一株促進毛葉苕子增長的根瘤菌及其應用的製作方法

2023-12-05 00:12:56 1

本發明涉及農業微生物領域中一株促進毛葉苕子增長的根瘤菌及其應用。

背景技術：

毛葉苕子(viciavillosaroth，也稱毛葉紫花苕子，簡稱毛苕)是一種優質的綠肥作物，主要分布在我國黃河、淮河、海河流域一帶，近些年遼年、內蒙、新疆等地也有播種，栽種面積較大。毛葉苕子的抗寒能力較強，一般品種能耐短時間零下20℃的低溫，並且幼苗的越冬率很高，同時毛葉苕子耐旱和耐貧瘠性也很強，一般在較貧瘠的土壤上種植，也能收到較高的產量，適應性較廣。

為培肥地力，確保農業持續穩定發展，農業部決定從1995年夏季開始在全國實施以積造有機肥為主要內容的「沃土計劃」，即是綠肥作物又是豆科作物的毛葉苕子種植面積在不斷增加。豆科根瘤菌的研究和應用在世界範圍內已有一百多年歷史，幾乎在全世界範圍內都提倡對豆科作物進行根瘤菌接種。

氮素是植物生長中最重要的營養元素之一，根瘤菌是一類能侵染豆科植物根部(少數是莖部)形成根瘤進行生物固氮的細菌，根瘤菌與豆科植物共生體系是生物固氮中作用最強的體系，土壤中的固氮微生物將空氣中的氮氣轉化為植物可吸收的氨，所固定的氮約為生物固氮總量的65％。當前，在退化土壤中種植豆科植物越來越受到人們的關注，因為退化土壤中氮素營養比較貧乏，通過豆科植物與根瘤菌的共生固氮作用可以提高土壤肥力，接種根瘤菌能夠提高豆科植物的產量和氮儲藏量。如果種植的豆科植物沒有相應的高效根瘤菌株與之共生結瘤並固定空氣中的氮素，它們將完全依賴土壤中的結合態氮，不但不能補充反而會消耗土壤中的氮素，導致土壤肥力下降。因此，為了充分發揮根瘤菌與豆科植物的共生固氮作用，以維持土壤氮素平衡，需要篩選高效菌株進行人工接種。開發和利用豆科植物與根瘤菌共生固氮效應的潛力很大。在生物固氮過程中，依據根瘤菌對寄主植物的專一性，把適於同一種根瘤菌結瘤固氮的植物列為一族，根瘤菌在族內各植物間可以轉接，稱為互接種族。毛葉苕子和豌豆在根瘤菌應用上是互接種族，豌豆根瘤菌既可以接種不同毛葉苕子也可以接種不同品種豌豆，但是接種效果差異較大。

有數據表明在不同綠肥種類間，毛葉苕子的固氮強度是最高的。同時毛葉苕子的改土培肥作用和壓青、茬地的增產效應都是非常顯著的。近十年來，我國毛葉苕子種植面積不斷擴大，毛葉苕子的栽培和利用技術逐漸提高，毛葉苕子接種根瘤菌技術的研究和應用被加大重視。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是如何顯著促進毛葉苕子增長。

為了解決以上技術問題，本發明提供了一株根瘤菌。

本發明所提供的根瘤菌是豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)，其菌株號為m1-10-3，該菌株已於2015年12月14日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.11877，以下簡稱為豌豆根瘤菌m1-10-3。

豌豆根瘤菌m1-10-3屬革蘭氏染色陰性，短小杆狀，菌體染色不均勻，形成著色與不著色部分的環狀體，不著色的部分脂類含量較高。無芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能運動。菌體大小為(0.5-0.8)×(1.1-2.9)微米。在酵母汁甘露醇瓊脂培養基平面上生長，菌落呈圓形凸起，邊緣整齊，較溼潤表面光滑，質地均一，淺乳白色，菌苔粘稠。豌豆根瘤菌m1-10-3具有序列表中序列1的16srdna序列。

為了解決以上技術問題，本發明還提供了促進毛葉苕子生長的菌劑。

本發明所提供的促進毛葉苕子生長的菌劑，含有豌豆根瘤菌m1-10-3或/和豌豆根瘤菌m1-10-3的代謝物。

所述促進毛葉苕子生長的菌劑具體可為提高毛葉苕子單株重量和/或提高毛葉苕子株高的菌劑。所述毛葉苕子單株重量是指毛葉苕子單株的地上部分和地下部分重量之和。

上述菌劑的活性成分可為豌豆根瘤菌m1-10-3或/和豌豆根瘤菌m1-10-3的代謝物，上述菌劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌劑的其他活性成分本領域技術人員可根據菌劑對毛葉苕子植株重量和/或植株高度促進效果確定。所述菌劑還可包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體為礦物材料、生物材料；所述礦物材料可為草炭、粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、矽石和硅藻土中的至少一種；所述生物材料為各類作物的秸稈、松殼、稻草、花生殼、玉米粉、豆粉、澱粉、草炭和動物的糞便中的至少一種；所述液體載體可為水；所述菌劑中，豌豆根瘤菌m1-10-3或/和豌豆根瘤菌m1-10-3的代謝物可以以被培養的活細胞、活細胞的發酵液、細胞培養物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述菌劑的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可溼性粉劑或水分散粒劑。

其中，豌豆根瘤菌m1-10-3的代謝物是將豌豆根瘤菌m1-10-3在微生物液體發酵培養基中培養得到的物質。

根據需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩定劑(如抗氧化劑)、ph調節劑等。

豌豆根瘤菌m1-10-3或所述促進毛葉苕子生長的菌劑在製備促進毛葉苕子生長的產品中的應用和在促進毛葉苕子生長中的應用均屬於本發明的保護範圍。

上述應用中，所述促進毛葉苕子生長可為提高毛葉苕子單株重量和/或提高毛葉苕子株高。

上述應用中，所述促進毛葉苕子生長的產品可為促進毛葉苕子生長的菌劑或含有所述促進毛葉苕子生長的菌劑的生物肥料。

本申請中，所述毛葉苕子可為土庫曼毛苕、青海苕子、和/或青苕一號。

為了解決以上技術問題，本發明還提供了一種培養豌豆根瘤菌m1-10-3的方法。

本發明所提供的培養豌豆根瘤菌m1-10-3的方法，包括在用於培養根瘤菌的培養基中培養豌豆根瘤菌m1-10-3的步驟。

所述用於培養根瘤菌的培養基可按照如下方法配製：丙三醇3-5ml，甘露醇2-5g，酵母浸粉0.8-1g，k2hpo40.5-1g，無水mgso40.1-0.2g，caso4·2h2o0.1-0.2g，nacl0.1-0.2g，1％(nh4)6mo7o24·4h2o1-1.5ml、1％h3bo31-1.5ml，瓊脂20g，用水定容至1000ml，調ph值為6.8-7.0，滅菌得到用於培養根瘤菌的培養基。

實驗證明，本發明的豌豆根瘤菌m1-10-3對毛葉苕子比豌豆根瘤菌h10和豌豆根瘤菌accc16505具有更顯著的促進生長和增產效果。豌豆根瘤菌m1-10-3與毛葉苕子接種組合對毛葉苕子具有顯著的增產效果，具有較高的實用性和可推廣性，有望發展成為毛葉苕子根瘤菌應用領域中一項新的優良組合技術。本發明在毛葉苕子種植業中具有廣闊的應用前景。

保藏說明

菌種名稱：豌豆根瘤菌rhizobiumleguminosarum

菌株編號：m1-10-3

保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏機構簡稱：cgmcc

地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號

保藏日期：2015年12月14日

保藏中心登記入冊編號：cgmccno.11877

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中的豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)accc16505於1990年4月1日收藏於中國微生物菌種保藏管理委員會農業微生物中心(簡稱accc，地址：北京市海澱區中關村南大街12號，中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，郵編100081)，自該收藏日起公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會農業微生物中心獲得該菌株。豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)accc16505在下文中簡稱豌豆根瘤菌accc16505。

下述實施例中的固體培養基的配製方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，k2hpo40.5g，無水mgso40.2g，caso4·2h2o0.2g，nacl0.1g，1％(nh4)6mo7o24·4h2o1ml、1％h3bo31ml，瓊脂20g，用水定容至1000ml，調ph值為6.8-7.0，121℃滅菌30min。

下述實施例中的液體培養基的配製方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，k2hpo40.5g，無水mgso40.2g，caso4·2h2o0.2g，nacl0.1g，1％(nh4)6mo7o24·4h2o1ml、1％h3bo31ml，用水定容至1000ml，調ph值為6.8-7.0，121℃滅菌30min。

實施例1、豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)m1-10-3cgmcc11877的分離及鑑定

1、菌株的分離

從青海省海東市平安區採集野生毛葉苕子根瘤，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鈣0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.1g，質量含量為1％的鉬酸銨水溶液1ml和質量含量為1％的硼酸水溶液1ml，0.5％剛果紅1ml，20g瓊脂，用水定容至1l，ph值為6.8-7.0)劃線分離得到菌株m1-10-3。

2、菌株的鑑定

2.1、形態學鑑定

將處於對數生長期，且菌落大小穩定，上述步驟1分離並純化得到的菌株m1-10-3進行單菌落狀態描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、溼潤度、菌落表面狀態、菌落邊緣狀態。另一方面，對處於對數生長期的菌株m1-10-3，經塗片染色後採用光學顯微鏡觀察菌體的形態。

結果表明菌株m1-10-3屬革蘭氏染色陰性，短小杆狀，菌體染色不均勻，形成著色與不著色部分的環狀體，不著色的部分脂類含量較高。無芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能運動。菌體大小為(0.5-0.8)×(1.1-2.9)微米。在酵母汁甘露醇瓊脂培養基平面上生長，菌落呈圓形凸起，邊緣整齊，較溼潤表面光滑，質地均一，淺乳白色，菌苔粘稠。

2.2、16srdna序列同源性分析

採用菌落pcr方法擴增步驟1所得的菌株m1-10-3的16srdna片段，相關試劑由全式金公司提供。對16srrna基因片段進行擴增並克隆測序的結果表明，菌株m1-10-3的16srdna具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株m1-10-3的rrna基因片段與豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)菌株ccbau85022的16srrna基因部分序列(sequenceid:eu256422.1)的相似性最高為99％。

2.3、生理生化特徵鑑定

參考《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑑定手冊.北京:科學出版社，2011.)和《微生物學實驗》(沈萍,範秀容,李廣武.微生物學實驗(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)測定菌株m1-10-3的生理生化特徵。結果表明菌株m1-10-3為化能異養型，能利用各種碳水化合物和有機酸的鹽作為碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、d-核糖、d-纖維二糖、d-阿拉伯糖、甘露醇、木糖、d-半乳糖、果糖、衛矛醇和肌醇；能利用銨鹽、硝酸鹽和多數胺基酸作為氮源；剛果紅吸色反應微吸色；石蕊牛奶反應不凝結，不產酸；不能利用纖維素和澱粉；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；從甘露醇產酸；在含糖培養基上生長常伴有豐富的胞外粘液；不產生硫化氫；不在甘油磷酸鈣培養基產生沉澱。

鑑於上述形態、生理生化特徵分析和16srdna序列同源性分析結果，將步驟1分離純化得到的菌株m1-10-3鑑定為豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)。該豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)m1-10-3已於2015年12月14日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.11877，以下簡稱為豌豆根瘤菌m1-10-3。

實施例2、豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑的製備

1、豌豆根瘤菌m1-10-3的斜面培養

挑取實施例1的豌豆根瘤菌m1-10-3接種於固體培養基進行斜面培養，在28℃下培養56小時，得到斜面培養的豌豆根瘤菌m1-10-3。

2、菌種的活化

挑取步驟1斜面培養的豌豆根瘤菌m1-10-3，將其接種於500ml液體培養基中，在28℃下培養48小時，得到豌豆根瘤菌m1-10-3菌液。

3、種子罐培養

取3l步驟2的豌豆根瘤菌m1-10-3菌液，將其接入100l種子罐中(含有60l液體培養基)進行種子培養，在30℃、120rpm下振蕩培養56小時培養，得到豌豆根瘤菌m1-10-3種子液。

4、發酵罐培養

按10％比例(體積比)將步驟3的豌豆根瘤菌m1-10-3種子液接入1000l發酵罐中(含有600l液體培養基)進行發酵培養，在28℃、150rpm下振蕩培養56小時，得到豌豆根瘤菌m1-10-3發酵液，該豌豆根瘤菌m1-10-3發酵液中豌豆根瘤菌m1-10-3的含量為30億cfu/ml。

5、豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑的製備

將草炭自然乾燥後進行粉碎，過100目篩，然後用石灰水調ph值為6.8，在121℃滅菌60min，得到無菌草炭。

將步驟4的豌豆根瘤菌m1-10-3發酵液與該無菌草炭混勻，再在28℃條件下增殖培養48h，得到豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑，分裝入庫。經檢測成品合格，該豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑中的豌豆根瘤菌m1-10-3的含量為2.0×108cfu/克。

實施例3、豌豆根瘤菌m1-10-3接種毛葉苕子的水培試驗

採用濾紙橋試管水培法。將濾紙裁成條狀，製成m型，中間凹處根據幼苗的大小製成v型小孔，m型濾紙的高度為試管的長度減去4cm。所用試管為2.0cm×20cm。

將配製好的無氮營養液分別裝入帶有濾紙支撐物的試管中，其高度位於h型濾紙的凹處，每個處理重複4個試管，並設對照管4個，灌裝後用耐高溫高壓的塑料薄膜封好後，15磅121℃滅菌1h備用。

選擇大小均一的土庫曼毛苕種子，用95％乙醇浸泡5min後用0.1％hgcl2表面滅菌5min,再用無菌水衝洗10次。將消毒的種子置於28—30℃溫箱中保溫催芽。光照要求從頂部照射，根部避光，可放置溫室或光照箱中，光照照強度約7000lux—8000lux；溫度：25—30℃；催芽長度為0.8-1.5cm。

實驗設不接菌對照處理和豌豆根瘤菌m1-10-3處理。實驗設三次重複，每次重複的實驗方法如下：

豌豆根瘤菌m1-10-3處理：將10粒催芽成功的種子放入菌懸液(用液體培養基稀釋實施例2步驟4的豌豆根瘤菌m1-10-3發酵液至豌豆根瘤菌m1-10-3的含量為2.0×107cfu/ml得到菌懸液)中浸泡30min,用無菌的鑷子小心夾出種子放入水培液試管的濾紙橋中固定好播種，將菌懸液平均吸入試管中。封口後於光照箱中光照培養，光照從頂部照射，光照時間14h/10h，根部避光，光照強度為7000lux—8000lux；溫度：25—30℃。

不接菌對照處理：與豌豆根瘤菌m1-10-3處理的區別僅在於將菌懸液替換為液體培養基，其他操作完全相同。

表1、土庫曼毛苕接種豌豆根瘤菌m1-10-3水培試驗結果

結果如表1所示，表明將豌豆根瘤菌m1-10-3接種土庫曼毛苕後，植株高度、植株根長、植株鮮重和植株乾重比不接菌對照分別增長32.56％、18.01％、19.32％和47.62％，表明本發明的可接種毛葉苕子的豌豆根瘤菌m1-10-3具有顯著的促生長效果。

對比例1、豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)h10cgmccno.11878的分離及鑑定

1、菌株的分離

從青海省樂都縣採集野生豌豆根瘤，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鈣0.2g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.1g，質量含量為1％的鉬酸銨水溶液1ml和質量含量為1％的硼酸水溶液1ml，0.5％剛果紅1ml，20g瓊脂，用水定容至1l，ph值為6.8-7.0)劃線分離得到菌株h10。

2、菌株的鑑定

2.1、形態學鑑定

將處於對數生長期，且菌落大小穩定，上述步驟1分離並純化得到的菌株h10進行單菌落狀態描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、溼潤度、菌落表面狀態、菌落邊緣狀態。另一方面，對處於對數生長期的菌株h10，經塗片染色後採用光學顯微鏡觀察菌體的形態。

結果表明菌株h10屬革蘭氏染色陰性，小短杆狀，菌體大小為0.5～0.9微米×1.2～6.0微米，在不同環境中生長的菌體形態不同。一般含有聚-β-羥基丁酸鹽顆粒。無芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，運動，好氧。最適生長溫度25～30℃，最適ph6.0～7.0。菌落呈圓形，邊緣整齊，微凸起，無色半透明或淺乳白色，粘稠。在酵母汁甘露醇無機鹽瓊脂培養基平板上生長3-6天後直徑2～4mm。在含糖培養基上的生長物常伴有豐富的胞外粘液。

2.2、16srdna序列同源性分析

採用菌落pcr方法擴增步驟1所得的菌株h10的16srdna片段，相關試劑由全式金公司提供。對16srrna基因片段進行擴增並克隆測序的結果表明，菌株h10的16srdna具有序列表中序列2的核苷酸序列。菌株h10的16srdna與豌豆根瘤菌rhizobiumleguminosarumstrainintad156的16srrna基因(sequenceid:kx066064.1)的相似性最高為99％。

2.3、生理生化特徵鑑定

參考《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑑定手冊.北京:科學出版社，2011.)和《微生物學實驗》(沈萍,範秀容,李廣武.微生物學實驗(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)測定菌株h10的生理生化特徵。結果表明菌株h10是化能異養型，能利用各種碳水化合物和有機酸的鹽類作為碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、d-核糖、d-纖維二糖、d-阿拉伯糖、甘露醇、木糖、d-半乳糖、果糖、衛矛醇和肌醇；能利用銨鹽、硝酸鹽和多數胺基酸可作為氮源；剛果紅吸色反應微吸色；石蕊牛奶反應不凝結，不產酸；不能利用纖維素和澱粉；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；從甘露醇產酸；在含糖培養基上生長常伴有豐富的胞外粘液；不產生硫化氫；不在甘油磷酸鈣培養基產生沉澱。

鑑於上述形態、生理生化特徵分析和16srdna序列同源性分析結果，將步驟1分離純化得到的菌株h10鑑定為豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)。該豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)h10已於2015年12月14日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為cgmccno.11878，以下簡稱為豌豆根瘤菌h10。豌豆根瘤菌h10已於2016年11月28日由本申請的申請人提出中國發明專利申請，申請號為201611072530.2。

對比例2、豌豆根瘤菌h10菌劑的製備

1、豌豆根瘤菌h10的斜面培養

挑取對比例1的豌豆根瘤菌h10接種於固體培養基進行斜面培養，在28℃下培養56小時，得到斜面培養的豌豆根瘤菌h10。

2、菌種的活化

挑取步驟1斜面培養的豌豆根瘤菌h10，將其接種於500ml液體培養基中，在28℃下培養72小時，得到豌豆根瘤菌h10菌液。

3、種子罐培養

取3l步驟2的豌豆根瘤菌h10菌液，將其接入100l種子罐中(含有60l液體培養基)進行種子培養，在30℃、120rpm下振蕩培養60小時培養，得到豌豆根瘤菌h10種子液。

4、發酵罐培養

按10％比例(體積比)將步驟3的豌豆根瘤菌h10種子液接入1000l發酵罐中(含有600l液體培養基)進行發酵培養，在28℃、150rpm下振蕩培養60小時，得到豌豆根瘤菌h10發酵液，該豌豆根瘤菌h10發酵液中豌豆根瘤菌h10的含量為30億cfu/ml。

5、豌豆根瘤菌h10菌劑的製備

將草炭自然乾燥後進行粉碎，過100目篩，然後用石灰水調ph值為6.8，在121℃滅菌60min，得到無菌草炭。

將步驟4的豌豆根瘤菌h10發酵液與該無菌草炭混勻，再在28℃條件下增殖培養48h，得到豌豆根瘤菌h10菌劑，分裝入庫。經檢測成品合格，該豌豆根瘤菌h10菌劑中的豌豆根瘤菌h10的含量為2.0×108cfu/克。

對比例3、豌豆根瘤菌accc16505菌劑的製備

1、豌豆根瘤菌accc16505的斜面培養

挑取豌豆根瘤菌accc16505接種於固體培養基進行斜面培養，在28℃下培養56小時，得到斜面培養的豌豆根瘤菌accc16505。

2、菌種的活化

挑取步驟1斜面培養的豌豆根瘤菌accc16505，將其接種於500ml液體培養基中，在28℃下培養72小時，得到豌豆根瘤菌accc16505菌液。

3、種子罐培養

取3l步驟2的豌豆根瘤菌accc16505菌液，將其接入100l種子罐中(含有60l液體培養基)進行種子培養，在30℃、120rpm下振蕩培養60小時培養，得到豌豆根瘤菌accc16505種子液。

4、發酵罐培養

按10％比例(體積比)將步驟3的豌豆根瘤菌accc16505種子液接入1000l發酵罐中(含有600l液體培養基)進行發酵培養，在28℃、150rpm下振蕩培養60小時，得到豌豆根瘤菌accc16505發酵液，該豌豆根瘤菌accc16505發酵液中豌豆根瘤菌accc16505的含量為30億cfu/ml。

5、豌豆根瘤菌accc16505菌劑的製備

將草炭自然乾燥後進行粉碎，過100目篩，然後用石灰水調ph值為6.8，在121℃滅菌60min，得到無菌草炭。

將步驟4的豌豆根瘤菌accc16505發酵液與該無菌草炭混勻，再在28℃條件下增殖培養48h，得到豌豆根瘤菌accc16505菌劑，分裝入庫。經檢測成品合格，該豌豆根瘤菌accc16505菌劑中的豌豆根瘤菌accc16505的含量為2.0×108cfu/克。

實施例4、豌豆根瘤菌m1-10-3與豌豆根瘤菌h10和豌豆根瘤菌accc16505接種毛葉苕子品種的效果比較試驗

選擇土庫曼毛苕、青海苕子和青苕一號這三個毛葉苕子品種進行促進生長實驗。

本試驗採用隨機區組設計，隨機設置12個處理區，每個處理區設三個小區重複。12個處理區分別為m1-10-3-青海苕子處理區、m1-10-3-土庫曼毛苕處理區和m1-10-3-青苕一號處理區這三個豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理區，h10-青海苕子處理區、h10-土庫曼毛苕處理區和h10-青苕一號處理區這三個豌豆根瘤菌h10菌劑處理區，accc16505-青海苕子處理區、accc16505-土庫曼毛苕處理區和accc16505-青苕一號處理區這三個豌豆根瘤菌accc16505菌劑處理區，對照-青海苕子處理區、對照-土庫曼毛苕處理區和對照-青苕一號處理區這三個不接菌對照處理區。

每個小區大小為4㎡,土壤ph8.3，土著根瘤菌平均數量2.0×102cfu/g幹土。按照毛葉苕子播種量為7.5kg/hm2準備種子。

m1-10-3-青海苕子處理區、m1-10-3-土庫曼毛苕處理區、m1-10-3-青苕一號處理區分別播種m1-10-3-青海苕子種子、m1-10-3-土庫曼毛苕種子、m1-10-3-青苕一號種子(將實施例2的豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑分別和青海苕子種子、土庫曼毛苕種子和青苕一號種子均按照1：10的質量比混合、拌勻得到的種子分別稱為m1-10-3-青海苕子種子、m1-10-3-土庫曼毛苕種子、m1-10-3-青苕一號種子)。

h10-青海苕子處理區、h10-土庫曼毛苕處理區、h10-青苕一號處理區分別播種h10-青海苕子種子、h10-土庫曼毛苕種子、h10-青苕一號種子(將對比例2的豌豆根瘤菌h10菌劑分別和青海苕子種子、土庫曼毛苕種子和青苕一號種子均按照1：10的質量比混合、拌勻得到的種子分別稱為h10-青海苕子種子、h10-土庫曼毛苕種子、h10-青苕一號種子)。

accc16505-青海苕子處理區、accc16505-土庫曼毛苕處理區、accc16505-青苕一號處理區分別播種accc16505-青海苕子種子、accc16505-土庫曼毛苕種子、accc16505-青苕一號種子(將對比例3的豌豆根瘤菌accc16505菌劑分別和青海苕子種子、土庫曼毛苕種子和青苕一號種子均按照1：10的質量比混合、拌勻得到的種子分別稱為accc16505-青海苕子種子、accc16505-土庫曼毛苕種子、accc16505-青苕一號種子)。

對照-青海苕子處理區、對照-土庫曼毛苕處理區、對照-青苕一號處理區分別播種ck-青海苕子種子、ck-土庫曼毛苕種子和ck-青苕一號種子(將實施例2中的無菌草炭分別和青海苕子種子、土庫曼毛苕種子和青苕一號種子均按照1：10的質量比混合、拌勻得到的種子分別稱為ck-青海苕子種子、ck-土庫曼毛苕種子和ck-青苕一號種子)。

將上述種子按照小區設計均勻播種到土壤中，播種方法為條播，行距為10cm。上述各處理區除所播種的種子不同外，其他條件完全相同。播種後在相同條件下培養至開花期，記錄各處理區各個植株地上部分高度(植株高度)、地上部分鮮重和地下部分鮮重得到植株鮮重(地上部分鮮重和地下部分鮮重之和)，並計算出各組的平均值，分別得到植株平均高度、植株平均鮮重。

表2、各處理區的植株平均高度和植株平均鮮重

表3、豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑與豌豆根瘤菌accc16505菌劑和豌豆根瘤菌h10菌劑的促生長比較效果

註：m1-10-3表示豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理區，h10表示豌豆根瘤菌h10菌劑處理區，accc16505表示豌豆根瘤菌accc16505菌劑處理區，對照表示不接菌對照處理區。

結果如表2和表3所示，表明：

1、豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的土庫曼毛苕與不接菌對照處理的土庫曼毛苕相比，株高增加了62.36％，植株鮮重增加了98.39％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的青海苕子與不接菌對照處理的青海苕子相比，株高增加了45.05％，植株鮮重增加了6.68％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的青苕一號與不接菌對照處理的青苕一號相比，株高增加了56.07％，植株鮮重增加了14.22％；

2、豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的土庫曼毛苕與豌豆根瘤菌accc16505菌劑處理的土庫曼毛苕相比，株高增加了51.36％，植株鮮重增加了55.55％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的青海苕子與豌豆根瘤菌accc16505菌劑處理的青海苕子相比，株高增加了19.89％，植株鮮重增加了-8.41％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的青苕一號與豌豆根瘤菌accc16505菌劑處理的青苕一號相比，株高增加了40.10％，植株鮮重增加了53.33％；

3、豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的土庫曼毛苕與豌豆根瘤菌h10菌劑處理的土庫曼毛苕相比，株高增加了36.69％，植株鮮重增加了32.34％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的青海苕子與豌豆根瘤菌h10菌劑處理的青海苕子相比，株高增加了2.14％，植株鮮重增加了4.96％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌劑處理的青苕一號與豌豆根瘤菌h10菌劑處理的青苕一號相比，株高增加了4.72％，植株鮮重增加了6.03％。

上述結果表明本發明的豌豆根瘤菌m1-10-3對毛葉苕子比豌豆根瘤菌h10和豌豆根瘤菌accc16505具有更顯著的促進生長和增產效果。

中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所

一株促進毛葉苕子增長的根瘤菌及其應用

1

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豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)

1

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