獲得高純度HMG－CoA還原酶抑制劑的方法
2024-02-06 04:44:15 1
專利名稱：獲得高純度HMG－CoA還原酶抑制劑的方法
背景技術：
洛伐他汀，普伐他汀，美伐他汀，辛伐他汀，它們的衍生物及類似物已知是HMG-CoA還原酶抑制劑，並用作抗高膽固醇血症製劑。通過用鑑別為屬於麴黴、紅麴黴、諾卡氏菌、Amycolatopsis、毛黴或青黴屬的不同種的微生物發酵可生產它們。
為生產安全和有效的藥物，活性成分的純度是一重要因素。如果如在治療或預防高血漿膽固醇症的情況中需長期服用藥物時，藥物的最高可能純度尤為重要。低純度藥物中雜質的積累可在臨床治療期間導致一些副作用。
以前專利申請中揭示的分離和純化抗高膽固醇血症製劑的方法，包括提取，層析，內酯化和結晶法的不同組合。通過這些方法獲得的終產物的純度低於99．6％。用這些方法得到較高純度的產物是可能的，但在用那些方法大工業規模生產所需產物的產量方面太低。
專利申請WO92／16276中揭示的分離方法提供了獲得純度高於99．5％的HMG-CoA還原酶抑制劑的溶液，但需要使用高度複雜的工業高效親和層析(HPLC)設備。根據WO92／16276，將接近85％或更高純度的粗製HMG-CoA還原酶抑制劑溶於一有機溶劑或有機溶劑和水的溶液中。然後將此混合物緩衝至pH在2～9之間，並置於HPLC柱上。在收集相應的HMG-CoA還原酶抑制劑峰值之後，除去一部分溶劑然後加入水或者除去2／3的溶劑混合物，以使HMG-CoA還原酶抑制劑結晶。最後通過此方法得到的產物純度至少99．5％，產量接近90％。
發明概述本發明涉及一種新的從發酵肉湯中分離和純化純度高於99．6％，優選高於99．7％的HMG-CoA還原酶抑制劑的工業方法。為達到此目的，對用屬於麴黴、紅麴黴、諾卡氏菌、Amycolatopsis、毛黴或青黴屬的不同微生物發酵期間產生的化合物的化學性質，及其在不同pH不同溶劑中的性能進行研究。由此，通過本發明的方法可實現前述目的，所述方法包括以下步驟--澄清菌絲體肉湯，並將此澄清肉湯濃縮為較小體積，--將此濃縮物酸化為pH值在4．5～7．5範圍內，隨後用乙酸乙酯提取HMG-CoA還原酶抑制劑，--任選地進行內酯化，--從水混溶性或水溶性的有機溶劑中結晶HMG-CoA還原酶抑制劑。
--從具有極限水混溶性或極限水溶性(limited miscibility orsolubility with water)的有機溶劑中結晶HMG-CoA還原酶抑制劑。
發明詳述
圖1分別示出在乙酸乙酯提取步驟中，HMG-CoA還原酶抑制劑(洛伐他汀)和雜質的分配係數對pH的依賴性。
圖2，3和4分別示出作為粗提組合物經乙酸乙酯提取之後，在從水混溶性或水溶性的有機溶劑中結晶之後，和在具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中進一步結晶之後，HMG-CoA還原酶抑制劑樣品的HPLC圖。
由於HMG-CoA還原酶抑制劑是典型的胞內及胞外產物，非強制性地但優選地將它們從菌絲體中有效地溶解於發酵液中。此溶解方法揭示於專利申請WO97／20834中，包括用強鹼將發酵肉湯處理為pH11．5，並攪拌3小時。WO97／20834教導此溶解可用鹼將發酵肉湯處理為pH10～13之間進行。所用溫度在60～95℃之間。HMG-CoA還原酶抑制劑在pH高於9非常有效地自菌絲體中溶解出，但太長時間暴露於如此劇烈條件下，導致萘骨架上羥基和羧酸之間酯鍵的降解。在更劇烈條件下，HMG-CoA還原酶抑制劑和脫醯的HMG-CoA還原酶抑制劑之間平衡移動至脫醯產物。我們已意外地發現溫度在10～40℃，優選在18～25℃如在室溫，時間少於1小時，優選少於半小時，如大約10分鐘，pH在9．5～13之間，最優選在9．5～11．5之間進行溶解的效率，與在先前專利申請中闡述的在較高溫度進行的不經濟及耗時較多的方法獲得的效率是相同的。此溶解也可在pH低於9．5，尤其低於6的情況下進行，但在此情況中必需使用大量的有機溶劑。
如果進行溶解HMG-CoA還原酶抑制劑的這種優選實施方案，隨後要用酸化劑，適當地用無機酸處理髮酵肉湯，以將pH值調節在7．5～8．5之間。適當的無機酸是磷酸，硫酸和鹽酸。HMG-CoA還原酶抑制劑在此pH範圍內是穩定的，且發酵肉湯也可在此步驟之後貯存一陣，如果必需或需要的話。
通過適當的分離步驟，如過濾和／或離心，將菌絲體從發酵肉湯中除去。優選用過濾法，且作為過濾技術，除經典過濾之外，微濾，超濾及滲濾也是適用的。然後用反向滲透或一些其它降低體積方法，將澄清的肉湯濃縮為較小體積，優選濃縮5～10倍。
以下闡述的酸化和乙酸乙酯提取步驟，是純化方法的要點。
將所述濃縮物用酸化劑，適當地用無機酸酸化，至pH值在4．5～7．5之間。可使用上述提及的無機酸的例子。然後用乙酸乙酯從所述pH經調正的濃縮物中提取HMG-CoA還原酶抑制劑。通過用反流提取柱適當進行提取。HMG-CoA還原酶抑制劑和可溶於乙酸乙酯的雜質之間的分配係數比在pH5．5～7．5，尤其在pH6．0～7．0最高，且在此步驟，一部分極性雜質已被除去。在pH值低於5．0，尤其低於4進行提取更有效，這是因為HMG-CoA還原酶抑制劑的分配係數較高，但這會產生高水平的極性雜質。在此pH值，可溶於乙酸乙酯的雜質的分配係數也較高，如圖1所示。由於其低分配係數，在pH值在4．5～7．5之間，尤其在5．0以上，更尤其在5．5以上進行提取入乙酸乙酯內，產生較低水平的極性雜質。在該pH值，HMG-CoA還原酶抑制劑從濃縮物至乙酸乙酯中的較差分配，可用較長反流提取柱補償。
如果需要，然後將所得乙酸乙酯提取物濃縮，並任選地在方法的此階段將HMG-CoA還原酶抑制劑內酯化。當pH在5．5～7．5之間時，HMG-CoA還原酶抑制劑的主要部分是游離酸形式。因而，如果HMG-CoA還原酶抑制劑在藥物中不用作內酯，可省略濃縮和內酯化步驟。通過將HMG-CoA還原酶抑制劑與催化量的無機或有機酸，最優選與三氟乙酸(TFA)接觸，適當的進行內酯化。然後可將任選地內酯化的HMG-CoA還原酶抑制劑直接從乙酸乙酯中結晶，將在以下闡述。或者，適當的通過汽化除去乙酸乙酯，並獲得任選地內酯化的HMG-CoA還原酶抑制劑粗產物。
將由此獲得的粗HMG-CoA還原酶抑制劑任選地進行吸附層析，優選反相層析。作為吸附層析的流動相，可適當的使用乙腈或低級醇，如乙醇，甲醇或丙醇，或這些溶劑與水的混合物。優選地，將粗HMG-CoA還原酶抑制劑溶於純乙腈或至少30％v／v乙腈的乙腈／水混合物中，並將所得溶液置於吸附層析柱上。此柱填充物包括但非限於基於辛基矽烷，二甲基矽烷，十八基矽烷，氰矽烷，聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物或丙烯酸類聚合物的固定相。其它典型的固定相物質也可使用，如二氧化矽，氧化鋁等等。將吸附的化合物用適當的流動相如乙腈／水梯度洗脫。收集相應的HMG-CoA還原酶抑制劑峰值，並除去流動相溶劑以使HMG-CoA還原酶抑制劑結晶。結晶的粗製HMG-CoA還原酶抑制劑的純度在80％～92％之間，並取決於發酵肉湯中的雜質分布。也可用正常層析，急驟層析，工業HPLC，或用提取或結晶法代替任選的吸附層析。
以下將更詳細地闡述本發明特殊的組合結晶處理法。更具體地，其包括將HMG-CoA還原酶抑制劑從水混溶性或水溶性的有機溶劑中結晶，和將HMG-CoA還原酶抑制劑從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中結晶。這二個結晶的順序也可以反過來。水混溶性或水溶性的，或具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑的性質，本領域技術人員已知，並如參見於併入參考的「Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry」，Vol．A24，5th版(1993)，pp．437-505中所述。在本發明中，術語「水混溶性或水溶性的」指基本上無限地，優選與水100％混溶或溶解的有機溶劑；術語「具有極限水混溶性或極限水溶性」還包括不混溶於或不溶解於水的有機溶劑。另外，本發明的結晶概念尤其也包括沉澱。
基本的水混溶性或水溶性的有機溶劑的例子包括低級烷醇如甲醇，乙醇，丙醇或異丙醇，低級烷基酮如丙酮和甲乙酮，低級烷基乙二醇醚如甲基乙二醇，乙基乙二醇，丙基乙二醇和二乙基乙二醇，及偶極非質子溶劑如N，N-二甲基甲醯胺(DMF)，N，N-二甲基乙醯胺(DMA)，和二甲基亞碸，包括這些溶劑的混合物。特別優選的水混溶性的有機溶劑例如是丙酮和低級烷醇。具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑例如包括高級烷醇如丁醇，異丁醇，戊醇，己醇，2-乙基己醇，苯甲醇和環己醇；高級烷基酮如甲基·丁基酮，甲基·異丁基酮和環己酮；酯如乙酸甲酯，乙酸乙酯，正丙基(和異丙基)乙酸酯，正丁基(和異丁基或仲丁基)乙酸酯和乙酸戊酯；醚如二乙醚和二異丙醚；氯化烴如亞甲氯和氯仿，乙腈等等，包括這些溶劑的混合物。作為具有極限水混溶性或極限水溶性的溶劑特別優選乙酸乙酯。
我們意外地發現，HMG-CoA還原酶抑制劑從水混溶性的有機溶劑如丙酮或低級烷醇中結晶，隨後從相同溶劑進一步再結晶僅可除去少部分非極性和大部分的極性雜質，從具有極限水混溶性的有機溶劑乙酸乙酯中結晶，隨後從相同溶劑再結晶，僅除去大部分非極性雜質。這一點從粗製HMG-CoA還原酶抑制劑的HPLC圖中(圖2)，在從丙酮中結晶後HMG-CoA還原酶抑制劑的HPLC圖中(圖3)和從丙酮中結晶後，並從乙酸乙酯中進一步再結晶獲得的HMG-CoA還原酶抑制劑的HPLC圖(圖4)中清晰可見。根據這一意想不到的認識，本發明的最後步驟包括從水混溶性或水溶性的有機溶劑中和從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中組合結晶，這一步驟是獲得高純度HMG-CoA還原酶抑制劑的方法中不能缺少的。
根據本發明的組合結晶處理可如下進行首先，將粗製的HMG-CoA還原酶抑制劑的晶體溶解於前述基本(優選100％)水混溶性或水溶性的有機溶劑中，尤其是丙酮或低級醇中，然後加入水使HMG-CoA還原酶抑制劑結晶或沉澱。或者，將溶於基本上水混溶性或水溶性的有機溶劑中的粗製HMG-CoA還原酶抑制劑加入水中以被結晶或沉澱。如果需要，可用相同或其它水混溶性或水溶性的有機溶劑將這些步驟重複進行，如根據起始粗製物的純度，重複1～4次。
然後將由此獲得的晶體溶解於前述具有極限水混溶性或極限水溶性的溶劑如乙酸乙酯中至合適濃度，優選在10～35g／l範圍，最優選在15～25g／l範圍內。在除去1／3～3／4的溶劑後，HMG-CoA還原酶抑制劑結晶。如果需要，可重複進行從相同或其它具有極限水混溶性或極限水溶性的溶劑中結晶，例如根據通過從水混溶性或水溶性的溶劑中結晶獲得的產物的純度重複1～3次。然後將此結晶的HMG-CoA還原酶抑制劑過濾，並乾燥以產生純度至少為99．6％的產物。
如已提及的，結晶順序可以是相反的，即首先進行從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中結晶，然後進行從水混溶性或水溶性的有機溶劑中結晶。在本發明一優選實施方案中，在乙酸乙酯提取步驟，或任選地，在上述內酯化步驟之後，可合適地首先進行從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑乙酸乙酯中的結晶。
用本發明的方法，可得到純度至少99．6％或甚至至少99．7％的產物。
在另一實施方案中，可以不同方式重複進行不同種類的結晶。
在本發明的另一方面中，前述從水混溶性或水溶性的有機溶劑中，和從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中的結晶組合法，被用作任何分離和／或純化HMG-CoA還原酶抑制劑的方法的最終精製步驟。據此，該最終精製步驟也可用於常規獲得的HMG-CoA還原酶抑制劑的粗製品。由此可獲得純度至少99．6％，甚至至少99．7％的HMG-CoA還原酶抑制劑。
當洛伐他汀被選作HMG-CoA還原酶抑制劑時，本發明的方法是特別適用的。根據本發明的另一方面，上述方法用於分離和／或純化洛伐他汀。
根據本發明的方法獲得的基本純化的HMG-CoA還原酶抑制劑，如洛伐他汀，美伐他汀，普伐他汀和辛伐他汀以及它們的衍生物和類似物，可有助於用於製備預防和／或治療疾病的藥物。該獲得的抑制劑和藥物特別用作降低中風，突發短暫缺血，動脈硬化和心肌梗塞的危險性的藥物或預防藥。
以下實施例例證了本發明的方法，而非限制權利要求中闡明的本發明的範圍。
然後將乙酸乙酯濃縮物(14l)置入反應器(40 l)中並內酯化。該內酯化反應由催化量的TFA(0．5ml TFA／1L濃縮物)起始。在40℃將內酯化步驟持續2小時。在內酯化之後，將濃縮物用14 l 5％碳酸氫銨水溶液衝洗2次。將水相排出，在旋轉蒸發器中將有機相進一步濃縮至乾燥。所得油狀產物(1．51)含有133g洛伐他汀。
將所得油狀產物(161ml)溶於80ml乙腈中，並加樣於充填XAD-16的層析柱上(80cm，3．6cm)(XAD-16是RohmHass公司的商品名，20-50目)。將此柱首先用40∶60乙腈／水(pH3，由HCl調正)以75ml／min速率洗脫。用UV檢測儀(236nm)監測洗脫液，且在吸收開始下降時，將柱用55∶45乙腈／水(pH3，由HCl調正)洗脫。收集主要組分，並在吸收下降後，將柱用80∶20乙腈／水(pH3，由HCl調正)衝洗。通過旋轉蒸發器(50℃，150mbar)從主要組分中除去乙腈，並將所得晶體濾出。晶體的質量是24．5g，且洛伐他汀的含量為50％w／w。HPLC純度為92．5％。
將所得晶體(24g)溶於350ml丙酮中，並在持續攪拌下加入700ml水。將此混合物置於4℃，30分鐘。濾出所得晶體，並在室溫下真空乾燥。晶體質量為12．7g，洛伐他汀含量為90％w／w。HPLC純度為98．8％。
在相同條件下重複從丙酮中結晶，獲得11．3g晶體，洛伐他汀含量為97％，HPLC純度是99．4％。
將從丙酮第二次結晶獲得的晶體(11．3g)溶於700ml乙酸乙酯中，並將乙酸乙酯真空蒸發至Lovaststin濃度為70g／l。將濃縮物置於8℃1小時。將所得洛伐他汀晶體濾出，然後真空乾燥。晶體的質量是9．4g，洛伐他汀含量為99．6％。HPLC純度為99．7％。
將所得晶體(2．1g)溶於50ml丙酮中，並加入85ml水。然後將此混合物置於10℃，30分鐘。濾出晶體，並在40℃真空乾燥。所得晶體質量為1．9g，洛伐他汀的含量為99％。HPLC純度是99．8％。
為進一步分離，將油狀產物進行吸附層析，並如實施例1進行組合結晶。
權利要求
1．一種從菌絲體生物量中分離和純化HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其包括--澄清菌絲體肉湯，並將澄清的肉湯濃縮至較小體積，--將濃縮物的pH值酸化至4．5～7．5範圍內，隨後用乙酸乙酯提取HMG-CoA還原酶抑制劑，--任選地進行內酯化，--從水混溶性或水溶性的有機溶劑中結晶HMG-CoA還原酶抑制劑，和--從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中結晶HMG-CoA還原酶抑制劑。
2．權利要求1的方法，還包括在澄清菌絲體生物量之前，將得自菌絲體生物量的HMG-CoA還原酶抑制劑在pH值在9．5～13之間溶於發酵液中，並將肉湯pH值調正至7．5～8．5之間。
3．權利要求2的方法，其中溶解步驟在溫度在10～40℃，時間不超過1小時條件下進行。
4．前述任一權利要求的方法，其中澄清菌絲體肉湯通過過濾將菌絲體從肉湯中除去而進行。
5．前述任一權利要求的方法，其中所述澄清的肉湯是通過反相滲透濃縮的。
6．前述任一權利要求的方法，其中濃縮物被酸化至pH值在5．5～7．5範圍內。
7．權利要求6的方法，其中濃縮物被酸化至pH值在6．0～7．0範圍內。
8．前述任一權利要求的方法，其中將提取自乙酸乙酯並任選地內酯化的HMG-CoA還原酶抑制劑進行吸附層析而純化。
9．權利要求8的方法，其中乙腈與水的混合物用作吸附層析的流動相。
10．前述任一權利要求的方法，其中結晶步驟的順序反過來。
11．前述任一權利要求的方法，其中用於結晶步驟中的水混溶性或水溶性的有機溶劑是丙酮或低級烷醇。
12．權利要求11的方法，其中結晶步驟包括將HMG-CoA還原酶抑制劑溶於丙酮中，然後向其中加入水。
13．前述任一權利要求的方法，其中從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中結晶的步驟包括將HMG-CoA還原酶抑制劑以10～35g／l的濃度溶於所述有機溶劑中，並除去1／3～3／4所述有機溶劑。
14．前述任一權利要求的方法，其中用於結晶步驟的具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑是乙酸乙酯。
15．前述任一權利要求的方法，其中獲得的HMG-CoA還原酶抑制劑純度高於99．6％。
16．前述任一權利要求的方法，其中選擇的HMG-CoA還原酶抑制劑是洛伐他汀。
17．一種純化HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，包括將HMG-CoA還原酶抑制劑進行組合結晶步驟，包括從水混溶性或水溶性的有機溶劑中結晶，及從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中結晶。
18．權利要求17的方法，其中組合結晶步驟是獲得純度高於99．6％的HMG-CoA還原酶抑制劑的最終精製步驟。
19．權利要求18的方法，其中獲得的HMG-CoA還原酶抑制劑的純度高於99．7％。
20．權利要求17～19任一方法，其中丙酮或低級烷醇用作水混溶性或水溶性的有機溶劑。
21．權利要求20的方法，其中所述結晶包括將HMG-CoA還原酶抑制劑溶於丙酮中，然後向其中加入水。
22．權利要求17～21任一方法，其中從具有極限水混溶性或極限水溶性的所述有機溶劑中的所述結晶，包括將HMG-CoA還原酶抑制劑以10～35g／l濃度溶於所述有機溶劑中，並除去1／3～3／4的所述有機溶劑。
23．權利要求17～22的任一方法，其中乙酸乙酯用作具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑。
24．權利要求1或權利要求17的方法在分離和／或純化洛伐他汀中的應用。
全文摘要
本發明描述了一種從菌絲體生物量中分離和純化HMG－CoA還原酶抑制劑的方法,其包括:澄清菌絲體肉湯,並將澄清的肉湯濃縮至較小體積,將濃縮物的pH值酸化至4.5～7.5範圍內,隨後用乙酸乙酯提取HMG－CoA還原酶抑制劑,從水混溶性或水溶性的有機溶劑中結晶HMG－CoA還原酶抑制劑,和從具有極限水混溶性或極限水溶性的有機溶劑中結晶HMG－CoA還原酶抑制劑。結晶步驟也可以反過來。所述結晶步驟的組合的概念也可用於純化粗製HMG－CoA還原酶抑制劑。
文檔編號B01D11/02GK1291238SQ99803080
公開日2001年4月11日 申請日期1999年2月17日 優先權日1998年2月18日
發明者茲拉特科·普夫勞姆, 杜尚·米利沃耶維奇, 達維德·塞尼察 申請人:萊克製藥與化學公司