一種膠質芽孢桿菌菌株及微生物菌劑的製作方法

2024-02-26 11:22:15 1

本發明屬於微生物工程領域，特別涉及一種膠質芽孢桿菌菌株及微生物菌劑及其應用。

背景技術：

鉀是植物生長發育所必需的大量營養元素之一，植物對鉀的需要量較大。鉀被植物的根系吸收後通過木質部和韌皮部運輸到需要部位發揮作用。近年來，隨著大量化肥的投入和盲目性偏重於氮磷肥的施用，使土壤養分失去平衡，鉀元素的虧缺已經成為農作物生長和產量的限制因子之一。但同時有資料證明土壤中蘊藏著豐富的不能為作物直接吸收利用的含鉀矽酸鹽礦物，每公頃含量達到約26100kg。因此，如何利用土壤中含鉀的矽酸鹽礦物，釋放出鉀元素，提高土壤含鉀量，成為農業科技研究的重要課題。

膠質芽孢桿菌bacillusmucilaginosus是矽酸鹽細菌(silicatebacteria)中的一種，是土壤中一種重要功能菌，它能分解長石、雲母等鋁矽酸鹽類的原生態礦物，使土壤中難溶性k、p、si等轉變為可溶性，供植物生長利用，同時還具有固氮的作用。

另外植物雖然各自有自身的多種抗旱機制，但是每種機制都要求使植物體內生理過程保持充足的水分供應，否則植物依然會缺水死亡。利用微生物來改善宿主的水分條件，增強宿主植株的抗旱性越來越受到重視。膠質芽孢桿菌可以產生大莢膜，莢膜的主要成分為多糖。莢膜多糖作為一種含水量很高的大分子，其大量極性基團可保護菌體免受乾旱損傷，在一定程度上可以增加植物的抗旱性，另外莢膜多糖也可以吸附儲存游離養分，供給植物生長使用。

技術實現要素：

本發明提出了一種膠質芽孢桿菌菌株及微生物菌劑，本發明在從沙化地的土壤中分離篩選出一株芽孢桿菌，經鑑定為膠質芽孢桿菌，經試驗表明此菌株具有解鉀，提高作物產量的作用；另外還能增加作物的抗旱性。

本發明具體是通過以下技術方案來實現的：

一種膠質芽孢桿菌菌株，2016年8月25日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為cctccno：m2016426，分類命名：膠質芽孢桿菌k5(bacillusmucilaginosusk5)。

一種功能菌為上述的的膠質芽孢桿菌的微生物菌劑。

優選地，微生物菌劑中菌株的活菌量至少為5.0×109cfu/g。

一種微生物菌劑應用于田間土壤解磷解鉀、提高作物產量和農作物抗旱性。

本發明豐富了微生物肥料菌種資源，拓寬微生物肥料在促進植物生長，改善農業農作物環境，抗旱保水等多方面的功能化發展。本技術將對提高作物產量和品質，促進農業可持續發展、減少環境汙染以及保障人類健康都有重要的理論和實踐意義。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1菌株k5平板菌落形態。

圖2菌株k5顯微鏡下形態。

圖3菌株k5的pcr凝膠電泳圖。

圖4為菌株k5的16rdna序列在核糖體資料庫上的比對結果。

圖5為不同處理組中油菜根系形態變化圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

實施例1：一株膠質芽孢桿菌，其篩選過程如下：

1)菌株的分離純化

土壤樣品來自武漢合緣生物股份有限公司合作項目沙化地的土壤。

除去地表植物殘體和表層土2cm-10cm，分別用多點採集方案在每個採樣點從沙化地土壤中採集5g-10g樣品，放入樣品袋中。經陰乾後，採用四分法將土壤樣品縮分至約50g左右；然後置於含有250ml滅菌pb緩衝液的500ml三角瓶中；30℃、180rpm震蕩30min，靜置沉澱(或1500rpm-5000rpm離心5min)，取上清液；取100ml上清液，經15-25℃、8000rpm-20000rpm離心10min，取沉澱；將沉澱懸浮於50ml滅菌pb緩衝液中再次15-25℃、8000rpm-20000rpm離心10min；重複兩次以後，將沉澱懸浮於10ml的無菌水中，製得土壤懸浮液。將此懸浮液稀釋至合適梯度後塗布於無氮培養基平板上，28℃—35℃倒置培養；挑取菌落大、生長快、透明且凸起高、粘著力強而有彈性的菌落分別進行分離純化，將純化後的菌株編號並保存。此次共分離純化出31株不同的菌株,分別編號為k1-k31。然後將此31株菌分別接種於鉀礦石搖瓶中，進行進一步進行解鉀能力的篩選，最終得到解鉀能力較高的5株菌，其中菌株k5的解鉀能力最強。

註：

無氮培養基配方：蔗糖5g/l，雲母礦粉(脫鉀)10g/l，na2hpo42.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，fecl30.005g/l，caco30.1g/l，瓊脂15—20g/l，ph7.2。

鉀礦石培養基配方：蔗糖5g/l，雲母礦粉(脫鉀)10g/l，na2hpo42.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，fecl30.005g/l，caco30.1g/l，ph7.2。

2)解鉀菌株的篩選

表1不同菌株解鉀能力比較

對所篩選的31株菌進行解鉀能力復篩的結果如表1所示，初篩的31株菌都具有不同程度的解鉀能力。綜合考慮發酵後的鉀濃度和增加倍數，有5株菌的解鉀能力較強，依次是k5、k12、k31、k09、k18。其中k5釋放的鉀離子濃度達到了24.50mg/l，為最高。

3)菌株的形態、生理生化及16srdna分子學鑑定

如圖1所示菌株k5在培養基平板上菌落為圓形，如半粒玻璃球；突起，凸起度大於45度；無色透明，5-6天後中部有渾濁點，邊緣透明；表面光滑，粘稠，彈性大，可拉成絲狀。顯微鏡下菌體粗長杆狀，有厚莢膜(見圖2)，芽孢大，橢圓形中生；孢囊壁厚(復紅著色，深紅色)，芽孢內也著色，淺紅色；成熟孢囊不膨大。

菌株k5能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇產酸不產氣；接觸酶陽性，溶菌酶抗性陽性，v.p反應陰性，吲哚陰性；能水解明膠、酪素、澱粉；不能水解卵磷脂、酪氨酸，不能使苯丙氨酸脫氨；5％的鹽液中不能生長，也不能生長於ph5.7sabouraud的葡萄糖培養基中，菌株k5與bacillusmucilaginosus的生理生化特徵比較如表2。

表2菌株k5與膠質芽孢桿菌的生理生化特徵比較

註：+：陽性；一：陰性；nd：沒有資料；+一：產酸不產氣

進一步進行基因組dna電泳和16srdna基因序列測序，如圖3將測定所得序列與ncbi資料庫blast同源性比對分析，選取同源性較高的模式菌株與菌株序列用clustalx1.81軟體進行多序列比對分析，用軟體megalign5.2中的鄰接法(neighbor-joiningmethod)構建系統發育樹。根據16srdna的系統發育樹分析菌株k5與膠質芽孢桿菌(bacillusmucilaginosus)的1412bp長度的匹配度達0.991，ncbi登錄號為dq898309。在dnaman軟體進行相似性對比如圖4，結果顯示相似性為99.9％，可以認定菌株k5為膠質芽孢桿菌bacillusmucilaginosus。

實施例2：微生物菌劑的製作

本項研究選取了葡萄糖、蔗糖和澱粉作為碳源備選；選取硫酸銨、硝酸鈉和豆餅粉作為氮源備選，通過單因子優化和正交試驗證實，此膠質芽孢桿菌最佳發酵配方為：蔗糖25g/l，豆餅粉9g/l，硫酸銨0.5g/l，硫酸鎂(七水)2g/l，磷酸二氫鉀4g/l，氯化鐵0.01g/l，ph7.2。在32℃，190rpm的培養條件下，100ml/250ml的裝量下，活菌屬可達8.0×108cfu/ml。

在5l的發酵罐上使用相同的發酵配方，6％的接種量，最終培養液中活菌數為6.9×109cfu/ml。

實施例3：微生物菌劑應用效果

1)k5菌劑對油菜生長發育的影響

按實施例2中的k5菌劑產品的最終形態，分別以不同的添加量設置4個處理：常規施肥(ck)、添加量0.01g/(kg土)(t1)、添加量0.1g/(kg土)(t2)、添加量1g/(kg土)(t3)。試驗以土壤盆栽方式進行，所用盆缽均為聚乙酯塑料盆，直徑30cm，高20cm，每盆裝土10kg，定植4棵幼苗。自定植後，按照大田管理的措施只進行水分管理，生長期為33d。

供試大棚的土壤採用ny/t1121土壤檢測系列標準中所規定的方法進行檢測，供試土壤指標如下表3：

表3供試土壤基本性狀

在植株帶根收穫後稱量地上部及根部鮮重，算出冠根比。結果如表4：

表4不同處理組中油菜生長狀況

由表4可知，不同處理組均能不同程度的提高油菜產量與冠根比。與ck相比，t1、t2、t3油菜地上部單株鮮重分別增加60.19％、86.66％、14.23％；冠根比分別增加14.60％、20.98％、11.72％(p＜0.05)。同時可以看出t2油菜單株鮮重最高，分別比t1、t3高16.52％和63.40％。

選取4個主要參數即總根長(a)、根體積(b)、根表面積(c)、根尖數(d)進行分析不同處理組中油菜根形態的變化。從圖5可以看出與ck相比，根長依次增加30.34％、101.70％、76.64％(p＜0.05)，根體積依次增加104.78％、214.20％、143.06％(p＜0.05)，根表面積依次增加4.89％、104.74％、7.26％，根尖數依次增加22.85％、47.89％、22.79％。各個處理組的根長和根體積都較ck有顯著差異。處理組之間相比，除根尖數差異顯著外，t2組根長較t1、t3組分別高出54.74％、14.18％(p＜0.05)；t2組根體積較t1、t3組分別高出53.43％、29.27％；t2組根表面積較t1、t3組分別高出95.19％、90.89％。

將油菜地上部分乾燥後粉碎，檢測其中全氮、總磷、總鉀的含量，結果如表5所示：

表5不同處理組中油菜地上部氮磷鉀含量(g/kg)

與ck相比，t1、t2、t3全氮含量依次增加32.21％、48.47％、22.31％(p＜0.01)；總磷含量依次增加13.21％、26.06％、15.46％(p＜0.01)；總鉀含量依次增加10.51％、47.11％、37.64％(p＜0.05)。

由以上數據可以看出，添加膠質芽孢桿菌k5菌劑能夠促進油菜生長，提高油菜品質，增加油菜中氮磷鉀的含量，但是隨著使用量的增加，各項指標呈下降趨勢。綜合分析表明該試驗以t2處理組，即0.10g/(kg土)的施用量最為合適。

2)k5菌劑對玉米苗抗旱性的影響

選用大田土壤，過篩除去石塊和雜質。將土分裝於高度和盆口上下直徑為12cm×33cm×22.5cm的塑料盆中，每盆裝入幹土3kg。以正常生長的盆栽玉米為對照(ck)，實驗組分為：乾旱脅迫的盆栽玉米(s1)、乾旱脅迫的k5菌劑處理玉米(s2)、乾旱脅迫的保水劑處理玉米(s3)。

乾旱脅迫：以稱重法澆水，澆水量為土壤最大持水量的50％左右(中度乾旱)，正常組土壤含水量維持在最大持水量的80％—85％。

s2組：菌劑和種子比為1:15拌種後播種；s3組：按照保水劑說明使用。

自播種後開始，至拔節期進行各項生理指標的檢測。

根據植株的萎蔫程度，評定乾旱情況。乾旱分級標準如下：

0級：植株正常生長，無萎蔫現象；1級：植株生長基本正常，葉片出現輕度萎蔫；2級：植株明顯萎蔫，除生長點及周圍幼葉尚保持伸展外，老葉片均萎蔫；3級：植株嚴重受害，生長點萎縮，恢復困難。

表6各實驗組的乾旱係數

從表6可知，s2組的玉米表現出的受旱程度較弱，植株生長基本正常，只出現輕度萎蔫，而添加保水劑的玉米與乾旱脅迫的s1組一樣，受旱比較嚴重。

一般認為，經過相同乾旱脅迫後，相對含水量下降幅度越大則抗旱性能越差。同時，在植物受到乾旱脅迫後，會採取一定的應激措施來減緩脅迫帶來的生理代謝不平衡。脯氨酸可以通過滲透調節來降低水勢，維持較高的滲透壓，保證植物細胞的正常生理功能；可溶性糖作為乾旱脅迫誘導的小分子溶質之一，不僅參與滲透調節，還能在維持植物蛋白質穩定方面起到重要作用。本試驗採用烘乾法測定玉米苗的含水量(rwc)，採用茚三酮法測定玉米苗的游離脯氨酸，採用蒽酮法測定玉米苗中的可溶性糖，以觀察受到乾旱脅迫的玉米苗在不同實驗組處理中的抗旱性差異。結果如表7：

表7不同實驗組玉米苗相對含水量、游離脯氨酸含量和可溶性糖含量

從表7可以看出k5菌劑處理的s2組玉米苗相對含水量較ck組下降的最少，保水劑處理的s3組次之，乾旱脅迫的s1組相對含水量下降的最多。同時，s2組的游離脯氨酸和可溶性糖含量遠遠低於乾旱脅迫的s1組和保水劑處理的s3組，基本接近於對照組ck。

植物在乾旱脅迫下進行複雜的生理生化響應，用單一的指標難以全面準確的反應除抗旱性的強弱。本試驗通過外觀以及測定相對含水量、游離脯氨酸含量和可溶性糖含量四個方面指標得出，在同等乾旱脅迫下，膠質芽孢桿菌k5處理過的玉米苗和保水劑相比表現出不同的受旱程度，表明膠質芽孢桿菌k5在提高玉米的抗旱性方面具有一定的作用。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。