雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗及其製備方法
2024-02-26 19:49:15 1
雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗及其製備方法
【專利摘要】本發明提供雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗及其製備方法，屬於生物工程領域。所述疫苗活性成分為滅活的雞新城疫病毒LaSota株和傳染性法氏囊病毒NJ09株CGMCC?NO：7758。本發明提供該疫苗的製備方法，將雞新城疫病毒LaSota株病毒液與傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分別濃縮、滅活，然後混合均勻，得到混合病毒液；將混合病毒液與佐劑混合均勻。本發明滅活疫苗，含有滅活的傳染性法氏囊病毒NJ09株，該毒株是超強的流行毒株、免疫原性強、攻毒保護性好；該二聯滅活疫苗免疫後抗體水平高，免疫攻毒保護率高，對傳染性法氏囊標準強毒株、超強毒株攻毒保護率達到90%以上，免疫持效期達到5個月。
【專利說明】雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程領域，具體涉及一種雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗及其製備方法。
【背景技術】
[0002]雞新城疫又稱亞洲雞瘟或偽雞瘟，具有很高的發病率和病死率，是危害養禽業的一種主要傳染病，OIE將其列為A類疫病。雞新城疫(Newcastle diseaSe，ND)是由雞新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、下痢、神經紊亂、黏膜和漿膜出血為特徵。該病死亡率高，對養雞業危害嚴重。1926年首先發現於印度尼西亞，不久又在英國新城發現，世界各國均有流行記載。
[0003]傳染性法氏囊病毒(Infect1us bursal disease Virus,縮寫為IBDV)隸屬於雙RNA病毒科雙RNA病毒屬，此病主要損害雞體淋巴器官造成免疫抑制，從而導致多種疫苗免疫無效及對其它疾病如新城疫、球蟲病等的易感性增高而引起經濟損失。傳染性法氏囊病(Infect1us bursal disease, IBD)於 1957 年首次發生於美國 Delware 州南部 Gumboro地區，我國於1979年相繼在廣州、北京、上海發現本病，對實際養殖生產造成重大損失，IBDV疫苗研究隨即展開，至今國內外已開發出弱毒、中等毒力活疫苗、滅活疫苗和基因工程疫苗，對該病防控起到一定作用。但是近年來，我國一些地方，特別是在法氏囊母源抗體高低不齊的蛋雞和肉雞飼養區， 仍然屢有傳染性法氏囊病(IBDV)的發生和流行，其原因主要為:一是超強毒株出現。IBDV在野外環境中變異能力很強，每年均有超強毒力的IBDV野毒出現，這一類毒株的毒力極有可能突破現有疫苗的保護，從而導致免疫雞群出現感染髮病、死亡的現象。二是弱毒疫苗無法突破母源抗體。現行免疫程序中IBDV弱毒苗一般在14~18日齡免疫，接種後進入雞體內的活病毒會被母源抗體捕獲、中和而失去複製活性，因而不能達到保護效果。同時雛雞體內母源抗體由高逐漸消減，雖有一定保護力但開始有部分雞暴露在感染威脅當中。三是傳染性法氏囊滅活疫苗研究落後。目前市場上使用的滅活疫苗一類是法氏囊全病毒滅活疫苗，使用傳染性法氏囊病毒株適應細胞製備，另一類是基因工程疫苗，採用大腸桿菌表達傳染性法氏囊病毒VP2基因製備。這兩種疫苗可以產生一定的免疫保護效果，但是，對於出現基因變異的超強毒株，會出現保護性下降的情況。因此，針對目前我國雞傳染性法氏囊病發病趨勢，分離法氏囊超強毒流行毒株，篩選其中免疫原性好、且可以適應細胞繁殖的種毒製備疫苗，對於該病的預防具有極其重要的意義，是符合生產實際需求的重要產品。
[0004]目前新城疫、傳染性法氏囊嚴重危害家禽養殖業的發展，在各種防控措施中，疫苗的免疫仍為最重要的措施。針對新城疫、傳染性法氏囊，已有相應的滅活單苗及二聯滅活苗，但是免疫劑量大，抗體水平低，保護率不高，給免疫雞群帶來一定的風險。因此，研製出免疫劑量小，免疫效果更好的新城疫、傳染性法氏囊二聯苗是一項具有重要意義的工作。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗，含有滅活的傳染性法氏囊病毒NJ09株，該毒株是超強的流行毒株、免疫原性強、攻毒保護性好；該二聯滅活疫苗免疫後抗體水平高，免疫攻毒保護率高，對傳染性法氏囊標準強毒株及目前流行的法氏囊超強毒株攻毒保護率達到90%以上，一次免疫，免疫持效期達到5個月。
[0006]本發明的另一目的在於提供雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的製備方法，該方法簡單，安全、成本低。
[0007]本發明的目的採用如下技術方案實現。
[0008]一種雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗，其活性成分為滅活的雞新城疫病毒La Sota株和傳染性法氏囊病毒NJ09株，所述傳染性法氏囊病毒NJ09株的保藏號為CGMCCNO:7758o
[0009]本發明還提供所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的製備方法，將雞新城疫病毒La Sota株病毒液與傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分別濃縮、滅活，然後混合均勻，得到混合病毒液；將所述混合病毒液與佐劑混合均勻，得到所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗。
[0010]在本發明中，將雞新城疫病毒La Sota株接種雞胚進行培養，收穫雞胚液作為雞新城疫病毒La Sota株病毒液；將傳染性法氏囊病毒NJ09株接種DF-1細胞或Ve1細胞進行培養，得到所述傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液。 [0011 ] 在本發明中，所述雞新城疫病毒La Sota株病毒液的病毒含量大於等於108_0EID50/ml，所述傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液的病毒含量大於等於107_°TCID5(l/ml。
[0012]優選的技術方案中，所述雞新城疫病毒La Sota株病毒液濃縮至原體積的1/4-1/2，所述傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液濃縮至原體積的1/5-1/7。
[0013]優選的技術方案中，所述濃縮後的雞新城疫病毒La Sota株病毒液和傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分別滅活後，按照體積比2: (1-3)混合均勻，得到混合病毒液。
[0014]在本發明中，將混合病毒液與吐溫-80按照體積比96: 4混合均勻，得水相；將注射用白油和司本一 80按照體積比為94:6混勻，得油相；將油相和水相按照體積比2:1混合均勻，獲得雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗。
[0015]有益效果:
[0016](I)雞新城疫病毒La Sota株，是我國雞新城疫疫苗製造的標準毒株，規模化生產工藝成熟、穩定，免疫原性好，安全。
[0017](2)傳染性法氏囊病毒NJ09株，是超強的流行毒株、免疫原性強、攻毒保護性好且適應細胞規模化培養。
[0018](3)本發明二聯滅活疫苗中含有的雞新城疫病毒為標準制苗株La Sota株，成品按照20 μ I/羽份免疫SPF雞後21天，新城疫抗體水平不低於41og2，達到效力檢驗標準；傳染性法氏囊病毒NJ09株，是超強的流行毒株、免疫原性強、攻毒保護性好且適應細胞規模化培養。本發明二聯滅活疫苗免疫後，抗體水平高，免疫攻毒保護率高，對傳染性法氏囊標準強毒株及目前流行的法氏囊超強毒株攻毒保護率達到90%以上，一次免疫，免疫持效期達到5個月。
[0019]本發明製備雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的方法，簡單、安全、成本低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是IBDV NJ09株F1、F2代細胞毒RT-PCR擴增產物的電泳圖，其中泳道1-Fl代細胞毒；2_F2代細胞毒；3_法氏囊病毒標準陽性對照；4_陰性對照；M-Marker。
[0021]保藏信息如下:
[0022]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0023]單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0024]參椐的生物材料(株):NJ09株。
[0025]分類命名:傳染性法氏囊病毒。
[0026]保藏號:CGMCCN0.7758。
[0027]保藏日期:2013年6月20日。
【具體實施方式】
[0028]雞新城疫病毒La Sota株:購自中國獸醫藥品監察所。
[0029]傳染性法氏囊病毒(Infect1usbursal disease Virus)BC6/85 株、B87 株來源:
[0030]購自中國獸醫藥品監察所。
[0031]【具體實施方式】
[0032]實例I傳染性法氏囊病毒NJ09株的分離與鑑定
[0033]1.NJ09株的分離
[0034](I)病料
[0035]病料為無菌採集疑似法氏囊病死亡病雞的法氏囊組織、心血、肝、腦、肺。
[0036](2)組織觸片
[0037]將病料作心血塗片及各臟器的病毒組織觸片，並進行染色鏡檢，發現病毒組織觸片染色鏡檢結果為陰性。
[0038](3)細菌培養
[0039]將上述病料，分別用馬丁肉湯和綿羊血培養基培養(按現行《中國獸藥典》附錄方法配製)，結果顯示無菌落生長，說明所述病料中不含有細菌。
[0040](4)病料處理
[0041]將上述病料在無菌容器中剪碎、磨碎，用含青鏈黴素的滅菌生理鹽水(每毫升生理鹽水含2000單位的青黴素和2000單位的鏈黴素)作1: 5倍稀釋，反覆凍融三次後，3000r/min離心20分鐘，取上清液保存於_20°C備用。
[0042](5)病毒分離、細胞馴化及收穫
[0043]將本實施例標題4中獲得的上清液，尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚，每胚接種量0.2ml，接種後置37°C條件孵化。接種24小時以內死亡胚棄去，收穫24小時以後死亡雞胚尿囊膜及胚體，組織搗碎後，用含青鏈黴素的滅菌生理鹽水(每毫升生理鹽水含1000單位的青黴素和1000單位的鏈黴素)作1: 2倍稀釋，反覆凍融三次後，3000r/min離心20分鐘，取上清液，即為通過雞胚傳代獲得的抗原毒(雞胚組織毒)El代，並連續通過雞胚傳至E4代，測定紅細胞凝集價及病毒含量。將紅細胞凝集價測定為陰性，病毒含量不低於105 0ELD50/0.2ml的抗原液1ml，接種已長成單層的DF-1細胞(由ATCC引進)，再加入9ml維持液(MEM營養液，購自默克密理博所屬北京清大天一科技有限公司，按商品說明現配現用)，37°C培養。培養時間達到120小時，收穫細胞毒，置一 20°C反覆凍融3次，離心取上清液連續盲傳26代，然後接種DF-1細胞出現典型病變，收穫細胞毒抗原液標記為Fl代；繼續在DF-1細胞上傳I代，收穫細胞毒抗原液，標記為F2代。取F2代細胞毒進行VP2基因序列測定。F2代細胞毒VP2全基因的RT-PCR擴增結果表明:擴增產物長度為1300bp (見圖1)與設計片段大小完全相符測序，表明為雞傳染性法氏囊病毒，置一 20°C保存。將F2代細胞毒通過DF-1細胞擴繁獲得的種毒(細胞毒)，命名為傳染性法氏囊病毒CV02株，縮寫為IBDV CV02 株。
[0044](6)純化獲得NJ09株
[0045]採用細胞或雞胚分離的病毒液中可能會混有I種或I種以上可以繁殖的其他病毒，需要通過純化試驗去除CV02株中混雜的野毒，分離到純淨、均一生長的傳染性法氏囊病毒。按《中國獸藥典》2010版附錄44頁方法製備CEF(雞胚成纖維細胞)，細胞數為
1.0-1.5XlOVml,鋪96孔細胞板，每孔加入0.1ml細胞懸液。將CV02株先10倍梯度稀釋至10_4，再2倍梯度、3倍梯度、5倍梯度分別稀釋至2_1(1、3_1(1、5_1(1。各稀釋度病毒接96孔細胞板，每孔接0.2ml，接毒後置37°C培養5天，每天觀察細胞病變情況。待細胞孔出現單個蝕斑時，把此孔細胞毒單獨回收，反覆凍融3次，-20°C保存備用。選擇稀釋度最高的蝕斑毒按此方法重複克隆兩次。測定第三次挑選的蝕斑毒病毒含量，共挑選蝕斑毒三株，其中第一株病毒含量為171TCID50M,高於另外兩株106 5TCID5(l/ml、106_7TCID5Q/ml。選擇病毒含量最高蝕斑毒命名為NJ09株,做為制苗用種毒，作為基礎種毒Fl代,並通過DF-1細胞連續傳至F15代。
[0046]2.NJ09株鑑定和性質
[0047](I)無菌檢驗
[0048]按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，NJ09株Fl代種毒樣品接種後，無菌生長。
[0049](2)病毒含量測定
[0050]將NJ09株Fl代病毒液10倍系列稀釋後，取10'10'10_8、10_9四個稀釋度，分別接種96孔細胞板上的單層雞胚成纖維細胞，置37°C孵育120小時。120小時後，逐孔觀察細胞病變，以接種細胞出現典型病變判為感染，按Reed-Muench方法計算病毒含量。結果表明:NJ09株Fl代種毒的病毒含量為107_ 1TCID5cZmL
[0051](3)特異性試驗
[0052]將NJ09株Fl代病毒液用滅菌生理鹽水作1: 100稀釋，與購自中國獸醫藥品監察所的雞傳染性法氏囊標準陽性血清混合，置37°C中和60分鐘後，接種雞胚成纖維細胞，0.2ml/孔(中和組)。同時設病毒對照組和陰性對照組各5孔，分別接種NJ09株Fl代病毒液1: 100稀釋液及滅菌生理鹽水，0.1ml/孔。接種後置37°C培養5天，每天觀察細胞病變情況。中和組、陰性對照組細胞無病變，病毒對照組所有孔全部出現典型病變，說明該毒株具有特異性，是傳染性法氏囊病毒，命名為傳染性法氏囊病毒(Infect1us bursaldisease Virus) NJ09株，縮寫為IBDV NJ09株或傳染性法氏囊病毒NJ09株或NJ09株，並送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。
[0053](4)毒力測定
[0054](a)VP2基因序列分析
[0055]RT-PCR 擴增 IBDV NJ09 株的 VP2 基因，序列如 SEQ ID NO:1 所示。IBDV NJO9 株的VP2基因序列與已報導強毒(HarBin-1)同源性99%，提示IBDV NJ09株具有強毒力。
[0056](b)對SPF雞的毒力試驗
[0057]攻毒用組織毒製備:將IBDV NJ09株病毒(105BID/0.1ml)與IBDV經典制苗株B87株(105 5ELD/0.2ml)、IBDV標準攻毒毒株BC6/85株病毒液(105BID/0.1ml)，分別按照1: 10稀釋，點眼感染SPF雞，72小時後剖檢，分別收穫各毒株感染雞法氏囊組織，搗碎後加入組織體積3倍的生理鹽水，即為攻毒用組織毒BI代，按此方法，用BI代組織毒再次感染SPF雞並收穫法氏囊組織，即為B2代組織毒。製備IBDV NJ09株B1、B2代組織毒，BC6/85株B1、B2代組織毒，B87株因是弱毒株，連續兩次感染SPF雞均不能使試驗雞發病。
[0058]毒力對比試驗:取NJ09株病毒Bl、BC6/85株B2和B87株E5代分別對SPF雞進行攻毒，統計攻毒後72小時內SPF雞的死亡數、感染數，結果如表1所示。從表1看出，NJ09株點眼感染SPF雞後，可引起試驗雞72小時內50 %死亡，感染率100 % ；BC6/85株可引起試驗雞100%感染，但不致死；B87株為制苗弱毒株，即便通過點眼、靜脈注射接種，也未能引起試驗雞感染髮病。各毒株攻毒試驗結果說明，NJ09株毒力比IBDV標準攻毒毒株BC6/85株更強，是超強流行毒株，不僅能引起試驗雞100%感染，而且還會造成50%死亡。
[0059]表1各毒株對SPF雞毒力比較試驗結果
[0060]
【權利要求】
1.一種雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗，其活性成分為滅活的雞新城疫病毒LaSota株和傳染性法氏囊病毒NJ09株，所述傳染性法氏囊病毒NJ09株的保藏號為CGMCC NO:7758。
2.權利要求1所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在於將雞新城疫病毒La Sota株病毒液與傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分別濃縮、滅活，然後混合均勻，得到混合病毒液；將所述混合病毒液與佐劑混合均勻，得到所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗。
3.根據權利要求2所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在將雞新城疫病毒La Sota株接種雞胚進行培養，收穫雞胚液作為雞新城疫病毒La Sota株病毒液；將傳染性法氏囊病毒NJ09株接種DF-1細胞或Ve1細胞進行培養，得到所述傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液。
4.根據權利要求3所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在於所述雞新城疫病毒La Sota株病毒液的病毒含量大於等於108_ °EID50/ml，所述傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液的病毒含量大於等於107』TCID5(l/ml。
5.根據權利要求4所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在於所述雞新城疫病毒La Sota株病毒液濃縮至原體積的1/4-1/2，所述傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液濃縮至原體積的1/5-1/7。
6.根據權利要求5所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在於所述濃縮後的雞新城疫 病毒La Sota株病毒液和傳染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分別滅活後，按照體積比2: (1-3)混合均勻，得到混合病毒液。
7.根據權利要求6所述雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗的製備方法，其特徵在於將混合病毒液與吐溫-80按照體積比96: 4混合均勻，得水相；將注射用白油和司本一80按照體積比為94:6混勻，得油相；將油相和水相按照體積比2:1混合均勻，獲得雞新城疫和傳染性法氏囊二聯滅活疫苗。
【文檔編號】A61P31/14GK104069489SQ201410326770
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月9日 優先權日:2014年7月9日
【發明者】於漾, 朱亞露, 揭鴻英, 畢志香, 褚軒, 何家惠, 侯繼波 申請人:江蘇省農業科學院