由細胞周期蛋白d1超量表達介導的真核細胞中所需蛋白的超量表達的製作方法

2023-12-08 19:35:16 3

專利名稱：由細胞周期蛋白d1超量表達介導的真核細胞中所需蛋白的超量表達的製作方法
背景技術：
哺乳動物細胞周期的遞進(progression)通過依賴細胞周期蛋白的激酶(CDK)有序地活化而被驅動。活性CDK由催化亞基和稱為細胞周期蛋白的調節亞基組成。通過用細胞周期蛋白與CDK抑制因子(CKI)相互作用以及翻譯後修飾(例如磷酸化作用)調節CDK活性。
由不同細胞周期蛋白亞基在定義的關卡上調節細胞周期狀態之間的轉換G1細胞周期蛋白調節G1/S轉換，S細胞周期蛋白調節通過S期的遞進，而G2或有絲分裂細胞周期蛋白調節進入有絲分裂。細胞定向進入S期發生在G1後期中的限制點(R)上，此後細胞完成分裂不再需要促有絲分裂生長因子。
細胞周期蛋白D和E在G1期間順序地合成，並對進入S期限速，因此它們可以被認為是G1細胞周期蛋白。至少三種哺乳動物基因編碼D-型細胞周期蛋白(D1、D2和D3)。D-型細胞周期蛋白作為對促有絲分裂刺激的延遲早期反應的部分被逐步誘導，並且它們以細胞譜系特異性的方式被表達。用CDK4和CDK6裝配D-型細胞周期蛋白由促細胞分裂原翻譯後調節。一旦裝配成功，結合細胞周期蛋白D的CDK就必須由CDK活化激酶(CAK)磷酸化以獲得催化活性。
來自A-、B-或E-型細胞周期蛋白的細胞周期蛋白D基因位於進化樹的不同分支上，而D-型細胞周期蛋白具有有些不同於其它細胞周期蛋白的特性。它們為短壽命蛋白(t1/2＜25min)。在G1期間生長因子的撤出防止細胞周期蛋白D的穩定積累，與生長因子喪失的細胞不能通過R點的遞進相關。因此，細胞周期蛋白D的表達由胞外信號調節，而不象細胞周期蛋白A、B和E的定期表達。
人細胞周期蛋白D1和E在齧類動物或人成纖維細胞中的超量表達縮短G1期、減小細胞大小和減少從G1期到S期轉換的血清需求量(Resnitzky等，MCB14，1669-79(1994)；Quelle等，Genes Development7，1559-71(1993)；Ohtsubo Roberts，Science259，1908-12(1992))。這些結果表明，D細胞周期蛋白可能超越了由細胞周期蛋白E生理學地調節的功能，或反之亦然。然而，細胞周期蛋白D或E的超量表達不導致成纖維細胞的轉化—細胞保持依賴血清、接觸抑制且不能在半固體培養基中形成集落。還發現細胞周期蛋白D1的超量表達增強內源基因擴增，表明它在腫瘤發育期間基因組不穩定性中起著重要的作用。Zhou等，Cancer Res.5636-9(1996)。
發明概述本發明涉及包括真核細胞，所述真核細胞包含(a)細胞周期蛋白D基因產物，其中所述細胞周期蛋白D基因產物在所述細胞中為功能性表達，其表達水平高於比任何天然表達水平；和(b)目的蛋白，其中所述目的蛋白在所述細胞中被表達，其表達水平高於任何天然表達水。
本發明還涉及產生目的蛋白的方法，所述方法包括A.提供表達以下物質的真核細胞1.細胞周期蛋白D基因產物，其表達水平高於任何天然表達水和2.目的蛋白，其表達水平高於任何天然表達水平；B.在允許表達所述目的蛋白和功能性表達所述細胞周期蛋白D基因產物的條件下培養所述細胞；和C.分離所述目的蛋白。
本發明的所述細胞最好是哺乳動物細胞，而CHO細胞為最優選的。所述細胞周期蛋白D基因產物最好是哺乳動物的，人源產物為最優選的。所述細胞周期蛋白D基因或編碼所述目的蛋白的基因(或兩者)可以包括於所述細胞內的一種或多種表達載體中，或可以將其整合到所述細胞基因組中。
任何數量的目的蛋白可以用於本發明中。具體地講，可以使用EPO、OPG、leptin和NESP及它們的任何衍生物。
附圖簡述

圖1顯示用pcDNA3.1/細胞周期蛋白D1轉染並用人細胞周期蛋白D1特異性抗體處理的AM-1細胞的裂解物的蛋白質印跡(參見材料和方法)。該印跡證實在AM-1/D細胞中人細胞周期蛋白的表達。
圖2A、2B、2C和2D為曲線圖，顯示得自用碘化丙錠染色和根據FACScan分析的AM-1/D和AM-1細胞系的非同步細胞的相對DNA含量(x軸)和細胞數目(y軸)的(Becton Dickinson；參見材料和方法)。這些圖顯示AM-1/D細胞中有顯著性更多的S期細胞。
圖3為顯示在各種水平上表達OPG-Fc的克隆數目的圖。如此後本文實施例1中所描述，用質粒pDSRα2/OPG-Fc轉染AM-1/D細胞。該圖顯示最高表達的克隆得自AM-1/D細胞系。
圖4為顯示EPO表達對用於擴增的MTX濃度作圖的曲線圖。如下文實施例2中所描述的，用質粒pDSRα2/hEPO轉染AM-1/D細胞。其中二個克隆顯示隨著MTX濃度的增加EPO產量提高，證實成功的基因擴增。
圖5顯示得自AM-1 CHO細胞或AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞的46個單獨的克隆中OPG(22-194)-cys-Fc表達水平的比較。得自AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞系的克隆顯示出比得自AM-1CHO細胞的克隆顯著高的OPG(22-194)-cys-Fc表達水平。
圖6顯示先前根據蛋白質印跡所測定的24個最高表達克隆中OPG(22-201)-Fc表達的比較。在所有情況下，得自AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞系的克隆均比得自CHO(SF)細胞的克隆顯示出顯著高的OPG(22-201)-Fc表達水平。
圖7顯示得自每個親代CHO細胞系的14個最佳克隆中根據EIA測定的平均NESP表達。從24孔板中收集條件培養液樣品，收穫2天。根據蛋白質印跡預篩選樣品。
圖8顯示旋轉瓶(spinner)和生物反應器收穫物的IEF蛋白質印跡，比較得自旋轉瓶和生物反應器培養物的分泌的NESP蛋白的同種型分布。旋轉瓶收穫物來自未擴增的克隆。從滾瓶條件培養液純化的標準NESP蛋白顯示所需的高分子量同種型。所述條件培養液收穫物包括所有同種型。所述印跡顯示所有樣品中都存在高同種型(highisoform)。
發明詳述除非在具體的實例中被限定，否則以下定義適用於本說明書所用的術語。
術語核酸的「被插入」和「插入」是指通過外源的方法將(例如，轉染)將核酸導入細胞或生物中。所述插入的核酸可以具有對於細胞基因組為外源的序列或已經存在於細胞基因組中的外源序列。在後一種情況下，所述插入的核酸使由所述插入的核酸編碼的蛋白的表達更高或所受的調節不同。
術語「EPO-相關蛋白」是指可以通過重組DNA和其它方法產生的促紅細胞生成素及其衍生物和類似物。這種衍生物包括末端截短、去除內部胺基酸(例如通過相關DNA的限制和再連接)和胺基酸置換等的蛋白。這種衍生物還包括融合蛋白(例如，具有Fc區)。促紅細胞生成素典型的衍生物描述於國際專利申請WO 91/05867、94/09257、88/03808和86/07594中，每個專利申請都通過引用結合到本文中。
術語「leptin-相關蛋白」是指可以通過重組DNA和其它方法產生的leptin(最好是人leptin)及其衍生物。這種衍生物包括末端截短、去除內部胺基酸和胺基酸置換等的蛋白。該定義內還包括包含leptin的融合蛋白，諸如包含leptin和Fc片段的融合蛋白。合適的leptin衍生物描述於專利申請WO 96/40912(1996年12月19日申請)、WO96/05309(1996年2月22日申請)、WO 97/06816(1997年2月27日申請)和WO 97/18833(1997年5月29日申請)中，所述專利申請都通過引用結合到本文中。
術語「OPG-相關蛋白」是指可以通過重組DNA和其它方法產生的OPG及其衍生物。這種衍生物包括末端截短、去除內部胺基酸(例如，通過相關DNA的限制和再連接)和胺基酸置換等。這種衍生物還包括融合蛋白(例如，具有Fc區)。OPG典型的衍生物描述於國際專利申請WO 97/23614中，所述專利申請通過引用結合到本文中。
製備方法基因構建物本發明所用的核酸可以通過重組核酸方法製備。參見，例如，Nelles等，J.Biol，Chem.，262，10855(1987)的重組DNA方法。
所述核酸可以得自各種來源，包括基因組DNA、亞基因組DNA、cDNA、合成DNA及其組合。基因組DNA和cDNA可以以許多方法獲得。可以分離編碼所需序列的細胞，分離基因組DNA(例如，通過用一種或多種限制性內切核酸酶處理)和克隆產生的片段，用與所需序列互補的探針鑑定，並篩選編碼所需活性的序列的存在。對於cDNA，所述cDNA可以克隆，並用編碼所需區域的cDNA的探針篩選產生的克隆。在分離所需克隆時，所述cDNA可以以與所述基因組DNA基本上相同的方式操作。
除所述目的蛋白的編碼序列外，所述基因構建物應包括許多調節區。對於表達，由合適的宿主識別的轉錄和翻譯信號是必需的。所述編碼序列也應連接到與所述宿主細胞相匹配的啟動子上。所述啟動子可以為誘導型的，使得可以進一步控制表達，或可以是組成型的。許多合適的啟動子為本領域已知的。
在另一方面，得自基因組DNA的啟動子區可以與所述編碼序列結合獲得。對於宿主細胞識別與編碼區相連的轉錄調節信號和翻譯起始信號而言，可以保留並編碼序列鄰近的5』區並用於轉錄和翻譯調節。該區通常包括涉及轉錄和翻譯的起始的那些序列，諸如TATA盒、加帽序列和CAAT序列等。該區通常為至少大約150鹼基對長，更通常為大約200bp，而極少超過大約1-2kb。
所述非編碼3』區可以保留，以及尤其是其轉錄終止調節序列，諸如終止信號和聚腺苷醯化區域。另外，所述非編碼3』區還包括增強子。在所述轉錄終止信號不是宿主細胞中令人滿意的功能信號的情況下，則得自不同基因的功能性3』區可以被置換。置換的3』區的選擇將依賴於選擇用於表達的細胞系統。
可以根據宿主的性質，使用各種各樣的轉錄和翻譯調節序列。所述轉錄和翻譯調節序列可以得自病毒源(例如，腺病毒、牛乳頭瘤病毒和猿猴病毒等)，其中所述調節信號得自宿主中具有高表達水平的基因。或者，可以使用來自哺乳動物表達產物(例如，肌動蛋白、膠原蛋白和肌球蛋白等)的啟動子。可選擇便於阻抑或活化的轉錄起始調節信號，以使所述基因的表達可以被調節。一種這樣的可控調節技術為利用溫度敏感的調節信號，以便可以通過改變溫度來阻抑或起動表達。另一種可控調節技術為利用對某些化學物敏感的調節信號。
所述構建物可以包括與對細胞可以是或不是內源的啟動子、增強子和其它調節區相連的對宿主細胞而言為內源的核酸序列。這種構建物使得能夠增加(例如，通過有效偶聯於組成型啟動子)或控制(例如，通過有效偶聯於調節信號)所述內源序列的表達。
為構建所述基因構建物，可以按照本領域已知的常規技術連接DNA片段這些技術包括使用限制性內切酶將粘端片段轉化為平端片段(或反之亦然)、使用聚合酶和核苷酸去補平粘端以形成平端、使用鹼性磷酸酶去避免不需要連接和使用連接酶去連接片段。
可以通過與便於選擇的基因相聯的轉化，將所述構建物導入細胞，其中所述構建物將整合到所述宿主基因組中(例如，通過同源重組)。所述構建物通常為具有宿主細胞識別的複製系統的載體的部分。
表達載體用於產生本發明的所述分子的表達載體包括質粒或其它載體。一般而言，這樣的載體包括在各種類型的細胞中提供表達的控制序列。可以使用本領域已知的重組DNA技術，構建含有所需編碼序列和控制序列的合適的表達載體，其中許多技術描述於Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，紐約，(1989)。
根據本發明所構思的表達載體為至少可以指導編碼所述目的蛋白或細胞周期蛋白D基因產物蛋白的核酸的複製和表達。第一類載體利用提供得自動物病毒(例如，牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或猿猴病毒40)的自主複製染色體外質粒的DNA元件。第二類載體依靠將所需基因序列整合到宿主細胞染色體中。
可用於本發明的表達載體通常包括複製起始點、位於被表達DNA序列的5』(即上遊)的啟動子以及轉錄終止序列。合適的複製起始點包括例如ColE1、pSC101、M13、SV40和EBV複製起始點。合適的終止序列包括例如牛生長素、SV40、lacZ和AcMNPV多角體聚腺苷酸化信號。合適的啟動子包括例如巨細胞病毒啟動子、lacZ啟動子、gal10啟動子和AcMNPV多角體啟動子。所述啟動子序列也可以為誘導型的，以提供對表達的條件(例如，在菌種生長培養基中有或無營養物或其它誘導物)。一個實例為得自λ噬菌體plac5的lac操縱子，所述操縱子可以由IPTG誘導。
所述表達載體還可以包括對所需產物最佳表達的其它調節序列。這樣的序列包括保證所述表達產物穩定性的穩定性前導序列；保證所述表達產物分泌的分泌性前導序列；正調節所述DNA序列表達的增強子；和提供限制性內切核酸酶切割的位點的限制性內切酶識別序列。所有這些材料均為本領域已知的和為市場上可得到的。參見，例如，Okayama，Mol.Cell Biol.，3，280(1983)。
合適的表達載體還可以包括標記序列，所述標記序列允許表型選擇轉化的宿主細胞。這種標記可以提供原養型到營養缺陷型的宿主和殺生物劑抗性(例如，抗生素抗性)等。所述選擇性標記基因可以或者直接連接至被表達的所述編碼序列上，或者通過共轉染導入同一細胞中。選擇性標記的實例包括新黴素抗性、氨苄青黴素抗性和潮黴素抗性等的基因。
所用的實際表達載體的特徵必須與所使用的宿主細胞相匹配。對於哺乳動物宿主，例如，所述表達載體可以包括從哺乳動物細胞基因組分離的啟動子(例如，小鼠金屬硫蛋白啟動子)或從生長於這些細胞中的病毒分離的啟動子(例如，痘苗病毒7.5K啟動子)。
合適的市場上可得到的可以插入本發明編碼序列的表達載體包括哺乳動物表達載體pcDNA I或pcDNA I/Neo(所述載體是最好的)、杆狀病毒表達載體pBlueBac、原核生物表達載體pcDNA II和酵母表達載體pYes2，所有這些載體可以得自Invitrogen Corp.，San Diego，Calif.。
宿主細胞本發明還涉及含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含所述目的蛋白和所述細胞周期蛋白D基因產物的DNA序列。合適的宿主細胞為真核細胞；例如，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆蟲細胞、COS-7細胞、人成纖維細胞和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞。可以用作宿主的哺乳動物細胞包括成纖維細胞源的細胞(例如，VERO或CHO-K1)或淋巴細胞源的細胞(例如，SP2/0-AG14或P3×63Sg8)或其衍生細胞。優選的哺乳動物宿主細胞為CHO細胞。
諸如骨髓瘤細胞或淋巴瘤細胞的無限增殖化細胞也為合適的宿主細胞。這些細胞可以生長在培養瓶中合適的營養培養液內或注射到胞質傳遞宿主(synergenic host)(例如，小鼠或大鼠)或免疫缺陷宿主或宿主部位(例如，無胸腺小鼠或倉鼠囊袋(pouch))。特別是可以將所述細胞導入腹腔生產腹水並收穫所述嵌合分子。或者，可以將所述細胞皮下注射並從所述宿主的血液中收穫抗體。所述細胞可以以與雜交瘤細胞相同的方式使用。參見，Diamond等，N.Eng.I.Med.，304，1344(1981)；Monoclonal AntibodiesHybridomas-A New Dimensionin Biologic Analysis(Kennatt等著)Plenum(1980)。
通過本領域已知的各種方法，可以將表達載體導入宿主細胞。例如，用表達載體轉染宿主細胞可以通過磷酸鈣沉澱法進行。然而，對將表達載體導入宿主細胞，也可以使用其它方法(例如，電穿孔、脂質體融合、核注射和病毒或噬菌體感染)。
含有表達載體的宿主細胞可以通過以下六個一般方案中的一個或多個鑑別(a)DNA-DNA雜交；(b)有或無標記基因功能；(c)評價根據所述宿主細胞中編碼基因構建物的mRNA轉錄物的產生所測定的轉錄水平；(d)免疫學方法檢測所述基因產物；(e)酶測定和(f)PCR。這些方法為本領域眾所周知的；參見，例如，美國專利第5,744,314號，所述專利通過引用結合到本文中。
也可以對本發明的所述表達載體和DNA分子進行序列分析。各種序列分析方法為本領域已知的。參見，例如，描述於Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-7(1977)的雙脫氧鏈終止方法和描述於Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，560-4(1977)的Maxam-Gilbert方法。
一旦將表達載體導入合適的宿主細胞，就可以在允許表達大量所述目的蛋白的條件下培養所述宿主細胞。按照常規方法(諸如抽提、沉澱、層析、親和層析和電泳等)，可以分離和純化所述目的蛋白。優選方法為親和層析。
當然，不用說並不是所有表達載體和DNA調節序列均同樣好地起作用，以表達本發明的所述核酸。也不是所有的宿主細胞採用相同的表達系統都將起到同樣好的作用。然而，本領域一般技術人員在不採用過度實驗和不背離本發明的範圍和精神的情況下，都可以使用本文所提供的指導在表達載體、DNA調節序列和宿主細胞之間作出選擇。
最佳實施方案的詳述以下為本發明的具體實施方案的詳細描述。這些實施方案為示例性的，用來說明本發明廣泛應用性。除非本說明書中另有說明，否則這些實施方案包括本發明的優選元件。
材料和方法質粒將人細胞周期蛋白D1基因(Genbank登錄號M64349)克隆到pcDNA3.1(Invitrogen)中，並在巨細胞病毒(CMV)啟動子/增強子下組成型表達產生pcDNA3.1/細胞周期蛋白D1。所述載體也攜帶新黴素抗性基因以在G418存在下選擇穩定的哺乳動物細胞系。
細胞培養將CHOd-(SF)細胞生長在100mm培養皿中的完全培養液{DMEM(Gibco/BRL)、5％胎牛血清(JRH Biosciences)、1％非必需胺基酸(Gibco/BRL)、1％次黃嘌呤/胸苷(HT)(Gibco/BRL)和1％穀氨醯胺/青黴素/鏈黴素(Gibco/BRL)}中。將所述細胞胰蛋白酶消化、計數並以1×10e6細胞/皿接種於60mm培養板(Falcon)中。在懸浮旋轉瓶培養中，AM-1 CHOd細胞生長在Amgen VM-大豆培養液中。將細胞計數、離心、重新懸浮於完全培養液中，並以1×10e6細胞/皿接種於60mm培養板中。將細胞培養過夜。在轉染前3小時，用4ml新鮮培養液更換所述細胞中的培養液。
細胞周期蛋白D1轉染。該轉染使用含有細胞周期蛋白D1 cDNA插入片段的載體pcDNA3.1 neo(Invitrogen)。對細胞的每個60mm培養板，將5μg pcDNA3.1/細胞周期蛋白D1(2mg/ml)和5μg小鼠基因組載體DNA(Clontech)(100μg/ml)加入到172.5μl無菌蒸餾水中。將25μl 2.5M CaCl2加入到所述DNA溶液中，得到終體積250μl。將5μg pneo載體DNA(1.126mg/ml)與5μg載體DNA一起加入到170.5μl無菌水中，接著加入25μl 2.5M CaCl2，作為載體對照。將25μl 2.5M CaCl2加入到225μl水中，作為模擬對照。將所述DNA溶液滴加到等體積(250μl)2×HBS(280mM NaCl，10mM KCl，1.5mMNaHPO4·2H2O，0.2mM葡聚糖，50mM HEPES，pH 7.05)中，向其中不斷通入空氣。所述DNA/HBS溶液於室溫下溫育30分鐘。從CHO細胞培養板中除去培養液，然後滴加DNA/HBS溶液(每皿500μl總體積)。對於每個細胞系，用pcDNA3.1/細胞周期蛋白D1、對所述載體對照和模擬對照的各一個培養板處理總共3個培養板。將所述細胞室溫下溫育30分鐘，此後在每個皿加入5ml完全培養液。然後將細胞於37℃培養過夜。次日用新鮮培養液更換所述培養液。
在轉染後48小時，所述CHO(SF)達到融合。胰蛋白酶消化所述細胞，然後以1×60mm皿對8×100mm皿的比率在完全培養液中再次貼壁培養。次日用含有1mg/ml遺傳黴素(G418)(Gibco/BRL)的完全培養液更換所述培養液。在轉染後72小時，AM-1 CHO細胞達到融合，然後進行相同的再次貼壁培養。每星期兩次用新鮮完全培養液+G418更換所述細胞的培養液。在首次加入G418選擇性培養液後10天，使用玻璃克隆圓柱體(Bellco)從CHO(SF)轉染的和AM-1 CHO細胞周期蛋白D1轉染的貼壁培養板中分離集落。胰蛋白酶消化細胞，然後再次接種於24孔板中。CHO(SF)細胞的轉染效率比AM-1CHO細胞(20-30集落/板)高很多(＞100集落/板)。從CHO(SF)/細胞周期蛋白D1板分離出總共72個集落，而從AM-1 CHO/細胞周期蛋白D1板分離出68個集落。在含有G418選擇性培養液的模擬對照皿上無集落存在。在挑取集落後，胰蛋白酶消化每個板中剩餘的細胞，然後混合到100mm板合併培養物中(CHO(SF)/細胞周期蛋白D1為3個合併物(pool)，而AM-1 CHO/細胞周期蛋白D1為2個合併物)。
使所述轉染的細胞生長到融合，然後再次貼壁培養於6孔板中，每克隆2孔/合併。在達到融合時，每個克隆細胞的其中1孔/合併用250ml 1％ Triton裂解緩衝液(1％Triton X100、1mM NaVO3、50mMTris/HCl pH 8、100mM NaCl、蛋白酶抑制劑)裂解。裂解物於14K離心15分鐘。收集上清液，然後貯存於-20℃。根據對細胞周期蛋白D1表達的蛋白質印跡分析裂解物。25μl每個樣品加親代CHO(SF)和AM-1 CHO系的對照樣品，與5μl 5X PAGE凝膠樣品緩衝液混合，煮沸3分鐘，然後上樣於12％ Novex Tris-甘氨酸凝膠上。在0.2μ硝酸纖維素濾膜(Schleicher and Schuell)上電印跡所述凝膠。用抗-細胞周期蛋白D1 Ab-3單克隆抗體(Calbiochem)探測所述濾膜，然後使用Amersham ECL試劑顯色。結果表明在合併培養物和大多數克隆中有不同程度細胞周期蛋白D1的超量表達。
將兩個AM-1 CHO/細胞周期蛋白D1合併培養物和兩個最高表達CHO(SF)/細胞周期蛋白D1合併培養物混合為「總合併物(masterpool)」，以用於隨後轉染每個細胞系。通過在次黃嘌呤/無胸苷選擇性培養液(DMEM、5％透析的胎牛血清(Hyclone)、非必需胺基酸、穀氨醯胺/青黴素/鏈黴素)中培養所述細胞，測試所述總合併培養物，以確定它們能否還保留DHFR陰性表型。在該培養液中沒有檢測到細胞生長。
EPO轉染將CHO(SF)/細胞周期蛋白D1和AM-1 CHO/細胞周期蛋白D1的總合併培養物保持在補充有1mg/ml G418的完全CHOd培養液中。將這些細胞以8×10e5細胞/皿接種於60mm板中，並培養過夜。使用上述方法用pSW19(pDSRα2幾乎相同的衍生物)/EPO靶DNA、pDSRα2載體對照DNA和鯡魚精子載體DNA(Gibco/BRL)轉染所述細胞。所用的pSW19/EPO DNA的終濃度為5μg/皿。轉染後24小時，給予所述細胞新鮮培養液。轉染後72小時，胰蛋白酶消化所述細胞，並以1∶8、1∶10和1∶20的比率(60mm板對100mm板)在選擇性培養液+1mg/ml G418中再次貼壁培養。每星期兩次用含有G418的新鮮培養液更換所述細胞中的培養液。在再次貼壁培養後12天，從CHO(SF)/細胞周期蛋白D1/EPO轉染的板中分離出48個集落。胰蛋白酶消化所述剩餘的細胞，然後混合為兩個合併培養物。在再次貼壁培養後15天，從AM-1 CHO/細胞周期蛋白D1/EPO轉染的板中分離出48個集落，並將所述剩餘的細胞混合為兩個合併物。通過得自分離克隆的融合24孔培養物或得自100mm板合併培養物的無血清條件培養液收穫物的蛋白質印跡，分析EPO表達。在還原條件下進行凝膠電泳，然後用抗-EPO單克隆抗體2D8探測印跡。
OPG轉染將pSW19/OPG DNA的構建物轉染到CHOd(SF)/細胞周期蛋白D1和AM-1 CHOd/細胞周期蛋白D1總合併物中，然後所述CHOd(SF)親代系以如所述EPO轉染相同的方法進行轉染。將OPG-Fc(22-201)的其中兩個分離轉染物轉染到所有三個宿主細胞系。從OPG-Fc(22-201)轉染物中挑取總共124個CHO(SF)集落、110個CHO(SF)/cycD集落和147個AM-1 CHO/cycD集落。在產生的克隆和合併物中，使用抗-huIgG-Fc-HRP抗體(Pierce)或親和純化的兔多克隆抗-huOPG，通過蛋白質印跡分析OPG表達。
碘化丙錠染色DNA將細胞接種於100mm板中，並使其生長到大約50％融合。用於測定的細胞必須處於對數期。通過胰蛋白酶消化，收穫所述細胞，然後將其吸移到含有等體積DMEM/FBS的離心管中。用血細胞計數器計數一等份細胞懸浮液。細胞密度應為大約106-107細胞/5ml。通過於1000×g離心沉澱所述細胞，然後用冰冷PBS漂洗二次。所述細胞必須是在單細胞懸浮液中。加入0.5ml PBS並渦旋混合所述細胞懸浮液。然後一邊輕輕地混合所述細胞懸浮液，一邊沿管壁滴加2ml70％乙醇固定所述細胞。最短的固定時間為30分鐘。(此時可以將細胞懸浮液於4℃貯存約2個星期，然後進行染色和分析。)將所述細胞離心除去乙醇上清液，用PBS漂洗一次，使其於4℃再次水合5分鐘。離心所述細胞，除去PBS，然後將所述沉澱物重新懸浮於0.5ml碘化丙錠溶液(Molecular Probes)(於PBS中製備的50μg/ml)中。加入10μl無DNA酶的RNA酶(10mg/ml)(Boehringer Mannheim)，然後所述細胞懸浮液於37℃溫育20分鐘。所述樣品用1ml PBS稀釋，並在1小時內通過FACS分析該樣品。
基因擴增根據逐漸分步加入氨甲蝶呤(MTX)到生長培養液中，進行所述細胞中的基因擴增。在氨甲蝶呤三種低濃度(1nM、2.5nM和5nM)的100mm板中，以比率1∶10傳代培養所述細胞。監測所述細胞的生長，並將最先達到融合的培養板用於下一輪的擴增。假如所述細胞在一種以上濃度的氨甲蝶呤中生長得同樣好，則取最高濃度用於下一輪的試驗。取48小時無血清DMEM收穫物(4ml/板)，根據蛋白質印跡或EIA進行所述蛋白表達水平的分析。使所述細胞在含有氨甲蝶呤的完全培養液中恢復24小時，然後以1∶10的比率傳代培養到3種較高的氨甲蝶呤濃度中。以增長量10nM至100nM增加MTX的濃度。一般來講，假如所述蛋白表達水平在100nM沒有達到峰值，則擴增以100nM增加量繼續進行，直到達到最高表達水平。一旦確定最佳濃度，就將所述細胞保持在有MTX的培養液中。
AM-1/D細胞系的產生AM-1/D細胞系得自描述於1987年10月27日授予的美國專利第4,703,008號，和Urlaub等，(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.774461中的CHOd(-)細胞系，兩者均通過引用結合到本文中。通過在逐漸減少直到最終無胎牛血清的VM-SOY培養液中傳代，使CHOd(-)細胞系適應。產生的適應無血清的細胞系AM-1仍然保留dhfr(-)表型。將AM-1細胞系工程改造以超量表達人細胞周期蛋白D1。
通過用於轉染的標準磷酸鈣沉澱法，將pcDNA3.1/細胞周期蛋白D1轉染到AM-1細胞系中。在用G418選擇時，胰蛋白酶消化所述集落，並混合為兩個合併物。使用人細胞周期蛋白D1特異性抗體(抗細胞周期蛋白D1 Ab-3，Calbiochem)，通過由所述合併物製備的細胞裂解物的蛋白質印跡(圖1)，證實人細胞周期蛋白D1蛋白的表達。用克隆環隨機地挑取許多集落，製備細胞裂解物以及進行分析。正如所期望的，在克隆之間，人細胞周期蛋白的表達是可變的。在所述克隆比較中，兩個合併物顯示總體高水平的人細胞周期蛋白D1蛋白(圖1)。將該兩個合併物混合為總合併培養物(AM-1/D)，所述培養物為用於全部隨後實驗中的親代細胞系。
在AM-1/D細胞系中表達的人細胞周期蛋白是有功能的通過改變細胞周期動態(dynamics)，我們確定人細胞周期蛋白D1為功能性地表達；參見，例如，圖2及下文。
將得自AM-1/D和AM-1細胞系的非同步細胞用碘化丙錠染色，然後根據FACScan(Becton Dickinson)分析。圖2A-2D顯示相對DNA含量(x軸)和細胞數目(y軸)。AM-1/D細胞(40.08％，40.14％)與AM-1細胞(33.73％，32.25％)相比有顯著性更多的S期細胞。這證實在一種CHO細胞系即AM-1/D中，人細胞周期蛋白D1的超量表達為功能性的，以便顯著性改變細胞周期動態。
實施例1用表達載體pDSRα2構建質粒pDSRα2/OPG-Fc，以表達人OPG(GenBank登錄號U94332)-Fc融合蛋白。使用標準磷酸鈣沉澱法，將pDSRα2/OPG-Fc的線性化DNA平行轉染到AM-1/D細胞和未修飾、最初的AM-1細胞中。在將細胞置於缺乏HT補充物的選擇性培養液中兩個星期後，隨機挑取每個轉染物的44個集落。
將所述集落單獨地轉染到24孔板中，並生長到融合。48小時後，收集無血清條件培養液，使用對人OPG特異性的抗血清通過EIA進行分析。圖3顯示得自這兩種細胞系在各種水平上表達OPG-Fc的克隆數目。清楚表明得自的AM-1/D細胞系有顯著性更多的克隆表達較高水平的重組蛋白，並且表達超過20mg/ml OPG-Fc的所有最高表達克隆均得自AM-1/D細胞系。
實施例2構建質粒pDSRα2/hEpo以表達人Epo基因，接著用上面描述的磷酸鈣沉澱法轉染到AM-1/D細胞中。隨機挑取48個集落用於進一步地分析。根據所述條件培養液的EIA分析鑑定出其中4個高表達克隆，然後進行開始於1nM的氨甲蝶呤擴增。圖4顯示在擴增過程期間EPO的表達。其中2個克隆，AM-1/D克隆2和AM-1/D克隆33顯示隨著MTX濃度的增加，EPO產量升高，證實成功地進行了基因擴增。用冰凍-融化和再次傳代測試這些克隆，沒有喪失EPO表達，證實這些克隆中EPO基因表達的穩定性。
AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞中OPG的表達在AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞和其它CHO細胞系中，比較兩種OPG構成物的表達。將OPG(22-201)-Fc轉染到AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞和親代CHO細胞系中，這些細胞先前適應於生長在無血清培養液[CHO(SF)]中。將OPG(22-194)·cys-Fc轉染到AM-1細胞周期蛋白D CHO細胞中和轉染到其親代AM-1 CHO細胞系中。使用標準磷酸鈣法和DHFR選擇法進行所述轉染。使用玻璃克隆圓柱體分離轉染的集落。在24孔板中，讓各個集落生長到融合。使用對OPG的多克隆抗血清，根據蛋白質印跡，分析無血清條件培養液收穫物的分泌OPG。得自根據蛋白質印跡顯示最高表達水平的那些克隆的條件培養液樣品，根據ELISA進一步分析。在得自AM-1 CHO細胞或AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞的46個單獨的克隆中，我們比較了OPG(22-194)-cys-Fc表達水平(圖5)。在根據蛋白質印跡先前所確定的24個最高表達克隆中，我們也比較了OPG(22-201)-Fc的表達(圖6)。在每種情況下，得自AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞系的克隆比得自CHO(SF)或AM-1 CHO細胞的克隆顯示顯著高的表達水平。
適應無血清培養液的CHO細胞中NESP的表達根據標準磷酸鈣法，將插入了NESP DNA的pDSR·2表達載體轉染到三種不同的適應無血清的CHOd細胞系CHOd-(SF)、AM-1和AM-1/細胞周期蛋白D中。在貼壁培養的有血清培養液中進行克隆的轉染、選擇和分離。使用抗EPO的單克隆抗體，根據蛋白質印跡，首先鑑定出表達高水平NESP的克隆。根據EIA進行表達的定量。根據於無血清培養液的懸浮培養中的生長，測試得自每個細胞系的最高表達克隆。通過在貼壁培養的有血清培養液中，在逐漸增加氨甲蝶呤的濃度下生長，對所述克隆也進行DNA擴增。根據蛋白質印跡和EIA分析，監測在擴增過程期間的NESP表達。在擴增過程期間的各個階段，分析所述克隆在無血清懸浮培養中的生長和表達。得自AM-1/細胞周期蛋白D CHO細胞系的克隆比得自另外兩個親代CHO細胞系的那些克隆有總體上的高NESP表達水平(圖7)。也根據等電聚焦確定同種型分布分析所述克隆。在得自親代CHO細胞系的各種克隆中或對照細胞系(61L)中，觀察到同種型分布方面沒有顯著性差異(圖8)。本說明書中所用的縮寫定義如下CHO中國倉鼠卵巢細胞DHFR EBV埃-巴二氏病毒EIA酶免疫測定EPO促紅細胞生成素HBSHEPES緩衝鹽溶液IEFMTX氨甲蝶呤NESP 新紅細胞發生刺激蛋白OPG骨原細胞生成素(osteoprotegerin)
權利要求
1.真核細胞，包含a)細胞周期蛋白D基因產物，其中所述細胞周期蛋白D基因產物在細胞中為功能性地表達，其表達水平高於任何天然表達水；和b)目的蛋白，其中所述目的蛋白在所述細胞中被表達，其表達水平高於任何天然表達水平。
2.權利要求1的所述細胞，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
3.權利要求1的所述細胞，其中所述細胞為CHO細胞。
4.權利要求3的所述細胞，其中所述細胞適應無血清培養液。
5.權利要求1的所述細胞，其中所述細胞為AM-1細胞。
6.權利要求1的所述細胞，其中所述細胞周期蛋白D基因產物包括哺乳動物細胞周期蛋白D1。
7.權利要求1的所述細胞，其中所述細胞周期蛋白D基因產物包括人細胞周期蛋白D。
8.權利要求1的所述細胞，其中所述細胞周期蛋白D基因產物包括人細胞周期蛋白D1。
9.權利要求1的所述細胞，其中所述目的蛋白為EPO-相關蛋白、OPG-相關蛋白或leptin-相關蛋白。
10.權利要求1的所述細胞，其中所述目的蛋白為EPO、NESP、OPG、OPG-Fc、leptin或Fc-leptin。
11.生產目的蛋白的方法，所述方法包括A.提供表達以下物質的真核細胞1.細胞周期蛋白D基因產物，其表達水平高於任何天然表達水和2.目的蛋白，其表達水平高於任何天然表達水平。B.在允許表達所述目的蛋白和功能性地表達所述細胞周期蛋白D基因產物的條件下培養所述細胞；和C.分離所述目的蛋白。
12.權利要求11的所述方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
13.權利要求11的所述方法，其中所述細胞為CHO細胞。
14.權利要求13的所述方法，其中所述細胞適應無血清培養液。
15.權利要求11的所述方法，其中所述細胞為AM-1細胞。
16.權利要求11的所述方法，其中所述細胞周期蛋白D基因產物包括哺乳動物細胞周期蛋白D1。
17.權利要求11的所述方法，其中所述細胞周期蛋白D基因產物包括人細胞周期蛋白D。
18.權利要求11的所述方法，其中所述細胞周期蛋白D基因產物包括人細胞周期蛋白D1。
19.權利要求19的所述方法，其中所述目的蛋白為EPO-相關蛋白、OPG-相關蛋白或leptin-相關蛋白。
20.權利要求19的所述方法，其中所述目的蛋白為EPO、NESP、OPG、OPG-Fc、leptin或Fc-leptin。
全文摘要
本發明涉及用於蛋白表達的真核細胞,所述真核細胞包含:(a)編碼細胞周期蛋白D基因產物的插入的核酸片段和(b)編碼目的蛋白的插入的核酸片段,其中所述細胞周期蛋白D基因產物和所述目的蛋白在所述細胞中被表達。本發明還涉及生產目的蛋白的方法,所述方法包括(a)將編碼細胞周期蛋白D基因產物的核酸和編碼目的蛋白的核酸插入到真核細胞中;和(b)在允許表達所述目的蛋白的條件下培養所述細胞;和(c)分離所述目的蛋白。所述細胞最好是哺乳動物細胞,而CHO細為最優選的。所述細胞周期蛋白D基因產物最好是人源的。合適的目的蛋白包括促紅細胞生成素(EPO)、骨原細胞生成素(OPG)、OPG－Fc、leptin、Fc－leptin和新紅細胞發生刺激蛋白(NESP)。
文檔編號C12N15/67GK1322253SQ99811899
公開日2001年11月14日 申請日期1999年8月11日 優先權日1998年8月11日
發明者胡小芬, J·M·古達斯, D·W·布蘭科夫 申請人:安姆根有限公司