耐輻射異球菌R1pprM基因在改良植物抗旱性狀中的應用的製作方法
2024-01-20 12:09:15
專利名稱：耐輻射異球菌R1pprM基因在改良植物抗旱性狀中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及耐輻射異球菌Rl pprM基因(Deinococcus radiodurans Rl pprM)的新功能，具體涉及該PPrM基因在改良植物對乾旱脅迫抗性等方面的用途。
背景技術：
而才_畐身寸胃王求胃 Deinococcus radiodurans Rl ^ 1956 ^Ξ Anderson ^ AMi^U 射滅菌處理的罐頭中發現的一種紅色細菌。Deinococcus radiodurans Rl 中的 pprM ―因(DR_0907, GeneID :1797366) 為冷激蛋白，在2009年Hirofumi Ohba等人發現該基因能依賴於PprI調控PprA等一系列 DNA損傷修復相關的蛋白(Ohba，H. Satoh, et al.，2009)來參與電離輻射後的DNA損傷修復，該基因也是Deinococcus radiodurans Rl具有輻射抗性的關鍵基因。儘管一般認為輻射抗性與乾旱脅迫抗性在進化上具有協同性，但目前有關 Deinococcusradiodurans Rl pprM基因對於提高植物抗旱性能的研究，並未見有報導。
發明內容
本發明的目的是從D. radiodurans Rl基因組中發現能夠增強植物乾旱抗性的基因。並將該基因轉入植物，使其獲得抵抗乾旱的能力。n 明入胃 3 ， Deinococcus radiodurans Rl pprM S @ (DR_0907, GeneID 1797366)具有抗旱的功能，可用於培育抗旱性狀的植物。本發明進行了如下工作1.通過 PCR 從 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因組擴增出 D. radiodurans RlpprM基因(DR_0907)，基因序列號為GeneID 1797366。其大小為402bp，將其克隆於載體pGEMT-easy上，構建了含有完整pprM基因的重組質粒pGEMT-pprM ；2.將能在大腸桿菌和耐輻射異球菌中都起作用的groEL啟動子連接於上述 pGEMT-pprM重組質粒上，構建具有groEL含完整的pprM基因的重組質粒pGEMT-pprMG ；3.將導入pprM基因的重組質粒pGEMT-pprMG轉入受體大腸桿菌JM109中，獲得工程菌株JM_pprM ；經實驗證實，該菌株具有分別抵抗4M NaCl和高濃度(3M)山梨醇(Sorbitol)衝擊的能力(因Sorbitol具有吸溼性，高濃度的Sorbitol溶液可以模擬乾旱的環境，詳見實施例2)；4.將D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)連接到植物表達載體pBI121 中，構建具有PPrM基因的重組質粒pBI121-pprM ；5.將pBI121-pprM重組質粒導入不具乾旱抗性的油菜中，獲得能夠耐受乾旱的油菜植株；實驗結果表明含有本發明所得的D. radiodurans Rl pprM基因的轉基因油菜獲得了較強的對乾旱的耐受能力(詳見實施例5，6，7)。
圖 1 是含有 D. radiodurans Rl pprM 基因(DR_0907)序列的 PCR 產物；圖2是含有D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)及groEL啟動子的原核表達載體的構建驗證電泳圖譜；圖3是含有D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)序列的植物表達載體構建的驗證電泳圖譜；圖4是在衝擊試驗前的含有空載體和含有D. radiodurans Rl pprM基因 (DR_0907)序列的原核表達載體的大腸桿菌的生長狀況，其中a是含有空表達載體的大腸桿菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)序列表達載體的大腸桿菌JM109 菌株；圖5是含有D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)序列的原核表達載體及空載體的大腸桿菌(E. coli)在含3M山梨醇的培養基中生長狀況，證明D. radiodurans Rl pprM 基因(DR_0907)能夠增強大腸桿菌具有抗旱的功能。圖中的菌株如下a是含有空表達載體的大腸桿菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)序列表達載體的大腸桿菌JM109菌株。圖6含有D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)序列表達載體及空載體的大腸桿菌在含4M NaCl的培養基中生長狀況，證明D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)具有耐鹽抗性。圖中的菌株如下a是含有空表達載體的大腸桿菌JM109菌株；b是含有D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)序列表達載體的大腸桿菌JM109菌株。圖7是轉基因油菜的RT-PCR驗證。圖8是轉pprM基因的油菜在處理前的狀態。圖9是陰性對照(非轉基因的油菜)在處理前的狀態。圖10是轉pprM基因的油菜停止澆水1周的狀態。圖11是陰性對照(非轉基因的油菜)停止澆水1周的狀態。圖12是轉pprM基因的油菜停止澆水2周的狀態。圖13是陰性對照(非轉基因的油菜)停止澆水2周的狀態。圖14是乾旱脅迫後轉基因油菜和野生型油菜植物組織細胞膜滲透性對比，其中縱坐標表明離子滲透率。圖15是乾旱脅迫後轉基因油菜和野生型油菜葉片丙二醛含量對比，其中縱坐標
表明丙二醛含量。
具體實施例方式以下實施例中所舉的質粒、菌株只是用於對本發明作進一步詳細說明，並不對本發明的實質內容加以限制。凡未註明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中所舉的質粒、菌株來源如下克隆載體pGEMT-easy 為ftOmrga公司市售產品；植物表達載體pBI121 為Clontech公司市售產品；大腸桿菌JM 109 為北京全氏金公司市售產品。農桿菌EHA 105由本實驗室保存實施例1 D. radiodurans Rl pprM基因序列在大腸桿菌中的表達根據已公布的D. radiodurans Rl基因組中的pprM基因序列設計一對PCR特異性引物，從D. radioduransRl基因組DNA中擴增完整的核苷酸序列。Up 5' AGCGACTAGT GCCAAAT ATGTGCCGAGTTTC 3' ；Down 5' ATCCCATATGTTACCAG CGGTCGTCGCGGC3 『。通過PCR方法從D. radiodurans Rl的基因組中擴增出序列SEQ ID N0: 1，條件95°C IOmin, [95°C 30sec，55°C 30sec，72°C 45sec] 30 個循環，72°C 10min，PCR 產物經膠回收後，克隆於載體pGEMT-easy上，命名為pGEMT-pprM，然後將來自於D. radiodurans Rl的groEL啟動子也連到這個載體上，構建大腸桿菌表達載體pGEMT-pprMG，將該表達載體轉化大腸桿菌JM109，經PCR、酶切，測序三方面驗證插入序列的正確(見圖1，2)，將該菌株命名為JM_pprM。將含有pGEMT-easy+groEL 空質粒的 Ε. coli JM109 命名為 JM_pGEMT_G。實施例2含D. radiodurans Rl pprM基因的工程菌株提高幹旱和鹽的耐受性實驗一、實驗方法1、將實施例1中所得的兩個重組的大腸桿菌接種於20mL LB液體培養基中，搖瓶培養3-4h後，再轉接於IOOmL的LB液體培養基中，儘量保持接種量的一致，培養至 0D0. 3-0. 4之間，儘量調至OD值一致。2、取IOmL的菌液離心後，在等體積的4M NaCl鹽溶液和3M的山梨糖醇溶液裡衝擊2h，每個樣品立即用無菌去離子水等比稀釋至10_4，取10 μ L點在LB固體培養基表面，經 37°C培養16h，觀察並照相。4M NaCl鹽溶液和3M的山梨糖醇均為高滲溶液，能模擬乾旱脅迫。二、實驗結果從圖4 中可看出，衝擊前含有 D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)的 JM_pprM 菌株與含空質粒的JM_pGEMT-G菌株生長狀態基本一致；4M NaCl鹽溶液和3M山梨醇衝擊後，含有D. radiodurans Rl pprM基因(DR_0907)的JM_pprM菌株生長狀況良好，菌落數目明顯多於只含空質粒的JM_pGEMT-G菌株(見圖4，5，6)。三、結論D. radiodurans Rl pprM基因能幫助原核生物耐受乾旱和鹽的脅迫。實施例3 D. radiodurans Rl pprM基因在油菜細胞中進行真核細胞表達及轉基因植株的鑑定(一)含目的基因植物表達載體的構建根據D. radiodurans Rl基因組序列設計pprM基因用於植物表達的引物，上遊引物加Bam HI，下遊引物加Mc I兩個酶切位點，且把起始密碼子從gtg改為atg。引物序列如下DR0907 PLANT UP :CGGCGGATCC ATGTGCCGAGTTTCGATTGT ；
5
DR0907 PLANT DOWN :ATTAGAGCTC TTACCAGCGGTCGTCGCGGC。且上遊帶有Bam HI酶切位點，下遊帶有Mc I酶切位點，將pprM (DR_0907)基因從基因組中擴增出來，片段經Bam HI,Sac I雙酶切膠回收後連接到同樣雙酶切的植物表達載體pBI 121上，構建出含有完整的DR0907基因的表達載體pBI 121-pprM(見圖3)。( 二)農桿菌介導轉化油菜實驗1.根癌農桿菌EHA105感受態的製備1)挑取單菌落，接種於5mL YEB液體培養基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250rpm 振蕩培養過夜；2)取 2mL 菌液，加入 50mL YEB 液體培養基(含 Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm 振蕩培養至OD6tltl約0. 6左右；3)將菌液轉至50mL無菌離心管中，冰浴30min，5000 X g離心5min ；4)棄上清，沉澱用2mL 20mM CaCl2重浮，每份100 μ L分裝到1. 5mL離心管中，液
氮中保存備用。2.重組質粒DNA轉入農桿菌1)將約pBI-pprM質粒DNA分別加入到100 μ L ΕΗΑ105感受態細胞中，混勻，冰浴5min ；2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉至37°C水浴中溫浴5min ；3)加入ImL YEB液體培養基，在搖床上250rpm復甦4 釙；4)取適量菌液塗布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那黴素(Kan) 100mg/L的YEB固體培養基上，置培養M 48h。3.農桿菌的質粒的提取1)挑取菌落於含利福平(Rif) 50mg/L和卡那黴素(Kan) 100mg/L的YEB液體培養基中(YEB 胰蛋白腖5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂0. 5g/L)，28°C，250rpm振蕩培養20h ；2)取 1. 5mL 菌液離心後，棄上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM pH8. 0，NaCl IOmM, EDTA IOmM pH 8. 0)洗滌兩次，棄上清，加入預冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8. O, IOmM EDTApH 8.0，RNaseA 100 μ g/mL) 300 μ L，用移液器反覆抽吸混勻，室溫靜置IOmin ；3)加入新鮮配置的溶液II (0. 2M NaOH, 1 % SDS) 600 μ L，上下顛倒幾次混勻；4)加入預冷的溶液III (5Μ乙酸鉀pH 5. 2，冰醋酸11. 5mL，加水至IOOmL) 450 μ L， 充分混勻，冰浴5min，4°C 12000 Xg離心5min，取上清用0. 6倍體積的異丙醇沉澱；5)沉澱用 TE (Tris-HCI 10mmol/L, lmmol/LEDTA, pH 8. 0)溶解後，經 PCR、BamHI, Sac I雙酶切驗證。4.油菜無菌苗的準備及農桿菌介導的pprM基因遺傳轉化1)油菜無菌苗的培養甘藍型油菜(Brassica napus L. ) (84100-18)種子在超淨工作檯上用滅菌水浸泡 IOmin, 10%的NaClO滅菌12min，再用0. 1 %的升汞溶液消毒7-8min，用滅菌水洗3_5遍，並把滅菌的油菜種子均勻地擺放在無激素的預培養基上(7.5%瓊脂)。光照培養，4-5d齡油菜幼苗最適於遺傳轉化。
2)預培養用75%的酒精和高溫消毒滅菌的剪刀剪掉子葉和生長點，剪取油菜無菌苗緊鄰生長點下約0.5cm長的下胚軸，置於預培養基(MS+6-BA 2mg/L+2，4_D 1 mg/L+AgN03 2. 5mg/ L+AS 19. 62mg/L)上，光照預培養2d。3)農桿菌的培養在50mL LB液體培養基(含卡那黴素100mg/L、利福平50mg/L)中加入 0. ImLpprM-EHA 105 菌液，28°C下 220rpm 振蕩培養 16h 左右，室溫下 4000 Xg 離心 lOmin， 棄上清液，菌體用滅菌的MS液體培養基(含AS 100ymol/L)懸浮，稀釋到原體積的5_20 倍，在下220rpm振蕩培養Ih，使菌液的OD6tltl達0. 5左右。4)共培養把預培養2d的下胚軸放入菌液中浸染lmin，用藥勺撈出下胚軸，放在滅菌的吸水紙上，吸乾下胚軸上的多餘菌液，再放到覆蓋有滅菌濾紙的預培養基上，用封口膜封好培養皿，25 °C左右，於暗處共培養約2d(暗培養)。5)誘導培養把共培養2d的下胚軸放到誘導培養基(MS+6-BA 2mg/L+AgN03 2. 5mg/L)上，用封口膜封好培養皿，25°C左右光照培養，每兩周繼代一次，直至長出膨大的愈傷組織。6)選擇培養把膨大的愈傷組織轉移到到篩選培養基(MS+6-BA 2mg/L+AgN032. 5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培養皿，25°C左右光照培養，每兩周繼代一次，直至長出苗。7)生根培養當幼芽長到l-2cm高時，把它們從愈傷組織上分離，轉移到生根培養基上 (1/2MS+NAA 0. 5mg/L+Kan 25mg/L)進行生根培養。在抗生素篩選條件下，約87%的芽在兩周後形成根。8)煉苗和移栽生根後的幼苗長到5-6cm高時，半敞開培養瓶蓋子，進行煉苗；待幼苗適應外界環境以後，轉移到室內滅菌的蛭石中栽種培養，並用1/2MS培養液澆灌。當幼苗生長至7-9cm 時，將幼苗移植到泥土中生長，然後再進行下一步實驗。實施例4利用RT-PCR方法檢測pprM基因在轉基因油菜植株中的表達1植物總RNA的提取使用上海華舜生物技術有限公司生產的柱離心式小量植物總RNA抽提試劑盒提取獲得的轉PPrM基因油菜的RNA，並用DNase I處理DNA。2RT-PCR反轉錄使用NEB公司的試劑盒(DyNAmo cDNA Synthesis Kit)。以反轉錄得到的 cDNA 為模板，利用引物 DR0907 PLANT UP CGGCGGATCCATGTGCCGAGTTTCGATTGT ；DR0907 PLANT DOWN :ATTAGAGCTC TTACCAGCGGTCGTCGCGGC 進行 PCR 反應，條件為 950C IOmin, [95°C 30sec，55°C 30sec，72°C 45sec] 30 個循環，72°C IOmin0PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測後，測序驗證。表明pprM基因已經成功的轉入到油菜內(見圖7)。實施例5轉pprM基因植物的抗旱實驗(1)——油菜植物葉片含水量測定
鑑於該核苷酸序列已被證明在大腸桿菌中對乾旱脅迫具有抗性，進一步對轉基因植株進行抗旱性鑑定。對油菜一次性澆足營養液後不再澆水，每隔一天測定葉片含水量。含水量的測定方法約0. Ig葉片從植株上取下後，立即稱取鮮重(FW)，然後將葉片浸入去離子水中4小時，取出用濾紙吸去表面水分，稱取飽和鮮重(TW)，然後將葉片放入烘箱於70°C烘乾至恆重，稱取乾重(DW)。相對含水量(Relativewatercontent，RffC)(% ) = (Fff-Dff)/(Tff-Dff) X 100%。植株在乾旱處理過程中，葉片相對含水量逐漸下降，且隨著乾旱處間的延長，轉基因植株相對含水量與野生型的差異逐漸明顯。野生型植株在幹早脅迫第4天時，葉片已經開始萎蔫，含水量急劇下降；轉基因的油菜乾旱脅迫第7天時，葉片才開始萎蔫，葉片失水速度明顯比野生型緩慢；幹早脅迫14天後，對照植株的葉片相對含水量降到49%，而轉基因株系的相對含水量在64-68%之間，遠高於對照植株(見圖8,9,10，11，12，13)。實施例6轉pprM基因植物的抗旱實驗O)——乾旱脅迫後轉基因油菜和野生型油菜植物組織細胞膜滲透性對比1)實驗目的當植物受到逆境影響時，如高溫或低溫、乾旱、鹽漬、病原菌侵染後，細胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細胞內的電解質外滲，以致植物細胞浸提液的電導率增大。膜透性增大的程度與逆境脅迫強度有關，也與植物抗逆性的強弱有關。這樣，比較同一作物不同品種在不同脅迫溫度下膜透性的增大程度，即可比較作物間的抗性強弱。因此，電導儀法已成為目前作物抗逆性栽培、育種上鑑定作物抗逆性強弱的一個精確而實用的方法。乾旱脅迫常常引起植物細胞損傷，導致細胞膜離子滲透率增加和脂膜過氧化。2)實驗材料a轉pprM基因的油菜(獲得方法見實施例2~)和野生型的油菜同時一次性澆足營養液後不再澆水，乾旱處理第8天的葉片；b未經乾旱處理的轉基因及野生型的油菜葉片；3)實驗方法和步驟經過乾旱處理的油菜葉片和沒有經過幹早處理的油菜葉片約0. lg，用雙蒸水衝3 次，以吸水紙輕輕吸乾葉片表面水分，將葉片剪碎置於25mL雙蒸水中，在真空乾燥器中於 0. 05MPa下抽氣20min，25°C下緩慢振蕩池，然後測定電導率Si，同時測定水的空白電導率 Cl。再將樣品在沸水浴中處理20min，冷卻至室溫後定容到25mL測定電導率S2，以相同方式處理水，測定其空白電導率C2。離子滲透率=(Sl-Cl)/(S2-C2) X 100%。4)實驗結果未處理的植株中，離子滲透率在12-15%之間；乾旱處理8天，野生型的植株的葉片細胞膜離子滲透率達到32%;轉基因植株的離子滲透率為22-24%，顯著小於野生型植株 (見圖14)。實施例7轉pprM基因植物的抗旱實驗(3)——乾旱脅迫後轉基因油菜和野生型油菜葉片丙二醛含量比對1)實驗目的本實驗採用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。其原理為植物在逆境條件下，往往發生膜脂過氧化作用，丙二醛(malondialdehyde，MDA)是其產物之一，通常利用它作為脂質過氧化指標，表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱。丙二醛在高溫、酸性條件下與硫代巴比妥酸(TBA)反應，形成在532nm波長處有最大光吸收的有色三甲基複合物，該複合物的吸光係數為155[mmol/(L*Cm)]，並且在600nm 波長處有最小光吸收。可按下列公式A532-A600 = 155000 X CX L(1)算出MDA濃度C( μ mol/L)，進一步算出單位重量鮮組織中MDA含量C( μ mol/g)。 式中A532和A6tltl分別表示532nm和600nm波長處的吸光度值。L為比色杯厚度(cm)。需要指出的是，植物組織中糖類物質對MDA-TBA反應有幹擾作用。為消除這種幹擾，經試驗，可用下列公式消除由蔗糖引起的誤差。C/ μ mol/L = 6. 45 (A532-A600) _0· 56Α450( 2)式中:Α450、A532 > A600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的吸光度值。用公式 (2)可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度，進一步算出其在植物組織中的含量。2)實驗材料a轉pprM基因的油菜(獲得方法見實施例幻和野生型的油菜同時一次性澆足營養液後不再澆水，乾旱處理第8天的葉片；b未經乾旱處理的轉基因及野生型的油菜葉片。3)實驗方法和步驟a取0.5g油菜葉片，共4份，分別加入5% TCA 5mL，研磨後所得勻漿在3000X g下離心IOmin ；b取上清液2mL，加0. 67% TBA 2mL,混合後在100°C水浴上煮沸30min，冷卻後再離心一次；c分別測定上清液在450nm、532nm和600nm波長下的吸光度值，並按公式(2)算出 MDA濃度，再算出單位鮮重組織中的MDA含量(μ mol/g)；d所得數據採用方差分析檢驗兩個不同油菜MDA含量的差異性。4)實驗結果乾旱脅迫後，轉基因植株的丙二醛的含量也低於野生型(見圖15)。以上實驗證明轉Deinococcus radiodurans Rl中pprM基因的油菜的抗逆性遠遠高於對照組的油菜。
權利要求
1.Deinococcus radiodurans Rl pprM 基因(DR_0907, GeneID :1797366)培育抗旱植物的用途。
2.含有權利要求1所述基因的重組質粒。
3.權利要求2所述的重組質粒，是能在大腸桿菌表達的質粒。
4.權利要求2所述的重組質粒，是能在植物中表達的質粒。
5.用權利要求2所述的重組質粒轉化的宿主細胞，包括原核細胞和真核細胞。
6.Deinococcus radiodurans Rl pprM—因(DR_0907, GeneID :1797366) 物的用途。
全文摘要
本發明發現耐輻射異球菌Deinococcus radiodurans R1中的pprM基因具有增強原核生物及植物的抗旱能力。本發明構建了包含上述基因的重組載體，把它們分別導入原核及真核宿主細胞。實驗證實，將pprM基因在原核宿主細胞及植物中表達後，均能增強對乾旱環境的抗性。
文檔編號C12N15/82GK102234655SQ20101016814
公開日2011年11月9日 申請日期2010年5月4日 優先權日2010年5月4日
發明者張維, 李新娜, 楊明坤, 林敏 , 王瑋, 陳明 申請人:中國農業科學院生物技術研究所