可在體內減少a的製作方法

2023-12-09 01:24:21

專利名稱：可在體內減少a的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於治療病灶性局部缺血性大腦梗塞(局部缺血性中風)的新型方法。
當流至大腦特定區域的動脈血減少到可導致神經元細胞死亡的臨界水平以下時，可發生病灶性局部缺血性大腦梗塞。人們認為通過過量的興奮性胺基酸穀氨酸可刺激諸如中風、癲癇和阿爾茨海默病這樣的中樞神經系統(CNS)中的神經元變性(2)。在CNS中注射穀氨酸興奮劑實際上可誘導類似於在神經變性疾病中所觀察到的海馬神經元細胞死亡(3)。
興奮毒素誘導的神經元變性由組織型纖溶酶原激活物(t-PA)來介導(4)。與這一觀察結果一致，缺乏t-PA小鼠可抵抗、且輸注纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAⅠ-1)可防止興奮毒素介導的海馬神經元變性(4-6)。
此外，纖溶酶原(Plg)即t-PA的酶原底物的缺乏和輸注α2-抗纖溶酶(α2-AP)可防止小鼠受到興奮毒素誘導的海馬神經元死亡的侵害(5)。已經提出纖溶酶介導的層粘連蛋白變性可通過破壞神經元-胞外基質相互作用使海馬神經元對細胞死亡敏感(7)。
Wang等(8)近來證明由大腦中動脈瞬時閉合所誘發的病灶性大腦局部缺血後的神經元損害在t-PA缺乏小鼠中也得到了減少而通過輸注t-PA加重。這提示纖溶酶原系統可能與建立大腦局部缺血性梗塞及其在溶栓療法中的擴展有關。近來證明使用包括鏈激酶和葡萄球菌激酶在內的其它血栓溶解劑也可使t-PA對持續病灶性大腦局部缺血的神經毒性作用發生(9)。因此，在那些患有持續性大腦動脈閉塞的患者中，用於局部缺血性中風的溶栓療法可以導致梗塞擴展，這不僅可以部分抵銷建立的動脈再通的全部有益作用(10、11)，而且確實對一小組患者有害。因為不能夠把將用溶栓療法實現大腦動脈再通的患者與將不能用溶栓療法實現大腦動脈再通的那些患者區分開來，所以開發可抵抗血栓溶解劑對持續病灶性大腦局部缺血的神經毒性作用的特殊結合策略看起來是正確的。
因此，本發明的目的是提供一種用於治療局部缺血性中風的新型方法。
在對產生本發明的研究中，關注的是下面的內容。儘管推定在大腦內病灶性局部缺血過程中的神經元損傷主要作為諸如穀氨酸這樣的興奮毒素累積的結果而發生，但是還沒有證明皮質神經元細胞死亡的發病機制中纖溶酶介導的層粘連蛋白變性的作用或另一種機理。為了描述纖溶酶原(纖維蛋白溶解)系統的各成分對病灶性大腦局部缺血性梗塞的作用，本發明者對通過將小鼠體左側大腦中動脈(MCA)與靶向滅活編碼Plg的基因、其激活物組織型纖溶酶原激活物(t-PA)或尿激酶類纖溶酶原激活物(u-PA)或纖維蛋白溶解抑制劑PAⅠ-1或α2-AP結合起來產生的梗塞大小進行了定量。此外，研究了t-PA和PAⅠ-1基因的腺病毒轉移和輸注人α2-AP對大腦梗塞的作用。
Strickland等同時發現t-PA缺乏可防止病灶性大腦局部缺血性梗塞，這已經得到了完全證明；且通過PAⅠ-1缺乏可導致梗塞大小明顯加大的觀察結果所擴大，Plg缺乏可防止興奮毒素誘發的神經元細胞死亡這一觀察結果還沒有得到證實。不過，發現Plg缺乏的小鼠體內病灶性大腦梗塞的大小顯著擴大，而相反，α2-AP缺乏的小鼠體內的病灶性大腦梗塞的大小顯著減小。
總之，這些發現表明纖溶酶原系統成分在兩個不同水平上影響病灶性大腦局部缺血性梗塞的大小1)t-PA活性的降低(t-PA基因失活或PAⅠ-1基因轉移)減少，而其增大(t-PA基因轉移或PAⅠ-1基因失活)增加了梗塞大小；和2)Plg活性的降低(Plg基因失活或注射α2-AP)增加，而其增大(α2-AP基因失活或α2-AP中和)減小了梗塞大小。這些發現與t-PA介導的纖溶酶生成導致神經元細胞死亡的唯一連接途徑不相適應，而提示了以反向起作用的兩種獨立的(分別是t-PA介導的和Plg-介導的)機理。
沒有預測到固有的與α2-AP一致的觀察結果，而它們大部分與治療局部缺血性中風有關。首先發現了梗塞大小與含有雜合子的基因型的相關性，從而顯示出那些野生型與純合表型之間的梗塞大小。其次，將人α2-AP(hα2-AP)快速濃注入α2-AP-/-小鼠引起了與劑量相關的梗塞擴展。重要的是，在MCA閉合後40分鐘靜脈給予來自親和特異性多克隆家兔抗-hα2-AP抗體的Fab片段顯著減小了大腦局部缺血性梗塞的大小。這一觀察結果提示了使用α2-AP抑制劑(例如中和單克隆抗體或中和α2-AP活性的化合物)抵銷病灶性局部缺血性梗塞的潛在途徑。通過給MCA閉合小鼠輸注纖溶酶而證實了這種手段，該手段通過中和α2-AP而顯著減小了梗塞大小。α2-AP在人血漿中的濃度為1mM(12)，相當於約500mg的總體收集量。等劑量的單克隆Fab片段約為400mg，而纖溶酶的劑量約為500mg，這種劑量較高但對於單一治療給藥來說並不過量。此外，梗塞大小與α2-AP水平(來源於基因劑量作用和劑量反應)成正比的觀察結果提示血漿水平的部分下降可能具有顯著的有益作用。
根據上述描述，本發明由此涉及可在體內減少α2-AP活性的化合物在治療病灶性大腦局部缺血性梗塞(局部缺血性中風)中的用途。
在本發明的具體實施方案中，涉及使循環的α2-AP濃度降低的化合物的用途。較低濃度的α2-AP會導致活性較低。在另一個實施方案中，直接降低循環的α2-AP的活性。
例如，適合於降低α2-AP濃度和活性的化合物是α2-AP中和抗體或其衍生物。優選的抗體是單克隆抗體。優選的衍生物是Fab片段、ScFv片段。
例如，中和α2-AP活性的化合物是纖溶酶、小纖溶酶(缺乏前4個Kringles)或微纖溶酶(缺乏全部5個Kringles)。
在下列實施例中更具體地證明了本發明，然而，它們並不用來限定本發明的範圍。在實施例中，參考下列附圖附

圖1-3是在小鼠體內連接大腦中動脈(MCA)後比較病灶性大腦局部缺血性梗塞體積(以mm3計)的柱形圖。數據代表平均值和直條SEM，在柱中給出了實驗號。
附圖1表示纖溶酶原系統成分缺乏(橫坐標上的基因型)對於病灶性局部缺血性大腦梗塞大小(以mm3計)的作用。WT野生型(50％C57BL6/50％S129、100％C57BL6和100％S129遺傳背景的採集值)。
附圖2表示t-PA或PAⅠ-1基因的腺病毒轉移分別對t-PA或PAⅠ-1缺乏小鼠體內的病灶性局部缺血性大腦梗塞大小的作用。
附圖3表示α2-AP對病灶性局部缺血性大腦梗塞大小的作用。
A．α2-AP基因型對大腦梗塞大小的作用。
B．注射hα2-AP或hαα2-AP、隨後是注射抗-hα2-AP Fab對大腦梗塞大小的作用。
通過皮下注射200mg懸浮在完全弗洛因德佐劑中的純化的人α2-AP、隨後通過在雙周間隔注射懸浮在不完全弗洛因德佐劑中的抗原而在家兔體內使多克隆抗血清升高。通過重複耳靜脈穿刺而獲得血清。將採集的血清在蛋白質-A瓊脂糖上進行層析(0.5ml血清/ml溼凝膠)、用0.1MTris.HCl(pH8.1)平衡並用0.1M甘氨酸．HCl(pH2.8)洗脫IgG，從而產生約10mg蛋白質/ml血清。親和特異性抗體通過用人α2-AP(2.5mg/ml溼凝膠)取代並用0.1M甘氨酸．HCl(pH2.8)洗脫的CNBr-活化的瓊脂糖柱上層析而獲自透析的IgG採集液，從而產生所用的約0.1mg特異性IgG/mg。
通過用木瓜蛋白酶消化而從親和特異性IgG中獲得Fab片段。由此將IgG溶解至5mg/ml的濃度並在50mM半胱氨酸、1mMEDTA、0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.0)存在的情況下用1％(w/w)的木瓜蛋白酶消化5小時。通過將碘乙醯胺加至終濃度為75mM而終止反應。在透析後，將該混合物在用PBS平衡的蛋白質-A瓊脂糖柱上純化。通過對IgG標準品校準用ELISA來測定Fab濃度。SDS凝膠電泳主要顯示出均勻的Fab片段(未示出)。2.2腺病毒載體的生產基本上如上所述通過293個細胞中的同源重組來產生重組腺病毒AdCMVt-PA和AdCMVPAⅠ-1(20)。對於AdCMVt-PA來說，將編碼野生型人t-PA的質粒pSTEt-PA的XbaⅠ-片段連入XbaⅠ-消化的pACCMVpLpA(21)以便產生pACCMVt-PA。通過將含有人PAⅠ-1全編碼序列的1.4-kb pPAⅠ-1RBR的EcoRⅠ/BglⅡ片段連入EcoRⅠ/BamHⅠ-消化的pACCMVpLpA來產生腺病毒前體pACCMVPAⅠ-1。在這些質粒中，t-PA和PAⅠ-1 cDNA定位在人巨細胞病毒立即早期增強子/啟動子與SV40t-抗原內含子/聚腺苷酸化信號之間以便形成一種完整的轉錄單位。
用10mg的pACCMVt-PA或pACCMVPAⅠ-1和5mg的pJM17(20)即一種含有全長腺病毒5d1309基因組的質粒共轉染293個細胞的單層培養物(22)。這些質粒之間的同源重組導致重組病毒基因組形成，其中腺病毒E1區被相應的t-PA或PAⅠ-1轉基因所取代。在所培養的293個細胞中重組病毒的複製得到從整合入293個細胞基因組的E1拷貝中轉染(trans)產生的E1A基因產物的支持。
在轉染後，收集重組的病毒噬斑並如(23)中所述擴增。通過對由生產性感染的293個細胞製備的病毒DNA進行限制分析和DNA印跡分析來測定重組病毒的同一性。以相同方式從pACRR5和pJM17中產生在E1位缺乏插入基因的重組腺病毒AdRR5並將其用作對照腺病毒(24、25)。在進一步應用前使重組病毒重新形成噬斑(replaqued)以便確保克隆的同一性。如上所述進行大規模重組腺病毒的生產(23)。用0.1mg/ml無菌牛血清清蛋白(BSA)補充純化的病毒、使其在液氮中驟冷並保存在-80℃下直到應用為止。通過在37℃下吸附1小時的單層293個細胞上的噬斑試驗來測定感染性病毒顆粒在純化儲備溶液中的滴度。一般獲得＞1010噬斑形成單位(pfu)/ml的純化病毒儲備溶液。已經另外描述了在通過靜脈快速濃注腺病毒轉移後t-PA和PAⅠ-1表達的動力學和器官分布(26、27)。2.3人纖溶酶的製備基本上如上所述由新鮮冷凍的人血庫血漿來製備人纖溶酶原(28)。向人血漿(6升)中加入20個單位的抑酶肽(Trasylol,Bayer，Germany)/ml、通過在4℃下以4,000 rpm離心15分鐘使其澄清。向上清液中加入賴氨酸-瓊脂糖(200g溼重，取代度約為1mg賴氨酸/g溼瓊脂糖凝膠)，在4℃下將該混合物攪拌1小時並在布氏漏鬥上回收所述凝膠。然後向濾液中加入120g賴氨酸-瓊脂糖，攪拌該混合物並如上所述回收凝膠。將合併的凝膠級分用18升含有10個單位抑酶肽/ml的0.2MK2HPO4/KH2PO4緩衝液(pH7.5)洗滌，然後傾入5×60cm柱上並在4℃下用含有10單位/ml抑酶肽的0.02MNaH2PO4、0.1MNaCl緩衝液(pH7.5)洗滌，直到洗滌液在280nm處的吸收度小於0.05為止。接著將該柱用含有0.05M6-氨基己酸的洗滌緩衝液和含有收集級分的蛋白質洗脫。從6升血漿中獲得含有650mg蛋白質的約145ml液體。將該採集液在Amicon PM10濾器上濃縮2.5倍並在用0.02M NaH2PO4、0.1MNaCl緩衝液(pH 7.5)平衡的5×90cmultragel AcA44柱上以60ml/小時的速率進行凝膠過濾。將來自主峰的含有約590mg蛋白質的級分在Amicon PM10濾器上濃縮至濃度為10mg/ml並冷凍至應用時為止。
如下由纖溶酶原製備人纖溶酶。將賴氨酸-瓊脂糖(20g溼重)加入到人纖溶酶原(200mg)溶液中，在4℃下將該混合物攪拌3小時，將凝膠在布氏漏鬥上洗滌並重新懸浮於30ml0.1MNaH2PO4緩衝液(pH7.4)中。加入含有纖溶酶．瓊脂糖的尿激酶(500μl的50μM溶液，通過使次魯普酶(Grünenthal,Aachen,Germany)活化來製備)並在4℃下將該混合物攪拌15小時。然後在布氏漏鬥上用0.1MNaH2PO4緩衝液(pH7.4)洗滌凝膠、傾入1.5×16cm柱；用0.1MNaH2PO4緩衝液(pH7.4)洗滌至洗滌液在280nm處的吸收度小於0.05為止並用含有0.05M6-氨基己酸的0.1MNaH2PO4緩衝液洗脫。收集含有級分的蛋白質，將甘油加入至終濃度為10％並在4℃下將採集液對含有10％甘油的0.1MNaH2PO4緩衝液透析。最終回收25ml溶液、蛋白質濃度為4.0mg/ml且活性纖溶酶濃度為25μM。2.4血漿中α2-抗纖溶酶的測定通過基於快速抑制纖溶酶的顯色底物試驗來測定小鼠血漿中的α2-抗纖溶酶水平(29)。簡單地說，在37℃下，將10μl小鼠血漿(按1/10在含有0.01％Tween20的0.05M NaH2PO4緩衝液(pH7.4)中稀釋)與420μl的0.05MTris-HCl、含有0.01％Tween20的0.1MNaCl緩衝液(pH7.4)並與20μl的0.125μM人纖溶酶(終濃度為5nM)混合。在第10S培養後，加入50μl的3mMS2403(Chromogenics,Antwerp,Belgium)並在405nm處測定吸收度的改變。使用緩衝液測得的吸收度改變約為0.18分鐘-1，而使用採集的小鼠血漿測得的吸收度改變約為0.09分鐘-1。2.5動物實驗按照美國生理協會和血栓形成與淤血國際委員會的指導原則進行動物實驗(30)。
按照Welsh等所述(31)，通過持續封閉MCA而產生病灶性大腦局部缺血。簡單地說，通過腹膜內注射氯胺酮(75mg/ml,Apharmo,Arnhem,The Netherlands)和賽拉嗪(5mg/ml,Bayer,Leverkusen,Germany)使各種性別、20-30g重的小鼠麻醉。肌內給予阿託品(1mg/ml,Federa,Brussels,Belgium)並通過將動物保持在加熱墊上來維持體溫。在左耳與左眼之間作「U」形切口。將顳肌的上側和底側片段切成段並通過顳肌回縮來暴露關顱骨。用手控鑽在MCA內的區域打一個小孔(1-2mm直徑)，灌注過量鹽水以便防止加熱損傷。用夾鉗取出腦膜並通過與10-0尼龍線(Ethylon,Neuilly,France)連接來封閉MCA並在連接點遠端切段。最後，將顳肌和皮膚縫回原位。
在連接MCA前4天，將AdCMVt-PA、AdCMVPAⅠ-1或AdRR5以1.3×109噬斑形成單位(p.f.u.)靜脈快速濃注。分2次通過靜脈注射給予人α2-AP(hα2-AP)，分別在連接MCA前1分鐘和連接MCA後30分鐘給予。通過靜脈快速濃注Fab片段，10分鐘後第2次注射hα2-AP。在連接MCA前15分鐘和連接MCA後15分鐘靜脈快速濃注給予人纖溶酶。
回收動物並將其放回到籠中。24小時後，用超劑量的戊巴比妥(500mg/kg,Abbott,Laboratories,North Chicago,IL)處死動物並將其斷頭。取出大腦並放入切成1mm節段的基質中。將這些部分浸入2％的氯化2,3,5-三苯基四唑鎓(TTC)的鹽水溶液(32)、在37℃下培養30分鐘並放入4％的福馬林的磷酸鹽緩衝鹽水。由於使用了該步驟，壞死梗塞區仍然未染色(白色)且清楚地與染色(磚紅色)的活組織區別開來。給這些部分照相併進行幾何面積測量。將梗塞體積定義為根據其厚度倍增的這些部分的未染色區域的總和。
將數據表示為n次測定的平均值±SEM。使用方差分析、隨後是Fisher’s PLSD試驗；使用Statview軟體包或通過學生t檢驗來測定差異的顯著性。
t-PA基因的失活與梗塞大小顯著減小至2.6±0.80mm3(n=11)相關(與野生型小鼠比較p＜0.0001)；而u-PA基因的失活對梗塞大小沒有影響(7.8±1.0mm3,n=8,p=NS與野生型比較)。
PAⅠ-1基因的失活與梗塞大小顯著增加相關(16±0.52mm3,n=6，與野生型小鼠比較p＜0.0001)(附圖1)。在含有失活Plg基因的小鼠中，大腦梗塞大小顯著大於野生型小鼠(12±1.2mm3,n=9，與野生型小鼠比較p＜0.037)；而相反，在α2-AP基因缺乏小鼠中，梗塞大小明顯減小(2.2±1.1mm3,n=7，與野生型小鼠比較p=0.0001)(附圖1)。
上述實施例表明α2-AP活性降低(減少α2-AP基因的表達或用抑制劑減少循環的α2-AP)可減小諸如在局部缺血性中風過程中遇到的病灶性大腦局部缺血性梗塞的大小。
連接左側大腦中動脈(MCA)可誘發近交Balb/c小鼠的大腦梗塞體積為27±1.3mm3(n=10)；而近交的C57BL/6小鼠為16±1.3mm3(n=12)。
給Balb/c小鼠注射0.2mgPli使梗塞大小減小至22±1.0mm3(n=9)(與鹽水相比p=0.006)。當在連接MCA前15分鐘或連接MCA後15分鐘注射給予Pli時，觀察到了類似的減少(表1)。在C57Bl/6小鼠中，注射0.2mg Pli使梗塞大小減小至10±1.2mm3(n=12)(與鹽水相比p=0.004)。
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1．可在體內減少α2-抗纖溶酶的化合物在製備用於治療病灶性大腦局部缺血性梗塞(局部缺血性中風)的治療用組合物中的用途。
2．根據權利要求1所述的用途，其中所述的化合物可降低循環的α2-抗纖溶酶的濃度。
3．根據權利要求1所述的用途，所述的化合物可降低循環的α2-抗纖溶酶的活性。
4．根據權利要求1-3所述的用途，其中所述的化合物是α2-抗纖溶酶中和抗體或其衍生物。
5．根據權利要求4所述的用途，其中所述的衍生物是Fab片段或ScFv片段。
6．根據權利要求1-3所述的用途，其中所述的化合物是選自纖溶酶、小纖溶酶(缺乏前4個Kringles)或微纖溶酶(缺乏全部5個Kringles)的中和α2-抗纖溶酶的化合物。
全文摘要
本發明涉及一種用於治療病灶性局部缺血性大腦梗塞(局部缺血性中風)的新型方法。已經發現減少α
文檔編號A61K39/395GK1320045SQ99811520
公開日2001年10月31日 申請日期1999年9月24日 優先權日1998年9月29日
發明者N·納加, D·J·科侖 申請人:勒芬研究與發展公司