光學分子成像用納米凝膠造影劑的製作方法

2023-12-03 07:46:46 6

專利名稱：光學分子成像用納米凝膠造影劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於紅外醫學成像的可注射診斷試劑。
背景技術：
近來，人們的強烈興趣已集中在開發能在生命系統內運栽和釋放生物、藥物 或診斷成分的納米粒子體系。這些體系典型包括與納米粒子栽體連接或包含在納 米粒子栽體中的藥物、治療劑、診斷劑、生物相容功能劑、造影劑和靶向部分， 這個領域研究的研究目標是提供具有諸如更長的循環壽命，更高的特異性，更低 的毒性和更好的治療效力等顯著優點的成像劑和治療刑。納米粒子組裝領域的研 究有望在癌症和其它危及生命的疾病治療方面取得重大改進，並有可能革新其臨 床診斷和治療。
最近將某些納米粒子提議作為某些藥物的栽體.參見例如，Sharma等， Oncology Research 8， 281 ( 1996 ) 5 Zobel等，Aiitisense Nucl. Acid Drug Dev,， 7:483 ( 1997) ; deVerdiere等，Br. J. Cancer 76， 198 ( 1997) ; Hussein等， Pharm.Res.， 14， 613 ( 1997) ; AJyautdin等,Pharm.Res.14， 325 ( 1997); Hrkach等，Biomaterials， 18， 27 ( 1997); Torchilin， J, Microencapsulation 15， 1 ( 1988 );以及它們的引用文獻。納米粒子化學提供廣譜的剛性聚合物結構，其 適用於藥物的包封，藥物傳遞和控制釋放。這些栽體的一些主要問題包括聚集、 生理條件下的膠體不穩定性、低荷載能力、藥物釋放動力學的受限控制以及合成 製備冗長且產物的產率非常低。
納米粒子組裝體的尺寸是決定它們在生物成分中的有用性的一個重要參數. 在體內施用後，大顆粒被網狀內皮系統除去，不能容易地被運輸到疾病位點(參 見例如，Volkheimer， Pathologe 14:247 (1993); Kwon和Kataoka， Adv. Drug. Del. Rev. 16:295 (1995), Moghimi等，(Moghimi， S. M,; Hunter, A. C.; Murray, J. C. "Nanomedicine: Current Status and Future Prospects." /^KS /o"謂/ 2005， /9， 311-330)報導大於lOOnm的顆粒容易被間質巨噬細胞清除，而150nm或更大的 顆粒容易在肝臟內聚集。大顆粒在細胞中的運輸和細胞內的遞送也是有限的，或 者沒有意義。參見例如，Labhasetwar等，Adv. Drug Del. Res. 24:63 (1997)'已 證明，大小為500nm到大於1微米的聚集陽離子種類(aggregated cationic species )
7在細胞轉染中是無效的.大顆粒(尤其是帶正電荷的大顆粒)在身體中表現出高
毒性，這部分是由於它們對肝臟和栓塞的不良作用。參見例如，Volkheimer， Patho，oge 14:247 (1993); Khopade等，Pharmazie 51:558 (1996); Yamashita等， Vet. Hum. Toxicol, 39:71 (1997)。
已發現某些特定的凝膠是無毒的，且能夠進入身體中的小毛細管，在體內被 運輸到疾病位點，穿過生物屏障(包括但不限於血-腦屏障和腸上皮)，吸收進入 細胞胞吞小泡，穿過細胞膜並運輸到細胞內的靶位點，相對於更大尺寸的微粒， 據信該尺寸範圍內的顆粒能夠被更有效地轉移通過動脈壁，參見Labhasetwar等， Adv. Drug Del. Res. 24:63 (1997),不希望受任何具體理論的束縛，還認為由於高 的表面積-體積比，小尺寸對於使用靶向分子成功靶向這些顆粒是必要的，另外， 當納米凝膠佔據大部分是水的流體動力球(hydrodynamic sphere)時，它們以比 固體顆粒更高的加栽水平被感興趣部分(生物靶向部分、染料等)功能化。
還相信，保持優選範圍內的粒度分布和徹底清除較大顆粒對於納米凝膠的有 效性和安全是必需的。公認的是，納米凝膠的有用性能僅由其尺寸和結構決定， 而不依賴於所使用的製備方法。
由於納米凝膠的獨特結構，它們結合了交聯聚合物凝膠和分散膠體顆粒的性 能。它們可以很高的生物製劑/聚合物網絡比率加栽各種生物製劑，包括小分子和 聚合物.生物製劑固定在納米凝膠的整個網絡體積內而不是它的表面，在特定條 件下，納米凝膠網絡的微型凹陷(microcoUapse)可一起發揮另外的掩蔽和保護 生物製劑的作用。已鑑定，納米凝膠在體內聚集會阻礙此類體系的應用.(參見 Sun, X.; Rossin， R.; Turner, JL L.; Becker, M. L.; Joralemon， M. J.; Welch, M. J.; Wooley， K. L. "An Assessment of the Effects of Shell Cross-Linked Nanoparticle Size, Core Composition, and Surface PEGylation on in Vivo Biodistribution" B/o附fl(TO柳c(/ecMto 2005， 6， 2541-2554.)
US 5,078,994公開了通過乳液聚合製備的共聚物微粒，其衍生自以下單體 至少約5重量％的含游離羧酸基的乙烯基單體、其上附加有聚亞烷基氧的單體、 親油單體和其它非離子親水單體。公開了包含這些共聚物的微凝膠，其水溶脹中 值粒徑為約0.01 約l.O微米。公開了藥物和診斷組合物，其包含治療劑或診斷劑 和微凝膠，所述微凝膠包含衍生自以下單體的共聚物至少約5重量％的含非酯 化羧酸基的乙烯基單體、親油單體和其它非離子親水單體，條件是當微凝膠的水 溶脹中值粒徑大於等於0.1微米時，至少5重量％的單體附加有聚亞烷基氧'還
8公開了診斷和治療方法，其中微凝膠基本不吸附蛋白質(protein non-adsorbent) 並且幾乎難於被呑噬作用呑噬(refractory to phagocytosis).然而，這些顆粒含有 大部分的疏水單體且聚乙二醇化程度低，因此其膠體穩定性和生物相容性較差， US 2003/0211158公開了新的微凝膠、微粒(尺寸一般為0.1~10微米)以及
聯劑分子製備該材料，所述交聯劑分子含有在弱酸條件下可裂解的鍵。交聯劑分 子例舉為二丙烯醯縮醛交聯劑，這些新材料有共同的特性，即能夠在細胞的內體 或溶酶體腔室中通常存在的條件下發生酸解降解，從而在細胞內釋放其有效載荷。 這些材料也可以用於傳遞治療劑至腫瘤的酸性區域和發炎位置。然而，這些顆粒 的尺寸範圍大得足以被網狀內皮系統攝取，這將帶來問題，另外，聚乙二醇化程 度低以及在體內結塊也是一個問題(參見Kwon， Y. J.; Standley， S. M.; Goh， S. L.; Frechet， J. M. J. /。《簡/ 。/Omfro歸J d柳e 2005， 105， 199-212 )
US 6,333,051公開了共聚物網絡，其具有至少一種交聯聚胺聚合物片段和至 少一種非離子水溶性聚合物片段，以及公開了它們的組合物，其具有至少一種適 當的生物制刑.該發明涉及聚合物技術，尤其是具有至少一種交聯聚胺聚合物片 段和至少一種非離子水溶性聚合物片段的聚合物網絡，及其組合物。然而，這些 納米凝膠與本發明的納米凝膠不同，它們並不基於烯鍵式不飽和主鏈。另外，這 些納米凝膠的製備冗長，而且只能得到少量產品，
The Journal of the American Chemical Society 124(51): 15198-15207 ("Polymeric Nanoge's Produced via Inverse Microemulsion Polymerization as potential Gene and Antisense Delivery Agents，，)描述了具有季胺官能團和PEGDA 交聯劑的交聯丙烯酸酯納米凝膠。此納米凝膠的尺寸約為40 200nnu然而，這 些納米凝膠不包含足夠的聚乙二醇化，並且製備冗長，只能得到少量產品.
US 5,874,111公開了高度單分散的聚合物親水納米凝膠的製備，所迷納米凝 膠的尺寸至多lOOnm，能將藥物包封其中，該方法包括將單體水溶液或預聚物反 膠束、交聯劑、引發劑以及任選的藥物或者靶物質的混合物進行聚合.通過脫除 溶劑乾燥聚合反應產物，得到乾燥的納米顆粒和用於反膠束製備過程中的表面活 性劑。將乾物質分散於水性緩衝液中，由此除去表面活性劑和其它有毒物質.該 發明涉及製備高度單分散的聚合物親水納米顆粒的製備方法，所述納米顆粒具有 或沒有包封其中的靶分子，尺寸高達lOOnm並且具有高度單分散性。此外，這些 顆粒沒有足夠的聚乙二醇化以提供生物相容性，並且製備冗長。
9很多作者已經描述了製備表面改性顆粒的穩定分散體的困難，在生理條件下
(pH7.4和137 mM NaCI)達到穩定甚至更困難，Burke和Barret (Langmuir， 19, 3297(2003))描述了使含胺的聚電解質、聚烯丙胺鹽酸鹽在鹽的存在下吸附到 70~100iim的二氧化矽顆粒上。該作者指出(P.3299)"溶液中NaCl的濃度保持 在l，OmM,因為更高的鹽濃度會導致懸浮液產生絮凝"。
Siiman等在U.S. 5,248,772中描述了膠體金屬顆粒的製備，所述膠體金屬顆 粒具有連接有側基胺基的交聯氨基葡聚糖塗層.以0.24重量％的很低固體濃度制 得該膠體，沒有說明顆粒的最終尺寸，也沒有指明直接與膠體表面結合的氨基葡 聚糖的分數。由於實施例2中殼物質的重量(0.463g)與核物質的重量(0.021g) 的比率大約為21:1，看起來可能只有很小一部分的氨基葡聚糖與膠體的表面結合， 而絕大部分游離存在於溶液中。問題在於這會導致顆粒表面上的活性胺基數量很 少，從而膠體中的載體顆粒運栽有用的生物成分，藥物成分或者診斷成分的能力 很低，另一個問題在於未吸附到顆粒表面的聚合物可以幹擾生物成分、藥物成分 或者診斷成分的後續結合或偶聯。然而，該參考文獻描述了具有生物相容性塗層 的固體金屬顆粒，該塗層與本發明的親水納米凝膠有本質的區別。
US 6，207，134 Bl描述了微粒診斷造影刑，其包含磁性或超磁性金屬氧化物和 聚離子塗層劑。該塗層劑包括"可生理耐受的聚合物"，其包括含胺聚合物'據說， 該造影劑"相對於常見顆粒，穩定性和毒性都有改進"(第6欄，第11-13行). 作者指出(第4欄，第15-16行)"不是所有的塗層劑都被沉積下來，可能需要用 1.5~7， 一般大約兩倍過量的...，，塗層劑，作者進一步說明只有很少一部分聚合物吸 附於顆粒。例如(134的

圖1中，加入的0.5mg/mL聚合物只有大約0.15mg/mL(或 約30%)吸附，通過常規方法製備'134的表面改性顆粒，所述方法涉及簡單的混 合、超聲處理、離心和過濾，此外，該文獻描述了聚合物塗覆的固體金屬顆粒， 其與本發明的親水納米凝膠有本質的區別。
要解決的問題
希望製備用作用於生物偶聯(bioconjugation)和靶向給藥的栽體的納米凝膠， 所述納米凝膠是穩定的從而可進行體內注射，特別是血管內注射。另外，希望所 述用作栽體的納米凝膠在生理條件下(pH7.4和137 mM NaCl)穩定.此外， 希望所迷顆粒能避免免疫系統的檢測。希望使未吸附於納米凝膠的聚合物的量達 到最少。另外，光學分子成像需要納米凝膠探頭，其尺寸小於100nm，耐蛋白質 吸附，具有便於連接的部分，用於與生物靶向單元連接，且含有能在紅外線UR)
10中發射的發射染料。 發明概述
本發明一種納米凝膠，其包含重複的、交聯的式I烯鍵式不飽和單體的水相
容性、溶脹的、支化聚合物網絡
(X)m-(Y)n-(Z)o 式I
其中X是含有離子或氫鍵鍵合部分的水溶性單體；Y是含有與可聚合的烯鍵式不 飽和基團結合的重複親水單元的水溶性大分子單體；Z是多官能(multifunctional) 交聯單體；m為50 90mol% ; n為2~30mor/。；和o為l~15mo，％ ,本發明還涉 及製備納米凝膠的方法，其包括製備單體X、 Y和Z的混合物和第一部分引發劑 在水中的集管(header)組合物，其中X是含有離子或氫鍵鍵合部分的水溶性單
體，Z是多官能交聯單體；製備第二部分引發劑、表面活性劑和水的反應器 (reactor)組合物，所述水足以提供1~10% w/w單體X、 Y和Z的組合物；使反 應器組合物達到聚合溫度；反應期間使反應器組合物保持在聚合溫度下，經一段 時間(over time)將集管組合物加入到反應器組合物中，以形成反應混合物，式 I的納米凝膠。其中納米凝膠包含重複的、交聯的式I烯鍵式不飽和單體的水相 容性、溶脹的、支化聚合物網絡
(X)m-(Y)n-(Z)o 式I
其中m為50~90mol % ; n為2 30mol % ;和o為l 15mol % , 發明的有益效果
本發明包括數個優點，但並不是所有優點都包括在一個單獨的實施方式中' 本發明的材料提供了高染料加載水平的媒質，所述材料在寬範圍條件下是穩定的， 容易製備，顯示出高的生物相容性，
附圖簡要說明
圖1示出了示例的加栽有染料的納米凝膠1和PBS緩衝液中的0.0125mg/ml
染料1的歸一化吸收光謙.
發明詳述
本發明涉及一種納米凝膠，其包含特定通式的重複的、交聯的烯鍵式不飽和
11單體的水相容性、溶脹的、支化聚合物網絡，
已發現某些特定的凝膠是無毒的，且能夠進入身體中的小毛細管，在體內被 運輸到疾病位點，穿過生物屏障(包括但不限於血-腦屏障和腸上皮)，吸收進入 細胞胞呑小泡，穿過細胞膜並運輸到細胞內的把位點.相對於更大尺寸的微粒，
據信該尺寸範圍內的顆粒能夠被更有效地轉移通過動脈壁，參見Labhasetwar等， Adv. Drug Del. Res. 24:63 (1997)。不希望受任何具體理論的束縛，還認為由於高 的表面積-體積比，小尺寸對於使用靶向分子成功靶向這些顆粒是必要的。另外， 當納米凝膠佔據絕大部分是水的流體動力球時，它們以比固體顆粒更高的加栽水 平被感興趣部分(生物靶向部分、染料等)功能化，
效性和安全是必需的。公認的是，納米凝膠的有用性能僅由其尺寸和結構決定， 而不依賴於所使用的製備方法。因此，本發明不受某些合成或純化操作的限制， 而是涵蓋了生物製劑組合物中有用的新化學個體。
本發明的納米凝膠在寬範圍的生理和實驗條件下是可溶的，高度穩定的且不 發生聚集。納米凝膠的荷栽能力可高達幾克或者幾十克/克聚合物網絡。這比納米 粒子所達到的荷栽能力高得多。參見Labhasetwar等，Adv. Drug Del. Res" 24:63 (1997)。與常規的藥物傳遞粒子(例如固體納米粒子(通常必須在生物製劑存在 下製備))不同，可在網絡合成後，將生物製劑加栽聚合物網絡。這大大簡化了 本發明的生物製劑組合物的製備和使用，允許使用含許多不同的生物製劑和組合 物的多批納米凝膠。
說明書中使用的術語應具有以下含義
術語"納米凝膠"是指溶脹的、相鄰的(contiguous)交聯聚合物網絡，尺寸 為5~100納米，通過它可以追蹤任何兩個原子(不包括抗衡離子)之間的通過鍵 途徑(through-bond path),
術語納米粒子或納米微粒是指尺寸小於lOOnm的顆粒，
術語"膠體"是指分散在液體(例如水)中的小顆粒的混合物.
術語"生物相容性，，是指組合物不會破壞引入其的生物系統的正常功能，典型 地，生物相容性組合物將會與血液相容，而不會在身體中引起不良作用。例如， 作為生物相容性物質，其應是無毒的、無免疫原性的或不形成血栓的。
術語"生物可降解的"是指材料可在生理條件下可被酶促降解或水解降解成能 夠通過正常過程從體內排除的較小分子.
12術語"刷狀聚合物"是指具有相對均勻的大分子"臂"的聚合物，每個臂的分
子量為400道爾頓或更大，從相鄰的(contiguous)聚合主鏈伸出(eminate)， 其中所述臂僅在其兩個可能的端部中的一端各自與主鏈連接，所述臂沿主鏈的分
布是相對均勻的。
術語"溶脹"是指溶劑化狀態，其中聚合物與溶劑分子結合而不是彼此結合， 從而擴大了單個聚合物分子所佔據的總體積。
術語"水相容性"是指材料在溫度為5 80'C的水中以溶脹狀態存在.
納米凝膠是穩定的溶液或分散體.如果通常在幾個小時優選幾周到幾個月的 時間內，固體顆粒沒有聚集(由粒度測量確定)並從分散體中沉澱出來，就認為 分散體是穩定的。描迷不穩定性的術語包括聚集、結塊、絮凝、膠凝和沉降，在 其製備的一天內，平均粒徑顯著增長到直徑大於核直徑的約3倍，並且分散體有 可見的沉澱，表明分散體不穩定。優選納米凝膠於20 35'C在0.137M NaCl (pH 7.4)中是穩定的。最優選納米凝膠在0.8MNaCI中是穩定的。
本發明的納米凝膠基本上不吸附血清蛋白.對於體內應用，令人合意的是， 納米顆粒具有長的循環壽命'血清蛋白實體吸附在納米顆粒表面上(調理作用) 常常會妨礙它們從循環中的去除，通常通過被巨噬細胞或者單核細胞攝取來實現 這種去除。即使沒有將它們從循環中去除的情況下，蛋白質與納米顆粒表面的非 特異性結合也會汙染表面，並遮蔽所需官能團，例如生物靶向部分.血清蛋白的 例子包括免疫球蛋白的各種亞類、補體蛋白、栽脂蛋白、血管性血友病(van Wi"ebrand)因子、血小板反應蛋白、纖連蛋白、甘露糖結合蛋白和血漿蛋白(例 如血清白蛋白)。就本發明而言，如果納米凝膠不吸附牛血清白蛋白(BSA)( — 種典型的血清蛋白)，那麼可以認為其基本上不吸附血清蛋白。可通過結合納米 凝膠與BSA，並在PBS緩沖液中實施尺寸排阻色譜來測試該性能.如果納米凝膠 不吸附BSA，那麼BSA的保留體積將與BSA本身的體積沒有差別，整個色譜曲 線的形狀將與單個成分(BSA和納米凝膠)的色譜曲線的形狀的組合一樣.
優選的實施方案中，納米凝膠是由水相容性、溶脹的、支化聚合物或大分子 單體製成，其中大分子單體是指重複的、交聯的式1烯鍵式不飽和單體的大分子 單體
(X)m-(Y)n-(Z)o 式I
式1中，X是高度親水的單體，其含有離子部分或含可交換質子的部分；Y是水
13溶性的大分子單體，其含有與可聚合的烯鍵式不飽和基團結合的重複的親水單元; Z是多功能的交聯單體.含可交換質子的部分可包括醇、伯胺及仲胺、伯醯胺、 仲醯胺、羧酸、氨基甲酸酯、醯亞胺、脲、膦酸、磺酸、亞磺酸或含有雜原子(N、
S、 O、 P)-氫鍵的任何其它單元。
"高度親水的單體"定義為logP計算值小於等於0.4, LogP值是指化合物的辛 醇-水分配係數的對數.化合物的辛醇/水分配係數(P)指平衡狀態下，溶解於辛 醇相中的物質的量除以水相中的濃度所得到的比值。LogP經常用來描述分子傾向 油(辛醇)或水相的相對趨勢(參見Leo and Hansch， "Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology," Wiley, New York, 1979， and in Leo, Hansch， and Elkins， CAe肌Z ev., 6， 525， (1971))。它是分子疏水或親水程度 的量度，測量單體的分配係數會有難度；但是，已開發了從化合物分子結構計算 logP的方法，例如由SYRACUSE RESEARCH CORPORATION ( Environmental Science Center, 6225 Running Ridge Road, North Syracuse, N.Y. 13212-2510)開 發的KOWWIN 程序1.6版本就是這樣的程序。
本發明中，m可以是50~90mo，％，優選60~80mol%.此外，n可以是 2~30mol%,優選10 20mol"/0， o可以是l~15mol%，優選2~9mol%。
X是含有離子或含可交換質子的部分的水溶性單體.特別有用的高度親水的 "X"單體可用下式描述
其中B是H或CH3， D可分別是H、具有氫鍵鍵合部分並含有不多於三個碳原子 的非離子單元、或含有至多六個碳原子的離子單元'E可具有B的組成，除了 E 另外可以是CH3' X可以是但不一定限於甲基丙烯酸、丙烯酸、丙烯醯胺、甲基 丙烯醯胺、氨丙基甲基丙烯跣胺鹽酸鹽、甲基丙烯酸磺基丙酯(sulfopropyl methacrylate)、丙烯酸羥乙酯或甲基丙烯酸羥乙酯、N-甲基丙烯醯胺或N，N-二 甲基丙烯醯胺。
Y是水溶性大分子單體，分子量為200 20，000，優選為400 10，000，包含重 復的水溶性單元。Y優選是聚乙二醇大分子單體，例如聚乙二醇丙烯酸酯、聚乙 二醇甲基丙烯酸酯、N-聚乙二醇丙烯醯胺、N-聚乙二醇甲基丙烯醯胺或具有苯乙烯末端的聚乙二醇大分子單體，
交聯單體Z可以是高度親水的或者可溶於有機溶劑(organic-soluble)的交 聯劑，例如亞甲基雙丙烯醯胺、N，N，-(l，2-二羥乙烯)二丙烯醯胺、亞甲基二甲基 丙烯醯胺二乙烯基苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯，該交聯單體優選是雙官能團的 ((Afunctional)、三官能團的或四官能團的，分子量小於300道爾頓。單體總量 的至少90%應該是高度親水或者水溶性單體.剩餘的10%可包含可溶於有機溶刑 或者非高度親水的單體。
納米凝膠的粒度可以通過很多方法或者多種方法的組合來表徵，所述方法包 括光散射法、沉降法(例如分析超速離心法)、水動力分離法(例如場流分級法) 和尺寸排阻色譜法，以及電子顯微鏡法。實施例中的納米凝膠主要用光散射法來 表徵 可以用光散射法獲得有關納米凝膠的體積中值粒徑、粒徑、數量和體積分 布、分布的標準偏差和分布寬度的信息，
納米凝膠的體積平均流體力學體積中值直徑可以在10~100nm，優選為 10~50nm,在磷酸鹽緩衝鹽水(137mM NaC" 2.7mM KCI， 10mM Na2HP04， 2mM KH2P04, pH7.4)中進行準彈性光散射測得。流體力學直徑指由準彈性光散射法 測定的聚合物和與它結合的溶劑的等效球體(叫uivalent sphere)的直徑。
納米凝膠的重均分子量也可以為15，000~6，000，000，優選為80，000 800,000， 最優選為100，000~400，000，重均分子量由靜態光散射法或尺寸排阻色諳法測得。 納米凝膠的重均平均聚合度可以是50 86，000，優選為100~1500,該聚合度可由重 均分子量、組分單體的分子量和摩爾分數計算得到，組分單體的摩爾分數可以由制 備納米凝膠的配方確定，或通過其它合適的確定聚合物組成的分析方法(NMR， 滴定法等)確定'納米凝膠在水中的(h參數可為0.01~0.30，優選為0.02 0.20。該 參數是流體動力球中納米凝膠的密度的量度，其通過如下方程式計算
麼二f ^
、3 J
其中Mw是由靜態光散射法或尺寸排阻色譜法測得的重均分子量，Rh是由準彈性
光散射法或其它合適的方法測得的流體動力半徑，NA是阿伏加德羅常數。
在1，1，1，2，2，2-六氟-2-丙醇(HFIP)中測得的特性粘數為0.40 dL/g~0.85 dL/g. 特性粘數是聚合物在無限稀釋的溶液中的粘度。它可以由毛細管粘度法測得，例 如在Principles of Colloid and Surface Chemistry (Paul C. Heimenz and Raj Rajahgopa，an， Marcel Dekker Inc， New York 1997)或者Colloidal Systems and
15Interfaces (Sydney Ross and Ian Morrison, John Wiley and Sons, New York, 1988)
中描述的方法，
由於可在寬範圍的化學條件下使用納米凝膠，因此在升高溫度下納米凝膠不 發生尺寸急劇縮小是有利的。許多已知的納米凝膠和微凝膠材料在升高溫度時會 發生明顯的形態變化，其中材料坍塌，有時發生劇烈的體積變化，這樣的轉變在 藥物遞送和成像應用中是不利的，因為這種顯著的形態變化可擾亂納米凝膠組合 物的有效栽荷、形態以及表面基團的配置或造成重排。當這種轉變在生理溫度或 接近生理溫度下發生時尤其不利。因此本發明的納米凝膠在溫度從25'C升至80'C 時，其流體動力直徑會顯示小的變化(<25% )或者淨增加.
本發明的納米凝膠可以用作運栽生物、藥物或診斷成分的載體，具體地，用 作栽體的納米凝膠不需要將具體治療劑或成像成分包裹起來，而是作為生物、藥 物或診斷成分的栽體。生物、藥物或診斷成分例如治療劑、診斷劑、染料或者放 射照像造影劑。術語"診斷劑"包括可作為造影劑從而在宿主哺乳動物中產生可 檢測的指示信號的成分.可檢測的指示信號可以是Y射線發射的、放射性的、回 聲的、螢光鏡的或生理學的信號等等，本文所用的術語"生物醫藥劑"包括有效 治療生理病症的生物活性物質、藥品、酶、激素、類固醇、重組產物等等.治療 劑的例子為抗生素、溶血栓酶(例如尿激酶或鏈激酶)、胰島素、生長激素、化 學治療劑(例如阿黴素)和抗病毒劑(例如幹擾素和阿昔洛韋)， 一經酶降解(例
包含本發明聚合物網絡和合適的靶向分子的組合物也在本發明的範圍內。本 文所用的術語"靶向分子，，指連接於本發明聚合物網絡以增強結合、運輸、堆積、
細胞中表現出生物活性的任何分子、原子或離子，靶向分子將時常包含通常對某 特定細胞表面抗原具有特異性的抗體、抗體片斷或嵌合抗體分子.其也可以是， 例如，與細胞表面受體有特定相互作用的激素，或者具有細胞表面受體的藥物. 例如，糖酯類可以靶向多糖受體。它也可以是，例如酶、外源凝集素和多糖.低 分子質量(mass)配體，例如葉酸及其衍生物也可用於本發明的上下文，靶向分 子也可以是多核苷酸、多肽、肽模擬物、包括多糖的碳水化合物、其衍生物或通 過組合化學和生物學方法得到的其他化學實體。靶向分子可用於促進本發明的納 米凝膠的胞內運輸，例如使用諸如促融肽(已由Soukchareun等在Bioconjugate Chem" 6， 43, (1995)中或Arar等在Bioconjugate Chem" 6， 43 (1995)中描述)、
,治療劑可以在一段時間內被釋放。核型(caryotypic)肽或提供向細胞內定點運輸(尤其，從內涵體腔室排出到細胞 質，或傳送到細胞核)的其它生物特異性基團作為靶向分子運輸到細胞核.
上述組合物可以進一步包含具有可以識別特定靶細胞的靶向部分的生物、藥 物或診斷成分，上述組合物的一個特徵可以是通過與上述用作栽體的納米凝膠結 合的靶向分子識別和結合細胞表面受體.就本發明目的而言，被納米凝膠運載的 化合物可以稱為"被栽"化合物，例如，上述包含識別特定靶細胞的牝向分子的生 物、藥物或診斷成分是"被栽"化合物.該特徵利用這樣的理解細胞表面結合亊 件通常是細胞級聯的起始步驟，細胞級聯引起一系列事件，特別是受體介導的內 吞。術語"受體介導的內吞"("RME") —般描述通過將配體結合到位於細胞表 面的受體上而催化受體結合的配體被內化入細胞的機制.許多蛋白質和其它結構 通過受體介導的內吞進入細胞，包括胰島素、表皮生長因子、生長激素、甲狀腺 刺激激素、神經生長因子、降血鈣素、胰高血糖素等等，
受體介導的內吞提供了一種將可能含有其它生物、藥物或診斷成分的所述納 米凝膠運輸到細胞內部的便利機制.在RME中，配體與位於細胞表面上的受體 的結合可引發細胞內信號，所述細胞內信號可包括內吞反應.這樣，用作栽體的、 結合有靶向部分的納米凝膠可以結合在細胞表面上，隨後內陷並內化於細胞中.
可以用作對本發明組合物有用的靶向試劑的部分的代表性但非限制性列表包括蛋 白質、肽、適體(aptomers)、有機小分子、毒素、白喉毒素、假單胞菌毒素、 霍亂毒素、蓖麻毒素、伴刀豆球蛋白A、勞氏肉瘤病毒、塞姆利基(Semliki)森 林病毒、水泡性口炎病毒、腺病毒、轉鐵蛋白、低密度脂蛋白、鈷胺傳遞蛋白、 卵黃蛋白、表皮生長因子、生長激素、甲狀腺刺激激素、神經生長因子、降血鈣 素、胰高血糖素、泌乳剌激素、促黃體生成激素、甲狀腺激素、血小板衍生生長 因子、幹擾素、兒茶酚胺、肽模擬物、糖酯類、糖蛋白類和多糖.也可以使用上 述部分的同源物或片斷。這些靶向部分可與納米凝膠結合，並用於將納米凝膠引 導到把細胞，隨後在把細胞中被內化.並不要求將整個部分用作靶向部分.已知 與特定受體或其他結構相互作用的這些部分的更小片斷也可以用作靶向部分.
抗體或抗體片段代表了最廣泛使用的一類靶向部分，其可用於增強納米凝膠 攝入細胞。可以通過本領域普通技術人員公知的各種技術中的任一種製備抗體. 參見例如，Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988。可以通過細胞培養技術製備抗體，細胞培養技術包括 產生單克隆體或通過將抗體基因轉染到合適的細菌或哺乳動物細胞寄主，以產生
17重組抗體，在一種技術中，首先將包含多肽的免疫原注射入各種各樣哺乳動物(例 如小鼠、大鼠、兔子、綿羊或山羊)中的任一種，如果多肽連接到栽體蛋白(例 如牛血清白蛋白或鑰孔蟲成血藍蛋白)可得到優異的免疫應答反應.將免疫原注 射入動物宿主，優選按照預定計劃摻入一種或多種強化免疫，並對動物定期放血，
對該多肽具有特異性的多克隆抗體從抗血清中純化出來。
對感興趣的抗原性多肽具有特異性的單克隆體可以通過例如Kohler和 Milstein， Eur. J. Immunol. 6:511-519， 1976中描述的技術和其改進技術製備，
單克隆體可以從生長中的雜交瘤克隆上清液中分離得到。另外，多種技術可 用來增加產量，例如將雜交瘤細胞系注射入合適的脊推動物宿主(例如小鼠)的 腹腔中。然後可以從腹水或血液中收穫單克隆抗體，可以用常規技術從抗體中除 去汙染物，例如色譜法、凝膠過濾法、沉澱法和萃取法，本發明的多肽可以用於 純化步驟(例如親合色譜步驟)中.
已描述了大量含有衍生自非人免疫球蛋白的抗原結合位點的"人源化"抗體
分子(Winter等，(1991) Nature 349:293-299; Lobuglio等，(1989) Pro" Nat. Acad.
Sci. USA 86:4220-4224)。這些"人源化，，分子被設計為將針對嚙齒類抗人抗體分
子的不良免疫應答最小化，所述不良免疫應答限制了那些部分在人類接受者中的
治療性應用的持續時間和有效性.
維生素和其它必需礦物質和營養素可用作靶向部分以增強細胞對納米凝膠的
攝取，特別地，維生素配體可以選自葉酸(folate)、葉酸受體-結合葉酸類似物 (binding analogs of folate)、其它的葉酸受體-結合配體、生物素、生物素受體-結合生物素類似物和其它的生物素受體-結合配體、核黃素、核黃素受體-結合核 黃素類似物、其它的核黃素受體-結合配體、硫胺素、硫胺素受體-結合硫胺素類 似物和其它的硫胺素受體-結合配體。被認為觸發受體介導的內呑作用，從而也能 按照本發明公開的方法應用的另外的營養素為肉鹼、肌醇、硫辛酸、煙酸、泛酸、 吡噴醛和抗壞血酸，以及脂溶性維生素A、 D、 E和K。另外，現有技術中描述 的任何"免疫脂質體，，(在脂質體表面連有抗體的脂質體)都適合與所迷組合物一 起使用
由於並非所有的天然細胞膜都具有生物活性的生物素或葉酸受體，所述組合 在生物活性的生物素或葉酸受體.這樣，可以通過以下方法增加細胞膜上的生物
18素或葉酸受體數目在缺乏生物素或葉酸的培養基上使細胞系生長以促進生物素 或葉酸受體的生成，或者表達插入的外源基罔，所述外源基因編碼與生物素或葉 酸受體相應的蛋白質或栽脂蛋白。
RME不是將所述納米凝膠轉運入細胞的唯一方法，可採用的通過將適當的實 體與納米凝膠連接的其它攝取方法包括了膜孔的有利使用.吞噬和胞飲機制也提 供了將納米凝膠內化入細胞的有利機制。
識別部分可以進一 步包含可被酶裂解或電化學裂解的序列.因此識別部分可 包含易被存在於細胞內部各種位置的酶裂解的序列，所述酶例如為蛋白酶或限制 性核酸內切酶(例如DNA酶或RNA酶)，
細胞表面識別序列不是必需的。因此，雖然細胞表面受體靶向部分可以用於 靶向給定的細胞類型，或者用於引導所述納米凝膠與細胞表面結合，但是並不要 求在納米凝膠的表面上存在細胞表面受體耙向部分.
為了將生物、藥物或診斷成分組裝到用作栽體的所述納米凝膠中，這些成分 可以通過鍵合與納米凝膠栽體連接，"連接"是指成分被納米凝膠攜帶，該成分可 被溶解，並非共價地結合在納米凝膠中。
一般地，可使用任何方式在感興趣的生物、藥物或診斷成分與用作栽體的納 米凝膠之間形成鍵合。這可以包括配體與外源分子通過連接基團直接或間接形成 共價鍵合、離子鍵合或氫鍵鍵合。典型地，通過生物、藥物或診斷成分與用作栽 體的納米凝膠的共價鍵合形成鍵合，通過在複合物的各成分上的酸劑、醛基、羥 基、氨基或聯亞氨基之間形成醯胺、酴或亞胺鍵來形成所述共價鍵合。優選本領 域公認的生物學不穩定的共價鍵合，例如亞胺鍵和含有-COOCH、 -0-O-或 -COOCH鍵的所謂的"活性"酯。感興趣的生物、藥物或診斷成分可連接於預先形 成的納米凝膠，或者感興趣的成分可以預先連接到可聚合單元，在納米凝膠的制 備過程中直接聚合入納米凝膠。氫鍵鍵合(例如發生在核酸的互補鏈之間)也可 用來形成鍵合.
在本發明的優選實施方案中，感興趣的生物、藥物或診斷成分通過與高度親 水性大分子單體單元末端的反應性化學單元反應而連接於納米凝膠，優選該反應 性化學單元是羧酸、胺或活化酯。最優選通過連接聚合物發生這種連接。
連接聚合物可用於醯化和烷基化方法中，其與水性和有機溶劑體系是相容的， 因此在與有用基團反應方面有更大的靈活性，並且所需的產品在含水環境(例如 生理環境)中更加穩定。連接聚合物具有聚乙二醇主鏈結構，其含有至少兩個反應基，每一端有一個，聚乙二醇大分子單體主鏈的一端含有可自由基聚合基團， 該基團可以是但不必限於甲基丙烯酸醋、丙烯酸酯、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、
苯乙烯類(styrenic)、烯丙基、乙烯基、馬來醯亞胺或馬來酸酯，聚乙二醇大分 子單體主鏈的另一端另外含有反應性化學官能團，其可作為其它化學單元(例如 猝滅劑或抗體)的連接點。該化學官能團可以是但不限於硫醇、羧酸、伯胺或仲 胺、乙烯基磺醯基、醛、環氧、醯肼、琥珀醯亞胺酯、馬來醯亞胺、ct-由代羰基 部分(例如碘乙醯基)、異氰酸酯、異硫氰酸酯和氮丙啶，優選這些官能團是羧 酸、伯胺、馬來醯亞胺、乙烯基磺醯基或仲胺.最優選反應基之一是丙烯酸酯、 氰基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，其用於形成納米凝膠和乳膠，以及通過麥可 (Michael )加成與硫醇進行反應。另外的反應基用於偶聯造影劑、染料、蛋白質、 胺基酸、肽、抗體、生物配體、治療劑和酶抑制劑。連接聚合物可以是支化的或 未支化的。優選地，對於最終產品製劑的治療用途，連接聚合物將是藥學上可接 受的 聚乙二醇大分子單體的分子量可以是300 10，000，優選為500 5000。
本文使用的特別優選的水溶性連接聚合物是式I的聚乙二醇衍生物。連接聚 合物的聚乙二醇(PEG)主鏈是通式為H(OCH(2)CH(2))(n)OH (其中n>4)的親 水的生物相容性無毒聚合物。
其中X-CH3或H， Y-O、 NR或S， L是連接基團或間隔基，FG是官能團， n大於4且小於1000,最優選X-CH3， Y-O、 NR， L是烷基或芳基，FG是 NH2或COOH， n為6 500或10~200。最優選n = 16,
以下是優選的連接聚合物的列表，但無意成為根據本發明的所有連接聚合物 的窮舉和完全的列表
X
0
0
X
0
20cooh
s、
,cooh
nh，
0
s cooh
cooh
s
nh，
s
cooh
s、 / 、n-h
.0
0
cooh
cooh
s、
21
^/nh2 hci
s
nh以上討論的任一種連接聚合物還用作本發明納米凝膠的Y單體， 在製備足夠純的納米凝膠(優選包含帶有生物、醫藥或診斷成分的納米凝膠) 後，將納米凝膠製備在可給予對象或樣品的藥物組合物中可能是合意的。優選的 給藥技術包括腸胃外給藥、靜脈內給藥和直接輸注入任何想要的把組織，所述把 組織包括但不限於實體肺瘤或其它腫瘤組織。可通過採用最後的純化步驟來完成 純化，所述步驟將納米凝膠溶解在含有合適藥物組合物的介質中。合適的藥物組 合物通常包含一定量的所需納米凝膠和符合劑量信息(在每一個案基礎上確定) 的活性試劑。所述納米凝膠可與藥學上可接受的稀釋劑或賦形劑(例如無菌水溶 液)混合得到合適的終濃度.此類製劑可典型地包括諸如磷酸緩沖鹽水(PBS) 的緩沖劑，或諸如藥物賦形劑、穩定劑(例如BSA或HAS)的其它添加劑，或 鹽(例如氯化鈉)。
對於腸胃外給藥，通常希望進一步通過確保此類組合物無菌、無免疫原性和 無致熱性以使其是藥學上可接受的.此類技術在本領域中通常是眾所周知的.另 外，對人類給藥，製劑應滿足FDA生物學標準所要求的無菌性、致熱性、 一般安 全性和純度標準。當所述納米凝膠組合物被引入到懸浮於細胞培養物中的細胞時， 足以在合適的生長培養基(例如Luria肉湯(LB))或適當的細胞培養基中將細 胞和納米凝膠一起培養。雖然可能有其它的引入方法，但這些引入處理是優選的， 並可以不需要考慮存在於用作載體的納米凝膠表面上的實體而實施，
可以通過連續加入單體進行溶液聚合製備本發明的納米凝膠。該方法包括制 備所有單體的混合物、第一部分引發劑和任選的溶於水中的表面活性劑的"集管" 組合物；製備第二部分引發劑和表面活性劑及水的"反應器"組合物，所迷水足以 提供l~10%Ww總單體的組合物；使所述"反應器"組合物處於聚合溫度；在反應 期間將所述"反應器"組合物保持在所述聚合溫度下；經一段時間將集管組合物加 入到反應器組合物中，以形成反應混合物.此外，可將反應混合物加熱至多48 小時，並通過滲析、超濾、滲濾或用離子交換樹脂處理可進一步純化反應混合物， "集管，，組合物由所有的單體的混合物、0~100%引發劑和0~100%表面活性 劑(如果使用表面活性劑)和0~100 %水製成。單體混合物包含50~90mol % —種 或多種"X型，，單體(優選60~80 mol% ) ， 2~30 mol%"Y型"單體(優選10~20 mol
22% )和1 20mor/。"Z型"單體(優選11~15 mol% ) . X、 Y和Z型單體已在本文 件的上面章節中描述，
引發劑可以是在加成聚合領域中已知的任何常用水溶性聚合引發劑.包括但 不限於偶氮化合物，例如4，4，-偶氮二(4-氛基戊酸)和2，2，-偶氮二(2-脒基丙烷)二 鹽酸鹽、2，r-偶氮二(N，N，-二亞甲基異丁脒)及其二鹽酸鹽、2，2，-偶氮二2-甲基 -N-(2-羥乙基)丙醜胺；水溶性過氧化物；氫過氧化物和過酸例如過乙酸和過氧化 氫；過-克酸鹽，例如過硫酸鉀、過》克酸鈉和過石克酸銨；二石克化物；四氮棒；和氧 化還原引發劑體系，例如H202/Fe2+、過硫酸鹽/亞硫氫酸鹽、草酸/Mn"、硫脲/Fe". 優選使用水溶性偶氮類引發劑。如果使用氧化還原或雙組分引發劑，則一個組分 將典型地包含在集管組合物中，另一組分將包含在反應器組合物中，這樣當該兩 種混合物混合時穩定地產生自由基，或者水溶性光引發劑可以與輻照源結合使用。
可在本發明中使用的表面活性劑可以是陰離子的、陽離子的、兩性的、中性 的、低分子量的、高分子、合成的或從天然來源中提取或衍生得到的表面活性劑。 存在著大量的已知表面活性劑。有關表面活性劑的良好參考文獻有^"r/a"a"f //fl禍融(GPO: Washington, D.C.， 1971)和AfcCWdteow E廳/s7y m1
(Manufacturing Confectioner Publishing Company: Glen Rock, 1992)。 一些實例包括但不限於十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磧酸鈉、磧基琥珀 酸酯類(例如商品名為AEROSO!^的那些產品)、乙氧基化烷基酚(例如TRITON X-100和TRITON圾X-705)、乙氧基化烷基酚硫酸鹽(例如RHODAPEX CO-436 )、 磷酸酯表面活性劑(例如GAFAC RE-90)、十六烷基三甲基溴化銨、十六烷基 氯化吡啶総、聚氧乙烯化長鏈胺及其季銨化衍生物、鏈烷醇胺縮合物 (condensates)、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物(例如商品名為 PLURONIC⑧和TECTRONIC⑧的產品)、N-烷基甜菜鹼、N-烷基胺氧化物和磺 化二苯醚(例如商品名為Dowfax⑧的產品).
"反應器，，組合物由其餘的引發劑、表面活性劑和水製成，所述水足以提供 l 10%w/w總單體的組合物。
使反應器組合物處於聚合溫度，並在反應期間保持在該溫度'該溫度是已知 聚合引發劑具有足夠活性的溫度，例如，使用AIBN或過石克酸鉀或4，4，-偶氛二(4-氰基戊酸)時，60 80'C通常是足夠的.對於過硫酸鹽/亞硫酸氫鹽氧化還原系統， 25 40'C通常是足夠的.
經30~1440分鐘將集管組合物加入到反應器組合物中.優選充分定時(timed )
23加入速率以使加樣完成時單體總量的至少80%已發生反應，
任選地，可進一步對反應混合物加熱至多48小時。優選對集管內容物和反應 器內容物脫氣(degas)，以除去氧氣，這可通過用氮氣或氳氣或其它合適的惰性 氣體對內容物充氣(sparging)，或者通過使內容物經過冷凍-抽吸-解凍的循 環然後將內容物用氮氣或氬氣保護(blanketing)來實現的。可通過滲析、超濾、 滲濾或用離子交換樹脂處理來進一步純化納米凝膠。
本領域普通技術人員將認識到，即使當本發明的實施限制於例如某些納米凝 膠時，仍然有大量製備和分散納米凝膠的方法，所述方法將產生具有所需特性的
及其生物試劑組合物.4rfvflwces /w G 〃oW awd /wfer/ace 5We"ce 1999， 80， 1-25對 這些方法中的一些進行了有用概述，這些方法包括反相乳液和微乳液技術，例如 在.yVw a/ t|/ f/te /l附m.am C7rew/c"/ 5W'一 2002， 124， 15198-15207， /m/Zar P/j"函c論'c《2005， 2， 83-91或在美國專利5,874,111中描述的那些技術；例如在 Afac/"omo,ecM/fl/" 5y附p油1995， 93， 293-300和在她awno/ea^ 2002， 35， 3668-3674中描述的間歇溶液聚合；以及高度稀釋交聯(dilution crosslinking)法， 例如在美國專利6890703中描述的那些方法。 提供以下實施例，對本發明進行說明。
除非另有說明，所有試劑均得自AldHch,使用帶有633nm雷射(利用173 度反向散射檢測器)的Nano ZS型ZEN3600 (Ma，vern Instruments)獲得準彈性 光散射測定.運行樣品的濃度為0.1~0.4% (溶於磷酸緩沖鹽水中進行)。在 1,1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中於45.0X:使用兩個Polymer Laboratories Mixed-C柱進 行尺寸排阻色譜,在T. H. Mourey， T. G. Bryan, /. C7i圓"豐,964， 169-178 (2002)中描述的設備上配備有兩角度(two-angle )彈性光散射(PDMZO, Precision Detectors)、差示粘度測定(Viscotek Model H502A)、分光光度和示差折光檢 測，25'C下使用兩個PSS Suprema柱在磷酸緩衝鹽水(0.137 M NaCl、 0.0027M KCI、 0.01MNa2PO4、 0.002M KH2P04)t測定一些材料的分子量分布.用兩角度 光散射檢測在PBS中測定絕對分子量.
實施例1.製備胺端基聚乙二醇大分子單體
24將335g聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(Aldrich, Mn=875 )與100ml甲醇混合， 用5.8g半胱胺(Aldrich， MW77)和二異丙基乙胺(Hunigs鹼)處理，室溫下攪 拌2天，用旋轉蒸發器濃縮。用1L乙酸乙酯吸收殘餘物並用10y。HCI水溶液萃取， 收集水層，加入50%的氫氧化鈉水溶液使之呈鹼性，然後乙酸乙酯萃取，有機層 經MgS04乾燥，過濾和濃縮，用無水二乙醚吸收殘餘物並用氣態HCI處理並使之 靜置.將乙醚潷去，以留下深藍色的油.用新鮮的二乙醚洗滌該物質，將二乙醚潷 去.使用旋轉蒸發器濃縮該深藍色的油，得到37g所需產物，為鹽酸鹽。
'H-NMR (300MHZ，CDCI3): D 1.18 (d， 3H)， 1.93 (bs， 3H)， 2.04 (bs， 2H)， 2.43-2.77 (bm， 7H)， 3.6-3.7 (vbs， -CH2CH20-)， 3.73 (bt， 2H)， 3.29 (bt， 2H)， 5.56 (bs， 1H), 6.12 (bs， 1H),
實施例2:含有9.30molV。交聯劑的磺化甲基丙烯酸納米凝膠(納米凝膠l)
用底部的Ace# 15玻璃絲(glass thread )以及用於連接內徑1/16英寸的聚四 氟乙烯管的一系列管接頭對500ml的三頸圓底燒瓶進行改裝。該燒瓶(以下稱為 "集管，，燒瓶)配備有機械攪拌器、帶有注射器針頭氮氣入口的橡膠隔片'該集管 燒瓶裝有曱基丙烯酸(4.88g， 5.66xl(T2mol )、亞甲基二丙烯醯胺(1.13g， 7.30x10-3mol)、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯(11.81g， 1.07xl0-2 mol， Mn= 1100)、 甲基丙晞酸鉀磺基丙酯(potassium sulfopropy， methacrylate ) (0,95g， 3.80x10—2mol)、 2，2，-偶氮二(N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.26g) 、 IN NaOH (3.96g)和蒸餾水(73.80 g)。配置機械攪拌器、回流冷凝器、氮氣入口和橡膠隔片 的1升三頸圓底燒瓶(以下稱為"反應器")中2，2，-偶氮二(N，N，-二亞曱基異丁 脒)二鹽酸鹽(0.26g) 、 IN NaOH (3.96g)和蒸餾水(149,84g)。將集管燒瓶和反應 器的內容物均攪拌至均勻，並且用氮氣鼓泡脫氣20分鐘，將反應器燒瓶放置在 50TC恆溫水浴中，使用QG6型實驗室泵(Fluid Metering Inc. Syossett，NY)經4 小時將集管燒瓶的內容物加入到反應器中.加料完成後，加入追蹤劑(chaser) 2,2，-偶氮二(N，N，-二亞曱基異丁脒)二鹽酸鹽(0.06g)，在50"C下攪拌反應混合物 16小時，使用14K截留膜(cutoff membrane)在連續補充水的浴中對反應混合 物進行滲析48小時 獲得504克含1.98%固體的無色溶液。通過準彈性光散射測 得體積中值直徑為16.8nm，變異係數為0,3,在磷酸緩衝鹽水中，尺寸排阻色謙 法得到Mn = 24,700， Mw = 64,600， Mz = 122,000以及Mw/Mn = 2.61， Mz/Mw = 1.88。經計算，0>2參數為3.18°/。，重均聚合度為270。
25實施例3:含有8.22mor/。交聯劑的胺官能化甲基丙烯酸納米凝膠(納米凝膠2) 這種納米凝膠的製備方法與實施例2中所述的相同，除了集管燒瓶內容物的 加入時間為2小時，採用3.5K截留膜進行滲析，集管燒瓶盛有甲基丙烯酸(3.85g， 4.47xl(T2im)l) 、 二乙烯基苯(0.79g， 6.00x10 —3mol，異構體的混合物，純度為 80 % ,其餘為乙基苯乙烯異構體)、實施例1中的胺端基聚乙二醇大分子單體(7.85g， 8.00x10 —3mol) 、 2，2，-偶氮二 ( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.06g )、十六 烷基氯化吡啶絲(0.31g)、蒸鎦水(76.40g)和1N NaOH (3.13g),反應器內 容物為蒸餾水(155.11g ) 、 2，2，-偶氮二( N，N，-二亞曱基異丁脒)二鹽酸鹽(0.06g )、 十六烷基氯化吡啶総(0.94g)和lNNaOH(3.13g)。"追蹤劑，，由2，2，-偶氮二( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.04g)組成.得到187.4g固體含量為3.48%的澄清 分散體。通過準彈性光散射檢測，體積中值直徑為22.4nm,變異係數為0.45。在 六氟-2-丙醇中，通過尺寸排阻色譜測得Mn- 206，000， Mw - 1，113，000， Mz = 262,000， Mw/Mn-5.41， Mz/Mw-2.30以及HFIP中= 0,288 dL/g,經計算， 0>2參數為31.54% ，重均聚合度為5230。
實施例4:含有1.94mol。/。交聯劑的胺官能化甲基丙烯酸羥乙酯納米凝膠(納米凝膠3) 這種納米凝膠的製備方法與實施例2中所述的相同，除了集管燒瓶內容物的 加入時間為2小時。集管燒瓶盛有甲基丙烯酸羥乙酯(3.91g， 3.00xl0zmo，)、 亞甲基雙丙烯醯胺(0.12g， 7.46xl0"mo1)、實施例1的胺端基聚乙二醇大分子單 體(7.48g， 7.57xl(T3mol) 、 2，2，-偶氮二 ( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.12g ) 和蒸餾水(72.11g)。反應器內容物由蒸餾水(146.40g)和2，2，-偶氮二 ( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.12g)組成."追蹤劑，，由2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞 甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.04g)組成.得到252,0g固體含量為3.46%的澄清分散 體。通過準彈性光散射檢測，體積中值直徑為25.8nm，變異係數為0.3.在六氟 -2-丙醇中，通過尺寸排阻色譜測得Mn=83，800， Mw=383，000， Mz=l，070，000， Mw/Mn = 4.57, Mz/Mw = 2.79以及HFIP中h-0.452 dL/g。經計算，參數0>2 為7.07%,重均聚合度為1278。
實施例5:含有1.98molV。交聯劑的甲基丙烯酸羥乙酯納米凝膠(納米凝膠4)
這種納米凝膠的製備方法與實施例2中所述的相同，除了集管燒瓶內容物的 加入時間為2小時。集管燒瓶盛有甲基丙烯酸羥乙酯(3.91g， 3.00x10 2mol)、 亞甲基雙丙烯醯胺(0.12g， 7.46xl(T4mol)、聚乙二醇單曱醚甲基丙烯酸酯(7.4化，
266.80xl(T3mol) 、 2，2，-偶氮二 ( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.12g)和蒸餾 水(72.11g),反應器內容物由蒸餾水(146.40g)和2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞甲 基異丁脒)二鹽酸鹽(0.12g)組成，"追蹤劑"由2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞甲基異 丁脒)二鹽酸鹽(0.04g)組成.得到252.0g固體含量為3.46%的澄清分散體 通 過準彈性光散射檢測，體積中值直徑為15,7nm,變異係數為0.3.在六氟-2-丙醇 中，通過尺寸排阻色譜測得Mn-53，400，Mw-171，000，Mz=325，000，Mw/Mn = 3.20， Mz/Mw^l.90以及HF1P中[til= 0.830 dL/g。經計算，0>2參數為14.01%，重均 聚合度為559。
實施例6:含有7.70mol。/。交聯劑的甲基丙烯酸羥乙酯納米凝膠(納米凝膠5)
這種納米凝膠的製備方法與實施例2中所述的相同，除了集管燒瓶內容物的 加入時間為2小時，集管燒瓶盛有甲基丙烯酸羥乙酯(3.80g， 2.92x10 —2mol)、 亞甲基雙丙烯醯胺(0.46g, 2.98x10 3mol)、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯(7.25g， 6.59x10 3mol) 、 2，2，-偶氮二 ( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.12g)和蒸餾 水(72.Ug)。反應器內容物由蒸餾水(146.40g)和2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞甲 基異丁脒)二鹽酸鹽(0.12g)組成'"追蹤劑，，由2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞甲基異 丁脒)二鹽酸鹽(0.04g)組成。得到252.0g固體含量為3，46%的澄清分散體'通 過準彈性光散射檢測，體積中值直徑為21.8nm，變異係數為0.3。在六氟J-丙醇 中，通過尺寸排阻色語測得Mn-in，OOO， Mw-283，000， Mz=555，000， Mw/Mn = 2.42， Mz/Mw = 1.96以及HF1P中ti1-0.670.經計算，0>2參數為8.66%,重均聚 合度為952。
實施例7:含有11.19mol。/。交聯劑的甲基丙烯酸羥乙酯納米凝膠(納米凝膠6)
這種納米凝膠的製備方法與實施例2中所述的相同，除了集管燒瓶內容物的 加入時間為2小時'集管燒瓶盛有甲基丙烯酸羥乙酯(3.80g， 2.92xl0-2mol)、 亞甲基雙丙烯醯胺(0.46g, 4.48xl0_3mol)、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯(7.4化， 6.38x10 3mol) 、 2，2，-偶氮二 ( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.12g)和蒸餾 水(72.11g)。反應器內容物由蒸餾水(146.40g)和2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞甲 基異丁脒)二鹽酸鹽(0，12g)組成，"追蹤劑"由2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞甲基異 丁脒)二鹽酸鹽(0.04g)組成。得到255g固體含量為3.05%的澄清分散體。通 過準彈性光散射檢測，體積中值直徑為27.7nm，變異係數為0.4,在1，1，1，3,3，3-六氟-2-丙醇中，通過尺寸排阻色譜測得Mn=533，000 ， Mw=l，265，000 ，
27Mz=3，800，000， Mw/Mn = 2.37， Mz/Mw-3.00以及HFIP中hJ=0.773dL/g,經 計算，0>2參數為19.93%，重均聚合度為4,399,
在一系列溫度下對納米凝膠進行準彈性光散射.數據沒有顯示突然的尺寸減 小，表明在測試溫度範圍內具有較低的臨界溶液溫度。
表l.隨溫度變化的納米凝膠6的流體動力學直徑
溫度(°c)流體動力學直徑(nm)
2528.9
3436.3
4338.6
5231.9
6133.4
7033.3
實施例8:含有9.30mor/。交聯劑的磺化甲基丙烯酸納米凝膠(納米凝膠7)
這種納米凝膠的製備方法與實施例2中所述的相同，除了集管燒瓶內容物的 加入時間為2小時，集管燒瓶盛有曱基丙烯酸(4.88g， 5.66xl(r2mol)、亞甲基 雙丙雄醯胺(1,13g, 7.30xl(T3mol)、聚乙二醇單甲瞇甲基丙烯酸醋(11.81g， 1.07x10 2mol)、曱基丙烯酸鉀磺基丙醋(0.94g， 3.81xl(T3mol) 、 2，2，-偶氮二( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.26g)、蒸餾水(73.80g)和lNNaOH (3.96g)' 反應器內容物由蒸餾水(149.84g) 、 2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸 鹽(0.26g)和INNaOH (3.96g)組成."追蹤劑，，由2，2，-偶氮二 ( N，N，-二亞甲基 異丁脒)二鹽酸鹽(0.06g)組成，得到441g固體含量為4.05%的澄清分散體。 通過準彈性光散射檢測，體積中值直徑為23.8nm,變異係數為0.3,在磷酸緩衝 鹽水中，通過尺寸排阻色譜測得Mn=98，700, Mw=406，500， Mz=976，500， Mw/Mn =4.12， Mz/Mw = 2.40。經計算，參數0>2為9.56% ,重均聚合度為1701.
實施例9A:含有6.21 10，％交聯劑的磺化甲基丙烯酸納米凝膠(納米凝膠8)
這種納米凝膠的製備方法與實施例2中所述的相同，除了集管燒瓶內容物的 加入時間為2小時.集管燒瓶盛有甲基丙烯酸(5.06g， 5.88xlO-2mol)、亞甲基 雙丙烯醯胺(0.75g， 4.86x10 3mol)、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯(12.00g， 1.09x10 2mol)、甲基丙烯酸鉀磺基丙酯(0.94g， 3.81xl(T3mol)、 2，2，-偶氮二( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸鹽(0.26g)、蒸餾水(73.71g)和INNaOH U,llg)。
28反應器內容物由蒸餾水(149.65g ) 、 2，2，-偶氮二 ( N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸 鹽(0.26g)和1NNaOH (4.11g)組成,"追蹤劑"由2，2，-偶氮二 (N，N，-二亞甲基 異丁脒)二鹽酸鹽(0.06g)組成.得到434.6g固體含量為3.87%的澄清分散體。 通過準彈性光散射檢測，體積中值直徑為22.0nm，變異係數為0.3.在磷酸緩衝 鹽水中，通過尺寸排阻色語測得Mn=60，100， Mw=186，500, Mz=403，000， Mw/Mn =3.10， Mz/Mw = 2.16,經計算，參數02為5.50%，重均聚合度為779.
實施例9B:將近紅外染料與納米凝膠l連接
IR染料1
通過將IR染料l( 10.46mg(40nmol)和26.15mg(100pmo1))溶解於1 2mlDMF 中製備兩種染料溶液。類似地，通過將冷凍乾燥的納米凝膠l(各0.067g， 200nmol) 溶解於l~2ml DMF中製備納米凝膠溶液.在各個納米凝膠溶液中加入0.2ml 0.45M HBTU ( 0-苯並三唑-N，N，N，，N，-四甲脲六氟磷酸酯，得自Applied Biosystems)，然後攪拌5分鐘。隨後在納米凝膠中加入0.25ml 2M二異丙基乙 胺(D1EA)，攪拌1分鐘。最後，將納米凝膠的活性溶液轉入染料溶液中，然後 在室溫下震蕩4 6小時。隨後將各納米凝膠/染料反應溶液傾入約10ml水中，並 加栽入截留分子量為30,000道爾頓的Centriprep YM-30濾筒中(Micon Bioseparations)，以3300RPM離心直到約75%的液體通過膜擴散，然後用水再 稀釋膜上的濃縮物，重複該操作直到滲透物為無色，
通過用已知濃度的染料溶液製備標準的紫外-可見光吸光度曲線來評估游離 染料的量。檢測偶合反應後的10ml濾液(含有所有未偶合(non-conjugated)染 料)的吸光度值並用標準吸光度曲線對游離染料的量進行量化。在用10.46mgIR 染料l的情況下，偶合物(conjugate)的產率評估為98%' UV/V為染料-納米凝 膠偶合物分析，顯示X,，目為784nm,在約725nm處有小的肩峰(shoulder)(參 見圖1),該肩峰(表明存在非發射性聚集物)相對較小，相對於主峰來說，不 比水溶液中的游離IR染料的光譜明顯，這說明了令人驚訝的結果，即使加栽量
29相對較高，連接在顆粒上的染料顯示相對較少的聚集.用準彈性光散射對偶合物
進行的分析顯示，體積平均直徑從18.6nm增加到24.1nm。
實施例10:利用細胞生存力試驗進行納米凝膠的細胞毒性研究
將人臍帶內皮細胞(HUVEC，從Cascade Biologies, Inc. (Portland, OR)購得) 維持在含有2%胎牛血清和抗生素的培養基(Medium )200中，將HUVEC( 2x104 細胞/孔)平板培養於完全培養基中的96孔板上。第二天用無血清培養基洗滌板 孔後，以表2列出的濃度加入納米凝膠。24小時後使用CenTiter-Gl(^發光細胞 生存力試驗試劑盒(Promega Corp., Madison, WI)測定細胞毒性.該試驗是基於對 存在的ATP (代謝活性細胞的指示劑)量化來測定培養基中活細胞數目的勻相測 定方法(homogeneous method)。將CellTiter-Glo⑧試劑與PH7.4的磷酸緩衝鹽 水1:1混合，然後加入細胞培養孔中，每孔的發光用Fluster OPTIMA讀板儀 (BMG LABTECH)測定，用三次重複測定的平均值表示結果(見表2 ),納米凝 膠1是如實施例2中描述的重複批次(duplicate batch ).
表2.納米凝膠l、 3、 4和5的細胞生存力試驗結果
分析樣品%生存力'
對照物100.00
納米凝膠4(0.2mg/ml)98,71
納米凝膠4 (0.02mg/ml)112.58
納米凝膠5 (0.2mg/ml)96.89
納米凝膠5(0,02mg/ml)112.69
納米艦3 (0.2mg/ml)99.36
納米嫩3 (0.02mg/ml)124.45
納米凝膠1 (重複批次)(0.2mg/ml)81.33
納米凝膠1 (重複批次)(0.02mg/ml)80.69
二氧化娃(0.2mg/ml)26.20
二氧化矽(0.02mg/ml)24.05
* °/。生存力=(樣品OD/對照物OD)*100
實施例lh將焚光染料連接到含胺的納米凝膠(納米凝膠3)
30NHS-Cy7
通過將lmg NHS-cy7染料(從GE Healthcare, Buckinghamshire, UK購得) 溶解在lmL DMF中製備NHS-cy7染料儲備溶液。在含有0.05% ( w/v )納米凝 膠的PBS緩衝液中加入cy7儲備溶液的等分試樣，至終體積為10mL。混合物避 光攪拌3小時，然後經Centriprep⑧YM-30過濾器(30，000MW截留)過濾，用PBS 緩衝液洗滌，保留濾液，直到濾液澄清。測定濾液的體積和吸光度以確定連接到 納米凝膠的cy7的數量。結果如表3所示。
表3
樣品編號 mgCy7/mg納米凝膠粒子 U-l 0.045 11-2 0.088 11-3 0.166 11-4 0.237
實施例12:將生物素-PEG連接到納米凝膠
將各批生物素-mPEG —簡S (從Nektar購得)(3.2mg、 6.4mg和12.8mg) 加入到3個含有10mL0.05。/。納米凝膠的PBS緩衝液的不同小瓶中。攪拌混合物 2小時，通過30，000MW過濾器過濾，棄去濾液，用PBS緩沖液洗滌，用PBS 緩沖液使所有樣品過濾後的終體積為4mL,
使用HABA/抗生物素蛋白(從Pierce購得)，通過配體取代試驗測定連接於 納米凝膠的生物素的數量，在典型的試驗中，在小瓶中用100nLPBS緩衝液溶解 HABA/抗生物素蛋白，隨後在lcm比色皿中用800pL PBS緩沖液溶解，將樣品 充分混合併記錄在500nm處的吸光度，然後向HABA/抗生物素蛋白溶液中加入 100mL連接納米凝膠的生物素，再次記錄在500nm處的吸光度，兩次測定的差
31值用來計算連接於納米凝膠的生物素樣品的數量。在樣品12-1中，在溶液中加入 NHS-cy7並在黑暗中攪拌2小時 用YM-30過濾器過濾出未連接的染料，直到濾 液澄清.測定濾液的體積和吸光度以確定連接的cy7的數量.結果如表4所示.
表4 .
500nm處的吸光度差值%生物素連接Hg cy7/mg納米凝膠
對照0.8520
12-10.7270.039873.2%210
12-20.6910.087580.4%
12-30.5730.185785.3%
實施例11-12的結果表明，本發明的納米凝膠可用來以共價方式連接成像造 影劑或治療劑的有效負荷，也可以將生物靶向部分連接到納米凝膠表面，用於生 物耙向識別。
實施例13.納米凝膠在1.5MNaCl中的穩定性
在1.5M NaCl溶液中對納米凝膠2~7進行準彈性光散射測定。體積平均直徑， 均與在PBS緩沖液中的值非常相似，記錄在下表5中。本實施例說明了納米凝膠 在濃電解質溶液中的膠體穩定性.
表5.納米凝膠在PBS緩衝液以及在1.5M NaCl中的QELS結果
在PBS緩衝液中的Dv (nm)在1.5M NaCl中的Dv(nm)
納米凝膠222.422.2
納米凝膠325.820.4
納米皿415.716.5
納米凝膠521.822.0
納米凝膠627.725.8
納米凝膠723.823.3
實施例14.在磷酸緩沖鹽水中蛋白質與納米凝膠結合
將納米凝膠4、 6、 8、 12和13分別與等重量的濃度為1.5mg/mL的牛血清白 蛋白(BSA)在磷酸緩沖鹽水中混合，通過尺寸排阻色諸(SEC)在磷酸緩衝鹽 水中在兩個FSS Suprema混合床拉上子30'C栓測混合物，將所得的色傳圖與單 獨的納米凝膠及BSA的色譜圖進行比較.BSA呈現一個尖的、可識別的單體峰
(區別於二聚物和更大種類的特徵高分子量肩峰)，並且用在線UV檢測器檢測
32到在270nm處有強紫外(UV)吸收，這些特徵使得BSA的色譜峰明顯區別於納米 凝膠的色譜峰，納米凝膠的色譜峰用UV檢測器在270nm處是觀察不到的，只能 通過示差折光檢測器來檢測。每個樣品混合物中檢測到的BSA峰與單獨的BSA 相比，看上去沒有變化。色譜圖證據表明BSA的尺寸並沒有增大，而當納米凝膠 與BSA分子強力結合時，BSA的尺寸會增大，
比較例1:用間歇反應法製備實施例7中的磺化甲基丙烯酸納米凝膠的嘗試
在配備有回流冷凝器、氮氣入口和機械攪拌器的1L三頸圃底燒瓶中裝入甲基 丙烯酸(4.88g， 5.66xl(T2mol)、亞甲基雙丙烯醯胺(1.13g， 7.30xl(T3mol)、聚乙二醇 單甲醚甲基丙烯酸酯(11.81g， 1.07xl(T2mol)、甲基丙烯酸鉀磺基丙醋(0"化， 3,81xl(T3 mol )、蒸餾水(223.65g)和1N NaOH ( 7.922g)'將燒瓶置於50'C恆 溫水浴中。當內容物達到50。C時，加入2，2-偶氮二(N，N，-二亞甲基異丁脒)二鹽酸 鹽(0.52g),兩小時內反應內容物形成膠體。
3權利要求
1. 一種納米凝膠，其包含重複的、交聯的式I烯鍵式不飽和單體的水相容性、溶脹的、支化聚合物網絡(X)m-(Y)n-(Z)o　　　　式I其中X是含有離子或氫鍵鍵合部分的水溶性單體；Y是含有與可聚合的烯鍵式不飽和基團結合的重複親水單元的水溶性大分子單體；Z是多官能交聯單體；m為50～90mol％；n為2～30mol％；和o為1～15mol％。
2.如權利要求1所述的納米凝膠，其中m為60~80mol%， n為10~20mol % ， o為2~9mol % 。
3.-如權利要求1所述的納米凝膠，其中X是含有離子或含可交換質子的部 分的水溶性單體，
4，如權利要求1所述的納米凝膠，其中X包含選自以下的至少一種醇、 伯胺及仲胺、伯醯胺、仲跣胺、羧酸、氨基甲酸酯、跣亞胺、脲、膦酸、磺酸、 亞磺酸和含有雜原子(N、 S、 O、 P)-氫鍵的任何其它單元'
5.如權利要求1所述的納米凝膠，其中X由式H或式HI表示其中B為H或CH3;D為H、具有氫鍵鍵合部分並含有不多於三個碳原子的非離子單元、或含有至多 六個碳原子的離子單元；和 E為H或CH3。
6.如權利要求1所述的納米凝膠，其中X為甲基丙烯酸、丙烯酸、丙烯醯 胺、甲基丙烯醯胺、氨丙基甲基丙烯醯胺鹽酸鹽、磺丙基甲基丙烯酸酯、丙烯酸(X)m-(Y)n-(Z)o 式1式H 或式HI羥乙酯或甲基丙烯酸羥乙酯、N-甲基丙烯醯胺或N，N-二甲基丙烯醯胺。
7，如權利要求1所述的納米凝膠，其中X為甲基丙烯酸x-羥乙酯或甲基丙 烯酸，
8. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中X的logP計算值為0.4或更小，
9. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中Y是分子量為200 20，000的水溶性 大分子單體，並包含水溶性重複單元。
10. 如權利要求l所述的納米凝膠，其中水溶性大分子單體Y為聚乙二醇大 分子單體。
11. 如權利要求10所迷的納米凝膠，其中Y選自聚乙二醇丙烯酸醋、聚乙 二醇甲基丙烯酸酯、N-聚乙二醇丙烯醯胺、N-聚乙二醇曱基丙烯醯胺和含有苯乙 烯末端的聚乙二醇大分子單體，
12. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中Y是根據式I的聚乙二醇大分子單 體主鏈，在所述大分子單體主鏈的一端具有可自由基聚合的基團，在所述大分子 單體主鏈的另一端具有不同的反應性化學官能團formula see original document page 3 式I其中X是CH3、 CN或H;Y是O、 NR,或S;L是連接基團或間隔基；FG是除烷氧基矽烷以外的官能團；n大於4且小於1000;以及其中R,和R2獨立地選自取代或未取代的烷基、芳基或雜醯基，
13. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中Z為亞曱基雙丙烯醯胺、N，N，-(1，2-二輕乙烯)二丙烯醯胺、亞甲基二甲基丙烯醯胺、二乙烯基笨或二甲基丙烯酸乙二醇酯。
14. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中Z為雙官能團的、三官能團的或四 官能團的，分子量小於300道爾頓，
15. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中X、 Y和Z的總量的至少90%是高 度親水性或水溶性的。
16. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中通過準彈性光散射在磷酸緩沖鹽水 中(137mMNaCL 2.7 mM KC1、 10 mM Na2HP04、 2mMKH2P04， pH 7.4)測定 的所述納米凝膠的體積中值流體力學直徑為10 50,
17. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中通過靜態光散射或尺寸排阻色謙測 得的所述納米凝膠的重均分子量為15，000~6，000，000。
18. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠的重均聚合度為 50 86，000'
19. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠在水中的(h參數為 O.O卜(UO。
20. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠在1.5MNaCI中穩定.
21. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠的特性粘數為0.40 dL/g 0.85 dL/g。
22. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠的流體力學直徑在溫 度從25。C升到80'C時發生淨增加，
23. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠的聚合度為20~1500.
24. 如權利要求l所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠的退溶脹比為0.02 0.乙
25，如權利要求1所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠對於牛血清白蛋白(BSA)而言是基本不吸附血清蛋白的。
26. 如權利要求1所述的納米凝膠，其中所述納米凝膠進一步包含至少一種 與所述納米凝膠結合的被栽化合物.
27. 如權利要求26所述的納米凝膠，其中所述至少一種與所述納米凝膠結合 的被栽化合物為生物化合物、藥物化合物或診斷化合物，
28. 如權利要求26所迷的納米凝膠，其中所述至少一種與所述納米凝膠結合 的被栽化合物是非共價結合的.
29. 如權利要求26所述的納米凝膠，其中所述至少一種與所述納米凝膠結合 的被栽化合物是共價結合的.
30. 如權利要求29所述的納米凝膠，其中所述共價結合是與X、 Y或Z形 成的，並在納米凝膠的製備過程中直接聚合入納米凝膠中。
31. 如權利要求26所述的納米凝膠，其中所述至少一種與所述納米凝膠結合 的被栽化合物為染料.
32. 如權利要求26所述的納米凝膠，其中所迷至少一種與所述納米凝膠結合的被載化合物為染料和把向部分。
33. —種製備納米凝膠的方法，其包括a. 製備單體X、 Y和Z的混合物與笫一部分引發劑在水中的集管組合物， 其中X是含有離子或氫鍵鍵合部分的水溶性單體，Y是含有與可聚合的烯鍵式不 飽和基團結合的重複親水單元的水溶性大分子單體，Z是多官能交聯單體；b. 製備第二部分引發劑、表面活性劑和水的反應器組合物，所述水所足以提 供l-l(T/。w/w單體X、 Y和Z的組合物；c. 使所述反應器組合物處於聚合溫度；d. 在反應期間將所述反應器組合物保持在所述聚合溫度下；和e. 經一段時間將所述集管組合物加入到所述反應器組合物中，以形成反應混 合物；其中，所述納米凝膠包含重複的、交聯的式I烯鍵式不飽和單體的水相容性、溶 脹的、支化聚合物網絡(X)m-(Y)n-(Z)o 式I其中m為50~90mol % ; n為2 30mol% ; o為l~15mol %
34. 如權利要求33所述的方法，其中所述單體X、 Y和Z的混合物包含 50~90mol % X， 2 30mol % Y和l~20mo， % Z,
35. 如權利要求33所迷的方法，其中所述引發劑為水溶性聚合引發劑，
36. 如權利要求35所述的方法，其中所述水溶性聚合引發劑為水溶性偶氮引 發劑。
37. 如權利要求33所迷的方法，其中所迷引發劑為氧化還原引發劑。
38. 如權利要求33所述的方法，其中所述引發劑為雙組分引發劑，其中所述 雙組分引發劑的一種組分包含在所迷集管組合物中，所述雙組分引發劑的另 一種 組分包含在所述反應器組合物中，從而當所迷集管組合物和反應器組合物混合時 穩定地產生自由基，
39. 如權利要求33所述的方法，其中所迷引發劑為水溶性光引發劑。
40. 如權利要求33所述的方法，其中用於將所述集管組合物加入到所述反應 器組合物中的所述時間為30~1440分鐘，
41. 如權利要求33所述的方法，其中以充分定時的加入速率將所述集管組合 物加入到所述反應器組合物中，以使當所述加入完成時單體總量的至少80%已反應。
42. 如權利要求33所述的方法，其中所述集管組合物進一步包含表面活性劑。
43. 如權利要求33所述的方法，其中進一步包括對所述反應混合物加熱至多 48小時。
44. 如權利要求33所述的方法，其進一步包括通過滲析、超濾、滲濾或者用 離子交換樹脂處理來純化所述的反應混合物。
45. 如權利要求33所述的方法，其進一步包括將所述集管組合物和所迷反應 器組合物脫氣以除去氧氣。
46. 如權利要求45所述的方法，其中通過用氮氣或氬氣或其它合適的惰性氣 體對內容物充氣，或者通過使內容物經過冷凍-抽吸-解凍的循環然後將內容物 用氮氣或氬氣保護來進行所述脫氣.
全文摘要
本發明涉及一種納米凝膠，其包含重複的、交聯的式I烯鍵式不飽和單體的聚合物網絡(X)m-(Y)n-(Z)o式I，其中X是含有離子或氫鍵鍵合部分的水溶性單體；Y是含有與可聚合的烯鍵式不飽和基團結合的重複親水單元的水溶性大分子單體；Z是多官能交聯單體；m為50～90mol％；n為2～30mol％；和o為1～15mol％。本發明還涉及一種製備納米凝膠的方法，其包括製備單體X、Y和Z的混合物和第一部分引發劑在水中的集管組合物，製備第二部分引發劑、表面活性劑和水的反應器組合物；使反應器組合物達到聚合溫度；將反應器組合物保持在聚合溫度下，在反應器組合物中加入集管組合物，以形成式I的納米凝膠。
文檔編號C08G65/334GK101511392SQ200780012667
公開日2009年8月19日 申請日期2007年3月29日 優先權日2006年4月10日
發明者G·L·斯拉特, J·R·貝內特, J·W·哈德, J·W·萊昂, L·戴, T·A·喬, T·H·穆裡 申請人:卡爾斯特裡姆保健公司