一種檢測乳腺癌her2基因表達量的方法及其試劑盒的製作方法
2024-01-19 14:33:15 2
專利名稱：一種檢測乳腺癌her2基因表達量的方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫學領域，涉及一種用於檢測乳腺癌HER2基因表達量的方法及其試劑盒。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是威脅女性健康的「頭號殺手」。隨著人們生活方式的改變，乳腺癌的發病率也呈逐年遞增之勢。每年全球約有140萬女性罹患乳腺癌，更有40萬女性死於乳腺癌。根據美國癌症協會2012發布的美國癌症統計預期數據來看，乳腺癌高居女性惡性腫瘤發病率第一位，佔所有新發女性惡性腫瘤的29%。在我國，近年來乳腺癌發病率也呈逐年遞增的趨勢。從1982年到2001年，女性乳腺癌發病率增加了 91%。近期北京、上海、天津等大城市的統計數據顯示，乳腺癌已成為我國女性最常見的惡性腫瘤，且發病率呈逐年上升趨勢，每年新增打3% -4%，超過世界水平1-2%，每年有20餘萬婦女患乳腺癌，發病率為女性易患腫瘤第一位。目前，乳腺癌的預警和早期診斷技術主要有以下幾種第一種為定期接受臨床體格檢查，但是乳腺癌的普查耗資較大，成本高，在我國乳腺癌的早期發現主要著眼於自我檢查，當患者發現腫塊而就診時，常常為時已晚；第二種為影像學診斷法，以鑰靶X射線攝片為主要手段，以超聲波掃描和MRI掃描為輔助，一般可檢測表現為腫瘤病變的微小鈣化，但是對於不典型的病變，如緻密型乳腺內的病變及近胸壁的病變易發生漏診，且對檢測儀器的要求高，耗時，費用高；第三種為生物靶標早期檢測，如乳腺癌相關基因的突變分析，血清中腫瘤標誌物的測定，由於基因的突變或異常表達通常早於病變的發生，可實現早期預警，且檢測方法簡單，快速，價格較低。因此，發展生物靶標檢測，尋找新的乳腺癌檢測靶標作為臨床檢測且簡單實用的技術對於乳腺癌患者提前預警及採用有效的治療手段意義重大。HER2基因(人表皮生長因子受體2基因)又稱neu或c_rbB_2基因，是一種原癌基因，位於17號染色體長臂上，編碼185KD跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶活性，屬於人類表皮生長因子受體(EGFR)家族。研究表明，HER2在20% -30%的原發性乳腺浸潤性導管癌中有基因的擴增和蛋白的過度表達。乳腺腫瘤患者J1ER2陽性意味著乳腺腫瘤細胞表面的HER2蛋白數量增多，過度傳遞信號，刺激癌細胞瘋狂增殖。J1ER2陽性的患者同其他乳腺癌病人相t匕，腫瘤惡性程度更高，進展更快，更容易復發和遠處轉移，且此類病人通常對內分泌治療不敏感，預後較差。因此，精確檢測HER2的表達對於乳腺癌的早期診斷、預後及個性化治療等方面具有重要的意義。量子點(Quantum dots, DQs)是一類大小在l-lOnm,半徑小於或接近於激子玻爾半徑的新型半導體納米晶體，作為一種應用於生物醫學領域的新型納米螢光材料探針，能克服傳統有機螢光染料的不足，具有激發光譜窄、連續，檢測靈敏度高，抗漂白能力強，螢光強度高而穩定，生物相容性好，不易受組織自發螢光幹擾等優點。現有技術中採用的量子點檢測方法一般為用量子點直接與抗體結合製作成探針，實現多抗原同時標記，此方法成本較高，探針保存時間短，需對量子點進行標記，不適合常規臨床檢測。
發明內容
本發明的目的在於提供一種檢測乳腺癌HER2基因表達量的方法及其試劑盒，實現對HER2基因表達量經濟、快速、靈敏的檢測。為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施一種檢測乳腺癌HER2基因表達量的量子點免疫螢光試劑盒，所述的試劑盒中包括(I)抗體稀釋緩衝液；(2)孵育緩衝液；(3)聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的溶液； (4)無鎘量子點的水溶液；所述的抗體稀釋緩衝液為磷酸與NaCl混合配置的磷酸-NaCl緩衝液；所述的孵育緩衝液為磷酸、NaCl和胎牛血清混合配置的磷酸-NaCl-胎牛血清溶液。優選地，所述的無鎘量子點為ZnSe/ZnS核/殼量子點，激發波長為365nm。優選地，所述的抗體稀釋緩衝液中磷酸與NaCl的摩爾比為I : I。優選地，所述的抗體稀釋緩衝液中磷酸與NaCl的濃度相同，且為0. 0. 1-0. 03mol/L0優選地，所述的孵育緩衝液含有5% -20%的胎牛血清。優選地，所述的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液濃度為I X IO-6Hiol/L-2Xl(T6mol/L。本發明還提供了一種用所述的試劑盒檢測乳腺癌HER2基因表達量方法，具體步驟如下(I)用抗體稀釋緩衝液稀釋聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的溶液；(2)將待測細胞加入步驟(I)得到的溶液中，再加入孵育緩衝液，室溫條件下聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體與待測細胞表面的HER2基因表達蛋白發生特異性的結合反應，將特異性結合反應完畢的溶液低速離心，離心後收集上清液；(3)將步驟(2)所得上清液加入無鎘量子點的水溶液中，在365nm下觀察無鎘量子點螢光，並用螢光光譜儀測定無鎘量子點螢光強度或在620-650nm下觀察聯吡啶釕螢光，並用螢光光譜儀測定聯吡啶釕螢光強度。優選地，所述的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體與所述的無鎘量子點摩爾比為I 20-1 7.5。優選地，步驟⑵中特異性的結合反應的時間為30_60min。優選地，步驟(2)中低速離心的離心力為500_800g。本發明的有益效果在於，第一，本發明中使用的量子點為無鎘量子點，減少了對環境的汙染；第二，本發明無需對量子點進行修飾，簡化了操作步驟；第三，本發明的檢測方法及試劑盒實現了對乳腺癌HER2基因表達量的檢測，靈敏度好，精確度高。
圖I是乳腺癌HER2基因表達量檢測方法流程圖。圖2是實施例I中HER2基因表達量無鎘量子點螢光圖。圖3是實施例2中HER2基因表達量聯吡啶釕螢光圖。圖4是實施例3中HER2基因表達量無鎘量子點螢光圖。圖5是實施例3中HER2基因表達量無鎘量子點螢光強度變化圖。圖6是實施例3中細胞數量與無鎘量子點螢光強度線性圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。本發明提供的乳腺癌HER2基因表達量檢測方法步驟如下，流程圖見圖I :(I)用抗體稀釋緩衝液稀釋聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的溶液；(2)將待測細胞和孵育緩衝液加入到(I)所得溶液，聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體與待測細胞表面的J1ER2基因表達蛋白發生特異性的結合反應，將特異性結合反應完畢的溶液低速離心，離心後收集上清液；形成抗原抗體結合物，HER基因表達蛋白位於細胞表面，抗體被結合到了細胞表面，結合了抗體的細胞的粒徑和質量均比HER2單克隆抗體大，用離心的方法可將二者分離，低速離心時，結合了抗體的細胞會形成沉澱，沒有與HER2基因表達蛋白結合的單克隆抗體不會沉澱；(3)將(2)所得上清液加入無鎘量子點的水溶液中，在365nm下觀察無鎘量子點螢光，並用螢光光譜儀測定無鎘量子點螢光強度或在620-650nm下觀察聯吡啶釕螢光，並用螢光光譜儀測定聯吡啶釕螢光強度；聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體與無鎘量子點共同存在時，由於無鎘量子點與聯吡啶釕之間發生光誘導電子轉移，無鎘量子點與聯吡啶釕形成絡合物，形成絡合物的無鎘量子點的螢光發生淬滅，而聯吡啶釕的紅色螢光不受影響，因此，聯吡啶釕標記的J1ER2單克隆抗體存在時，無鎘量子點的螢光強度減弱，聯吡啶釕標記的J1ER2單克隆抗體與無鎘量子點比例關係決定了無鎘量子點螢光的信號強度；HER2基因表達量越多，結合的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體越多，離心後上清液中的聯吡啶釕標記的J1ER2單克隆抗體越少，發生螢光淬滅的無鎘量子點就越少，無鎘量子點螢光強度越大，聯吡啶釕的螢光強度就越小，兩種螢光均可表徵J1ER2基因表達量。下面結合附圖與實施例對本發明進行進一步闡述。實施例I一、所述的試劑盒中包括(I)抗體稀釋緩衝液磷酸與NaCl的混合溶液，其中磷酸和NaCl的濃度均為0.01mol/L ；(2)孵育緩衝液磷酸、NaCl、胎牛血清配置的混合溶液，磷酸、NaCl的濃度為0. Olmol/L，胎牛血清濃度為5% ；(3)聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的溶液濃度為I X 10_6mOl/L ；(4) ZnSe/ZnS核/殼量子點的水溶液濃度為2. 0 X 10_6mol/L ；
二、所述的試劑盒的製備I、聯吡啶釕標記HER2單克隆抗體的製備將50 ii g的HER2單克隆抗體乾粉溶解在500 U L的磷酸鹽緩衝溶液中(pH = 8.0),加入NHS(N-Hydroxysuccinimide, N-輕基琥拍醯亞胺)活化的聯卩比唳釕固體粉末Img,室溫條件下結合反應lh，然後用將結合反應後的溶液轉移至50KD的超濾離心管，在離心力為8000g下離心IOmin,收集離心後上清液,即得到連卩比唳釕標記的抗體溶液。2、ZnSe/ZnS核/殼量子點的製備50mL 超純水中，依次加入 148mg(0. 5mmol) Zn (NO3) 2 *6H20, 276mg (0. 9mmol)GSH(穀胱甘肽)，9mg (0. 05mmol) Na2SeO3,0. 2g 的 NaBH4 (過量)，室溫下攪拌 15min,調節 pH = 9. 5，在120°C油浴條件下混合反應70min，即得到ZnSe/ZnS核/殼量 子點水溶液。三、試劑盒的應用用一中的試劑盒對人乳腺導管癌細胞進行檢測(I)用抗體稀釋緩衝液稀釋聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液，使聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的濃度為4. OX 10_7mOl/L ;用超純水稀釋ZnSe/ZnS核/殼量子點水溶液，使ZnSe/ZnS核/殼量子點的濃度為2. 0 X 10_8mol/L ；(2)將細胞密度為4. 0 X IO7個/mL的人乳腺導管癌細胞培養液500 y L (細胞數量為20000)與200 ii L濃度為4. 0 X 10^7mol/L的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液混合，再加入IOOu L孵育緩衝液，室溫下放置30min，發生抗原抗體特異性結合反應，再用500g離心力低速離心，使抗原抗體結合物沉澱；(3)將步驟(2)中的上清液與200 u L濃度為2. 0 X 10_8mol/L的ZnSe/ZnS核/殼量子點溶液混合，於365nm下觀察藍色螢光，在620nm下觀察紅色螢光，並用螢光儀於365nm下測量ZnSe/ZnS核/殼量子的螢光強度，在620nm下測量聯吡啶釕的螢光強度。將800 u L超純水與200 u L濃度為2. OX 10_8mol/L的ZnSe/ZnS核/殼量子點溶液混合作為對照。檢測結果如圖2所示，對照與人乳腺導管癌細胞的ZnSe/ZnS核/殼量子點螢光值相當，20000個乳腺導管癌細胞已經接近了試劑盒測量的上限值，20000個乳腺導管癌細胞中HER2基因的表達量高，此時無法觀察到紅色螢光，紅色螢光信號強度也處於無法檢測。實施例2一、所述的試劑盒中包括(I)抗體稀釋緩衝液磷酸與NaCl的混合溶液，其中磷酸和NaCl的濃度均為0.02mol/L ；(2)孵育緩衝液磷酸、NaCl、胎牛血清配置的混合溶液，磷酸、NaCl的濃度為0. 02mol/L，胎牛血清濃度為10% ；(3)聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液濃度為I X 10_6mOl/L ；(4) ZnSe/ZnS核/殼量子點水溶液濃度為I. 0 X 10_6mol/L ；二、試劑盒的應用用一中的試劑盒對人乳腺癌細胞和人胚腎細胞進行檢測(I)用抗體稀釋緩衝液稀釋聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的溶液，使聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的濃度為6. OX KTmol/L ;用超純水稀釋ZnSe/ZnS核/殼量子點的水溶液，使ZnSe/ZnS核/殼量子點的濃度為5. 0 X 10_8mol/L ；
(2)第一組將細胞密度為4. 0 X IO7個/mL的人乳腺癌細胞培養液500 y L (細胞數量為20000)與200 ii L濃度為6. OX KTmol/L的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液混合，再加入100 U L孵育緩衝液，室溫下放置30min，發生抗原抗體特異性結合反應，再用500g離心力低速離心，使抗原抗體結合物沉澱； 第二組將細胞密度為4. 0 X IO7個/mL的人胚腎細胞培養液500 y L (細胞數量為20000)與200 ii L濃度為6. OX 10_7mOl/L的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液混合，再加入IOOy L孵育緩衝液，室溫下放置45min，發生抗原抗體特異性結合反應，再用800g離心力低速離心，使抗原抗體結合物沉澱；(3)將步驟⑵中的第一組上清液和第二組上清液分別與200ii L濃度為
5.OX 10_8mol/L的ZnSe/ZnS核/殼量子點溶液混合，在620nm下觀察紅色螢光，並用螢光儀於620nm下測量聯吡啶釕的螢光強度。將800 u L超純水與200 u L濃度為2. 0X 10_8mol/L 的ZnSe/ZnS核/殼量子點溶液混合作為對照。結果如圖3所示，人胚腎細胞的紅色螢光強度大於乳腺癌細胞的紅色螢光強度，乳腺癌細胞J1ER2基因的表達量高於人胚腎細胞HER2基因的表達量，對照組紅色螢光無法檢測。實施例3一、所述的試劑盒中包括(I)抗體稀釋緩衝液磷酸與NaCl的混合溶液，其中磷酸和NaCl的濃度均為0.03mol/L ；(2)孵育緩衝液磷酸、NaCl、胎牛血清配置的混合溶液，磷酸、NaCl的濃度為0. 03mol/L，胎牛血清濃度為20% ；(3)聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液濃度為2X 10_6mOl/L ；(4) ZnSe/ZnS核/殼量子點水溶液濃度為2. 0 X 10_6mol/L ；二、試劑盒的應用用一中的試劑盒對不同密度的BT474細胞進行檢測(I)用抗體稀釋緩衝液稀釋聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液，使聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的濃度為6. OX 10_7mOl/L ;用超純水稀釋ZnSe/ZnS核/殼量子點水溶液，使ZnSe/ZnS核/殼量子點的濃度為8. 0 X 10_8mol/L ；(2)按照表I的密度將1-14組的BT474細胞培養液500 ii L與200 ii L濃度為
6.OX KTmol/L的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液混合，再加入100 u L孵育緩衝液，室溫下放置60min，發生抗原抗體特異性結合反應，再用600g離心力低速離心，使抗原抗體結合物沉澱；表1BT474細胞密度梯度
權利要求
1.一種檢測乳腺癌J1ER2基因表達量的量子點免疫螢光試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒包括 (1)抗體稀釋緩衝液； (2)孵育緩衝液； (3)聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的溶液； (4)無鎘量子點的水溶液； 所述的抗體稀釋緩衝液為磷酸-NaCl緩衝液； 所述的孵育緩衝液為磷酸-NaCl-胎牛血清緩衝液。
2.根據權利要求I所述的檢測乳腺癌HER2基因表達量的量子點免疫螢光試劑盒，其特徵在於，所述的無鎘量子點為ZnSe/ZnS核/殼量子點。
3.根據權利要求I所述的檢測乳腺癌HER2基因表達量的量子點免疫螢光試劑盒，其特徵在於，所述的抗體稀釋緩衝液中磷酸與NaCl的摩爾比為I : I。
4.根據權利要求3所述的檢測乳腺癌HER2基因表達量的量子點免疫螢光試劑盒，其特徵在於，所述的抗體稀釋緩衝液中磷酸與NaCl的濃度相同，且為0. 01-0. 03mol/L。
5.根據權利要求I所述的檢測乳腺癌HER2基因表達量的量子點免疫螢光試劑盒，其特徵在於，所述的孵育緩衝液含有5% -20%的胎牛血清。
6.根據權利要求I所述的檢測乳腺癌HER2基因表達量的量子點免疫螢光試劑盒，其特徵在於，所述的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體溶液濃度為I X 10_6mOl/L-2X 10_6mOl/L。
7.一種用權利要求I所述的試劑盒檢測乳腺癌HER2基因表達量的方法，其特徵在於，具體步驟如下 (1)用抗體稀釋緩衝液稀釋聯吡啶釕標記的J1ER2單克隆抗體的溶液； (2)將待測細胞加入步驟(I)得到的溶液中，再加入孵育緩衝液，室溫條件下聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體與待測細胞表面的HER2基因表達蛋白發生特異性的結合反應，將特異性結合反應完畢的溶液低速離心，離心後收集上清液； (3)將步驟(2)所得上清液加入無鎘量子點的水溶液中，觀察無鎘量子點螢光，並用螢光光譜儀測定無鎘量子點螢光強度或觀察聯吡啶釕螢光，並用螢光光譜儀測定聯吡啶釕螢光強度。
8.根據權利要求7所述的試劑盒使用方法，其特徵在於，所述的聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體與所述的無鎘量子點摩爾比為I : 20-1 7.5。
9.根據權利要求7所述的試劑盒使用方法，其特徵在於，步驟(2)中特異性的結合反應的時間為30-60min。
10.根據權利要求7所述的試劑盒使用方法，其特徵在於，步驟(2)中低速離心的離心力為 500_800g。
全文摘要
本發明公開了一種檢測乳腺癌HER2基因表達量的方法及其檢測試劑盒。本發明所提供的試劑盒包括(1)抗體稀釋緩衝液，(2)孵育緩衝液，(3)聯吡啶釕標記的HER2單克隆抗體的溶液，(4)無鎘量子點的水溶液。所述的抗體稀釋緩衝液為磷酸與NaCl混合配置的磷酸-NaCl緩衝液；所述的孵育緩衝液為所述的抗體稀釋緩衝液與胎牛血清混合。實驗證明，本發明的檢測乳腺癌HER2基因表達量的方法操作簡單，靈敏度高，精確度好。
文檔編號G01N33/68GK102798724SQ201210279149
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年8月7日
發明者蔡林濤, 盛宗海, 胡德紅, 龔萍, 張鵬飛, 高篤陽 申請人:深圳先進技術研究院