水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的分子標記方法

2024-02-26 11:51:15 3

專利名稱：水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的分子標記方法
技術領域：
本發明涉及水稻條紋葉枯病抗性基因^v6-z'的分子標記方法，屬於農業生物工程技術領域，專用於水稻條紋葉枯病抗性品種的選育和純度鑑定。二、 背景技術水稻條紋葉枯病是由條紋葉枯病毒(Rice Stripe Virus, RSV)引起的病毒病，其傳毒介 體主要是灰飛蝨(丄aocfe/;7/2ax Wn'^e//^ Fallen.)。該病於1897年最早發生在日本關東的群 馬、櫪木等地區，而我國最早發生該病是在1964年。近幾年，隨著氣候環境和種植結構 調整，水稻條紋葉枯病發病規模有著不斷擴大的趨勢。江蘇自1964 1965年首次發生以 來，就一直在蘇南地區存在，個別年份危害較重。1998年以後，條紋葉枯病在江蘇省的 發生呈猛烈上升趨勢，2000年首次在蘇北地區暴發，至2007年己連續8年在江蘇省範圍 內流行且受災面積均在千萬畝以上，成為影響江蘇粳稻生產的頭號殺手(王才林，江蘇農 業科學，2006， (3): 1-5)。儘管早在本世紀60年代，日本水稻遺傳學家就對水稻條紋葉枯病抗性資源進行了大 量篩選、鑑定以及遺傳分析工作，但迄今仍只有兩種主要的病毒抗性基因的遺傳機制被闡 明。 一種以日本陸稻品種為代表，抗性由兩對顯性互補基因SA;fl(S/W)和SA^(^v2)共同控 制；另一種以一些非日本秈稻品種為代表，抗性由一對不完全顯性基因5h^/(5h;3)控制(陳 濤等，江蘇農業科學，2006， (2): 1-4)。隨著分子標記技術的發展，對由主基因和微效 多基因結合控制的遺傳以及微效多基因控制的遺傳進行分析已經成為可能。到目前為止， 利用不同的遺傳群體已初步定位了 27個27Z"孫黛珍等，中國農學通報，2006， 22(12): 318-321)，但這些G7Xs中如果除去上述主要的三個位點外，其它位點的效應值均不太大， 很難在實際生產中得到應用。分析國內外目前育成的抗條紋葉枯病栽培粳稻系譜，發現其抗性基因最初來源於兩個 秈稻品種Modan和Mudgo，進一步研究證實這兩個抗性品種的抗性基因均為S/v6々，所 以選育含》v6-/抗性基因的水稻品種是控制水稻條紋葉枯病危害最經濟、有效的方法。 對已研究清楚的抗性基因加以有效利用，可以縮短育種周期，滿足國內目前對抗條紋葉枯 病優質水稻品種的迫切需要。然而，利用傳統的田間或室內接蟲鑑定的方法對5^6-/基因 進行後代追蹤不漢耗時耗力，而且存在諸多不確定因素，利用分子標記輔助選擇方法可以 有效的解決這一難題。Hayano-Saito Y(Hayano-Saito Y， "7Tzeor々7/7/ 2000， 101(1):59-63)利用/ ^IP或C4屍s標記已將抗性基因限定在第11染色體兩個克隆序列重 疊的約286Kb的區域內。然而，這些標記的信息尚未公開，難以用於輔助選擇育種，因此篩選與緊密連鎖的SSR標記，無疑可以加速標記輔助選擇技術在條紋葉枯病抗 性品種選育過程中的利用。三、 發明內容技術問題本發明是針對上述情況，利用分子生物學和生物信息學的方法以含Srv6-/基 因的日本水稻品種關東194為材料，篩選和尋找穩定存在的與水稻條紋葉枯病抗性基因 ■S/vZm'緊密連鎖的SSR分子標記，並用於輔助育種。技術方案水稻條紋葉枯病抗性基因5h^/的分子標記方法，其特徵在於用顯性SSR標記RMll-8引物正向序列為TAGCCATGCTCATGCGTCAT反向序列為CGCGGT丁TGCAGTAGTTGC擴增水稻條紋葉枯病抗性品種或育種材料DNA,如果能夠擴增出157bp的單一條帶，則 表明抗條紋葉枯病基因存在，該基因位於水稻第11染色體上。有益效果水稻條紋葉枯病是影響粳稻生產的一種嚴重病毒病害。本發明利用分子生物學 和生物信息學的方法篩選到一個與水稻條紋葉枯病抗性基因5^6-/緊密連鎖的SSR標記， 該標記的應用可以加速條紋葉枯病抗性品種選育。其優點具體歸納如下(1) 與一些效應較小且受環境影響較大的水稻條紋葉枯病抗性位點(g7Ii)相比， 5h^-Z以其穩定、過硬的抗性以及主效、簡單的遺傳方式而被廣泛應用傳統育種。對5h^" 基因進行分子標記輔助選擇，可以快速培育出大量抗性穩定的水稻品系或品種。(2) 傳統育種是利用含抗性基因的親本與生產上常用的品種進行一系列雜交，然後對 條紋葉枯病抗性進行單株選擇。由於該病的抗性受環境條件的影響很大，表型鑑定結果的 可靠性偏低，因此通過田間抗性鑑定或室內接蟲鑑定來判斷條紋葉枯病抗性基因型，不僅 費時費力，而且難度大，成本高。通過對其抗性基因緊密連鎖標記的帶型檢測，可預測其 抗性基因型，進而在苗期即可鑑定高抗單株，這樣不僅節約鑑定費用，而且大大提高抗條 紋葉枯病水稻品種的選擇效率。(3) 本發明獲得的與條紋葉枯病抗性基因S v6"緊密連鎖的SSR標記，其檢測快速、 簡單，結果穩定、可靠，適合在短時間內的對大量育種材料進行標記基因型的檢測，以判 斷其是否具有水稻條紋葉枯病抗性，並進行篩選。四

圖1水稻條紋葉枯病抗性品種"關東194"的系譜 .圖2開發水稻條紋葉枯病抗性輔助選擇標記所涉及的染色體片段圖3 SSR引物RM1卜8對田間抗、感小區的篩選電泳圖譜(a) RMU-8對田間抗病小區的篩選(PR:關東194; PS:武粳3; Fl:武粳13/關東194; 1~8: 田間抗性和分子鑑定一致單株；9~10:田間抗性和分子鑑定不一致單株)(b)RMll-8對田間感病小區的篩選(PR:關東194; PS:武粳13; Fl:武粳13/關東194; 1~9-田間抗性和分子鑑定一致單株；10:田間抗性和分子鑑定不一致單株) 圖4 SSR標記RM11-8對39個條紋葉枯病抗性品系的電泳篩選圖譜(PR:關東94; PS:武粳13: F,:武粳13 /關東194; 1~8:田間抗性和分子鑑定一致的品 系-,9~10:田間抗性和分子鑑定不一致的品系)五具體實施方式
(結合附圖具體說明)(1)材料抗病品種關東194:抗條紋葉枯病的優質粳稻品種(日本引進，含"Modan"的5^6-/ 抗性基因，圖l)，日本茨城縣育成，2003年農林水產省登錄，登錄名為農林387號。抗 條紋葉枯病，基因型為SA^-!'Sfv6-!'，該品種全生育期130-135天，株高85 95cm，每株有 效穗6 8個，每穗實粒數95 105粒，結實率93%~95%，千粒重24~25g。感病品種武粳3:江蘇高產粳稻品種，江蘇省武進區稻麥育種場育成，2003年審定 定名。條紋葉枯病抗性基因型為^v6-/^v6-/。該品種全生育期156天，株高97 102cm， 每株有效穗8 10個，每穗實粒數115-125粒，結實率92%~93%，千粒重27 28g。 由抗、感組合武粳13/關東194產生的高世代抗病和感病小區。 1999年在海南選用江蘇高產粳稻品種武粳13 (武育5021)(感病親本，條紋葉枯病 抗性基因型為^v6AA;Zm')為母本(？)與引進的抗條紋葉枯病的優質粳稻品種關東194 (抗性親本，基因型為5h^/S/v6-!')為父本(3)雜交配組。2000年在南京種植F,組合， 同年冬在海南種植F2，成熟後全部單株混收，2001年在南京種植F3，成熟後全部單株混 收。F2代選單株衍生F3小區，以後每個小區繼續收穫一個單株加代衍生成相應小區。2002 年(F4)開始選擇單株，此後(2003-2005年)每年在南京種植各世代(F5 ~F7)株系。 單株選擇材料每年正季種植於江蘇省農業科學院糧食作物研究所試驗田(南京)，5月 15~18日播種，秧田設置在灰飛蝨蟲源豐富的小麥田邊。6月15~18日移栽。每個株系種 植40 50株，2行或4行區，行株距17cmxl7cm,小區間空1行。田間管理按常規方法 進行，秧田期和移栽後30天內不防治灰飛蝨。(2)與S v6-i緊密連鎖SSR標記的選取、開發及多態性篩選利用Hayano-Saito Y (Hayano-Saito Y，" a/. 7T7ew^;^/1998,96(8): 1044-1049)對水稻條紋葉枯病抗性基因5^6-/的定位結果，並結合日本水稻基因組網站 (www.rpg.dna.affic.go.jp/IRGSP)已公布的第11染色體整合圖譜的數據，發現在目標基因 上方3.0cM處的一個WFLP標記C1172 (第II染色體一80.2cM)在整合圖譜中同樣存在， 從該標記向下到另一個/ /^XP標記E1126S (第11染色體一84.3 cM)共4.1 cM的區段內查 找到10個克隆序列(圖2)。利用己公布的微衛星標記並用SSR搜索軟體-SSR HUNTER 2.0 對10個克隆序列中可能存在的SSR位點進行查詢、篩選，並設計、合成了 13對SSR引物。利用上述13對引物在抗性親本關東194和感病親本武粳13間進行多態性篩選，結果 只有一對引物RM11-8 (表1)在抗性親本和感病親本組合中呈現多態性，多態頻率極小 (7.69%)，這可能是抗、感親本均為粳稻，遺傳差異較小的緣故。RMU-8的帶型為顯性， 其？1的帶型與感病親本一致。表l在兩個親本間表現多態的SSR標記RM11-8標己正向序列(5' — 3')反向序列(5' — 3')所在克隆 退火，片段大小RM1卜8TAGCCATGCTCATGCGTCATCGCGGTTTGCAGTAGTTGCSJNBa0038B22 59'C 157bp(3)田間鑑定從2004年正季農藝性狀基本穩定時開始對這些小區的水稻條紋葉枯病抗性進行大田 鑑定。移栽30天後調査條紋葉枯病的自然發病情況，以感條紋葉枯病品種武育粳3號為 對照，利用條紋葉枯病大發生的自然條件進行抗性篩選，發病單株病級參照Washio等 (1968)制定的抗性鑑定標準，即A級長勢很差，病葉整片或部分萎蔫，葉片巻曲、枯死；B級長勢很差，但病葉不萎蔫，下部黃葉病斑連續，上部葉有褪綠症狀；Bt級 症狀與B相似，但長勢較差；Cr級長勢較弱，病葉略巻曲，病部略黃，呈零星點狀或 條紋狀，病健部交界明顯；C級長勢略弱，零星點狀略黃，病健部有間隔；D級長勢 很好，初期可見的很小病斑隨苗的生長被掩飾。將A、 B和Bt作為感病，Cr、 C 、 D和 未出現症狀的作為抗病，計算小區中感病植株的比例為發病率。將發病率分成一級 (<4.9%)、 二級(5%~9.9%)、三級(10%~19.9%)、四級(20% 39.9%)和五級(》40%) 5個等級。根據系譜關系統計不同發病率等級單株後代出現各級單株的比例，評價抗性篩 選的效果。為了確保鑑定結果的可靠性，小區育秧均選擇在江蘇省農業科學院糧食作物研究所 試驗田(南京)小麥田周圍，且對這些小區不噴灑任何殺蟲劑，以保證充足蟲量的遷入， 每年單株接蟲量均保證在5頭以上。水稻病情調査分3次，前兩次在水稻條紋葉枯病發病 高峰期進行，後一次在水稻分櫱盛期進行，發病程度用小區發病率(感病單株佔小區48 個單株的百分比)表示。連續三年鑑定為高抗的108個小區(無典型發病株)，視其抗性 基因型為S/vZw'5^6-/，對三年連續鑑定為高感的68個小區(發病率》感病親本)，視其 感病基因型為加6-i加6-i'。 2006年正季病情調查結束後，採用SDS法提取抗感親本、Ft 及代表高世代純合抗性小區基因型的一個抗性單株和代表高世代純合感病小區基因型的 一個感病單株的葉片提取DNA。 PCR擴增反應根據Chen (Chen X W a/. 7T eor Zpp/ Ge"W, 1997, 95(4): 553-567.)報導，反應產物在4%瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化乙錠染色並於凝 膠成像系統下觀察，記載。(4)標記選擇效率評價在優良組合武粳13 /關東194的高世代小區中，選擇三 年連續鑑定為高抗小區的抗性單株(抗病基因型為Srv6-z' S/v6-0和高感小區的感病單株(感病基因型為加6々^v6-Z)進行標記RMll-8的篩選(圖3)。結果顯示對田間鑑定 為純合抗病基因型的小區進行RMll-8的篩選時，純合抗性親本帶型的小區數與田間鑑定 為純合抗病的小區數其吻合率為90.74%;對田間鑑定為純合感病的小區進行RM11-8的 篩選時，由於RMll-8為顯性標記無法區分純合感病親本帶型和抗感雜合帶型，故無法對 其感病小區的吻合率做準確判別(表2)。因此，對抗性基因型小區進行SSR標記RMll-8 的篩選所產生的吻合率90.74%更適合作為本試驗對水稻條紋葉枯病抗性基因輔助選擇效 果的評價指標。表2 田間鑑定和RMll-8標記篩選結果對比田間鑑定基因型個數分子標記帶型及個數吻合率(％)歸-/ SvZw'i n 純合抗性親本帶型純合感病親本帶型或F,帶型 ^ 9890.74 10純合抗性親本帶型純合感病親本帶型或F,帶型08167 —(5) SSR標記RMll-8在實際育種中的應用移栽後30天在農藝性狀穩定的小區採取單株葉片，用SDS法提取DNA(Deilaporta SL， Wood J， Hicks JB. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep， 1983， 1 (1): 19 ~ 21)。根據引物RM11-8序列進行PCR擴增。正向序列為 TAGCCATGCTCATGCGTCAT，反向序列為CGCGGTTTGCAGTAGTTGC。擴增體系10^1， DNA模板1/J， 94°C 預變性5min， 94°C變性0.5min, 59'C復性0.5min, 72°C延伸 Imin， 35個循環後，72'C再延伸7min。反應產物在3.5%瓊脂糖凝膠上電泳，經溴化乙錠 染色並於凝膠成像系統下觀察，根據帶型判斷各單株的抗性基因型，獲得157bp單一條帶 的確定為抗性基因型S/v6-i v&-i的抗病株系。根據分子標記輔助選擇的上下世代的抗性 表現，評價標記輔助選擇的效果。我們利用標記RMll-8對武粳13 /關東194的後代選 種單株進行大量篩選，淘汰純合感病親本或F！帶型的單株(極個別農藝性狀優良株予以 保留)，保留純合抗性親本帶型的單株。至2007年，對該組合進入課題組品比試驗的39 個高產、優質、抗條品系(其中4個品系已進入江蘇省各類中間試驗)再次進行了標記檢 測和田間發病情況調査(均為高抗，發病率低於2°/。)。結果顯示除JD7033和JD7301的 帶型為純合感病親本或F,帶型而表現高抗外，其它37個品系的分子檢測結果均為純合抗 性親本帶型且大田鑑定結果亦表現為高抗(圖4)。因此，通過上述SSR分子標記來鑑定 5h;6-Z基因型並篩選抗病水稻植株，可以迅速提高我國水稻條紋葉枯病抗性品種的育種進 程。結合條紋葉枯病自然發病情況調查結果，只在基因型為S/vZw'5h^-/、抗性級別達到一、 二級的小區選擇單株。2006年獲得條紋葉枯病抗性穩定、農藝性狀一致的優質、高產新 品系"寧5055"，其株高98 102cm，每株8 10穗，穗長16cm，穗型偏直立，每穗總粒數 140 150粒，結實率90%~92%，千粒重26 27g。序列表江蘇省農業科學院水稻條紋葉枯病抗性基因》v6-/的分子標記方法說明書 00 2008-01-03 2 Patentln version 3.1 1 20 DNA人工合成 RMll-8引物正向序列 (1)..(20) 1tagccatgct catgcgtcat 20 2 19 DNA 人工合成 RMll-8引物反向序列 (1)..(19) 2cgcggtttgc agtagttgc 19
權利要求
1、水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的分子標記方法，其特徵在於用顯性SSR標記RM11-8引物正向序列為TAGCCATGCTCATGCGTCAT反向序列為CGCGGTTTGCAGTAGTTGC擴增水稻條紋葉枯病抗性品種或育種材料DNA，如果能夠擴增出157bp的單一條帶，則表明抗條紋葉枯病基因Stvb-i存在，該基因位於水稻第11染色體上。
全文摘要
本發明涉及水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的分子標記方法，屬於農業生物工程技術領域。依據前人對條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的定位結果，利用分子生物學和生物信息學的方法設計了13對與水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i緊密連鎖的SSR標記，其中1對標記RM11-8在抗、感育種親本關東194(攜帶Stvb-i基因)和武粳13之間呈現多態性。利用已知抗、感基因型的該組合高世代小區對該標記進行了抗性選擇效果的評價，其吻合率為90.74％。因此，RM11-8可作為該組合抗水稻條紋葉枯病輔助選擇的分子標記，預測其抗性基因型，大大提高水稻條紋葉枯病抗性品種的選擇效率和鑑定效率。
文檔編號C12Q1/68GK101225445SQ200810018799
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月25日 優先權日2008年1月25日
發明者張亞東, 鎮 朱, 李餘生, 靜 林, 王才林, 凌 趙, 濤 陳 申請人:江蘇省農業科學院