基於氧化石墨烯複合納米纖維組織工程支架的製備方法與流程
2024-02-19 22:30:15
本發明涉及一種基於氧化石墨烯複合納米纖維組織工程支架的製備方法。
背景技術：
近年來，隨著人口老齡化及運動損傷的增多，器官和組織的缺損或衰竭是發生最為頻繁、最具破壞性和花費最為昂貴的問題。組織再生以及功能的恢復一直是困擾臨床的一個難題。
組織工程與再生醫學的發展為重建或修復人類病損組織和器官提供了有效的治療手段。其支架材料的涉及決定組織工程成敗的關鍵因素之一。支架材料的設計應最大限度仿生人體細胞外基質(ECM)結構與功能特點，才能有效解決材料的生物相容性問題。理想的支架材料不僅需要適度的力學為細胞生長提供三維支撐，還需有利於細胞在其表面粘附、增殖和遷移，促進機體再生與修復。因此，從結構和功能上仿生細胞外基質的理想組織工程支架具有廣闊的開發前景。絲蛋白是一種從家蠶、野蠶以及蜘蛛絲中提取的天然共聚物，其作為一種天然纖維蛋白，含有對人體極具營養價值的18種胺基酸，是一種天然活性蛋白，具有較低的免疫原性、良好的生物相容性，其本身及其降解產物對細胞和機體無毒，不會或較少引起炎症和免疫排斥反應。同時，野蠶絲中的柞蠶絲蛋白分子中含有特殊的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列。RGD序列作為細胞膜整合素受體與細胞外配體相結合的識別位點，介導細胞與細胞外基質及細胞之間的相互作用，能夠促進細胞對於支架的識別及粘附。絲素蛋白支架可以通過結合細胞或生長因子為修復受損的組織提供一個合適的微環境，充當臨時的組織替代支架材料。因此基於絲蛋白的生物支架材料在生物醫用組織領域有很好的應用前景。但由於天然蛋白質力學性能較差無法滿足組織功能的需要，所以限制了其在生物醫學領域中應用。
高分子聚合物由於良好機械性能，被廣泛用於組織工程和藥物釋放領域。但是其屬於合成高分子材料，不能為組織生長絲蛋白和高分子聚合物混紡可以結合二者的優點，既能使支架材料具有較高且符合神經組織的力學性能，又能為組織生長提供生物信號，促進細胞的粘附、增值和分化，從而滿足各種組織的需要。
氧化石墨烯是石墨烯的一種衍生物，微觀結構可以隨時在橫向尺寸上擴展到數十微米，其片層上含有很多含氧基團如羧基、羥基與環氧基等，具有兩親性。氧化石墨烯如同界面活性劑一般存在界面，降低了界面間的能量，在水中具有優越的分散性。特別地，氧化石墨烯的含氧活性基團化學特性不同，為與多種絲素蛋白之間的相互作用提供了大量的結合位點。同時也存在離子鍵和氫鍵等非共價鍵的結合作用。另外，氧化石墨烯具有優異的力學性能和良好的生物相容性，可用作生物複合材料的力學增強相，提高了生物支架材料的力學性能。目前，氧化石墨烯在組織工程方面研究主要集中在二維薄膜、納米片作為性能增強添加物以及採用化學氣相沉澱技術製備石墨烯三維泡沫。將氧化石墨烯製備基於塗層複合納米纖維組織工程支架材料的研究鮮有報導。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種物理化學性能優異，生物相容性好的複合納米纖維組織工程支架的製備方法。
為了達到上述目的，本發明提供一種基於氧化石墨烯複合納米纖維組織工程支架的製備方法，其特徵在於，包括：
步驟1：將絲素蛋白與高分子聚合物溶於溶劑中，攪拌至完全溶解，得到紡絲液；
步驟2：將步驟1得到的紡絲液進行靜電紡絲得到納米纖維膜，採用乙醇或其溶液進行燻蒸處理，乾燥得到絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維支架材料；
步驟3：將步驟2得到的絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維支架材料浸漬在氧化石墨烯分散液中，取出，乾燥得到複合納米纖維組織工程支架。
優選地，所述的氧化石墨烯分散液的製備方法包括：將氧化石墨烯水溶液進行超聲分散，真空過濾去除雜質，稀釋，得到氧化石墨烯分散液。
優選地，所述的步驟2中的乾燥為真空乾燥，時間為24—72h。
優選地，所述的步驟1中的絲素蛋白的製備方法包括：將絲素蛋白原料進行脫膠、溶解、透析處理後得到絲素蛋白溶液，進行冷凍乾燥，得到純淨絲素蛋白。
更優選地，所述的絲素蛋白原料為家蠶絲、野蠶絲、蜘蛛絲或者轉基因絲，其中野蠶絲為柞蠶絲。
優選地，所述的絲素蛋白與高分子聚合物的質量比為1∶99-99∶1。
優選地，所述的紡絲液的濃度為4-12％(質量體積比)。
優選地，所述的靜電紡絲的工藝參數為：調節電壓為8-15KV，噴絲頭和接受裝置之間的距離(接收距離)為6-15cm，紡絲速率為0.8-1.2ml/h。
優選地，所述的氧化石墨烯分散液的濃度為0.05-10mg/ml。
優選地，所述的步驟3中的浸漬時間為20min-12h。
優選地，所述的高分子聚合物為PCL、PLA、PGA、PLLA、P(LLA-CL)、PLGA、PEO、PEUU、PVA或PU中的至少一種。
本發明還提供了上述的複合納米纖維組織工程支架在製造血管、神經導管、骨組織、肌腱組織和皮膚中的應用。
本發明將絲素蛋白和和高分子聚合物共混採用靜電紡絲技術製備的複合納米纖維支架能最大限度的從結構和功能上仿生人體細胞外基質，另外，在其支架表面塗層氧化石墨烯不僅使複合納米支架材料具有較大比表面積，可以與絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維材料充分接觸，提高其機械性能，有利於界面應力的傳導，而且可以與絲素蛋白產生協同作用，提高複合納米纖維支架材料的生物活性。使其有望成為理想中的組織工程支架。在本發明作出之前，還沒有文獻和專利報導過有關氧化石墨烯塗覆絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維組織工程支架製備。本發明對於生物醫用材料及生物醫學領域神經組織工程領域具有重要的意義。
本發明以物理化學性能優異，生物相容性好的絲蛋白/高分子聚合物複合納米纖維為基體，通過物理靜電相互作用及氫鍵作用，氧化石墨烯在複合納米纖維基體上實現自組裝，在其表面形成片徑為50nm-200nm的片狀塗層，經過乾燥燻蒸等處理得到具有不同濃度的氧化石墨烯塗覆的絲素蛋白/高分子聚合物的組織工程支架。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：
(1)本發明的優點在於採用靜電紡絲技術製備出物理化學性能優異，生物相容性好的絲蛋白/高分子聚合物複合納米纖維支架，在其表面塗層不同濃度的氧化石墨烯既能使支架材料具有較高且符合組織的力學性能，又能為組織生長提供生物信號，促進細胞的粘附、增殖和分化。
(2)複合納米纖維支架材料和氧化石墨烯之間的接觸即發生自組裝，無需添加任何交聯劑和調節PH，操作簡單，重複性好。
(3)可通過調節氧化石墨烯濃度及浸漬時間、循環次數來控制組織工程支架的物理化學性能。製備的氧化石墨烯塗覆的複合納米纖維支架材料不僅沒有破壞掉原有的納米纖維結構，使其仍具有納米纖維支架材料高比表面積，孔隙率高等的優點，同時還同絲素蛋白產生協同作用，在原有的基礎上提高了支架材料的生物活性。使其在神經組織工程方面具有很好地應用前景；
(4)具有廣闊的應用前景：可以應用於多種組織修復：血管、神經導管、骨組織、肌腱組織、皮膚等
(5)本發明操作簡單，能夠實現工業化生產，原料安全可靠未使用到任何其他有害有毒的化學試劑，易實現工業化生產。
附圖說明
圖1為對比例1及實施例1-3中不同濃度的氧化石墨烯塗層柞蠶絲素蛋白/聚乳酸聚己內酯複合納米纖維支架光學圖片：(a)未塗層的複合納米纖維支架(b)塗層氧化石墨烯0.5mg/ml複合納米纖維支架，(c)塗層氧化石墨烯1.0mg/ml複合納米纖維支架，(d)塗層氧化石墨烯1.5mg/ml複合納米纖維支架；
圖2為對比例1及實施例1-4中不同濃度的氧化石墨烯塗層柞蠶絲素蛋白/聚乳酸聚己內酯複合納米纖維支架掃描電鏡圖片：(a)未塗層的複合納米纖維支架(b)塗層氧化石墨烯0.5mg/ml複合納米纖維支架，(c)塗層氧化石墨烯1.0mg/ml複合納米纖維支架，(d)塗層氧化石墨烯1.5mg/ml複合納米纖維支架(e)塗層氧化石墨烯2.0mg/ml複合納米纖維支架。
圖3為對比例1及實施例1-4不同濃度的氧化石墨烯塗層柞蠶絲素蛋白/聚乳酸聚己內酯複合納米纖維支架力學性能；
圖4為對比例1及實施例1-4不同濃度的氧化石墨烯塗層柞蠶絲素蛋白/聚乳酸聚己內酯複合納米纖維支架的拉曼光譜。(a)未塗層的複合納米纖維支架(b)塗層氧化石墨烯0.5mg/ml複合納米纖維支架，(c)塗層氧化石墨烯1.0mg/ml複合納米纖維支架，(d)塗層氧化石墨烯1.5mg/ml複合納米纖維支架(e)塗層氧化石墨烯2.0mg/ml複合納米纖維支架。
圖5為雪旺細胞(SCs)在對比例1及實施例1-4中所述的不同濃度的氧化石墨烯塗層柞蠶絲素蛋白/聚乳酸聚己內酯複合納米纖維支架生長粘附的掃描電鏡圖片。(a)未塗層的複合納米纖維支架(b)塗層氧化石墨烯0.5mg/ml複合納米纖維支架，(c)塗層氧化石墨烯1.0mg/ml複合納米纖維支架，(d)塗層氧化石墨烯1.5mg/ml複合納米纖維支架(e)塗層氧化石墨烯2.0mg/ml複合納米纖維支架。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
本發明各實施例中所用的高分子聚合物為聚乳酸-聚己內酯，其為市售產品，其分子量Mn為30萬，其中，乳酸單元和己內酯單元的摩爾比為50：50。
本發明各實施例中的氧化石墨烯水溶液為市售產品，濃度為2mg/ml。
對比例1
一種基於氧化石墨烯複合納米纖維組織工程支架的製備方法，具體步驟為：
1、將柞蠶絲在95～100℃環境下，置於含5g/L Na2CO3的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠後得到柞蠶絲素纖維，60℃烘乾。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置於飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍乾燥得到柞蠶絲素蛋白。
2、稱取絲素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶於5ml六氟異丙醇中，以一定的速率磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為10％(w/v)的紡絲液，進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏5x5cm2接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓12千伏，接收距離8cm，紡絲速率1.2ml/h，大約4h後鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下後放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下進行燻蒸處理24h進行交聯，處理完畢後在溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空乾燥48h，去除殘留溶劑，得到絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維支架材料。
3、將得到的複合納米纖維支架浸漬在純水中3min，循環浸漬5次，用pH為7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗數次，取出，最後乾燥得到複合納米纖維組織工程支架。
實施例1
一種基於氧化石墨烯複合納米纖維組織工程支架的製備方法，具體步驟為：
1、將柞蠶絲在95～100℃環境下，置於含5g/L Na2CO3的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠後得到柞蠶絲素纖維，60℃烘乾。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置於飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍乾燥得到柞蠶絲素蛋白。
2、稱取絲素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶於5ml六氟異丙醇中，以一定的速率磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為10％(w/v)的紡絲液。進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏5x5cm2接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓12千伏；接收距離8em，紡絲速率1.2ml/h，大約4h後鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下後放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下進行燻蒸處理24h進行交聯，處理完畢後在溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空乾燥48h，去除殘留溶劑，得到絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維支架材料。
3、將氧化石墨烯水溶液進行超聲分散，真空過濾去除雜質，稀釋為0.5mg/ml，得到氧化石墨烯分散液；將得到的複合納米纖維支架浸漬在氧化石墨烯分散液中30min，循環浸漬5次，用pH為7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗數次，取出，最後乾燥得到複合納米纖維組織工程支架，其光學圖片如圖1所示，掃描電鏡圖片如圖2所示。
實施例2
一種基於氧化石墨烯複合納米纖維組織工程支架的製備方法，具體步驟為：
1、將柞蠶絲在95～100℃環境下，置於含5g/LNa2CO3的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠後得到柞蠶絲素纖維，60℃烘乾。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置於飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍乾燥得到柞蠶絲素蛋白。
2、稱取絲素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶於5ml六氟異丙醇中，以一定的速率磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為10％(w/v)的紡絲液。進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏5x5cm2接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓12千伏；接收距離8cm，紡絲速率1.2ml/h，大約4h後鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下後放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下進行燻蒸處理24h進行交聯，處理完畢後在溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空乾燥48h，去除殘留溶劑，得到絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維支架材料。
3、將氧化石墨烯水溶液進行超聲分散，真空過濾去除雜質，稀釋為1.0mg/ml，得到氧化石墨烯分散液；將得到的複合納米纖維支架浸漬在氧化石墨烯分散液中30min，循環浸漬5次。用pH為7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗數次，取出，最後乾燥得到複合納米纖維組織工程支架，其光學圖片如圖1所示，掃描電鏡圖片如圖2所示。
實施例3
一種基於氧化石墨烯複合納米纖維組織工程支架的製備方法，具體步驟為：
1、將柞蠶絲在95～100℃環境下，置於含5g/L Na2CO3的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠後得到柞蠶絲素纖維，60℃烘乾。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置於飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍乾燥得到柞蠶絲素蛋白。
2、稱取絲素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶於5ml六氟異丙醇中，以一定的速率磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為10％(w/v)的紡絲液。進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏5x5cm2接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓12千伏；接收距離8cm，紡絲速率1.2ml/h，大約4h後鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下後放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下進行燻蒸處理24h進行交聯，處理完畢後在溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空乾燥48h，去除殘留溶劑，得到絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維支架材料。
3、將所得的氧化石墨烯水溶液進行超聲分散，真空過濾去除雜質，稀釋為1.5mg/ml，得到氧化石墨烯分散液；將得到的複合納米纖維支架浸漬在氧化石墨烯分散液中30min，循環浸漬5次，用pH為7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗數次，取出，最後乾燥得到複合納米纖維組織工程支架，其光學圖片如圖1所示，掃描電鏡圖片如圖2所示。
實施例4
一種基於氧化石墨烯複合納米纖維組織工程支架的製備方法，具體步驟為：
1、將柞蠶絲在95～100℃環境下，置於含5g/L Na2CO3的溶液中脫膠3次，每次30min，浴比1∶50。脫膠後得到柞蠶絲素纖維，60℃烘乾。將柞蠶絲素纖維按浴比1∶10置於飽和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，獲得的柞蠶絲素蛋白溶液裝入截留分子質量為8-10KDa的透析袋中，用去離子水透析3d，經冷凍乾燥得到柞蠶絲素蛋白。
2、稱取絲素蛋白0.125g，高分子聚合物0.375g，溶於5ml六氟異丙醇中，以一定的速率磁力攪拌至完全溶解，得到濃度為10％(w/v)的紡絲液。進行靜電紡絲，用鋁箔平整包纏5x5cm2接收板接收納米纖維，紡絲條件：電壓12千伏；接收距離8cm，紡絲速率1.2ml/h，大約4h後鋁箔上接收到一定厚度的納米纖維膜。取下後放入密閉容器內，用體積分數75％的乙醇在溫度為25℃、標準大氣壓的條件下進行燻蒸處理24h進行交聯，處理完畢後在溫度為25℃、真空度為-30KPa的條件下真空乾燥48h，去除殘留溶劑。得到絲素蛋白/高分子聚合物複合納米纖維支架材料
3、將氧化石墨烯水溶液進行超聲分散，真空過濾去除雜質，稀釋為2.0mg/ml，得到氧化石墨烯分散液；將得到的複合納米纖維支架浸漬在氧化石墨烯分散液中30min，循環浸漬5次，用pH為7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗數次，取出，最後乾燥得到複合納米纖維組織工程支架。
對比例1及實施例1-3所述的氧化石墨烯塗層的納米纖維支架其光學圖片如圖1所示，其結果顯示未塗層氧化石墨烯的支架材料為白色，塗層氧化石墨烯支架材料為棕色，其表明氧化石墨烯已存在於納米纖維支架材料上。
對比例1及實施例1-4所述的氧化石墨烯塗層的納米纖維支架其掃描電鏡圖片如圖2所示。其結果表明塗層氧化石墨烯的支架纖維平整光滑，含有氧化石墨烯支架纖維表面粗糙有片層覆蓋，其結果顯示氧化石墨烯已塗層到納米纖維支架材料上且不會破壞納米纖維的結構。
對比例1及實施例1-4所述的氧化石墨烯塗層的納米纖維支架力學性能如圖3所示，將其支架材料剪成3cm x1cm的矩形樣品在拉力拉伸測試儀上進行檢測，其結果顯示塗層氧化石墨烯後複合納米纖維支架的力學性能明顯優於未塗層的納米複合纖維支架，斷裂伸長率和斷裂強度都有所提高。
對比例1及實施例1-4所述的氧化石墨烯塗層的納米纖維支架拉曼光譜譜圖如圖4所示，將不同樣品採用拉曼光譜分析儀測試，其結果顯示塗層的氧化石墨烯支架D峰與G峰氧化石墨烯的比值小於1，表明氧化石墨烯已塗層到納米纖維支架材料上。
對比例1及實施例1-4所述的雪旺細胞(SCs)在不同濃度的氧化石墨烯塗層柞蠶絲素蛋白/聚乳酸聚己內酯複合納米纖維支架生長粘附的掃描電鏡圖片如圖5所示，將不同樣品進行滅菌處理用於雪旺細胞的培養，具體為利用24孔打孔器進行各樣品的準備，將個樣品置於24孔培養板中，以蓋玻片作為對照樣，將各板置於體積分數為75％的酒精蒸汽缸中進行滅菌處理2h後置於超淨工作檯備用，利用PBS依次清洗支架以及空白培養板3次，以此除去未揮發的酒精蒸汽。雪旺細胞的種植密度為每孔1×104個，再將配好的DMEM培養基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％雙抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO2的培養箱內孵育，以上操作步驟均在超淨臺內完成。進行酒精脫水處理，用於電鏡的拍攝，其結果表明塗層氧化石墨烯的支架材料與未塗層的納米纖維支架材料更有利於細胞生長粘附。