一株防治茄果類蔬菜土傳病害枯草芽孢桿菌pts-394及其應用的製作方法
2024-02-26 02:22:15 2
專利名稱：一株防治茄果類蔬菜土傳病害枯草芽孢桿菌pts-394及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生防菌劑及其應用，尤其是一株枯草芽孢桿菌PTS-394及其在防治茄果類蔬菜兩種重要土傳病害(枯萎病和青枯病)中的應用。
背景技術：
隨著種植業結構的調整，設施蔬菜種植面積逐年增加，高產、連作、多樣化的設施蔬菜種植布局為病蟲害提供了充裕的營養和繁殖條件。因此，近年來設施蔬菜的重大病害頻繁暴發。目前，設施蔬菜生產上防治病害主要依靠化學農藥。這不僅造成生態環境嚴重汙染，而且直接增加蔬菜中有毒化學物質的殘留，對人類健康帶來嚴重危害。為了解決蔬菜產量和質量之間矛盾，達到防治植物病害、減少化學農藥的使用量的目的，使用生物防治控制植物病害的方法越來越受到各國政府和人民的關注。生物防治主要是利用生物多樣性，通過在自然界釋放或引進有益生物，可持續控制植物病害。1950年以來國內外均開展了利用生防菌劑防治植物病害的研究，取得了初步成效。如利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)防治水稻紋枯病、大豆銹病、大白菜軟腐病等；利用螢光假單胞桿菌(Fluorescent pseudomonads)防治棉花、亞麻、苜蓿、黃瓜等作物的鐮刀菌枯萎病；利用酵母菌(Candida saitoana)、丁香假單胞菌(I^eudomonas syringae)和成團泛菌(Pantoea agglomerans)防治多種水果採後病害等等。茄果類蔬菜枯萎病(病原菌為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)和青枯病(病原菌為茄青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum)
中的兩種主要土傳病害。青枯病又稱細菌性枯萎病，田間發病症狀與枯萎病非常相似多在番茄開花期間發生，隨著坐果及果實膨大，病情逐漸加重。病原菌侵染維管束，阻塞其輸送營養物質，病莖縱切面維管束變褐。相似的病症給兩種病害的診斷和防治帶來了很大難題。 已報導的枯萎病生防菌劑主要有木黴菌、非致病尖孢鐮刀菌、假單孢菌和芽孢桿菌等；青枯病生防菌劑主要有無致病力青枯菌和芽孢桿菌等。但是，目前這些生防菌劑都是針對單一病害為作用靶標，由於兩種病害病症相似，生產上經常發生用藥不當，從而導致防效不佳。解決這個問題的途徑之一就是以茄果類蔬菜枯萎病菌和青枯病菌為靶標菌，篩選、鑑定對兩種病原菌皆具拮抗作用的生防菌劑並田間應用。江蘇省農科院從寧夏銀川、江蘇沭陽、福建廈門和雲南昆明等地的番茄、辣椒、西瓜等作物根際土壤中，分離純化獲得1239個細菌分離物。篩選獲得對多種真菌病害有很好防效的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PTS-394。其特性記載為A、形態特徵枯草芽孢桿菌PTS-394菌株營養體為杆狀，兩端橢圓，周生鞭毛。大小為(0. 7 0. 8)微米X O. 0 3. 0)微米。無莢膜。芽孢中生，橢圓形，大小為(0. 6 0. 9)微米X (1. 0 1. 5)微米。B、菌落形態特徵枯草芽孢桿菌PTS-394在牛肉汁蛋白腖瓊脂平板上培養時，菌落邊緣波浪形，米色，表面有皺褶。質地為不透明狀，不產生色素。
C、生理生化特性枯草芽孢桿菌PTS-394革蘭氏反應陽性。H2A酶反應陽性， V. P.反應陽性。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇利用為陽性。澱粉水解、明膠液化、檸檬酸鈉利用、二羥基丙酮形成反應也均為陽性。最佳生長溫度30°C，55°C以上不生長。D、種屬鑑定枯草芽孢桿菌PTS-394的DNA提取採用常規方法，採用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和濃度。以提取的基因組DNA為模板，用細菌通用引物擴增16S rRNA序列。引物 BSF(27f) :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；BSR(1541r) :AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。PCR 反應條件95°C 4min ；94°C 40s, 55°C 45s, 72°C lmin，25 個循環；72°C 5min，PCR 產物經 1 %瓊脂糖凝膠電泳驗證後，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將測得的16S rRNA序列在NCBI核酸資料庫上採用Blast程序進行同源性搜索。測序結果顯示枯草芽孢桿菌 PTS-39416S rRNA序列與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis有很高的同源性，遞交GenBank 獲取基因登錄號為JF419551。E、枯草芽孢桿菌PTS-394還具有許多優良性能，如生長速度快；適應環境能力強；能在土壤和植物表面定殖，並形成優勢種群；誘導寄主產生抗病性；分泌產生多種抗菌物質。目前，將生防菌劑(枯草芽孢桿菌PTS-394)用於防治茄果類蔬菜兩種重要土傳病害(枯萎病和青枯病)並未見諸報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) PTS-394，該菌株已於2011年2月M日在NCBI核酸資料庫GenBank上獲取基因登錄號JF419551。本發明的另一目的是針對目前生產上茄果類蔬菜兩種重要土傳病害(枯萎病和青枯病)病症相似，難以診斷和防治不佳的問題，篩選獲得一株對枯萎病和青枯病均具有良好防治效果的生防菌劑(枯草芽孢桿菌PTS-394)及其應用。枯草芽孢桿菌PTS-394能在植物根圍迅速定殖，形成優勢種群；分泌抗菌相關物質；誘導植物抗病性；從而實現利用該生防菌劑持久控制茄果類蔬菜土傳病害流行的目的。本發明提供了一種生防菌劑，其中有效活性成分由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PTS-394 組成。本發明所述的生防菌劑，其中枯草芽孢桿菌PTS-394分泌的代謝產物中包括蛋白酶和嗜鐵素兩種抗菌相關物質。本發明所述的生防菌劑，它是水劑或可溼性粉劑。水劑各組分的重量百分比為
枯草芽孢桿菌PTS-394發酵液中菌含量 101-2xl01 cfu/mL 助劑0.5%-20%
表面活性劑0%-20°/o防腐劑
水
pH
0.1%-0.5%
餘量
4.0-7.0可溼性粉劑各組分的重量百分比為
枯草芽孢桿菌PTS-394粉劑(菌含量101Q-5xl01Qcfu/g) 10%-90%本發明所述的生防菌劑，其中助劑可任選一種或多種下列物質ΝΝ0(亞甲基二萘磺酸鈉)、氮酮、噻酮；粘合劑可任選一種或多種下列物質聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇(聚合數12000-20000)；表面活性劑可任選一種或多種下列物質十二烷基磺酸鈉、 十二烷基苯磺酸鈉、木質素磺酸鈉、茶枯粉、皂角粉；防腐劑可任選一種或多種下列物質 苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、丙酸鈣、雙乙酸鈉。填充劑可任選一種或多種下列物質 輕質碳酸鈣、硅藻土、高嶺土、絹雲母粉和白碳黑。本發明所述的生防菌劑的用途是將所述的生防菌劑稀釋後灌入蔬菜根部用於防治多種土傳病害；其特徵包括所述的土傳病害是茄果類蔬菜枯萎病和青枯病。本發明進一步提供了所述生防菌劑的應用，其特徵在於成品藥劑稀釋後的有效藥物成分含量 104-108Cfu/mL 或 104-108cfu/g。本發明的優點在於通過引進對人畜安全、對茄果類蔬菜枯萎病、青枯病均具有較強抑制作用的枯草芽孢桿菌PTS-394，達到利用一種生防菌劑同時防治茄果類蔬菜兩種重要土傳病害的目的；減少化學藥劑用藥量、降低用藥成本；同時改善生態環境、減少了化學藥劑在蔬菜中的殘留量。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
圖1是枯草芽孢桿菌PTS-394及其稀釋液對番茄枯萎病菌菌絲生長的抑制作用。 圖2是枯草芽孢桿菌PTS-394及其稀釋液對番茄青枯病菌的抑制作用。 圖3是枯草芽孢桿菌PTS-394能產生嗜鐵素。 圖4是枯草芽孢桿菌PTS-394能產生蛋白酶。
圖中A 枯草芽孢桿菌PTS-394原液；A-I 枯草芽孢桿菌PTS-394的100倍稀釋液； A-2 枯草芽孢桿菌PTS-394的500倍稀釋液；B 番茄枯萎病菌。
具體實施例方式實施例1、枯草芽孢桿菌PTS-394對枯萎病菌和青枯病菌的抑制作用。供試病原菌菌株番茄枯萎病菌由江蘇省農科院植保所提供。用PSA培養基(200g馬鈴薯、20g蔗
助劑粘合劑表面活性劑填充劑 pH
1%-20% 2%-20% 0.5%-20% 10%-90% 6.0-7.0糖、20g瓊膠和IOOOmL蒸餾水，pH 5. 6 6. 6) 培養5d，備用。番茄青枯病菌由江蘇省農科院植保所提供。用NA培養基(牛肉浸膏3. 0g，酵母膏lg，蛋白腖5g，葡萄糖10g，瓊脂20g，蒸餾水IOOOmL) 28°C振蕩(150rpm/min)培養2d，備用。將江蘇省農業科學院篩選獲得的枯草芽孢桿菌PTS-394在NA培養基上進行活化，然後移入50mL NA培養液中，在下振蕩(150rpm/min)培養2d，備用。番茄枯萎菌餅(直徑為7mm)置於空白PDA平板一側(距平板邊緣30mm)。平行另一側(距平板邊緣 30mm)放置5mm滅菌濾紙片(距平板中心30mm)，濾紙片加入不同稀釋倍數的枯草芽孢桿菌 PTS-394菌液5yL。每處理重複3皿。設清水對照。恆溫培養，待對照平板菌落長滿時測量調查病原菌菌落直徑，並計算抑制率。抑制率=(對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑)/對照病原菌菌落直徑X 100 %。吸取青枯菌液塗布NA平板(0. 3mL菌液/平板)。培養皿成十字架形放置4張滅菌濾紙片，濾紙片上加入不同稀釋倍數的枯草芽孢桿菌PTS-394菌液5 μ L 設清水對照。每處理重複3皿。恆溫培養2d，測量抑菌圈直徑。試驗結果見表1、圖1-2。試驗結果表明枯草芽孢桿菌PTS-394原液、100倍稀釋液和500倍稀釋液對番茄枯萎病菌和青枯病菌均具有較強的抑制作用。表1枯草芽孢桿菌PTS-394對番茄枯萎病菌和青枯病菌的抑制作用如圖1和圖2所示。實施例2枯草芽孢桿菌PTS-394代謝分泌物-抗菌相關物質的產生供試材料蛋白酶檢測培養基脫脂奶粉100g，瓊脂20g，定容至1000mL。幾丁質酶檢測培養基膠狀幾丁質 15g，MgS04 ·7Η20 0. 5g，FeSO4 · 7Η20 0. OlgjK2HPO4 0. 7g, KH2PO4 0. 3g、瓊脂20g，定容至IOOOmL, ρΗ7· 0 7. 2。纖維素酶檢測培養基蛋白腖10g，酵母粉 10g，羧甲基纖維素鈉log, NaCl 5g，KH2PO4 lg，瓊脂20g，定容至IOOOmL, ρΗ7· 0。嗜鐵素檢測培養基=CAS 60. 5g，IOmL 三價鐵溶液(lmmol. L^1FeCl3 ·6Η20)，HDTMA 72. 9g，瓊脂 20g,定容至 lOOOmL，pH7. 0。將江蘇省農業科學院篩選獲得的枯草芽孢桿菌PTS-394在NA培養基上進行活化， 然後移入50mL NA培養液中，在下振蕩(150rpm/min)培養2d，備用。蛋白酶檢測蛋白酶檢測培養基平板中央放置5mm滅菌濾紙片，每張濾紙片上滴
6拈抗菌液5 μ L。每處理重複4皿。培養2d，觀察有無透明圈產生。幾丁質酶檢測幾丁質酶檢測培養基中央放置5mm滅菌濾紙片，每張濾紙片上滴拈抗菌液5 μ L。每處理重複4皿。培養3 7d，觀察有無透明圈產生。纖維素酶檢測纖維素酶檢測培養基平板中央放置5mm滅菌濾紙片，每張濾紙片上滴拮抗菌液5 μ L。每處理重複4皿。培養3 7d，觀察有無透明圈產生。嗜鐵素檢測嗜鐵素檢測培養基平板中央放置5mm滅菌濾紙片，每張濾紙片上滴檢拮抗菌液5 μ L。每處理重複4皿。培養3 7d觀察顏色變化，若有桔黃色暈圈產生，則有嗜鐵素產生。試驗結果表明枯草芽孢桿菌PTS-394不能分泌幾丁質酶和纖維素酶；能分泌蛋白酶；也能分泌嗜鐵素，在測試平板上能螯合三價鐵離子，形成淡黃色暈圈(圖3和圖4)。如圖3和圖4所示。實施例3200億枯草芽孢桿菌PTS-394水劑的配製A、菌種準備及活化。NA培養基(同實施例1)按常規方法滅菌，做成斜面，預培養2天後，接種枯草芽孢桿菌PTS-394，培養溫度；培養時間2天。B、液體發酵。—級發酵將上述培養好的試管斜面，用接種環移一環菌苔入500mLNA培養液(同實施例1)中，共移2瓶。在下振蕩(150rpm/min)培養2d，備用。二級發酵培養基配方豆餅粉^^，大豆粉化日^^，酵母粉。.15%，玉米粉 2. 0%，魚粉 1. 0%，NaCl 0.05%,CaCO3 0.3%。消前pH 7. 5。2 噸發酵罐中投料 1 噸。121°C 滅菌30分鐘。冷卻至30°C左右時接種上述一級發酵菌種液1000mL。液體發酵溫度30°C， 攪拌轉速250rpm/min。通氣量1 1.5。發酵周期為M小時。三級發酵培養基配方同二級發酵。15噸發酵罐中投料10噸。121°C滅菌30分鐘。 冷卻至30°C左右時接種上述二級發酵菌種液1噸。液體發酵溫度33°C，攪拌轉速300rpm/ min。通氣量1 1.5。發酵周期為36小時左右，發酵液中90%菌體形成芽孢時放罐。C、水劑配置。 發酵液放入儲罐中，加入NNO (亞甲基二萘磺酸鈉)0. 5 %、十二烷基苯磺酸鈉6 %、 苯甲酸鈉0. 1 %，攪拌均勻。測得發酵液PH值為5. 4，活芽孢數為2 X 101(lCfU/mL。實施例4200億枯草芽孢桿菌PTS-394可溼性粉劑的配製A、菌種準備及活化。同實施例3。B、液體發酵。同實施例3。C、製備活菌原粉。將發酵液放入沉降池中，利用等電點沉降3天後，經碟片式離心機離心去水，留菌漿。菌漿中按體積加入10% (w/v)的輕質碳酸鈣(細目325目)，用噴霧乾燥方法將菌漿噴幹成枯草芽孢桿菌PTS-394的芽孢原粉。噴霧乾燥時進口溫度175°C，出口風溫72°C。測得原粉中活芽孢數5X 101QCfU/g。
D、製備可溼性粉劑助劑選擇NNO(亞甲基二萘磺酸鈉)；粘合劑為聚乙二醇；表面活性劑為十二烷基苯磺酸鈉；填充劑為輕質碳酸鈣。將各組分按照下列重量百分比備料枯草芽孢桿菌PTS-394活菌原粉40%;NN0(亞甲基二萘磺酸鈉)7%;聚乙二醇 3% ；十二烷基苯磺酸鈉5% ；輕質碳酸鈣45%。製備過程將枯草芽孢桿菌PTS-394活菌原粉等按上述比例置於混合器中，混合均勻後，經氣流粉碎機粉碎至325目過篩，包裝，即成200億枯草芽孢桿菌PTS-394可溼性粉劑。實施例5200億枯草芽孢桿菌PTS-394水劑對番茄枯萎病和青枯病的盆栽防治試驗。試驗時間於2010年10月1日左右(番茄落種)在江蘇省農科院溫室內進行。試驗品種江蔬一號(由江蘇省農科院蔬菜所提供)。供試病原菌菌株番茄青枯病菌製備同實施例1。番茄枯萎病菌孢子液的製備如下將實施例1中的平板用無菌水洗下，打散，使之成均勻的孢子懸浮液。顯微鏡下用血球計數板計數，用無菌水調至濃度106孢子/mL。試驗藥劑和對比藥劑200億枯草芽孢桿菌PTS-394水劑由實施例3提供。對照藥劑為50%多菌靈(由江蘇輝豐農化股份有限公司提供)和72%農用硫酸鏈黴素(由河北省石家莊曙光製藥廠提供)，它們都是生產上防治枯萎病和青枯病的常用化學藥劑。田間藥效試驗將江蔬1號番茄種播於滅菌土壤中，當番茄苗長出6片真葉時，移
田ο枯萎病防治試驗將秧苗移栽至裝有IOOg無菌土的盆缽中，每盆1株。每株番茄苗灌根20mL枯萎病菌孢子液(濃度為IO6孢子/mL)，6h後灌根20mL枯草芽孢桿菌PTS-394 水劑(菌含量為108Cfu/mL)。每處理20盆，常規管理。清水和常用化學藥劑50%多菌靈為對照。生長30d後調查病情，計算防效。青枯病防治試驗將秧苗移栽至裝有IOOg無菌土的盆缽中，每盆1株。每株番茄苗灌根20mL枯草芽孢桿菌PTS-394水劑(菌含量為108cfu/mL)，6h後灌根20mL青枯菌液 (菌含量為108CfU/mL)。每處理20盆，常規管理。清水和72%農用硫酸鏈黴素為對照。生長30d後調查病情，計算防效。番茄枯萎病和青枯病發病症狀非常相似，病情分級標準如下0級為莖內維管束正常，外部無症狀；1級為莖內維管束1/4以下變色；3級為莖內維管束1/4 1/2變色；5 級為莖內維管束1/2 3/4變色；7級為莖內維管束3/4以上變色，部分葉片萎蔫；9級為整株枯死。病情指數=[(各級發病數X各級代表值)/(調查總株數X最高級代表 it)] XlOO防治效果(％)=[(對照的病情指數-防治的病情指數)/對照的病情指數]X100%
試驗結果見表(表幻。人工接種後，番茄枯萎病的病情指數是48. M %，番茄青枯病的病情指數為78. 39%。枯草芽孢桿菌PTS-394水劑對番茄枯萎病和青枯病的防效較高， 分別為77. 40%和74. 49%。常規化學藥劑多菌靈和農用硫酸鏈黴素盆栽防效均不理想，分別為46. 09%和55. 35%，明顯低於枯草芽孢桿菌PTS-394水劑的防治效果。表2枯草芽孢桿菌PTS-394水劑對番茄枯萎病菌和青枯病菌的盆栽防治效果
權利要求
1.一種生防菌劑，其中有效活性成分由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PTS-394 組成。
2.根據權利要求1所述的生防菌劑，其中，枯草芽孢桿菌PTS-394分泌的代謝產物中包括蛋白酶和嗜鐵素兩種抗菌相關物質。
3.根據權利要求1-2所述的生防菌劑，其特徵在於，它是水劑或可溼性粉劑。
4.根據權利要求3所述的生防菌劑，其中水劑各組分的重量百分比為 枯草芽孢桿菌PTS-3^發酵液中菌含量 101G-2xl01G cfu/mL 助劑0.5%-20%表面活性劑0%-20%防腐劑0.1%-0.5%水餘量pH6.0-7.0
5.根據權利要求3所述的生防菌劑，其中可溼性粉劑各組分的重量百分比為 枯草芽孢桿菌PTS-394粉劑(菌含量101G-5xl01GcfU/g) 10%-90% 助劑1%-20% 粘合劑 2%-20% 表面活性劑 0.5%-20% 填充劑 10%-90% pH 6.0-7.0
6.根據權利要求4-5所述的生防菌劑其中助劑可任選一種或多種下列物質ΝΝ0(亞甲基二萘磺酸鈉)、氮酮、噻酮；粘合劑可任選一種或多種下列物質聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇(聚合數12000-20000)；表面活性劑可任選一種或多種下列物質十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、木質素磺酸鈉、茶枯粉、皂角粉；防腐劑可任選一種或多種下列物質苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、丙酸鈣、雙乙酸鈉。填充劑可任選一種或多種下列物質輕質碳酸鈣、硅藻土、高嶺土、絹雲母粉和白碳黑。
7.—種權利要求1-6所述的生防菌劑的用途，其特徵在於將所述的生防菌劑稀釋後灌入蔬菜根部用於防治土傳病害。
8.根據權利要求7所述的生防菌劑的應用，其特徵在於所述的生防菌劑可以同時防治茄果類蔬菜兩種重要土傳病害(枯萎病和青枯病)。
9.根據權利要求7或8所述的生防菌劑的應用，其特徵在於成品藥劑稀釋後的有效藥物成分含量 104-108Cfu/mL 或 104-108cfu/g。
全文摘要
本發明涉及一種生防菌劑，其中有效活性成分由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PTS-394組成。其特徵在於該生防菌劑是水劑或可溼性粉劑。水劑中各組分的重量百分比為枯草芽孢桿菌PTS-394菌含量為2×1010cfu/mL；NNO(亞甲基二萘磺酸鈉)0.5％、十二烷基苯磺酸鈉6％、苯甲酸鈉0.1％。可溼性粉劑各組分的重量百分比為枯草芽孢桿菌PTS-394活菌原粉(菌含量5×1010cfu/g)40％；NNO(亞甲基二萘磺酸鈉)7％；聚乙二醇3％；十二烷基苯磺酸鈉5％；輕質碳酸鈣45％。應用時，將上述生防菌劑稀釋後灌入蔬菜根部用於防治蔬菜土傳病害，主要是茄果類蔬菜枯萎病和青枯病；成品藥劑稀釋後的有效藥物成分含量104-108cfu/mL或104-108cfu/g。其優點是通過引進對人畜安全、對茄果類蔬菜枯萎病菌、青枯病菌均具有較強抑制作用的枯草芽孢桿菌PTS-394，達到利用一種生防菌劑同時防治兩種土傳病害；減少化學藥劑用藥量、降低用藥成本；同時改善生態環境、減少了化學藥劑在蔬菜中的殘留量。
文檔編號A01P3/00GK102550607SQ201110339098
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者喬俊卿, 劉郵洲, 梁雪傑, 聶亞峰, 陳志誼 申請人:江蘇省農業科學院