一種檢測青黴素的免疫膠體金試劑板的製備方法
2024-01-26 20:50:15
專利名稱：一種檢測青黴素的免疫膠體金試劑板的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測乳製品中抗生素殘留試劑板的製備方法，具體涉及一種檢測
青黴素藥物殘留的免疫膠體金試劑板的製備方法。
背景技術：
青黴素類抗生素是|3 -內醯胺類中一大類抗生素的總稱，因為價廉、方便、低毒、 高效等特點，被廣泛應用於實際生產。青黴素廣泛應用於治療奶牛疾病、促進奶牛生長、降 低發病率、提高飼料利用率，帶來乳業增產的同時，也不可避免的造成了原料奶抗生素殘留 問題，最終導致青黴素在人體內的殘留。由此可引起過敏反應，造成人體內環境平衡的紊亂 和菌群失調，同時在進行藥物治療時會產生耐藥性，另外青黴素殘留會導致牛乳的發酵不 能正常完成，對乳品生產企業造成巨大經濟損失，對進出口貿易造成一定影響。我國農業部 第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定青黴素G和普魯卡因青黴素在奶 類中殘留限量標準為4ng/mL。 目前，對於青黴素類藥物殘留的檢測方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化 分析法，如HPLC及LC-MS，具有特異性好、準確率高的特點，是各大檢測機構對檢測樣本進 行確證的首選方法，但存在對設備、環境、操作技能等要求，不利於大規模樣本篩選，因而不 適合廣大基層部門。免疫分析法，如酶聯免疫吸附法(ELISA)，具有檢測量大，操作相對簡單 等優點，越來越多地被用於動物性食品中抗生素殘留的檢測，但是ELISA法整個操作時間 仍需要l-2h，且需用到特殊儀器設備，具有一定局限性。
發明內容
本發明的目的在於針對上述方法的不足，提供一種靈敏度高、操作簡單、檢測時間
短、不需要特殊儀器設備、生產成本低的原奶中青黴素免疫膠體金快速檢測試劑板。 本發明試劑板由上下兩塊塑料模板、背襯及粘附在背襯上依次緊密相連的樣品
墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成。 其中樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l-2mm的重 疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位順利進行，另一方面是為了使樣 品溶液與樣品墊有充分反應時間，樣品墊上的緩衝體系可以中和樣品溶液的酸鹼度，保證 樣品溶液中的有效成分與膠體金結合墊上的金標抗體順利發生反應。 膠體金結合墊上包被有抗青黴素單克隆抗體與膠體金的結合物；硝酸纖維素膜上 從樣品墊到吸水墊方向依次包被有青黴素G-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測 線和質控線。偶聯青黴素G的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血藍蛋 白(KLH)等。抗青黴素單克隆抗體為可以識別青黴素G、氨苄青黴素和羥氨苄青黴素的免疫 球蛋白或其片段。 本發明試劑板的各部分組成成分與功能如下 塑料模板，起固定試紙條及標示功能區(加樣孔、檢測區、控制區)的作用。
背襯為一面塗有不乾膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組
成部分的作用。 樣品墊由玻璃纖維製成，起吸收樣品溶液與緩衝樣品溶液pH值的作用。 膠體金結合墊由聚酯膜製成，其上標記有抗青黴素單克隆抗體與膠體金的結合
物，是樣品溶液中的有效成分與金標抗體發生反應的場所。 硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表徵出來。
吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多餘的溶液吸收。
本發明試劑板具有如下有益效果 (1)特異性好。本發明試劑板對青黴素類藥物中的青黴素G、氨苄青黴素及羥氨苄 青黴素的交叉反應率分別為100%、70%及60%，對其他種類的抗生素包括氯黴素、喹諾酮 類、四環素類、慶大黴素、鏈黴素、磺胺類藥物等無交叉反應，可見，本發明對青黴素類藥物 反應均有高度專一性。 (2)靈敏度高。本發明試劑板對原奶中青黴素G的檢出限為4ng/mL，可以滿足我 國農業部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中對青黴素G和普魯卡因青黴 素在奶類中最高殘留限量4ng/mL的規定要求。 (3)操作簡單快捷，不依賴任何實驗設備，不需任何專業培訓。本發明試劑板將反 應所需的大部分原料整合到試劑條中，滴樣後抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮 短了檢樣時間，且樣品無需特殊處理，滴樣後3-5分鐘內即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素 膜上的檢測線和質控線的顏色深淺讀取結果，檢測過程無需特殊儀器輔助，普通人員均可 操作，不需要專業培訓，極易推廣使用。 (4)成本低，效益好。本發明試劑板生產工藝成熟、流程簡單，生產成本低廉，投資 少，收效快。
圖1為青黴素免疫膠體金快速檢測試劑板結構示意圖，其中1為樣品墊，2為膠體 金結合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不乾膠，8為PVC板。
圖2為青黴素免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制 區，T為檢測區。 圖3為青黴素免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定示意圖，其中C為控制區，T為 檢測區。
具體實施例方式
本發明試劑板的製備包括青黴素-BSA偶聯物的製備，抗青黴素單克隆抗體的制 備，膠體金溶液的製備，膠體金標記抗青黴素單克隆抗體的製備和青黴素免疫膠體金快速 檢測試劑板的組裝。 1.青黴素G與載體蛋白的偶聯 採用戊二醛法將青黴素G鈉鹽與載體蛋白偶聯製備免疫抗原和包被抗原。稱取 48mg青黴素G鈉鹽溶於2mL水中，用10mL PB緩衝液(0. lmol/L PH 6.0)溶解50mg牛血清 白蛋白，加入到上述溶液中，再緩慢加入lmL 10X戊二醛溶液，將混合溶液室溫下攪拌2h，雙蒸水透析5天，濾膜過濾後，收集。
2.抗青黴素單克隆抗體的製備 取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的青黴素G-載體蛋白偶聯物與等 體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 ii g/只劑量皮下注射，之後每隔3周加強免疫1次，用不 完全佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫l次，不用佐劑，劑量加倍。細胞融合按常規方法 進行將Sp2/0多發性骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1 : 10的比例混合，在50XPEG作用下 融合，HAT培養基懸浮，分種於96孔培養板中，371\5% C02培養箱中培養。
融合後，待細胞生長到培養孔面積的1/4時，採用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初 篩選擇10mg/L青黴素載體蛋白偶聯物(此處載體蛋白與作為免疫原的載體蛋白應為不同 種類)包被酶聯板，被測孔加培養上清，孵育、清洗後，加入羊抗鼠IgG-HRP(1 : 1000) ，OPD 顯色。篩選出的陽性孔再用青黴素G-載體蛋白偶聯物(同初篩)包被的酶聯板進行阻斷 間接ELISA。將細胞培養上清與2X10—^01/L青黴素溶液等量混合，37t:感作lh，加入已包 被的酶標板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH7.4)替代青黴素溶液作對照，其餘步驟同上。若 青黴素阻斷後的0D值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經2 3次檢測都呈陽性的 孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。 體外培養將克隆化的細胞株擴大培養，細胞濃度達5X10SmL—1時停止換液，細胞 全部死亡後收集培養液。體內誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天後的小鼠腹腔注射克隆 化細胞株107個細胞，7天後抽取腹水。
3.膠體金溶液的製備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其製備方法為在lOOmL去離子水中加入lmL 1% 檸檬酸三鈉，煮沸後迅速加入lmL 1%氯金酸，繼續煮沸10min，冷卻後，4t:下保存備用。
4.膠體金標記抗青黴素單克隆抗體的製備 取已製備好的100mL膠體金溶液，用0. lmol/L碳酸鉀溶液調pH到8. 0。邊攪拌 邊加入1. 5mg抗青黴素單抗，攪拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG 20000)，攪拌15min。 20， OOOrpm離心15min，棄上清液，加入10mL pH 7. 4PBS緩衝液(含 0. 4mol/LPEG)清洗2次。將沉澱用5mL含2% BSA的PBS緩衝液(pH 7. 4)溶解，用0. 22 y m 無菌過濾器過濾後，fC保存備用。
5.青黴素免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝 參照圖l，用點膜機把適當濃度的青黴素G-載體蛋白偶聯物及羊抗鼠IgG噴在硝 酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37t:烘箱乾燥8h。以同樣方法，將製備好的金標 記青黴素單克隆抗體包被在膠體金結合墊上。 檢測試劑組成為一個PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖 維素膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中製成檢測試 劑板，再放入帶乾燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。
6.青黴素免疫膠體金快速檢測試劑板檢測原理 當待檢樣品溶液滴入試劑板加樣孔後，樣品溶液因硝酸纖維素膜載體的毛細管作 用向另一端擴散。在移動的過程中，會發生相應的抗原抗體反應，並通過免疫膠體金的顏色 顯示出來。如果樣品溶液含有青黴素類藥物殘留，青黴素類藥物先和膠體金顆粒上的抗體 反應，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的青黴素類藥物佔據而無法與檢測線上青黴素G特異性抗原結合；當樣品中的 青黴素類藥物含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色， 判定為陽性。反之，當樣品中青黴素類藥物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上 的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。 7.青黴素免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施例操作方法
7. 1樣品製備取2mL原奶加入5mL離心管中，再加入60iiL 3mol/L HC1溶液，振蕩30秒。加入 4mL乙酸丁酯，劇烈振蕩1分鐘，靜置分層。取3mL上層溶液到另一離心管中，加入250 y L PB緩衝液(0. lmol/L PH 7. 4)，振蕩1分鐘，靜置分層。吸取至少100 y L下層溶液滴板。
7. 2檢測步驟 從包裝袋中取出試劑板，用滴管吸取待檢溶液，在加樣孔中滴入3滴(約100 ii L)， 加樣後開始計時，結果應在3 5分鐘讀取，其他時間判讀無效。
7. 3結果判斷 讀取結果時，將試劑板水平置於觀察者正面，如圖2右側所示。 陰性(-):T線顯色比C線深或一樣深，表明樣品中青黴素類藥物濃度低於4ng/mL
或無青黴素類藥物殘留。如圖3.a所示。 陽性(+) :T線顯色比C線淺，或T線無顯色，表明樣品中青黴素類藥物濃度高於 4ng/mL ;T線比C線越淺，表明樣品中青黴素類藥物濃度越高。如圖3. b所示。
無效未出現C線，可能操作不當或試劑板已失效。應再次閱讀說明書，並用新試 劑板重新測試。如圖3.c所示。
權利要求
一種青黴素免疫膠體金試劑板的製備方法，其特徵在於醋酸纖維膜上的膠體金結合墊上包被有抗青黴素單克隆抗體-膠體金標記物，從樣品墊到吸水墊方向依次是檢測線和質控線，包被有青黴素-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG。
2. 如權利要求1所說的標記物，其特徵在於將膠體金與抗青黴素單克隆抗體按一定比例混勻，使膠體金與抗青黴素單克隆抗體形成穩定的膠體金顆粒，通過濃縮形成抗青黴素單克隆抗體-膠體金標記物。
3. 如權利要求書l所說的檢測線，其特徵在於偶聯青黴素的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血藍蛋白(KLH)等。
4. 如權利要求1所說的製備方法，其特徵在於樣品中的青黴素含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性；反之，當樣品中青黴素含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。
5. 如權利要求1所說的製備方法，其特徵在於工藝流程包括製備青黴素-BSA偶聯物、製備抗青黴素單克隆抗體、製備膠體金溶液、製備膠體金標記抗青黴素單克隆抗體和組裝青黴素免疫膠體金快速檢測試劑板。
全文摘要
本發明涉及一種檢測青黴素藥物殘留的免疫膠體金試劑板的製備方法。該試劑板由上下兩塊塑料模板和試紙條組成。在試紙條背襯上依次緊密粘貼有樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，相鄰各部分間有1-2mm的重疊。膠體金結合墊上包被有抗青黴素單克隆抗體與膠體金的結合物，硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有青黴素G-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質控線。該試劑可半定量直觀檢測樣品中的青黴素G、氨苄青黴素和羥氨苄青黴素殘留，整個檢測過程僅需5分鐘左右，且無需任何實驗設備，利於大規模樣本篩選，適合於廣大基層部門對乳製品中的青黴素進行大規模快速檢測。
文檔編號G01N33/558GK101710121SQ20091015420
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月6日 優先權日2009年11月6日
發明者卜令傑, 張少恩, 桑麗雅, 邵偉 申請人:杭州南開日新生物技術有限公司