞株、單克隆抗體、檢測試劑和試劑盒的製作方法

2023-12-09 01:53:51 2

專利名稱：口蹄疫雜交瘤細胞株、單克隆抗體、檢測試劑和試劑盒的製作方法
口蹄疫雜交瘤細胞株、單克隆抗體、檢測試劑和試劑盒技術領域
本發明系有關於一種生產抗口蹄疫病毒之單克隆抗體的雜交瘤細胞、其單克隆抗體，及包含此單克隆抗體的免疫檢測試劑和試劑盒，特別是關於一種可用於夾心酶連接免疫吸附試驗之生產抗口蹄疫病毒非結構蛋白之單克隆抗體的雜交瘤細胞株、其單克隆抗體，以及包含此單克隆抗體的免疫檢測試劑和試劑盒。
背景技術：
口蹄疫(FMD ；foot-and-mouth diease)為偶蹄類動物之高度傳染性疾病，主要感染的經濟動物如牛，豬和綿羊。口蹄疫常以發燒與嘴、舌頭、鼻孔、腳和乳頭的上皮水泡及腐爛等症狀為特徵。口蹄疫病毒是一個正股RNA病毒，隸屬於Picornaviridae科之 Aphthovirus屬，為小的無封套病毒，含有8. 5kbp基因可轉譯出結構與非結構蛋白(NSPs)。 本病毒含有7種血清型，包括0、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2和SAT 3等分布在全世界，而每個血清型無交叉保護作用，FMDV在各個血清型之間由於具有高的突變速率因此演化的過程也是即為快速，其中於病毒的表面如VPl結構蛋白為主要的中和部位是極具有可塑性 (Plasticity)及高抗原性變異。在1997年，臺灣爆發嚴重的口蹄疫疫情，由血清型0型病毒引起的(命名為0/TAW/97)。此株為非典型的嗜感染豬原型。經試驗研究發現該株之非結構蛋白區3A之一段(即93-102)密碼子缺損，此片段為決定病毒是否能於試管內牛上皮細胞增殖之主要限制生長因素，故此缺損片段之病毒株證實是造成0/YUN/TAW/97病毒株在牛隻體內毒力減弱的原因。在1997年爆發當時，由於控制和貿易限制等而造成國家經濟受到嚴重的影響(估計總值超過60億美元)。另一病毒株，在金門發現自亞臨床感染的動物，病毒基因含有全長的3A非結構蛋白轉譯區，證實為牛型之強毒株(0/TAW/2/99)。0/ TAW/2/99 口蹄疫病毒為南亞血清0型的地理型(Topotype)，自1999年入侵臺灣。當時疾病爆發後，立即採取檢疫措施，且在感染牧場中進行篩除，並儘快銷毀處置感染的畜體。而預防性篩檢疑似感染牧場也同時列入防堵措施。
若以傳統不活化病毒生產方法之缺點為(1)由於口蹄疫為高度傳染性疾病，藉由空氣傳染，製備不活化病毒需使用到病毒，不僅實驗室必須符合生物安全等級之三級負壓實驗室，而且實驗過程中病毒有可能發生再活化，危險性高。( 不活化病毒無法產生寄主於活體感染狀態下自然產生的非結構蛋白，因此檢測效能欠佳。發明內容
本案系利用大腸桿菌細胞(E.coli.)來表達口蹄疫病毒之非結構蛋白 (Non-Structural Protein, NSP)，利用親代細胞與骨髓瘤細胞融合而製成雜交瘤細胞株。 將0/TWA/99病毒株之3ABC基因應用pRSET、pET 32、pET43及pBlueBacHis2等載體系統進行克隆，再應用大腸桿菌及杆狀病毒進行蛋白質之表達，以純化後之NSP作為抗原進行酶結合免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ；ELISA)。特徵在於能夠專一性辨識動物感染口蹄疫病毒後所產生的NSP抗體，本案所保護之技術標的，包含針對FMDV5NSP的雜交瘤細胞株及其單克隆抗體，以及包含有該單克隆抗體之Sandwich ELISA檢測試劑或其試劑盒等。
而本案因應安全性及有效性考慮，不使用病毒而系利用分子生物學技術，以非結構重組蛋白的抗原決定位開發雜交瘤來生產單克隆抗體，此法不需用到病毒，可在二級實驗室進行，安全性高，而且該方法可以檢測NSP抗體，以正確分辨出活體感染口蹄疫病毒之個體。且經實驗發現，其敏感性及特異性皆高於95%以上，顯示本案發明對於感染口蹄疫病毒之檢體有專一性，並可區別自然感染及疫苗免疫動物產生之抗體。
本發明系提供一種雜交瘤細胞，系由親代細胞與骨髓瘤細胞融合而製成，其特徵如保藏號為PTA-11304之細胞株所示，親代細胞系由原核細胞所表達之口蹄疫病毒之由 3ABC基因片段所編碼之NSP作為抗原免疫至小鼠，並將小鼠體內之脾臟細胞取出而製成， 且雜交瘤細胞株所生產之單克隆抗體能夠專一性辨識口蹄疫病毒之3ABC肽片段，且不會與豬水皰病(Swine vesicular disease ；SVD)抗血清產生非特異性反應。
因此，本發明之主要目的為提供一種雜交瘤細胞株，由於其所生產之單克隆抗體對口蹄疫病毒之NSP具有專一性辨識能力，且不會與其它水皰性疾病抗體產生交叉反應， 故可用於發展免疫快速檢測試劑之用途。
此外，本發明亦提供一種單克隆抗體，其特徵在於其系由保藏號PTA-11304所產生，且可專一性辨識口蹄疫病毒之NSP 3ABC肽片段，且對於豬水皰病抗體無交叉反應。
因此，本發明之主要目的為提供一種單克隆抗體，由於其對口蹄疫病毒之NSP具有專一性辨識能力，且不會與其它水皰性疾病抗體產生交叉反應，故可用於發展免疫快速檢測試劑之用途。
又，本發明尚提供一種包含有上述單克隆抗體的免疫檢測試劑、免疫檢測試劑盒， 以及利用上述抗體之免疫檢測方法，由於所使用的單克隆抗體對口蹄疫病毒之3ABC肽具有專一性辨識能力，且不會與其它水皰性疾病抗體產生交叉反應，故可用於發展免疫快速檢測試劑之用途。


圖1為Sandwich ELISA方法之解析圖。
符號說明
固相載體10
單克隆抗體11
樣本抗原12
待測檢體13
偵測抗體14
訊號產生物質15
受質1具體實施方式
由於本發明系揭露一種雜交瘤細胞株、其單克隆抗體、利用前述單克隆抗體所製作之免疫檢測試劑及試劑盒，其中所利用之免疫學原理、細胞培養、染色及蛋白質偵測等相關技術，已為相關技術領域具有通常知識者所能明了，故以下文中之說明，不再作完整描述。同時，以下文中所對照之圖式，系表達與本發明特徵有關之示意，並未亦不需要依據實際情形完整繪製，合先敘明。
本發明第一實施例系提供一種雜交瘤細胞株，可生產抗口蹄疫病毒之單克隆抗體，其流程如第1圖所示，系以Sp2/0骨髓瘤細胞株與自BALB/c小鼠取得之親代細胞進行製備，此雜交瘤細胞株之保藏號為PTA-11304，且其所生產之單克隆抗體可專一性辨識口蹄疫0/TAW/99病毒株之NSP。
本發明所提供之保藏號PTA-11304所示之雜交瘤細胞株，其親代細胞系依下列步驟所製備而得
步驟一首先，設計適當引物，利用反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)，針對口蹄疫0/TAW/99病毒株之NSP 3ABC基因進行擴增。其中，擴增之目標基因片段又以3ABC基因片段中的高度保守區域(Highly conserved region)為佳，其核酸序列如SEQ ID N0:1所示，而其胺基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
步驟二 將步驟中藉由反轉錄-聚合酶連鎖反應所得之3ABC基因片段構建至pET 載體。完成序列確認後，利用限制酶切割，將所得之目標基因片段再構建至PTH 162-B載體，將構建完成後的PTH質粒轉到(trangene)原核細胞中，並使其表達pTH 162-B中3ABC 基因片段所編碼的重組蛋白。此步驟所使用的原核細胞以大腸桿菌為佳。
步驟三將步驟二中利用原核細胞所表達而得的重組蛋白進行純化後當作免疫抗原，對BALB/c小鼠重複進行注射，使其產生針對3ABC重組蛋白的免疫反應。再將免疫後的 BALB/c小鼠脾臟細胞取出，作為製備可生產抗口蹄疫病毒NSP單克隆抗體的雜交瘤細胞株之親代細胞。
將上述步驟所製備而得的親代細胞與骨髓瘤細胞株進行融合而得到雜交瘤細胞。 利用間接酶結合免疫吸附試驗(Indirect ELISA)及^festern印跡法(Western blotting) 篩選出其培養之上清液對於0/TAW/99病毒株之3ABC重組蛋白具有特異性反應的雜交瘤細胞株。
經由上述步驟篩選後所得之雜交瘤細胞株，其生產出的單克隆抗體對於口蹄疫0/ TAW/99病毒株之NSP具有專一性辨識能力，前述之NSP包含有3ABC基因片段的高度保守區域所編碼之肽片段。
本發明之第二較佳實施例為單克隆抗體，具有保藏於美國典型培養物保藏 Φ ( ATCC , Patent Deposit Designation, jft tit =Manassas, VA, USA) 1 Ii ^ ^ PTA-11304(保藏日期2010年9月14日)之雜交瘤細胞株所生產的單克隆抗體之特徵。由保藏號PTA-11304之雜交瘤細胞株所生產的單克隆抗體，對於口蹄疫病毒中屬於血清型0 型的0/TAW/99病毒株的NSP具有專一性辨識能力，特別是對於NSP中3ABC基因中高度保守區域所編碼之肽片段具有專一性辨識能力，且對於豬水皰病(SVD)抗體無交叉反應。
此外，由於製備本較佳實施例單克隆抗體之抗原系衍生自口蹄疫病毒0/TAW/99 病毒株中NSP之3ABC基因片段高度保守區域所編碼的重組蛋白，因此，經由後續實驗結果可得知，本較佳實施例所提供之單克隆抗體，亦可辨識屬於血清型如A型、C型、Asia 1型、 SAT 1型、SAT 2型及SAT 3型等的口蹄疫病毒。
又，為了得到高濃度及高純度的單克隆抗體，除了藉由活體外(In vitro)細胞培CN 102533663 A養技術以大量培養第一較佳實施例所提供的雜交瘤細胞株並收集其培養上清液之外，亦可將第一較佳實施例所提供的雜交瘤細胞株注入小鼠腹腔內，收集所產生的腹水。無論藉由活體外細胞培養所收集而之上清液，或是自小鼠體內收集而得的腹水，均可藉由適當之純化過程(例如利用proteinA管柱層析法)，純化出本較佳實施例之單克隆抗體。
本發明之第三較佳實施例係為一種免疫檢測試劑，用於酶結合免疫吸附試驗 (ELISA)中，藉以檢測待測抗體，其中包含有如第二較佳實施例中所描述的單克隆抗體。由於本較佳實施例之免疫檢測試劑中所含有的單克隆抗體系以小鼠脾臟細胞作為親代細胞而製得，屬於小鼠品系之IgG免疫球蛋白，故可配合其他適當的試劑，藉由Sandwich ELISA 以偵測待測之豬只檢體中是否含有抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體。
本發明之第四較佳實施例為一種免疫檢測試劑盒，藉由Sandwich ELISA以檢測豬只檢體中是否帶有抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體。本較佳實施例之免疫檢測試劑盒，包含有
(1)單克隆抗體，其特徵如同第二較佳實施例所提供之單克隆抗體，對於口蹄疫 0/TAW/99病毒株NSP中3ABC基因片段所編碼之肽片段具有專一性辨識能力。此外，單克隆抗體11系以適當濃度塗布於固相載體上。固相載體可以是微孔盤、微球體、雜交膜、或是試紙。
(2)偵測試劑，包含有偵測抗體及訊號產生物質，偵測抗體可直接與訊號產生物質共軛結合。前述的訊號產生物質可以是放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物(化學冷光標記物或生物冷光標記物)、螢光標記物，或是酶；適合本較佳實施例的酶可以是過氧化氧酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、鹼性磷酸 Sl (Alkaline phospatase ；AP)、以及 beta—半乳糖昔醇(Beta—galactosidase)。而在訊號產生物質是酶的狀況下，偵測抗體是與生物素(Biotin)共軛結合，另外訊號偵測物質則以酶形式與抗生物素蛋白連接。
(3)樣本抗原，系衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株之NSP中3ABC基因高度保守區域所編碼之重組蛋白。
此外，本較佳實施例所提供之免疫檢測試劑盒，可進一步包含有受質，受質可與酶反應而發生呈色反應。受質的種類與試劑盒中所選用的酶系統有關，例如酶為 HRP 時，受質以 ABTS(2，2 『 -azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6_sulfonate)) 為佳；而當酶為AP時，選用的受質則以溶解於DEA (Diethanolamine)緩衝溶液中的 PNPP(Para-nitrophenylphosphate)為{圭。
又，本較佳實施例之免疫檢測試劑盒亦可進一步包含有衝洗試劑(Wash reagent)，衝洗未附著於固相載體的單克隆抗體，或是將未與單克隆抗體產生專一性結合的樣本抗原、待測樣本之雜質、偵測抗體及訊號產生物質衝洗出來，避免上述物質殘留而造成檢測結果之誤差甚至是偽陽性結果的發生。衝洗試劑的組成則可為磷酸鹽緩衝溶液 (PBS)、三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液(TBS)、Tween 20，或是上述溶液的任意組合。
本較佳實施例之免疫檢測試劑盒亦可進一步包含有阻隔試劑(Blocking reagent)，將固相載體中未結合單克隆抗體之位置加以阻隔，以避免後續添加之樣本抗原、 待測樣本、偵測抗體及訊號產生物質附著所造成的偽陽性訊號。阻隔試劑則以包含有蛋白質為佳，蛋白質可以是牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)、動物明膠(Gelatin)，或是前述蛋白質的任意組合。此外，亦可直接使用脫脂牛乳做為本較佳實施例之阻隔試劑。
本發明亦提供一種免疫檢測方法，如下述第四較佳實施例所示，系利用ELISA來檢測待測抗體。請參閱第1圖，為本實施例所利用之Sandwich ELISA方法之解析圖。免疫檢測方法包含有下列步驟
步驟一提供固相載體10。
步驟二 提供單克隆抗體11，具有如第二較佳實施例所提供之單克隆抗體的特徵，為保藏於美國ATCC Intent Deposit Designation保藏號為PTA-11304之雜交瘤細胞株所生產，且對於口蹄疫病毒中屬於血清型0型的0/TAW/99病毒株的NSP具有專一性辨識能力，特別是對於NSP中3ABC基因中高度保守區域所編碼之肽片段具有專一性辨識能力。
步驟三將步驟二所提供單克隆抗體11施加(Applying)至固相載體10上。
步驟四提供樣本抗原12，樣本抗原12系與步驟二所提供之單克隆抗體11進行專一性結合。樣本抗原12則以衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株的NSP為佳，又以衍生自口蹄疫0/TWA/99病毒株的3ABC基因之重組蛋白為更佳。
步驟五提供待測檢體13。將待測檢體13施加於固相載體10上，且待測檢體13 可操作性地與步驟四所提供的樣本抗原12進行免疫反應，藉以於固相載體10上與單克隆抗體11及樣本抗原12共同形成免疫複合物。
步驟六提供偵測試劑，偵測試劑可操作性地與於步驟五中所形成的免疫複合物進行免疫反應，藉以產生訊號。
步驟七偵測由步驟6中所產生的訊號。
此外，本較佳實施例中，步驟六所提供的偵測試劑，可進一步包含有偵測抗體14 與訊號產生物質15 ；偵測抗體14與訊號產生物質15之特徵、相互連結關係，以及選用種類與第四較佳實施例中所述大致相同，在此不再贅述。
本較佳實施例亦可進一步包含提供衝洗試劑之步驟，將步驟三中未附著於固相載體10上的單克隆抗體11，或是將步驟四中未與單克隆抗體11產生專一性結合的樣本抗原 12、步驟六中待測檢體13所帶有之雜質，步驟六中未與形成於步驟五中的免疫複合物進行免疫反應的偵測抗體14及訊號產生物質15衝洗出來，避免上述物質殘留而造成檢測結果之誤差甚至是偽陽性結果的發生。而衝洗試劑可為PBS、TBS、Tween 20，或是上述溶液的任思組合。
此外，若是步驟六所提供的偵測試劑包含有以酶作為其訊號產生物質15，則需要另外加入與所提供酶產生免疫反應的受質16。例如當使用HRP需使用ABTS作為其受質， 而當使用AP時，其受質則以溶於DEA溶劑的PNPP為佳；此外，依據步驟六所使用的酶與受質的種類，需要有不同的偵測方法來偵測這些由不同系統所產生的訊號。例如當使用 HRP作為酶及ABTS作為受質的呈色系統時，檢測結果系利用各待測樣本在波長為450nm或 460nm下的吸收光譜加以判定；而當使用AP作為酶及PNPP及DEA作為受質的呈色系統時， 檢測結果則利用各待測樣本在波長為430nm下的吸收光譜加以判定。
本較佳實施例亦可進一步包含提供阻隔試劑之步驟，此步驟之目的在於將固相載體在步驟三之後未結合單克隆抗體之位置加以阻隔，以避免後續於步驟四、五及六中添加之樣本抗原、待測檢體、偵測抗體及訊號產生物質直接附著於固相載體上所造成的偽陽性訊號。阻隔試劑則以包含有蛋白質為佳，蛋白質可以是BSA、酪蛋白、動物明膠，或是前述蛋白質的任意組合。此外，亦可直接使用脫脂牛乳作為本較佳實施例所提供的阻隔試劑。
本發明另提供下列實驗例作為本發明之進一步說明，但並非作為本發明之限制。
實驗例1 材料與方法
1. 1 血清
為測試檢測之靈敏度，自年齡為8周的豬只且經過口蹄疫病毒0/TAW/97病毒株試驗攻毒感染後34天的豬只採集32個口蹄疫陽性(FMD-positive)豬只血清樣本。
為比較本發明所提供之夾心ELISA檢測試劑盒與其他三種商售之ELISA檢測試劑盒，系自32頭不帶特定致病原(Specific-pathogen-free ；SPF)且經實驗性感染口蹄疫病毒0/TAW/97病毒株的豬只採集其血清樣本，共計320個。前述320個血清樣本的採集時間點為感染病毒後第0、2、4、6、8、10、14、21、28，以及第34天。此外，30個血清樣本採集自以口蹄疫0/TAW/97病毒株進行實驗性感染後觀天的豬只亦並同測試。
為測試專一性，自未感染之豬只採集255個血清樣本，以及自施打過疫苗的豬只中採集了 165個血清樣本。自未感染之豬只所採集到的255個血清樣本其中有96個系自 SPF豬只體內採集而得，其餘159個則採集自1997年口蹄疫疫情爆發前未感染之豬只。自施打過疫苗的豬只中所採集到的165個血清樣本，系自165未經感染且施打過2次市售0 血清型口蹄疫病毒疫苗的豬只體內所採集而得。
此外，為評估本發明所提供的Sandwich ELISA檢測試劑盒對豬水皰病毒(Swine vesicular disease virus ；SVDV)可能發生的交叉反應(Cross-reactivity)，以及為了要證實本發明所提供的Sandwich ELISA檢測試劑盒對不同血清型口蹄疫病毒之間的交叉反應，使用 6 個抗 SVDV 的抗血清(Antiserum) (UKG/27/72strain EU SVD reference serum batch 2002)以及6個牛隻的抗不同血清型(血清型A、C、Asia USAT USAT 2、SAT3) 口蹄疫病毒的抗血清系來自英國動物衛生研究所(Institute for Animal Health,Pirbright, United Kingdom)產制。
恢復期中的豬只血清是由實驗性感染0/TAW/97及0/TAW/99病毒株的豬只，在感染觀天后分別取得，其血清中和抗體效價(SN titer)分別為1 256與1 512，作為 Wfestern印跡法(Western blotting)及Sandwich ELISA中所使用的陽性對照組，另陰性對照組係為SPF豬只血清。
1. 2 反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)引物設計
一引物對(Primer pair)系設計用來自口蹄疫病毒0/TAW/99病毒株基因體擴增其3ABC基因區域的核酸片段(GenBank accession No. AJ539137之第5595號至第6119號核苷酸區域，其詳細序列如SEQ ID NO :1所示，其胺基酸序列如SEQ ID N0:2所示)。其正向引物(Forward primer)其序列為5 『 -CACCGGATCCTGTCGCGAGACTCGCAAGAGACAGCAG-3 『， 其中包含有BamHI限制酶之酶切位點；而其反向引物(Reverse-primer)之序列為5' -CC CGAATTCGCACGTCTTCCCGTCGAGGATGAGCTC-3 『，其中包含有 EcoRI 限制酶之酶切位點。
1. 3 反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
反轉錄-聚合酶連鎖反應混合物系利用Superscript One-Step RT-PCRSystem 以及Platinum Pfx DNA Polymerase 製備而得，而反應系利用 GeneAmp PCR system MOOthermocycler熱循環機中進行；而反應進行溫度及時程如下首先將反應樣本培育於7/13 頁420C中40分鐘，接著再於90 95°C中進行50秒的預加熱變性(Pre-denaturation)，接著再重複進行30 40次的下列熱循環於90 95°C中加熱變性(Denaturation) 30秒，於 50 55°C中退火(Annealing) 30秒，於68 72°C中延伸(Extension) —分鐘。最後再於 72°C中延伸七分鐘，並設定將樣本保持於4°C。經上述反轉錄-聚合酶連鎖反應所得之產物系保存於-20°C中，直至後續實驗所需。其中10微升(yL)的反轉錄-聚合酶連鎖反應產物系經由2%的瓊脂電泳分析，並且利用STORSafe DNA gel stain染劑，於一倍的TAE緩衝溶液中染色，並於UV光中進行顯色。
1. 4 口蹄疫病毒3ABC基因之克隆(Cloning)
首先，利用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit實驗試劑盒將瓊脂凝膠中的產物純化取出，再利用適當的限制酶(BamHl與EcoRl)進行處理後，與pET vector進行粘接，以製得一完整之表達載體。將前述表達載體導入BL21(DE!3)感受態細胞，並培養於添加 100微克/毫升(μ g/mL)氨苄西林(Ampicillin)的Luria-Bertani瓊脂培養皿中。將生長出的陽性菌落挑選出來，並利用Miniprep Kit試驗試劑盒萃取各菌落的質粒，且篩選出帶有3ABC基因片段的質粒樣本。最後，將篩選出的樣本進行DNA測序，以確認該質粒樣本所帶有的3ABC基因片段之核酸序列。
1. 5 口蹄疫病毒3ABC多肽於大腸桿菌中之表達與純化
將大腸桿菌以所製得的pTH 162-B質粒進行轉化，於添加100微克/毫升 (μ g/mL) Ampici 11 in的Luria-Bertani培養液在37 V中劇烈搖晃進行培養。當培養至中對數期(Mid-logarithmic phase)時，於培養液中添加異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropylthiogalactoside ；IPTG)，使其最終濃度為一毫摩爾濃度(mM)，並將培養液繼續培育4小時，以誘導3ABC多肽之表達。接著利用離心方式收集將大腸桿菌菌體，並加入細菌蛋白萃取試劑或超聲波震蕩法將菌體裂解。在裂解物中的可溶性的3ABC多肽系利用 His-Tag親和性層析管柱(Affinity chromatography column)加以純化，最後定量純化所得之產物。
1. 6 =SDS膠體電泳與Western印跡分析
經上述實驗例1. 5純化所得之3ABC多肽，系經由12% SDS膠體電泳加以分析； 經過12% SDS膠體電泳之後，再將蛋白質轉印於PVDF硝化纖維濾紙之上，利用Western印跡法分析其對於強陽性豬只血清之血清反應性。Western印跡法之步驟系使用的第一抗體為適當稀釋之陽性豬只血清，而第二抗體為適當稀釋之帶有鹼性磷酸酶的山羊抗豬(Goat anti-swine) IgG 抗體。最後利用 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)與氮藍四唑(Nitro blue tetrazolium)作為鹼性磷酸酶之受質及呈色物質。
1. 7 病毒中和測試
為確認用來作為陽性血清組經實驗性感染豬只的感染情形，感染病毒株的豬只，其血清收集後均依照國際動物衛生組織(Office International Des Epizooties ； OIE)-陸生動物診斷試驗及疫苗手冊(Manual ofDiagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals)之方法進行病毒中和測試。
1. 8 小鼠免疫與抗3ABC單克隆抗體之製備
生產抗3ABC重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株系經由下列方法製備以皮下注射的方式將200微克經由實驗例1. 5所製備而得的3ABC重組蛋白作為抗原來免疫BALB/11c小鼠，免疫間隔為4周。在進行細胞融合之前的3至4天，再將同量的抗原放入磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate-buffered saline)中以皮下注射方式對小鼠進行補強注射(Boost)。 將免疫後之BALB/c小鼠犧牲後取出其脾臟，並將取得之脾臟細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合以製得雜交瘤細胞。經過兩周後，利用含有口蹄疫病毒0/TAW/97或0/TAW/99重組蛋白的間接酶聯免疫吸附試驗(Indirect ELISA)，針對雜交瘤細胞的培養上清液進行篩選；此外，亦利用Western印跡法針對雜交瘤細胞的培養上清液進行篩選，其方法與實驗例 1. 6中所述相同。經間接酶聯免疫吸附試驗分析後，將測試結果陽性/陰性比例(Positive/ negative (P/N)ratio)大於2的雜交瘤細胞株挑選出進行放大培養。經判定為會生產抗 3ABC抗體之雜交瘤細胞株，將其注射入BALB/c小鼠腹腔，收及其產生之腹水。最後利用 Affi-Gel protein A管柱層析法自收集之腹水中純化出抗體，而純化所得之抗體濃度最高可至10毫克/毫升(mg/mL)。
1. 9 夾心酶聯免疫吸附試驗(Sandwich ELISA)
針對口蹄疫病毒株血清型0型的Sandwich ELISA(如圖一所示)系建立來對口蹄疫NSP之抗血清進行定量。一般來說，系先在微孔盤(Nunc Maxisorb)上塗布單克隆抗體，並以酸鹼值9. 6且0.06摩爾濃度(M)的碳酸/碳酸氫鹽緩衝溶液作為塗布緩衝液，塗布後培育於4°C下直至隔夜；單克隆抗體並依棋盤式滴定方式塗布於微孔盤，以決定單克隆抗體(CmA40)對口蹄疫病毒0型NSP之最佳濃度。塗布完成後，將以稀釋液進行最佳稀釋之口蹄疫病毒0型非結構重組蛋白加入微孔盤中，在37°C中培育一小時。之後，將以阻隔緩衝液適當稀釋後的豬只血清取100微升加入微孔盤中，在37°C中培育一小時。將連接有HRP的山羊抗豬IgG抗體(HRP conjugated-goat anti-swine IgG)以阻隔緩衝液稀釋後，在微孔盤中各反應孔中加入100微升。之後，使用3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(3，3，，5， 5，-tetramethylbenzidine ；TMB)作為受質，並在室溫中反應呈色10至15分鐘。最後，在各反應孔中加入50微升，1. 0摩爾濃度的硫酸以停止呈色反應，測量各反應孔中波長450nm 的OD值。上述各步驟中有在37°C中培育一小時者，之後再以清洗液清洗6次。
1. 10 偵測抗口蹄疫病毒NSP抗體的ELISA試劑盒之比較
本發明亦比較三種市售酶聯免疫吸附試驗試劑盒與本發明所提供之免疫檢測試劑盒，對於抗口蹄疫病毒NSP之抗體偵測能力的差異。Ceditest FMDV-NS檢測試劑盒 (Cedi-Diagnostics B. V. , Lelystad,Netherlands)為阻隔型(Blocking)酶連接免疫吸附試驗試劑盒，UBI FMD NS EIA檢測試劑盒(United Biomedical Inc. , Hauppauge,New York, USA)係為利用人工合成之3B肽的間接酶聯免疫吸附試驗試劑盒，CHEKIT FMD-3ABC檢測試劑盒(IDEXX Laboratories Inc. , ffestbrook, Maine, USA)係為利用大腸桿菌表達 3ABC 多肽的間接酶聯免疫吸附試驗試劑盒。上述檢測試劑盒之使用系依照各試劑盒製造商之使用說明。
實驗例2 大腸桿菌表達3ABC重組蛋白
口蹄疫病毒0/TAW/993ABC基因序列系取自美國國家生技資訊中心(NCBI) GenBank 資料庫中，GenBank accession No. AJ539137，第 5595 號至第 6119 號核苷酸區域，其詳細序列如SEQ ID NO :1所示，其中包含有525個核苷酸長度的編碼區域(Coding region)，故其編碼之重組蛋白為175個胺基酸長(序列如SEQ ID NO 2所示)。比較近來自亞洲、非洲與歐洲所分離出的泛亞洲(Pan-Asia) 口蹄疫病毒株血清型0型的基因組序列，其基因一致性約在97%至99%。
將上述經由反轉錄-聚合酶連鎖反應所擴增而得之DNA片段，插入pETvector表達載體。將前述表達載體導入大腸桿菌BL21DE3株系感受態細胞，並培養於添加100微克 /毫升Ampicillin的Luria-Bertani瓊脂培養皿中，挑選出陽性菌落，並萃取出帶有3ABC 基因插入片段的質粒。
將帶有3ABC基因插入片段的質粒送入大腸桿菌BL21DE3菌株進行轉化，並於添加 100微克/毫升Ampicillin的Luria-Bertani培養液在37°C中劇烈搖晃進行培養。當培養至中對數期時，於培養液中添加異丙基硫代半乳糖苷，使其最終濃度為一毫摩爾濃度，並將培養液繼續培育4小時，以誘導3ABC重組蛋白之表達。表達出的3ABC重組蛋白系利用親合性層析管柱加以純化，純化所得之3ABC重組蛋白經由12% SDS膠體電泳及Western印跡法加以分析。Western印跡分析之結果顯示，經由上述方法表達之蛋白其大小為40kDa， 且證實會與抗口蹄疫病毒之抗血清產生反應(結果未示)。經定量後，純化所得之3ABC之重組蛋白濃度約為11. 2毫克/毫升。
實驗例3 小鼠免疫與抗3ABC單克隆抗體之製備
生產抗3ABC重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株系經由下列方法製備以皮下注射的方式將200微克經由實驗例1. 5所製備而得的3ABC重組蛋白作為抗原來免疫BALB/ c小鼠，免疫間隔為4周。在進行細胞融合之前的3至4天，再將同量的抗原放入磷酸鹽緩衝溶液中以皮下注射方式對小鼠進行補強注射。將免疫後之BALB/c小鼠犧牲後取出其脾臟，並將取得之脾臟細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合以製得雜交瘤細胞。經過兩周後，利用含有口蹄疫病毒0/TAW/97或0/TAW/99重組蛋白的間接酶結合免疫吸附試驗，針對雜交瘤細胞的培養上清液進行篩選；此外，亦利用Western印跡法針對雜交瘤細胞的培養上清液進行篩選，其步驟方法與實驗例2中所述相同。經間接酶聯免疫吸附試驗分析後，將測試結果陽性/陰性比值(Positive/negative (P/N) ratio)大於2的雜交瘤細胞株挑選出進行放大培養。經判定為會生產抗3ABC抗體之雜交瘤細胞株，將其注射入BALB/c小鼠腹腔，收及其產生之腹水。最後利用Affi-Gel protein A(Millipore)管柱層析法自收集之腹水中純化出抗體，而純化所得之抗體濃度最高可至10毫克/毫升。
實驗例4 =Sandwich ELISA 之判讀
為確保各測試間品質控制血清測試結果的穩定，各Sandwich ELISA的96孔測試盤中無論陽性血清與陰性血清均做二重複。經統計18個測試之結果，陽性血清測試結果為 0. 90士0. 09，變異係數指標為9. 78%;陰性血清之測試結果為0. 09士0. 02，變異係數指標為 24.33%。共有770個測試血清OD45tlnm之測試結果皆以標準化呈現。陰性豬只血清共計觀7 個，其中包含有255件樣本由未感染之豬只所採集，而有32件樣本由感染後第0天之豬只所採集；前述觀7件陰性血清樣本與62頭實驗性感染的豬只共同用來決定本發明所提供之 Sandwich ELISA 結果的決定值(Cut-off value)。
本發明所提供之免疫檢測試劑盒的專一性確定測試系測試了 96頭SPF豬只體內採集之血清。所有測試樣本的OD45tlnm讀值最大頻度分布均小於0. 15，其中部份測試樣本的 OD450nm讀值最大頻度分布高於0. 06至0. 11。此外，自經疫苗接種免疫之豬只所採集而得之血清樣本，其測試結果的OD45tlnm讀值均小於0. 22。因此，決定值系定於OD45tlnm讀值為0. 22。 亦即，當待測樣本測試結果的OD45tlnm讀值小於0. 22時，則該測試結果判定為為陰性；而當待測樣本測試結果的OD45tlnm讀值大於或等於0. 22時，則該測試結果判定為陽性。測試結果如表一所示。
表一
權利要求
1.一種雜交瘤細胞株，系由親代細胞與骨髓瘤細胞融合而製成，其特徵如保藏號為 PTA-11304之細胞株所示，該親代細胞系由原核細胞所表達之口蹄疫病毒之由3ABC基因片段所編碼之非結構蛋白作為抗原免疫至小鼠，並將該小鼠體內之脾臟細胞取出而製成，且該雜交瘤細胞株所生產之單克隆抗體能夠專一性辨識口蹄疫病毒之該3ABC肽，且對於豬水皰病抗血清不會產生非特異性反應。
2.根據權利要求1所述之雜交瘤細胞株，系製備自口蹄疫病毒0/TAW/99病毒株，其分泌的單克隆抗體同時對0/TAW/97病毒株會產生專一性的結合。
3.根據權利要求2所述之雜交瘤細胞株，該非結構蛋白系衍生自該口蹄疫病毒2C、3A、 3AB、;3BC 及 3ABC 基因片段之一高度保守區域(highly conserved region)。
4.根據權利要求3所述之雜交瘤細胞株，該非結構蛋白3ABC基因片段之該高度保守區域具有如SEQ ID NO :1之核酸與胺基酸序列。
5.根據權利要求1所述之雜交瘤細胞株，該小鼠係為Balb/c品系小鼠。
6.根據權利要求1所述之雜交瘤細胞株，該原核細胞係為大腸桿菌。
7.根據權利要求1所述之雜交瘤細胞株，該單克隆抗體同時對於0型以外的口蹄疫病毒如血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型及SAT 3型等皆有專一性反應。
8.一種單克隆抗體，其特徵在於該單克隆抗體系由權利要求1至7中任一項所述之雜交瘤細胞株所產生，且對於口蹄疫病毒之3ABC肽具有專一性辨識能力，而對於豬水皰病之抗血清不會產生非特異性反應。
9.根據權利要求8所述之單克隆抗體，其特徵在於該口蹄疫病毒係為血清型0型(0 serotype)。
10.根據權利要求9所述之單克隆抗體，其特徵在於該口蹄疫病毒係為0/TWA/99病毒株。
11.根據權利要求8所述之單克隆抗體，其特徵在於該單克隆抗體對於口蹄疫病毒血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型或SAT 3型有交叉反應，即可辨識口蹄疫七種血清型。
12.一種免疫檢測試劑，系用於酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，藉以檢測一待測抗原，其特徵在於該免疫檢測試劑包含有權利要求9所述之單克隆抗體。
13.如權利要求12所述之免疫檢測試劑，該待測抗原係為抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗 # (anti-3ABC antibody)。
14.一種免疫檢測試劑盒，系利用夾心酶聯免疫吸附試驗檢測待測檢體中的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體(anti-3ABC antibody)，其特徵在於該免疫檢測試劑盒包含有如權利要求8所述之單克隆抗體及偵測試劑。
15.如權利要求14所述之免疫檢測試劑盒，進一步包含有抗原樣本，該抗原樣本系衍生自口蹄疫病毒之3ABC肽。
16.如權利要求14所述之免疫檢測試劑盒，該偵測試劑包含有偵測抗體及訊號產生物質。
17.如權利要求16所述之免疫檢測試劑盒，該偵測抗體與該訊號產生物質係為共軛結I=I O
18.如權利要求16所述之免疫檢測試劑盒，該訊號產生物質系選自下列所構成的群組之一放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物、螢光標記物及酶。
19.如權利要求18所述之免疫檢測試劑盒，該冷光標記物係為化學冷光標記物或生物冷光標記物。
20.如權利要求18所述之免疫檢測試劑盒，該酶系選自下列所構成的群組之一過氧化S酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、鹼性磷酸酶(Alkaline Phospatase ；AP)、以及 Beta-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase)。
21.如權利要求20所述之免疫檢測試劑盒，進一步包含有生物素及抗生物素蛋白，該生物素系與該偵測抗體連接，且該抗生物素蛋白系與該酶連接。
22.如權利要求21所述之免疫檢測試劑盒，進一步包含有受質，該受質可與該酶反應而發生呈色反應。
23.如權利要求14所述之免疫檢測試劑盒，進一步包含有衝洗試劑，該衝洗試劑系選自下列所構成的群組之試劑及其組合磷酸鹽緩衝溶液(PBS)、三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液(TBS)以及 Tween 20。
24.如權利要求14所述之免疫檢測試劑盒，進一步包含阻隔試劑，藉以阻隔固相載體上未結合該單克隆抗體之位置。
25.如權利要求M所述之免疫檢測試劑盒，該固相載體系選自下列所構成的群組之一微孔盤、微球體、雜交膜、及試紙。
26.如權利要求M所述之免疫檢測試劑盒，該阻隔試劑系包含有蛋白質，該蛋白質系選自下列所組成的群組之試劑及其組合牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)以及動物明膠(Gelatin)。
27.如權利要求M所述之免疫檢測試劑盒，該阻隔試劑係為脫脂牛乳。
28.一種免疫檢測方法，系利用酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)進行檢測，包含有下列步驟提供固相載體(Solid phase carrier)； 提供單克隆抗體，該單克隆抗體具有權利要求8所述之特徵； 將該單克隆抗體施加(Applying)至該固相載體； 提供樣本抗原，該樣本抗原系與該單克隆抗體進行專一性結合； 提供待測檢體，該待測檢體可操作性地與該樣本抗原進行免疫反應，藉以於該固相載體上形成一免疫複合物；提供偵測試劑，該偵測試劑可操作性地與該免疫複合物進行免疫反應，並產生訊號；以及偵測該訊號。
29.如權利要求28所述之免疫檢測方法，該抗原樣本系衍生自口蹄疫病毒之3ABC基因。
30.如權利要求觀所述之免疫檢測方法，該偵測試劑包含有偵測抗體與訊號產生物質。
31.如權利要求30所述之免疫檢測方法，該偵測抗體系與該訊號產生物質共軛結合。
32.如權利要求30所述之免疫檢測方法，該訊號產生物質系選自下列所構成的群組之一放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物、螢光標記物及酶。
33.如權利要求32所述之免疫檢測方法，該冷光標記物係為化學冷光標記物或生物冷光標記物。
34.如權利要求32所述之免疫檢測方法，該酶系選自下列所構成的群組之一過氧化氧酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase ；HRP)、鹼性磷酸 Sl (Alkaline phospatase ；AP)、以及 Beta—半乳糖昔醇(Beta—galactosidase)。
35.如權利要求32所述之免疫檢測方法，該訊號產生物質進一步包含有生物素及抗生物素蛋白，該生物素系與該偵測抗體連接，請該抗生物素蛋白系與該酶連接。
36.如權利要求35所述之免疫檢測方法，進一步包含有提供受質之步驟，該受質可與該酶反應而發生呈色反應。
37.如權利要求觀所述之免疫檢測方法，進一步包含有提供衝洗試劑之步驟，該衝洗試劑系選自下列所構成的群組之試劑及其組合磷酸鹽緩衝溶液(PBS)、三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液(TBS)以及Tween 20。
38.如權利要求觀所述之免疫檢測方法，該固相載體系選自下列所構成的群組之一 微孔盤、微球體、雜交膜、及試紙。
39.如權利要求觀所述之免疫檢測方法，進一步包含有提供阻隔試劑(Blocking reagent)之步驟，藉以阻隔該固相載體上未結合該單克隆抗體之位置。
40.如權利要求39所述之免疫檢測方法，該阻隔試劑系包含有蛋白質，該蛋白質系選自下列所組成的群組之試劑及其組合牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin ;BSA)、酪蛋白(Casein)以及動物明膠。
41.如權利要求39所述之免疫檢測方法，該阻隔試劑係為脫脂牛乳。
全文摘要
本發明系提供一種雜交瘤細胞株、其單克隆抗體、包含前述單克隆抗體之免疫檢測試劑及試劑盒，以及免疫檢測方法。雜交瘤細胞株系由親代細胞與骨髓瘤細胞融合而製成，其特徵如保藏號為PTA-11304之細胞株所示，該親代細胞系由原核細胞所表達之口蹄疫病毒之由3ABC基因片段所編碼之非結構蛋白作為抗原免疫至小鼠，並將該小鼠體內之脾臟細胞取出而製成，且該雜交瘤細胞株所生產之單克隆抗體能夠專一性辨識口蹄疫病毒之該3ABC肽，且不會與豬水皰病抗血清產生非特異性反應。
文檔編號C12N5/18GK102533663SQ201010588900
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月15日 優先權日2010年12月15日
發明者李璠, 潘居祥, 鍾明華, 陳姿菡 申請人:財團法人工業技術研究院