鈍頂節旋藻藻藍蛋白及其應用的製作方法

2024-01-26 02:33:15 1

專利名稱：鈍頂節旋藻藻藍蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新穎的藻藍蛋白，更具體地，涉及鈍頂節旋藻的藻藍蛋白，含該藻藍蛋白的組合物，及其用途。
鈍頂節旋藻的學名為Arthrospira platensis，俗稱螺旋藻，是一種有價值的植物蛋白資源。它含有豐富的蛋白質、β—胡蘿蔔素等營養物質。
中國專利申請89100036.4公開了一種以藍藻—螺旋藻為原料，經磨細，浸取，水解，製得蛋白質胺基酸溶液，再用該溶液配製藍色透明飲料的方法。
中國專利申請No.94112205.0，題為「節旋藻保健食品組合物及其製法」，公開了一種含有節旋藻酶解提取物的食品組合物，及其製法。
1986年，美國哈佛醫學院的Schwartz和Shklar經研究發現，顫藻科從螺旋藻屬的一種未知品種的藻類提取的藻蛋白混合物，對一些癌細胞有抑制作用，並有抗疲勞等功能。亦有人將其應用於抗衰老和治療AIDS病(愛滋病)等方面。
總之，現有技術中未見有關從螺旋藻屬的藻類中提取藻藍蛋白的報導，尤其沒有從鈍頂節旋藻提取藻藍蛋白的報導。
本發明的一個目的是提供一種新穎的蛋白質，該蛋白質為從鈍頂節旋藻中提取分離而得的藻藍蛋白。
本發明的另一目的是提供一種藻藍蛋白的製法。
本發明的第三個目的是提供一系列含藻藍蛋白的食品組合物。
本發明的第四個目的是提供該藍藻蛋白在螢光檢測方面的用途。
為了實現上述目的，本發明人經數年研究，從鈍頂節旋藻中提取了一種新穎的藻藍蛋白，其特徵在於，該藻藍蛋白的分子量約為14500道爾頓，等電點為4.8，其最大光譜吸收值為620mm，此外，該藻藍蛋白是由α和β亞單位組成的寡聚體，其中α和β亞單位是由160—180個胺基酸構成的多肽鏈，且兩亞單位具有同源性。
本發明還提供了含適量藻藍蛋白作為主要組份的一系列的食品組合物。
本發明還提供了藻藍蛋白在螢光檢測方面的應用。
本發明的提取自節旋藻的藻藍蛋白既是某些藻類細胞重要的捕光色素蛋白，又因其極佳的保健功效而與人類生活密切相關。可以將藻藍蛋白作為有效成分加入到食物組合物中，製成不同的保健食品。這樣食品組合物不僅可以製成各種人們常見和常用的形式，而且能起到極佳的保健作用。
節旋藻原產非洲，喜高溫、長日照和高pH值等環境。我國原來沒有這種植物。1978年，本發明人首先從美國引入藻種進行馴育。通過超微結構等方面的研究發現，被國內外誤稱為「螺旋藻」的，實為鈍頂節旋藻(Arthrospira platensis)。關於節旋藻的培養方法和條件，以及收穫節旋藻的方法，可以參見本發明人於1994年6月18日申請的，申請號No.94112205.0，題為「節旋藻保健食品組合物及其製法」的專利申請。
本發明提取藻藍蛋白的全過程如下培養節旋藻，收穫後製得乾燥的節旋藻，經破壁、離心製得粗提液，粗提液再經鹽析，滲析，離子交換層析等步驟製得純淨的藻藍蛋白。
更具體地，將節旋藻幹藻粉加水適量，(為乾粉重量的15～20倍)→置—4℃冷凍，→25°～35℃融解，→再冷凍融解，重複3～5次；(或用酶進行酶解)→離心→丟棄沉澱物，取上清液，加硫酸銨分鎦，→丟棄下層沉澱物，取上層物，經溶解和滲析→用DEAE纖維柱進行離子交換層析，冷凍乾燥得到純淨的藻藍蛋白。
其中，破細胞壁可採用凍融法或酶解法等方法進行。
其中，酶解時選用的酶可以是(但並不局限於)下列酶的一種或多種纖維素酶，木瓜酶，菠蘿酶，米曲酶，紅曲酶，澱粉酶，糖化酶，蝸牛酶等。酶解一般在pH3—8，溫度20—50℃進行18—24小時，酶解條件也可按廠商建議的條件。
凍融過程可進行一次或多次。一般以多次，尤其3—5次為好。
製得的藻藍蛋白經研究發現，其光譜特性如下最大吸收值為620mm，螢光最大值為640mm。
這表明藻藍蛋白吸收光譜與綠色植物光合作用光譜恰好互補，這對分布廣，原初生產力大而缺乏葉綠素b的藻類來說，更顯得重要。
藻藍蛋白在水溶液中的吸收光譜比在活體中峰值(λmax)稍向藍移，其光譜形狀和強度主要取決於發色基的性質，數量和聚集狀態，一般發色基4吡咯系統中共軛雙鍵愈多，λmax愈向紅移；(α，β)的吸收光譜只是α，β—亞單位分別吸收的迭加，但進一步聚合則會引起長波吸收峰紅移，並伴有吸收係數(εM)增加。
藻藍蛋白在生活細胞中很少發生螢光，它們一旦被釋放到溶液中並給以適量光照時，PE便發出棕色螢光，而PC則發出紅色螢光。比較PE、PC、AP和Chla的吸收和發射光譜，PE—PC之間，PC—Ap之間和Ap—Chla之間均有較強的吸收重迭，這暗示能量在這些光合色素間的傳遞順序為PE—PC—Ap—Chla。
對藻藍蛋白的結構進行了深入研究，發現藻藍蛋白一般是由α和β單體組成寡聚體，其中α和β亞單位是由大約160—180胺基酸組成的多肽鏈。
藻藍蛋白亞單位的同源性在更高水平上還表現在相似的聚合行為和聚合分子構象上，其逐級聚合過程為其在細胞內擔負的能量傳遞功能奠定了結構基礎。
純化後的藻藍蛋白用聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)電泳和等電聚集均得到單一色帶，其等電點(IEP)值分別為4.8，通過12％SDS聚丙烯醯胺凝膠(SDS—PAGE)電泳可見鈍頂節旋藻的藻藍蛋白由α和β兩個亞單位組成，其分子量為14500。
藻藍蛋白的胺基酸組成和含量，經測定，數據列於表1。
表1.
鈍頂節旋藻藻藍蛋白的胺基酸組成和含量(％)
從表1可以看出，藻藍蛋白中所含的二羧基胺基酸(天冬氨酸，穀氨酸)與鹼性胺基酸(賴氨酸、精氨酸)之比值較高，所以其等電點(IEP)較低，為4.8。此外，藻藍蛋白缺乏甲硫氨酸，脯氨酸和組氨酸。
令人驚奇的是，本發明人發現藻藍蛋白有極其重要的保健作用它具有較高的促紅細胞生成素活性，同時對CFU—E集落形成具有較強的刺激作用(表2)。
表2.
鈍頂節旋藻藻藍蛋白對胎鼠肝細胞晚期紅系祖細胞的影響
從表2可見，螺旋藻藻藍蛋白具有較高的促紅細胞生成素活性，同時對CFU—E集落形成具有較強的刺激作用。
藻藍蛋白對正常小鼠CFU—GM的形成也有影響。數據列於表3。
表3.
體外加入鈍頂節旋藻藻藍蛋白對正常小鼠CFU—GM形成的影響
注MCM小鼠肌條件培養液(Conditioned Medium of micemusal)C－PC得自節旋藻的藻藍蛋白。
X±SD n＝5*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001(與對照相比)。
觀察了60Coγ射線5Gy照射小白鼠粒單系祖細胞後30天內的恢復情況，發現，在受照後的第1—5天小白鼠粒單祖細胞集落形成最少，第10天開始恢復回升，而給予腹腔注射藻藍蛋白試驗組小鼠，其CFU—GM產率顯著高於對照組。說明鈍頂節旋藻藻藍蛋白可顯著促進受照小鼠粒單系祖細胞的增殖分化。
此外，藻藍蛋白對體外照射骨髓細胞CFU—GM形成也有影響。
將正常小鼠骨髓製成單細胞懸液後與不同濃度的藻藍蛋白一起孵育後，經60Coγ射線照射後再進行CFU—GM培養，其結果見表4。
表4.
鈍頂節旋藻藻藍蛋白對受照小鼠骨髓細胞CFU—GM形成的影響
從表4可以看出，與不同濃度的藻藍蛋白一起孵育的骨髓細胞形成CFU—GM產率明顯高於對照組，由此可見藻藍蛋白能提高骨髓細胞的抗輻射能力。
還研究了藻藍蛋白對小鼠血清集落刺激活性的影響。
取正常小鼠，腹腔注射藻藍蛋白，給藥1～10天後從眼球取血，所得血清作為集落刺激因子(Colony stimulating factor，CSF)來源培養CFU—GM。數據列於表5。
表5.
鈍頂節旋藻藻藍蛋白對小鼠血清集落刺激活力的影響
注a.終濃度10％b.終濃度5％從藻藍蛋白對絲裂原刺激的小鼠脾細胞產生集落刺激因子所造成的影響，也可看出藻藍蛋白的保健功效。
正常小白鼠腹腔注射藻藍蛋白5天後，第6天取脾細胞按5×106ml濃度培養於含5μg/ml ConA的無血清培養液中，培養後離心取上清，檢測上清液的集落刺激活性，同樣在脾細胞培養體系中加入不同濃度的藻藍蛋白，所得上清液進行集落刺激活性測定。兩種方法製備的脾細胞培養上清液的檢測結果見表6和表7。
表6.
鈍頂節旋藻藻藍蛋白體內誘導小鼠脾臟產生集落刺激因子的影響
a.終濃度10％b.終濃度5％SF－SCCM無血清脾細胞條件培養液**P＜0.01，***P＜0.001(與對照相比)由表6可見，腹腔注射藻藍蛋白，能較顯著地誘導小鼠脾細胞產生集落刺激因子。
表7.
鈍頂節旋藻藻藍蛋白體外誘導小鼠脾臟細胞產生集落刺激因子的影響
a.終濃度10％b.終濃度5％*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(與對照相比)從表7可以看出，體外加入藻藍蛋白能較顯著地誘導小鼠脾細胞產生集落刺激因子。
此外，通過藻藍蛋白對小鼠紅系祖細胞(CFU—E，BFU—E)增殖分化的影響。
(a)對正常小鼠和貧血小鼠CFU—E和BFU—E形成的影響。
正常小白鼠腹腔注射藻藍蛋白5天，第6天進行CFU—E和BFU—E的培養，實驗結果表明，鈍頂節旋藻藻藍蛋白能極顯著地提高小鼠的CFU—E和BFU—E的產率，說明鈍頂節旋藻藻藍蛋白可促進小白鼠紅系造血。
正常小白鼠頸椎脫臼處死，取出股骨製成單細胞懸液，作CFU—E的培養，培養體系以不同濃度的藻藍蛋白取代EPO或EPO存在時直接加入不同濃度的藻藍蛋白來培養CFU—E，以1640作空白對照，只加EPO為正常對照，結果如表8中所列。由此可知，藻藍蛋白對CFU—E有直接的刺激作用，促進CFU—E集落的形成。藻藍蛋白和EPO同時存在時可顯著提高CFU—E的產率(與正常對照組相比)。
表8.
體外加入鈍頂節旋藻藻藍蛋白對CFU—E形成的影響<
>EPO促紅細胞生成素(Erythropoietin)*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，(與對照組(I)相比)
在BFU—E培養體系中，以終濃度為0.015μg/ml的藻藍蛋白取代EPO或BPA，或同時取代EPO和BPA，以及EPO和BPA同時存在時加入藻藍蛋白來培養BFU—E。另設4組對照，EPO和BPA同時加入的正常對照，EPO和BPA其中之一加入以及EPO和BPA都不加入。實驗結果如表9。
表9.
不同條件下鈍頂節旋藻藻藍蛋白對BFU—E形成的影響
a.終濃度0.015μg/ml(**)P0.01，與對照組I相比，**P0.01，與對照組II相比。
BPA爆式集落刺激因子HS馬血清從表9可以看出，加入藻藍蛋白BFU—E產率不下降與正常對照相同，無BPA存在時，BFU—E不能形成，但加入了藻藍蛋白後，可以形成極少的集落。因此可以推知藻藍蛋白有著EPO的活性，並有一定BPA樣的作用。
小鼠經60Coγ射線照射和腹腔注射鹽酸苯肼後形成貧血症狀，其CFU—E和BFU—E產率顯著下降。但是不管是照前或是照後給予小鼠腹腔注射藻藍蛋白，小鼠的CFU—E和BFU—E產率顯著高於對照組。
綜上所述，從鈍頂節旋藻中提純的藻藍蛋白具有的保健功效主要表現在具有較高的促紅細胞生成素活性，同時對CFU—E集落形成具有較強的刺激作用可促進和加速受60Coγ射線(5Gy)照射後小白鼠白細胞的恢復；能較顯著地提高小白鼠骨髓有核細胞數，可以抵抗或顯著抵抗照射對小白鼠骨髓有核細胞的損傷，並使其恢復達到正常值；促進小鼠粒單系祖細胞的增殖分化；能顯著地誘導小鼠脾細胞產生集落刺激因子；對小鼠骨髓基質祖細胞的形成有促進作用，亦即對骨髓微循環有一定的影響。
所以，為了開發利用這種能促進免疫系統，抵抗各種疾病的天然蛋白質，在實驗基礎上，本發明人進一步提供了一系列含藻藍蛋白作為有效組份的保健食品組合物。
保健食品組合物一般含有95％藻藍蛋白以及5％水和/或輔料。
其中一種保健食品組合物為膠囊或片劑，其組成為95％藻藍蛋白，以及5％輔料。
另一種保健食品組合物為飲料，其組成為7％藻藍蛋白，91％水以及2％輔料。
第三種保健食品組合物為口服液，其組成為30％藻藍蛋白，68％水和2％輔料。
在本發明中，「輔料」指構成保健食品組合物的輔助性原料，即除藻藍蛋白和水之外的其他次要材料，具體包括
①穀類；澱粉；糊精；②蔬菜泥；③甜味劑—甜菊甙或蛋白糖，或木醇糖等；④香精；⑤羧甲基纖維素；⑥阿拉伯膠；西黃蓍膠等。
採用藻藍蛋白作為食品組合物中一種特效的保健成分，製作保健食品組合物時，可以採用食品加工及製作領域熟知的方法、工藝、和設備，並且還可加入其他已知的具有保健功效的成份，以更均衡地發揮保健功效。
此外，較作為一種新穎的蛋白質，由於藻藍蛋白在較寬的pH值範圍內有效高螢光產率；它們的螢光不因其它生物分子的存在而消失；可較好溶介於水；以液體或固體狀態存在時都極穩定且能保存較長時間等原因，因此能用於免疫檢測，螢光顯微術，等方面。
下面結合本發明的實施例，進一步詳細地闡述本發明。
除非特別註明，否則所有的百分比都是重量百分比。實施例1藻藍蛋白粗提液的製作實施例1A取幹藻粉100g加2000ml磷酸緩衝液(pH7.3)加澱粉酶1.5g，置35℃水浴中30分鐘，充分攪拌30分鐘後，置-20℃環境下速凍，待結成冰塊後取出，置35℃水浴中解凍，再攪拌30分鐘，再速凍，如此反覆三次，凍融後，4℃1000rpm離心30分鐘，收集上清液，此即為粗提液。實施例1B在100g幹藻粉內，加2000ml 25℃蒸鎦水pH7.3加澱粉酶1.2g，置37℃水浴中45分鐘，攪拌30分鐘後速凍成冰塊，30℃條件下解凍，攪拌40分鐘再速凍。重複三次，1500rpm離心，取上清液，(此即為粗提液)。實施例1C取100g幹藻粉加糖化酶1g，加20℃蒸鎦水2000ml pH7.3置27℃水浴中30分鐘，攪拌30分鐘，速凍，20℃條件下解凍，速凍，反覆凍融三次後2000rpm離心，取上清液，即得粗提液。實施例1D取幹藻粉10g加200ml磷酸緩衝液pH7.3電磁攪拌30分鐘，置-20℃環境中12小時，取出置37℃水浴中解凍，再攪拌30分鐘，再結冰12小時後取出解凍，攪拌，冰凍，如此反覆凍融三次後，4℃1000rpm離心30分鐘，收集上清液(此即粗提液)。實施例2藻藍蛋白分離、純化將實施例1中得到的粗提液用蒸鎦水稀釋一倍，上DEAE52纖維素柱(3×18cm)。該柱頂預先用10mM pH7.3磷酸緩衝平衡，280nm檢測，待粗提液全部進入纖維柱後，用同一緩衝液洗柱至基線，再改用10mM pH8.0的磷酸緩衝，並加0.3N和0.6N的NaCl，分部洗脫和收集。
取0.3N的NaCl的洗脫峰，加固體硫酸銨至飽和度，4℃靜置4小時後2500rpm離心，收集沉澱，加水10ml溶解，並對水透析，更換透析液二次，最後置500ml 10mM pH7.3的磷酸緩衝液中透析平衡過夜。
透析後的液體，2500rpm離心去沉澱，上清液以Seohade×G75凝膠柱過濾(1.5×95cm)凝膠柱預先用10mM pH7.3的磷酸緩衝平衡，一次上樣，以同一緩衝洗脫，分部收集，並作CFU—E及電泳分析，冷凍乾燥得成品。實施例3
保健食品組合物之一膠囊(或片劑)的製作(1)配方a.藻藍蛋白提取物56％，澱粉4％，β糊精20％，糖粉20％；b.藻藍蛋白提取物66％，β糊精4％，澱粉30％；c.藻藍蛋白提取物85％，β糊精5％，羧甲基纖維素1％，敷料9％；d.藻藍蛋白提取物95％，β糊精和羧甲基纖維素5％(其比例85∶15)(2)製法純化藻藍蛋白粉＋輔料(按配方)→揉製成團，手感適當→18目篩，篩製成顆粒→置80℃以下烘箱內烘乾→分別用手工或機器灌裝入膠囊內→檢驗(秤重誤差不得大於±0.1g→封裝→60Co幅射滅菌→成品；或將已烘乾之顆粒→壓製成片，→包或不包糖衣→封(包)裝→檢驗→幅射滅菌→成品。(3)優點藻藍蛋白被包含在膠囊裡；可根據應用的要求，可使其在胃或腸內崩解；它不僅可以有效的防止其氧化，而且能更好保持特性、有效成份，提高保健效果。實施例4保健食品組合物之二飲料和口服液的製作，a.取提純的乾燥藻藍蛋白50g加2.5g阿拉伯膠，在幹乳缽中研勻，一次加入25ml蒸鎦水，勻質機中迅速磨成乳，然後加入甜菊甙水溶液適量，再緩緩加入西黃蓍膠漿(0.7g粉)加水適量製成漿，加入0.1％山梨酸鉀，加蒸鎦水至1000ml，將其灌瓶、滅菌即成。
b.藻藍蛋白70％卵磷脂30g，勻質機中研磨成乳，加甜菊甙水溶液適量，繼續乳化加山梨酸鉀0.1％，加蒸鎦水至1000ml用其灌瓶，滅菌即成。
c.藻藍蛋白30g，甜菊甙，檸檬酸適量，消毒滅菌水使成100ml，裝瓶消毒殺菌即成。
口服液和飲料的特點純天然綠色；無任何人工色素無糖含多種胺基酸和元素及微量元素。
儘管，本發明是結合以上的具體實施例進行闡述的，但是，通過閱讀本發明的說明書及權利要求書，本領域的技術人員能充分理解本發明的特徵及優點，並且能夠對本發明的具體實施例在不違背本發明主旨的前提下作出許多修改，增加或刪除等變動，但這同樣落於本申請的權利要求書所限定的範圍中。
權利要求
1.一種藻藍蛋白質，其特徵在於，該蛋白質是從鈍頂節旋藻中提取的，其分子量為14500道爾頓，等電點為4.8，最大光譜吸收值為620nm，並且是由α和β亞單位組成的寡聚體，其中α和β亞單位是由160—180胺基酸構成的多肽鏈，而且兩亞單位具有同源性。
2.一種保健食品組合物，其特徵在於，它含有如權利要求1所述的藻藍蛋白作為組份之一。
3.一種如權利要求2所述的保健食品組合物，其特徵在於，該保健食品組合物為膠囊或片劑。
4.一種如權利要求2所述的保健食品組合物，其特徵在於，該保健食品組合物為飲料或口服液。
5.一種如權利要求1所述的藻藍蛋白的用途，其特徵在於，該藻藍蛋白用於螢光檢測，免疫檢測和螢光顯微術。
全文摘要
本發明公開了一種新穎的藻藍蛋白，該蛋白是從鈍頂節旋藻中提取的，分子量為14500道爾頓，等電點為4.8，最大光譜吸收值為620mm。該蛋白是由α和β亞單位組成的寡聚體。該藻藍蛋白具有出色的保健功效。本發明還公開了一系列含該藻類蛋白的保健食品組合物，以及其在螢光檢測領域的用途。
文檔編號A23L1/305GK1117973SQ9410929
公開日1996年3月6日 申請日期1994年8月31日 優先權日1994年8月31日
發明者張媛貞, 曾昭琪, 李祥林, 石玉潔 申請人:張媛貞, 曾昭琪, 李祥林, 石玉潔