一種用微生物發酵技術生產複合膽紅素鹽的方法
2024-01-27 03:40:15 1
專利名稱：一種用微生物發酵技術生產複合膽紅素鹽的方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，用微生物發酵技術生產複合膽紅素鹽的方法。
背景技術：
天然牛黃作為傳統名貴中藥材，是中成藥的重要原料。長期以來，藥源緊缺，難以滿足 臨床用藥的需要，大量牛黃依賴進口。為此，為解決天然牛黃資源緊缺問題，醫藥專家一直 在尋找牛黃的替代品，自1972年國家陸續批准了3個牛黃代用品，g卩人工牛黃、培植牛黃和 體外培育牛黃。目前作為天然牛黃原料的替代用品，除了培植牛黃外，其他都是在牛體外生 產的產品，而醫藥市場也是以在牛體外生產的產品為主。天然牛黃形成的過程是一個生命歷 程，天然牛黃的替代用品無論從機理、工藝、成分、結構還是藥效等方面，都試圖與天然牛 黃接近。研究表明，無論是膽紅素鈣結石還是膽固醇結石，都與膽汁中膽汁酸鹽減少有關， 其膽酸受細菌的影響也是較嚴重的，牛黃中幾乎不存在游離膽酸的吸收峰，而主要是牛磺酸 和甘氨酸結合的膽汁酸，游離膽酸不是牛黃的主要成分，更不是成石的原因。體外膽汁中的 膽紅素是極不穩定的，極容易被破壞，牛磺膽酸鈉的存在可使膽紅素鈣鹽沉澱顆粒變小，顆
粒的聚集程度減小。還有，膽汁中的所有的有機和無機成分是在一個複雜和共生的環境下存 在並逐步交織在一起，最終形成特有的複雜成分和結構。而現在上市的體外生產的牛黃代用 產品，其原理與天然牛黃形成相背離，其所謂的工藝與天然牛黃的形成過程完全不同，成分 中包括膽紅素鹽、膽酸、以及去氧膽酸等的複合膽紅素鹽均是直接加入的，所以實質是化學 方法製備的牛黃代用品。所以複合膽紅素鹽的科學合理的製備是牛黃代用品最關鍵的技術和 工藝。
現有的天然牛黃代用品中複合膽紅素鹽的製作方法中存在以下不足 一、複合膽紅素鹽
中成分的形成與膽汁發酵不同步，不是一個生物生長過程。二、以膽紅素鈣為主要成分的復
合膽紅素鹽的形成過程是一個化學反應過程；膽酸類物質是直接添加游離的化學純。三、即 使有膽汁的發酵，但其過程與包括以膽紅素鈣為主要成分的複合膽紅素鹽和膽酸類物質形成 過程是分離的。四、膽汁中的細菌的生長繁殖不是一個自然的過程，而是運用單一或者幾種 篩選出的菌株進行接種發酵。五、現行的牛黃代用品所謂的品質控制是基於其質量標準的型 式檢測，所以其滿足的是檢測指標而已。
發明內容
本發明目的旨在提供一種用微生物發酵技術生產複合膽紅素鹽的方法，彌補現有天然牛 黃的替代品中製作複合膽紅素鹽關鍵技術的諸多缺陷不足，使其不只是滿足所謂的品質控制 是基於其質量標準的檢測指標等型式檢測，而是從機理、工藝、成分、結構、藥效等方面更 與天然牛黃接近，使天然牛黃的替代品發揮起應有的作用。
鑑於上述目的得以實現，本發明提供的技術方案如下-
本複合膽紅素鹽的製作方法，是用新鮮牛膽汁與牛黃的相關成分組成發酵底料配方和發 酵補料配方，發酵底料在發酵罐開放自然環境下染菌發酵，經過補料分批培養發酵，使複合 膽紅素鹽逐步形成，用蒸氣滅菌沉澱、蒸發濃縮、噴霧乾燥為成品複合膽紅素鹽。
上述製作工藝中，發酵底料配方為新鮮牛膽汁500-1000ml、牛磺酸5-10g。其優選配 方為新鮮牛膽汁600ml、牛磺酸5g。新鮮牛膽汁是指新鮮得到或新鮮得到並置於2-4'C冷 藏保存的膽汁。上述製作工藝中，新鮮牛膽汁直接加入牛磺酸組成底料發酵液。
上述製作工藝中，發酵補料配方為新鮮牛膽汁1000-1500ml、牛磺酸5-10g、膽紅素 35-50g、膽酸5-15、去氧膽酸3-8g、氫氧化鈣10-20g、硫酸鋅l-2g、硫酸鎂l-2g。其優選 配方為新鮮牛膽汁1200ml、牛磺酸8g、膽紅素40g、膽酸10、去氧膽酸5g、氫氧化鈣15g、 硫酸鋅lg、硫酸鎂lg。
上述製作工藝中，新鮮牛膽汁加入其他補料成分，並加入同比例的蒸餾水充分攪拌後組 成補料發酵液。
上述製作工藝中，上述底料發酵液和補料發酵液在不鏽鋼的配料罐中完成；發酵在不鏽 鋼的發酵罐中進行。
上述製作工藝中，將底料發酵液在溫度30-45'C的開放自然環境下染菌並進行發酵，發 酵周期為48-72小時，發酵過程在30-60轉/分進行轉動攪拌。其中的細菌包括大腸桿菌、腸 球菌但不限於以上細菌範圍。優選溫度為4(TC，轉速為60轉/分。
上述製作工藝中，底料發酵後進行兩次間歇地補料發酵；第一次在底料發酵後進行，發 酵36-48小時後進行第二次在補料發酵，溫度仍在30-45。C範圍內，發酵過程在30-60轉/分 進行轉動攪拌。優選溫度、轉速同上。
上述製作工藝中，第二次在補料料發酵48小時後結束髮酵，是發酵罐升溫到60-65'C繼 續攪拌20-30分鐘，繼續升溫到90-10(TC繼續攪拌15-30分鐘後，冷卻，冷卻後見大量的棕 紅色沉澱物。在升溫過程中繼續進行轉動攪拌。
上述製作工藝中，將升溫並冷卻後發酵物過濾放入真空旋轉蒸發裝置中，減壓至一0.8 Mpa 一0.9Mpa，在65-75'C恆溫條件下蒸發濃縮，至含固量達到30-40%結束。
上述製作工藝中，將濃縮液在0.1 Mpa壓力條件下，進口溫度130-140"、塔內溫度 100-ll(TC、出口溫度70-85。C，進行噴霧乾燥，最終得到粉狀複合膽紅素鹽產品。
上述製作工藝中，最終產品檢測指標為膽紅素>35%、游離膽紅素《0.7、灰分《10%、水 分《10%.
本發明與現有的複合膽紅素鹽的製作方法相比具備其優勢如下 一、本發明製造的複合 膽紅素鹽與天然牛黃形成的原理相一致。二、本發明製造的複合膽紅素鹽中的成分是在生物、 生化過程中形成的，不是化工原料簡單的混合和堆積。三、膽汁中的細菌的生長繁殖發酵是 一個自然的過程，與體內細菌感染和繁殖一致。四、檢測指標和品質控制不是簡單得滿足型 式檢測，而是發酵前、中的靜態配方指標與發酵中的動態過程相交織，最終達到發酵後產品 的品質控制。
具體實施例方式
本發明通過下列具體方案得以實施，所述的實施案例並不局限於案例的具體內容。 案例l:將新鮮牛膽汁6000 ml加入牛磺酸50g在不鏽鋼配料罐中組成底料發酵液後道入不 鏽鋼的發酵罐中，在溫度4(TC的開放自然環境下染菌並進行發酵60小時，發酵過程在45轉/ 分進行轉動攪f豐。再用新鮮牛膽汁12000ml加入牛磺酸80g、膽紅素400g、膽酸100g、去氧膽 酸50g、氫氧化鈣150g、硫酸鋅10g、硫酸鎂10g，並加入同比例的蒸餾水充分攪拌後組成 25000ml，底料發酵結束加入補料發酵液12500ml發酵48小時後，進行第二次補料12500ml繼續 發酵48小時發酵，溫度仍在4(TC範圍內，發酵過程在60轉/分進行轉動攪拌。發酵結束後，將 發酵罐升溫到65。C繼續攪拌30分鐘，再繼續升溫到10(TC繼續攪拌30分鐘後，冷卻，並冷卻後 發酵物過濾放入真空旋轉蒸發裝置中，減壓至一0.8Mpa，在65'C恆溫條件下蒸發濃縮，至含 固量達到35%結束，將濃縮液在O. 1 Mpa壓力條件下，進口溫度13(TC、塔內溫度10(TC、出口 溫度70。C，進行噴霧乾燥，最終得到1000g士100g粉狀複合膽紅素鹽產品。最終產品檢測指標 為膽紅素>36%、游離膽紅素《0. 7、灰分《10%、水分《10%。
案例2:將新鮮牛膽汁18000 ml加入牛磺酸200g在不鏽鋼配料罐中組成底料發酵液後道入
4不鏽鋼的發酵罐中，在溫度42'C的開放自然環境下染菌並進行發酵50小時，發酵過程在45轉/ 分進行轉動攪拌。再用新鮮牛膽汁36000ml加入牛磺酸250g、膽紅素1250g、膽酸300g、去氧 膽酸120g、氫氧化鈣400g、硫酸鋅30g、硫酸鎂30g，並加入同比例的蒸餾水充分攪拌後組成 80000ml，底料發酵結束加入補料發酵液40000ml發酵48小時後，進行第二次補料40000ml繼續 發酵48小時發酵，溫度仍在40'C範圍內，發酵過程在60轉/分進行轉動攪拌。發酵結束後，將 發酵罐升溫到6(TC繼續攪拌30分鐘，再繼續升溫到10(TC繼續攪拌25分鐘後，並冷卻後發酵物 過濾放入真空旋轉蒸發裝置中，減壓至一0.8Mpa，在70'C恆溫條件下蒸發濃縮，至含固量達 到10%結束，將濃縮液在O. 1 Mpa壓力條件下，進口溫度135'C、塔內溫度105'C、出口溫度75 'C，進行噴霧乾燥，最終得到3000g土200g粉狀複合膽紅素鹽產品。最終產品檢測指標為膽紅 素》37%、游離膽紅素《0. 7、灰分《10%、水分《8%。
案例3:將新鮮牛膽汁30000 ml加入牛磺酸300g在不鏽鋼配料罐中組成底料發酵液後道入 不鏽鋼的發酵罐中，在溫度38'C的開放自然環境下染菌並進行發酵60小時，發酵過程在30轉/ 分進行轉動攪拌。再用新鮮牛膽汁60000ml加入牛磺酸350g、膽紅素2000g、膽酸500g、去氧 膽酸200g、氫氧化鈣700g、硫酸鋅50g、硫酸鎂40g，並加入同比例的蒸餾水充分攪拌後組成 130000ml，底料發酵結束加入補料發酵液65000ml發酵48小時後，進行第二次補料65000ml繼 續發酵48小時發酵，溫度仍在4(TC範圍內，發酵過程在45轉/分進行轉動攪拌。發酵結束後， 將發酵罐升溫到6(TC繼續攪拌30分鐘，再繼續升溫到10(TC繼續攪拌25分鐘後，冷卻，冷卻後 發酵物經過過濾放入真空旋轉蒸發裝置屮，減壓至一0.8Mpa，在65'C恆溫條件下蒸發濃縮， 至含固量達到38%結束，將濃縮液在O. 1 Mpa壓力條件下，進口溫度135。C、塔內溫度102'C、 出口溫度7(TC，進行噴霧乾燥，最終得到5000g士400g粉狀複合膽紅素鹽產品。最終產品檢測 指標為膽紅素5536%、游離膽紅素《0.6、灰分《10%、水分《9%。
權利要求
1. 一種用微生物發酵技術生產複合膽紅素鹽的方法，其特徵在於是用新鮮牛膽汁與牛黃的相關成分組成發酵底料配方和發酵補料配方，發酵底料在發酵罐開放自然環境下染菌發酵，經過補料分批培養發酵，使複合膽紅素鹽逐步形成，用蒸氣滅菌沉澱、過濾、蒸發濃縮、噴霧乾燥為成品複合膽紅素鹽。
2. 根據權利1要求的方法，其特徵在於新鮮牛膽汁直接加入牛磺酸組成底料發酵液；發酵底 料配方為新鮮牛膽汁500-1000ml、牛磺酸5-10g。其優選配方為新鮮牛膽汁600 ml、牛 磺酸5g。新鮮牛膽汁是指新鮮得到或新鮮得到並置於2-4'C冷藏保存的膽汁。
3. 根據權利l要求的方法，其特徵在於新鮮牛膽汁加入其他補料成分，並加入同比例的蒸餾 水充分攪拌後組成補料發酵液；發酵補料配方為新鮮牛膽汁1000-1500ml、牛磺酸5-10g、 膽紅素35-50g、膽酸5-15、去氧膽酸3-8g、氫氧化鈣10-20g、硫酸鋅1-2g、硫酸鎂l-2g。 其優選配方為新鮮牛膽汁1200ml、牛磺酸8g、膽紅素40g、膽酸10、去氧膽酸5g、氫氧 化鈣15g、硫酸鋅lg、硫酸鎂丄g。
4. 根據權利1要求的方法，其特徵在於上述底料發酵液和補料發酵液在不鏽鋼的配料罐中完 成，發酵在不鏽鋼的發酵罐中進行；將底料發酵液在溫度30-45。C的開放自然環境下染菌並 進行發酵，發酵周期為48-72小時，發酵過程在30-60轉/分進行轉動攪拌。其中的細菌包括 大腸桿菌、腸球菌但不限於以上細菌範圍。優選溫度為4(TC，轉速為60轉/分。
5. 根據權利1要求的方法，其特徵在於底料發酵後進行兩次間歇地補料發酵；第一次在底料 發酵後進行，發酵36-48小時後進行第二次在補料發酵，溫度仍在30-45i:範圍內，發酵過 程在30-60轉/分進行轉動攪拌。優選溫度、轉速同上。
6. 根據權利1要求的方法，其特徵在於第二次在補料料發酵48小時後結束髮酵，是發酵罐 升溫到60-65。C繼續攪拌20-30分鐘，繼續升溫到90-IO(TC繼續攪拌15-30分鐘後，冷卻， 冷卻後見大量的棕紅色沉澱物，在升溫過程中繼續進行轉動攪拌。
7. 根據權利l要求的方法，其特徵在丁將升溫並冷卻後發酵物過濾後，放入真空旋轉蒸發裝 置中，減壓至一O. 8Mpa^^ — 0.9Mpa，在65-75'C恆溫條件下蒸發濃縮，至含固量達到30-40%。
8. 根據權利1要求的方法，其特徵在於將濃縮液在0. 1 Mpa壓力條件下，進口溫度130-]40 °C、塔內溫度100-ll(TC、出口溫度70-85'C，進行噴霧乾燥，最終得到粉狀複合膽紅素鹽產 品。最終產品檢測指標為膽紅素》35t游離膽紅素《0. 7、灰分《10%、水分《10%。
9. 根據權利1要求的方法，其特徵在於將新鮮牛膽汁500-1000ml加入牛磺酸5_10g，在不 鏽鋼配料罐中組成底料發酵液後道入不鏽鋼的發酵罐中，在溫度30-45'C的開放自然環境下 染菌並進行發酵48-72小時，發酵過程在30-60轉/分進行轉動攪拌。再用牛膽汁1000-1500nd 加入牛磺酸5-10g、膽紅素35-50g、膽酸5-15、去氧膽酸3-8g、氫氧化鈣10-20g、硫酸鋅 l-2g、硫酸鎂l-2g，並加入同比例的蒸餾水充分攪拌後組成1500-2500ml，底料發酵結束加 入補料發酵液800-1500ml發酵36-48小時後，進行第二次補料800-1500ml繼續發酵36-48 小時發酵，溫度仍在30-45'C範圍內，發酵過程在30-60轉/分進行轉動攪拌。發酵結束後， 將發酵罐7I溫到65'C繼續攪拌20-30分鐘，再繼續升溫到90-IOO'C繼續攪拌15-30分鐘後， 冷卻過濾後，放入真空旋轉蒸發裝置中，減壓至一0.8 Mpa 一0.9Mpa，在65-75。C恆溫條件 下蒸發濃縮，至含固量達到30-40%結束，將濃縮液在0. 1 Mpa壓力條件下，進口溫度130-140 °C、塔內溫度100-ll(TC、出口溫度70-85'C，進行噴霧乾燥，最終得到粉狀複合膽紅素鹽產 品。最終產品檢測指標為膽紅素》35%、游離膽紅素《0.7、灰分《10%、水分《10%。
全文摘要
提供一種用微生物發酵技術生產複合膽紅素鹽的方法。本發明彌補現有天然牛黃的替代品中製作複合膽紅素鹽關鍵技術的諸多缺陷不足，是用新鮮牛膽汁與牛黃的相關成分組成發酵底料配方和發酵補料配方，發酵底料在發酵罐開放自然環境下染菌發酵，經過補料分批培養發酵，使複合膽紅素鹽逐步形成，用蒸氣滅菌沉澱、蒸發濃縮、噴霧乾燥為成品複合膽紅素鹽。使其不只是滿足所謂的品質控制(基於其質量標準的檢測指標等型式檢測)，而是從機理、工藝、成分、結構、藥效等方面更與天然牛黃接近，使天然牛黃的替代品發揮起應有的藥用價值和作用。
文檔編號C12P17/18GK101469337SQ20071016905
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月28日 優先權日2007年12月28日
發明者傑 胡 申請人:傑 胡