鑑定糖鏈結構的方法及其分析裝置的製作方法
2023-12-01 00:24:16 2
專利名稱：鑑定糖鏈結構的方法及其分析裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及用質譜儀分析糖鏈結構的系統。
背景技術：
隨著人類基因組草圖序列數據的公布，作為後基因組研究，研究與開發階段已經轉移到蛋白質功能與結構分析以及相互作用分析。另一方面，活體中約一半蛋白質在翻譯後經歷糖鏈修飾，正在表明，通過經歷這樣的修飾，優先發揮其正確功能。因此，闡明糖蛋白的功能對於實現基因組藥物創製和醫療實踐再發展是一個不可缺少的途徑。因此，作為下一代後基因組研究，有必要從「糖蛋白質組」的觀點來進行研究與開發，目標是以糖鏈和蛋白質為整體進行全面分析並闡明其功能，特別是，需要開發能夠快速分析糖鏈的新技術，目前難以分析糖鏈的功能和結構。
糖鏈深深涉及蛋白質的穩定性和定位，對於細胞的更高生命功能表現發揮著重要作用，例如作為細胞表面識別分子起作用。然而，由於成分糖的多樣性、結合成分糖的順序和結合形式的差異以及成分糖之間的端基異構體結構的差異，糖鏈具有非常高的多樣性。例如，在成分糖中，葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和甘露糖(Man)是具有相同分子量的同分異構體。儘管認為成分糖的種類不是很多，但是大多數糖鏈是結合了數十種成分糖而形成的，以致結合的組合數非常大。除此之外，還有許多由於分支結構導致的異構體，和同分異構體如α和β端基異構體，和一些硫酸化和磷酸化修飾的同分異構體。
除了這些多樣性外，糖鏈量非常小的事實使它們的分析更加困難，鑑於此，目前還沒有開發出擴增糖鏈的方法。
至今，已經開發出多種分析糖鏈結構的方法，包括一種使用水解酶和HPLC的方法以及一種利用凝集素親和層析、甲基化分析、質譜分析和NMR的方法(Okura和Kameyama「Current Situation and Future of SugarChain Structure Analysis「，Bioindustry，CMC出版社，2003年1月，18-24)。然而，糖鏈的完全結構信息不能通過任何單獨的方法獲得，有必要將多種方法結合起來進行分析。為此，為了分析一個糖鏈，需要麻煩的操作和長時間，不能實現高通量的分析。
從高速和易操作的觀點看，前述的各種分析方法中，那些使用質譜分析的方法有望在將來成為糖鏈結構分析的主流。
然而，常規的MS/MS(MS2)質譜分析法中，端基同分異構體和結構同分異構體不能被區別。
於是，希望通過重複糖鏈離子(MSn)的[(i)碎裂]—[(ii)質量測定和碎片離子選擇]—[(iii)進一步碎裂]的步驟而獲得糖鏈的複雜結構信息(Y.Takegawa等，「Structural assignment of isomeric 2-aminopyridin-derivatizedoligosaccharides using MSn spectral matching」，Rapid Commun.MassSpectrum，2004；18385-391)。然而，因為每次碎裂產生了數十或甚至數百的碎片離子，所以在全部這些碎片離子上進行進一步碎裂和全部碎片離子的比較(模式匹配)是不可行的。即使當進一步碎裂只限於主要的碎片離子，如果用反覆試驗法進行碎裂，則需要大量的樣品。
發明內容
本發明要解決的目標是提供一個分析糖鏈的系統，其能夠用少量的樣品簡單而快速地確定糖鏈完整的一級結構。
只用質譜分析通過集中工作快速地確定糖鏈結構，本發明人發現了一種快速而精確地獲得糖鏈完整一級結構信息的方法，包括同分異構體的信息和單糖結合位置的信息，該方法通過從產生的碎裂(碎片)離子中選擇適當的離子(或多種離子)並在其(或它們)上進行下一級碎裂。
就是說，為了解決前述目標而作出的本發明是一種用質譜儀鑑定分析-目標糖鏈結構的方法，該方法通過將測量的MS3碎片圖譜(pattern)與資料庫中參考MS3碎片圖譜相比較實現，這裡測量的MS3碎片圖譜是包含在一個測量的MS2碎片圖譜中每一個MS2碎片離子的碎片圖譜，MS2碎片圖譜是將分析-目標糖鏈進行碎裂質譜分析而獲得，其特徵在於，在多個包含在測量的MS2碎片圖譜中的MS2碎片離子中，只對所選MS2碎片離子進行碎片質譜分析，這裡每一個所選MS2碎片離子有多個儲存於資料庫中的參考MS3碎片圖譜，其相互相似指數與預定值相同或小於預定值，其中多個參考MS3碎片圖譜與被選擇的MS2碎片離子有相同的先驅離子質荷比。
如上所述，由於糖鏈中有各種各樣的同分異構體，認為難以通過質譜分析來區別它們。然而，碎片圖譜的差異是通過反覆碎裂產生的，這一點已經明確。目前認為，通過測定碎片圖譜直到MS3，大多數糖鏈的結構能夠被鑑定。
然而，為了獲得一個MS3碎片圖譜，必須從初始糖鏈進行兩階段的碎裂，由此，從一個糖鏈獲得的MS3碎片圖譜的數目是巨大的。從一個未知糖鏈獲得的MS3碎片圖譜(稱為「測量的MS3碎片圖譜」)和資料庫中存儲的MS3碎片圖譜(稱為「參考MS3碎片圖譜」)的無條理圖譜匹配不僅費時，而且可妨礙正確的圖譜匹配(或鑑定)。
於是，本發明中，如上所述，在包含於一種測量的MS2碎片圖譜內的多個MS2碎片離子中，碎裂質譜分析只在所選MS2碎片離子中進行，這裡每一個所選MS2碎片離子有多個參考MS3碎裂圖譜，其相互相似指數是一個預定值(第一測定值)或更小，其中多個參考MS3碎片圖譜具有和所選MS2碎片離子相同的先驅離子質荷比。
在這裡，有三個或更多這樣的MS3碎片圖譜的情況下，任何兩個MS3碎片圖譜組合的相似指數最高的一個能夠作為上述相似指數而被採用。
資料庫中存儲的參考MS3碎片圖譜相互相似指數高的情況下，以及通過對一個未知樣品進行MS3分析以測量MS3碎片圖譜的情況下，很難確定測量的MS3碎片圖譜和它們中的任何一種相匹配。依本發明的方法，測定可以更快地進行，首先通過在MS3碎片圖譜相互相似指數低的MS2碎片離子上進行碎裂質譜分析(或者以相似指數從低到高的順序)，和進行MS3碎片圖譜的比較(匹配)。
期望通過與先驅離子的質荷比聯繫在一起，預先在資料庫中存儲前述MS3碎片圖譜的相互相似指數。因此，可進行更快速的圖譜匹配。
關於前述所選MS2碎片離子，期望把它們以一個預定標準分級(ranking)。分級可基於前述MS3碎片圖譜的相互相似指數而完成。備選地，資料庫中參考MS3碎片圖譜的數目可以在進行分級中被考慮。當一個通過分析而獲得的未知樣品MS3碎片圖譜與資料庫中存儲的參考MS3碎片圖譜之間的相似指數不小於預定值(第二預定值)時，按照分級繼續進行碎裂質譜分析，在那裡完成分析，基於匹配圖譜鑑定糖鏈結構。
期望只採用這樣的MS2碎片離子，其具有在測量的MS2碎片圖譜中峰強度不低於為此處理目標而預定的值。
依照前述程序鑑定之前，期望從測量的MS2碎片圖譜(包括先驅離子的峰)計算糖鏈的理論組成，基於此，在存儲於資料庫中的MS2碎片圖譜和MS2碎片離子之中，預選和限制到將要和測量的MS2碎片圖譜和碎片離子相比的那些。
前述方法表示了一個在MS2碎片離子上進行進一步碎裂質譜分析的準則。本發明的方法能夠被類似地用在進一步碎裂階段，以測定產生的碎片離子(MSn碎片離子)中哪些碎片離子應該優先做進一步的碎裂質譜。如前所述，認為大多數糖鏈結構能夠通過比較MS3碎片圖譜被鑑定。但有時需要對一些複雜的或者具有細微同分異構結構差異的糖鏈進行MS4碎裂或更進一步的碎裂。在此情況下，用本發明的方法作為準則，能夠提高效率。
當碎裂質譜分析按照上述每一階段進行時，期望設定先驅離子的碎裂能量不低於預定值，其由相應的先驅離子而測定。通過將能量近似地設定在一個值，在此值下先驅離子幾乎完全碎裂，碎裂產生的碎片圖譜的再現性變好，糖鏈結構的鑑定變得更可靠。期望通過與先驅離子相關聯，在資料庫中存儲預定的碎裂能量值。
質譜分析有望成為一種能夠對複雜和多樣的糖鏈進行快速結構分析的方法。但是，為了進行正確鑑定，需要重複糖鏈離子的[(i)碎裂]—[(ii)碎片離子的質量測定和選擇]—[(iii)進一步碎裂]，至少對直至MS3碎片圖譜進行圖譜匹配。然而，因為數十或數百的碎片離子在每個碎裂過程中產生，對所有這些碎片離子進行進一步碎裂和比較(圖譜匹配)不太實際的。即使當進一步碎裂只限於主要的碎片離子，如果碎裂要進行反覆試驗，那麼需要大量的樣品。
本發明的分析糖鏈結構的方法為進行進一步碎裂提出了有用的準則，因此，能夠快速地達到目標鑑定。另外，由於避免了不必要的分析，所以能夠控制樣品消耗，即使少量樣品也能被充分地鑑定。
附圖簡述
圖1是實現本發明的裝置的示意結構圖。
圖2是本發明的一個實例所得的測量的MS2碎片圖譜。
圖3是存儲於資料庫中對應於前述測量的MS2碎片圖譜的參考MS2碎片圖譜及其結構模型。
圖4是具有同一MS2碎片離子先驅離子的MS3碎裂圖譜比較。
圖5是MS2碎片離子在m/z＝1280條件下的測量的MS3碎片圖譜。
圖6是存儲於對應於前述測量的MS3碎片圖譜的資料庫中參考MS3碎片圖譜及其結構模型。
圖7是用於檢驗算法的兩種樣品的糖鏈結構式，算法用於計算兩個碎片圖譜(波譜)的相似指數(相異指數)。
圖8是樣品相異指數的計算結果表。
圖9是用於檢驗前述算法的另外兩種樣品的糖鏈結構式。
圖10是樣品相異指數的計算結果表。
圖11是用於檢驗前述算法的其他另外兩種樣品的糖鏈結構式。
圖12是樣品相異指數的計算結果表。
圖13是用於檢驗前述算法的其他另外三種樣品的糖鏈結構式。
圖14是樣品相異指數的計算結果表。
圖15是本發明方法一個實施例的流程圖。
實施本發明的最佳方式本發明將通過一個實例詳細地解釋如下。圖1表示了實現本發明的糖鏈結構分析器的示意結構。分析器包括一個質譜儀MS部分和一個分析部分ANL。質譜儀MS裝備有一個基質輔助雷射解吸離子化(MALDI)的離子發生器、一個四極離子阱(QIT)和一個飛行時間(TOF)質譜儀，分析部分ANL包括一個資料庫DB。許多結構已知的糖鏈離子的質譜分析圖譜(碎片圖譜)以及它們的一級和二級(MS2和MS3)碎片離子質譜分析圖譜(碎片圖譜)被存儲在資料庫中。另外，為分析部分ANL提供了一個圖譜匹配程序(pattern matcher，PM)用於比較質譜儀MS發送的碎片圖譜(數據)和資料庫DB中存儲的碎片圖譜(數據)，並計算它們的相似指數。為質譜儀MS部分提供了一個控制部分CNTL，用於控制整個分析器。
使用這個分析器，一種進行未知糖鏈結構分析的方法將在所用流程圖15中加以解釋。首先，用適當的切割酶或使用一個適當的化學裂解反應將一種待鑑定的未知糖鏈從含有糖蛋白或糖脂的生物學樣品中釋放出來。如果需要，標記所得的糖鏈樣品，與一種基質試劑混合，將其送到質譜儀MS。在質譜儀部分MS中，用MALDI將樣品離子化，用TOF進行質譜分析。從而，測量了糖鏈離子(先驅離子)的質荷比([質量m]/[電荷z])。此外，通過在離子阱QIT中進行碎裂，產生其碎片離子，測量了每一個碎片離子的質荷比和強度。因而，獲得了一個MS/MS碎片圖譜(測量的MS2碎片圖譜，MS2FPm)(步驟S1)。MS2碎片圖譜的一個實例表示在圖2中。在這個實例中，先驅離子(未知糖鏈樣品的離子)的質荷比m/z是2147.8。MS2碎片圖譜的數據從質譜儀MS發送到分析部分ANL。
分析部分ANL中，從MS2碎片圖譜的數據中得到，(1)先驅離子的質荷比，(2)每一個碎片離子的質荷比，和(3)每一個碎片離子的強度。
基於這些數據，以及在製備樣品中用到的標記試劑、切割酶和試劑的信息，分析部分ANL計算糖鏈的理論組成(步驟S2)。標記試劑等的信息可通過一個操作者輸入至質譜儀MS或分析部分ANL。
在圖2的實例情況下，從質荷比為2147.8的先驅離子確定該糖鏈的理論組成是(Hex)5(HexNAc)6。
然後，在分析部分ANL中，計算了每一個具有計算的理論組成的所有糖鏈異構體(參考MS2碎片圖譜，MS2FPd)的MS2碎片圖譜和從質譜儀MS發送的MS2碎片圖譜(MS2FPm)之間的相似指數S。計算兩個碎片圖譜的相似指數S(或相異指數D)的方法將在稍後詳細解釋。於是，只有與測量的MS2碎片圖譜的相似指數S不小於預定值S21的這樣的參考MS2碎片圖譜被預選(步驟3)。
當理論組分是(Hex)5(HexNAc)6時，圖3所示的糖鏈同分異構體的四種MS2碎片圖譜被存儲於分析部分ANL的資料庫DB中。相應於每一個碎片圖譜的糖鏈結構模型表示在圖3的圖譜上。只有碎片圖譜(c)和(d)與圖2的測量的碎片圖譜的相似指數S大於預定值S21。
這樣預選的參考MS2碎片圖譜中，以從高到低的強度順序選擇一個預定數目的碎片峰(步驟S4)。這裡，選擇MS2碎片峰中，峰數目也可被預先確定，或者，可以選擇具有預定強度水平(相對於最大峰)或更高水平的峰。
從圖3(c)和(d)的兩個參考MS2碎片圖譜，選擇了如下六個碎片峰。
m/z＝2129m/z＝1848m/z＝1782m/z＝1645m/z＝1483m/z＝1280這樣選擇的碎片峰中，選擇了碎片離子(MS2碎片離子)，然後碎裂質譜分析應該在質譜儀MS中進行。這裡，用到了本發明的方法。
讀出存儲於資料庫DB中的MS3碎片圖譜，其先驅離子是相應於預選碎片峰的碎片離子(通常，與一個先驅離子有關係的多個MS3碎片圖譜被存儲)，計算了它們之間的相似指數(不是後面描述的相異指數D，而是當兩個圖譜相似時呈更高值的相似指數)S。以及，只有相似指數不大於預定值S22的MS2碎片離子進行質譜儀MS中的碎裂質譜分析(步驟S5)。同時，這些MS2碎片離子以相似指數從小到大的順序被分級(步驟S6)。
關於前述所選的六個碎片峰，對應於各個峰的MS3碎片圖譜表示在圖4中。其中，源自m/z＝1483的先驅離子的兩個MS3碎片圖譜和源自m/z＝1280的先驅離子的兩個MS3碎片圖譜比源自其他先驅離子的MS3碎片圖譜有較低的相互相似指數。當這些存儲於資料庫DB中的參考MS3碎片圖譜與未知樣品的測量的MS3碎片圖譜相比(圖譜匹配)時，在兩個參考MS3碎片圖譜的相似指數小的情況下(即，這兩個圖譜遠距離)，比這兩個圖譜互相相似的情況更容易確定測量的MS3碎片圖譜與參考MS3碎片圖譜之一相匹配。
圖4表示了每一個先驅離子的兩個MS3碎片圖譜。對於一個先驅離子可能有三個或更多MS3碎片圖譜被存儲在資料庫DB中。在那種情況下，任意兩個MS3碎片圖譜間的相似指數也可用作該指數。但是，期望在任何兩個MS3碎片圖譜間用最大的相似指數，因為，在此情況下，其他MS3碎片圖譜間的相似指數比它較小。這使測量的/參考圖譜的匹配可靠。
在圖4的情況下，MS3碎片圖譜之間的相似指數小於m/z＝1280的情況。這樣，MS2碎片離子被優先採用，其次採用m/z＝1483的MS2碎片離子。
基於這樣選擇和分級的結果，分析部分ANL將隨後應該進行碎裂質譜分析的先驅離子的質荷比數據發送到質譜儀MS。在質譜儀MS中，根據從分析部分ANL發送的數據，只有產生於離子阱QIT的MS2碎片離子中指定的碎片離子(在上述實例的情況下，m/z＝1280的碎片離子)留在離子阱QIT中，並用預定能量將它們碎裂而進行MS3質譜分析(步驟S7)。由此獲得的m/z＝1280(校正的m/z＝1280.4)的測量的MS3碎片圖譜表示在圖5中。
測量的MS3碎片圖譜的數據從質譜儀MS發送到分析部分ANL，圖4中第二階段的兩個參考MS3碎片圖譜之間的相似指數在那裡分別計算，並和預定閾值S31進行比較(步驟S8)。在此情況下，如圖6(a)所示，和測量的MS3碎片圖譜有較高的相似指數。
因而，此時分析樣品的糖鏈被確定為(Hex)5(HexNAc)6，具有如圖6(a)上部分所示的結構(步驟S9)。
然後，解釋了計算未知樣品的測量的碎片圖譜和存儲於資料庫中參考碎片圖譜之間的相似指數的算法，在前述鑑定程序中曾經用到。在如下算法解釋中，前述「碎片圖譜」是指「譜圖(spectrum)」。
(1)關於每一個測量的譜圖和參考譜圖，在某一m/z(質荷比)值的範圍內的峰歸為一組(或合併)。在這些峰中，具有最高強度的峰被認為是合併後的峰。
(2)假設合併後測量的譜圖的n個峰(P1，P2，…，Pn)強度是xi(i＝1-n)，測量的譜圖的向量X生成為，X＝(x1，x2，…，xn)。
(3)關於參考譜圖，確定對應於測量的譜圖的峰Pi的一個參考譜圖峰，並從峰的強度中產生參考譜圖的向量Y，為Y＝(y1，y2，…，yn)。
(4)從兩個向量X和Y間的歐幾裡得距離(Euclidean distance)獲得兩個譜圖的相異指數D1，如下。
D1＝∑(i＝1～n)(xi-yi)2由於當兩個譜圖完全相同時這裡計算的值D1是0(零)，當兩個譜圖的差異更大時，值D1更大，值D1被稱為「相異指數」。自然地，該值能夠成為兩個譜圖間相似度的量度。為了表示兩個譜圖由於變近而變大的相似度，可以用相異指數的倒數。
(5)在上面計算的相異指數D1中，一個已知糖鏈結構(參考譜圖)具有未知樣品譜圖(測量的譜圖)中未出現的峰，呈一個小的相異指數(大相似指數)。這樣，通過交換測量的譜圖和參考譜圖的向量再次計算相異指數D2。即，對於具有相異指數D1不高於預定閾值的參考譜圖，前述向量X從參考譜圖計算出，前述向量Y從測量的譜圖計算出，並獲得了相異指數D2。
用實際數據校驗前述計算相異指數(相似指數)方法的效果。用於校驗的樣品是通過將標記有PA的糖鏈進行質譜分析而獲得的譜圖。讓合併後m/z值範圍為0.8，並讓認為是相同峰的m/z值範圍為0.5，進行計算。通過質譜儀AXIMA/QIT(AXIMA是島津公司的註冊商標)的峰列表輸出的％AREA值(預定範圍中的峰面積值)獲得強度值。
(1)0NA-00001a(100.1)和0NA/00001b(100.2)的比較它們的結構式表示在圖7(a)和(b)中。關於這兩種同分異構結構，計算了兩個具有相同結構但是採集自不同實驗的樣品的譜圖間相異指數，以及兩個同分異構體樣品譜圖的相異指數。結果表示在圖8的表中。
圖8表的第一行是0NA-00001a(100.1)(先驅離子質荷比是1214)的MS2譜圖相異指數計算結果。中間兩個單元格中的數據表示兩個不同時間將同一樣品進行質譜分析所得的平均相異指數計算值，右邊兩個單元格中數據是它們與同分異構體0NA-00001b(100.2)的MS2譜圖的相異指數值。在MS2譜圖中，同一樣品間相異指數和同分異構體樣品間相異指數並不是很不同。
圖8表的第二行是關於質譜譜圖(MS3譜圖)相異指數計算結果，其中m/z＝915的0NA-00001a(100.1)碎片離子被進一步碎裂。同樣，中間兩個單元格中數據表示兩個不同時間將同一樣品進行質譜分析所得的平均相異指數，右邊兩個單元格中數據是它們與同分異構體0NA-0001b(100.2)在同樣m/z＝915的MS3譜圖的相異指數。當分析直到MS3譜圖時，同分異構體樣品的相異指數大於同樣樣品間的相異指數。圖8表的第三行是關於先驅離子在m/z＝1196的結果，顯示了同樣的結果。
圖8表第四到第六行是關於0NA-00001b(100.2)的相似計算結果。使用m/z＝1214條件下先驅離子的MS2譜圖和使用m/z＝915條件下先驅離子的MS3譜圖測量結果中，同一樣品間相異指數值和同分異構體間相異指數值看不出差別，但是在使用m/z＝1196條件下先驅離子的MS3譜圖結果中，同一樣品間相異指數比同分異構體間小。
(2)ONG-00001c(100.3)和ONG-00001d(100.4)的比較它們兩者的結構式表示在圖9(c)和(d)中。相異指數的相似計算結果表示在圖10的表中。在這些樣品中，任何情況下，同一樣品間相異指數遠比同分異構體樣品之間的相異指數小。
(3)ONG-00001e(310.2)和ONG-00001f(310.3)的比較它們兩個的結構式表示在圖11(e)和(f)中，相異指數計算結果表示在圖12的表中。對於這些樣品，在不同於用到m/z＝1280的先驅離子的情況下，同一樣品的相異指數比同分異構體樣品之間的相異指數大。這是因為二者樣品的峰呈現細微差異，由於合併(merging)程序而使該差異增強。在用m/z＝1280的先驅離子的MS3譜圖中，同一樣品之間的相異指數比同分異構體樣品之間的相異指數小。因此，這能夠區別兩個同分異構體。
(4)ONG-000020(400.2)、ONG-000021(400.3)和ONG-000022(400.5)的比較各自的結構式表示在圖13中。從MS2譜圖，這三種同分異構體不能被區別。然而，當通過選擇特殊峰進行MS3時，那些同分異構體能夠被區別。特別是，在作為峰使用m/z＝1686、1764和1967的先驅離子的MS3譜圖情況下，具有最小相異指數(或最相似樣品)的結構對應於正確的糖鏈結構。
從前述實驗結果，首先，確認前述計算方法對於確定兩個譜圖間的相似指數(相異指數)是有效的。另外，清楚地表明，即使當同分異構體間結構差異不能被MS2階段譜圖的相似指數(相異指數)所反映時，通過進行碎裂質譜分析直到MS3，同分異構體結構的差異能夠通過計算譜圖相似指數(相異指數)而區別。
權利要求
1.用質譜儀鑑定分析-目標糖鏈結構的方法中，通過比較測量的MS3碎片圖譜和資料庫中存儲的參考MS3碎片圖譜，其中所述測量的MS3碎片圖譜是包含在測量的MS2碎片圖譜中的每一個MS2碎片離子的碎裂圖譜，其通過將所述分析-目標糖鏈進行碎裂質譜分析而獲得，所述鑑定糖結構的方法的特徵在於，在包含在測量的MS2碎片圖譜中的多個MS2碎片離子中，只對選定的MS2碎片離子進行碎裂質譜分析，其中每一個選定的MS2碎片離子具有存儲於資料庫中的多個參考MS3碎片圖譜，其相互相似指數等於或小於一個預定值，其中所述多個參考MS3碎片圖譜和所述選定的MS2碎片離子具有同樣的先驅離子質荷比。
2.權利要求1所述的鑑定糖鏈結構的方法，其中參考MS4碎片圖譜或由進一步碎裂產生的MSn參考碎片圖譜被進一步存儲於資料庫中，通過將它們和測量的MS4碎片圖譜或由進一步碎裂而來的MSn測量的碎片圖譜相比較來進行糖鏈結構的鑑定，並且，以與上述同樣的方式，只有多個參考MSn+1碎片圖譜之間相互的相似指數不高於預定值的測量的MSn碎片離子進行進一步的碎裂質譜分析。
3.用質譜儀鑑定分析-目標糖鏈結構的方法中，通過比較測量的MS3碎片圖譜和資料庫中存儲的參考MS3碎片圖譜，其中所述測量的MS3碎片圖譜是包含在測量的MS2碎片圖譜中的每一個MS2碎片離子的碎裂圖譜，其通過將所述分析-目標糖鏈進行碎裂質譜分析而獲得，所述鑑定糖結構的方法的特徵在於，在包含在測量的MS2碎片圖譜中的多個MS2碎片離子中，以從小到大的存儲於資料庫中的多個MS3碎片圖譜的相互相似指數的順序進行碎裂質譜分析，其中所述多個參考MS3碎片圖譜和所述選定的MS2碎片離子具有同樣的先驅離子質荷比。
4.權利要求3的鑑定糖鏈結構的方法，其中參考MS4碎片圖譜或由進一步碎裂產生的MSn參考碎片圖譜被進一步存儲於資料庫中，通過和測量的MS4碎片圖譜或由進一步碎裂而來的MSn測量的碎片圖譜相比較來進行糖鏈結構的鑑定，並且，以與上述同樣的方式，只有多個參考MSn+1碎片圖譜之間相互相似指數不高於預定值的測量的MS4碎片離子進行進一步的碎裂質譜分析。
5.根據權利要求1到4中任何一項的鑑定糖鏈結構的方法，其中前述參考MSn+1碎片圖譜之間的相互相似指數被存儲於資料庫中，與所述先驅離子的質荷比相聯繫。
6.根據權利要求1到5中任何一項的鑑定糖鏈結構的方法，其中只有在測量的MSn碎片圖譜中峰強度不低於預定值的MSn碎片離子進行鑑定方法。
7.根據權利要求1到6中任何一項的鑑定糖鏈結構的方法，其中糖鏈的理論組成從測量的MSn碎片圖譜中計算出，並基於此，在存儲於資料庫中的參考MSn+1碎片圖譜中，將要比較的圖譜被預先限制。
8.根據權利要求1到7中任何一項的鑑定糖鏈結構的方法，其中所述碎裂質譜分析的碎裂能量被設定為不小於依賴於所述先驅離子的預定值。
9.權利要求8的鑑定糖鏈結構的方法，其中所述碎裂能量的預定值被存儲於資料庫中。
10.根據權利要求1到9中任何一項的鑑定糖鏈結構的方法，其中兩個碎片圖譜間的相似指數通過如下方法確定a)第一個碎片圖譜中，質荷比在預定範圍內的峰被分組在一起，在那些峰中，具有最高強度的峰被用作代表該範圍的峰。b)第二個碎片圖譜中，通過與上述相同的排列(ranging)選定代表峰。c)使兩個碎片圖譜在各自範圍中代表峰的強度要素所組成的兩個向量之間的歐幾裡得距離作為相異指數，並且相似指數基於相異指數而確定。
11.權利要求10的鑑定糖鏈結構的方法，其中關於第二碎片圖譜，其相對於第一碎片圖譜的相異指數不超過預定值，通過交換第一和第二圖譜重複前述步驟以計算第二相異指數，並且所述相似指數基於第二相異指數而定。
12.分析糖鏈的質譜儀，包含質譜分析部分，其裝備有用於容納和碎裂離子的工具，資料庫部分，其中存儲有已知糖鏈的MSn碎片圖譜，和數據處理部分，用於控制基於權利要求1到11中任何一項所述方法的質譜儀，並鑑定分析-目標糖鏈。
13.用於執行權利要求1到11中任何一項所述的方法的程序。
全文摘要
本發明的目的是提供一個分析糖鏈結構的系統，其能夠用少量樣品簡單而快速地確定糖鏈的完整一級結構。在鑑定一個分析目標糖鏈結構的方法中，用質譜儀通過比較測量的MS3碎片圖譜和資料庫中所存參考MS3碎片圖譜，這裡測量的MS3碎片圖譜是包含在測量的MS2碎片圖譜中的每一個MS2碎片離子的碎裂圖譜，其通過將分析目標糖鏈進行碎裂質譜分析而獲得，本發明的特徵在於，包含在測量的MS2碎片圖譜中的多個MS2碎片離子中，只有對選定的MS2碎片離子進行碎裂質譜分析，這裡每一個選定的MS2碎片離子具有存儲於資料庫中的多個參考MS3碎片圖譜，其相互的相似指數小於一個預定值，其中多個參考MS3碎片圖譜和選定的MS2碎片離子具有同樣的先驅離子質荷比。
文檔編號G01N33/483GK1930470SQ20058000802
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月19日
發明者龜山昭彥, 成松久, 菊池紀廣, 中家修一 申請人:獨立行政法人產業技術綜合研究所, 三井情報開發株式會社, 株式會社島津製作所