一種改裝鈍頂螺旋藻整藻膽體的方法
2024-01-26 02:23:15
專利名稱：一種改裝鈍頂螺旋藻整藻膽體的方法
技術領域：
本發明涉及一種改裝鈍頂螺旋藻整藻膽體的方法，屬於海洋生物技術領域。
背景技術：
為了研究蛋白質等生物大分子的細胞定位、相互作用及其動態變化，研究人員急需新技術和新材料來實現對蛋白質等生物大分子的「標識」、「閱讀」和「查詢」。現在常用的螢光標記，由於螢光染料分子螢光特性的限制(螢光光譜較寬、量子產率低)，遠遠不能適用於高通量的生物大分子專一標識。
藻膽蛋白是一類光合作用捕光色素-蛋白質複合物，主要存在於藍藻、紅藻、隱藻和少數甲藻中。在光合作用中起捕獲和傳遞光能的作用，具有強烈的螢光。在藍藻和紅藻中，由2-3種藻膽蛋白組成超分子結構藻膽體，形成高效的能量傳遞序列。在80年代中期，美國研究藻類光合作用的學者提出將藻膽蛋白作為螢光標記物，用於診斷試劑。由於其獨特的優點，藻膽蛋白和藻膽蛋白標記的診斷試劑在90年代初進入國際市場。
同常用的螢光標記物相比，藻膽蛋白具有下列優點生產過程安全、無毒，光能吸收強，螢光產率高，超過90％，背景光幹擾和假陽性率低，在pH4-11的範圍內穩定，可以作雙色、三色和四色標記。所以，這類試劑的應用範圍不斷擴大。但是，由於價格昂貴，尚未應用到普及型的臨床診斷試劑。我國全部進口，也僅限於用細胞流式儀進行的診斷。
藻膽蛋白做為螢光探針，有其獨特的優勢，但單個的藻膽蛋白分子，由於其分子較小、分子中含有的色素基團較少，因此，產生螢光的亮度不夠，使得在高解析度的檢測中靈敏度不高。美國莫森曼(J.P.Morseman)提出，應用固定化的完整藻膽體做為螢光探針，可用於多種生物醫學檢測。由於藻膽體中含有更多的色素基團，因此，其亮度較高，並且，激發波長為藻紅蛋白(PE)或藻藍蛋白(PC)的吸收波長，而螢光發射來自APC，因此，激發波長和發射波長相距更遠，避免相互幹擾。鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)是目前可以進行規模化養殖的單細胞絲狀藍藻，是製備完整藻膽體的良好材料，鈍頂螺旋藻的藻膽體由藻藍蛋白(CPC)和異藻藍蛋白(APC)及少量連接蛋白組成，其高效激發波長為CPC的最大吸收峰620nm，其發射峰是APC的螢光發射峰680nm，斯託克位移為80nm，為了進一步加大斯託克位移，更好的避免激發光對發射螢光的幹擾，可以對易於製備的鈍頂螺旋藻藻膽體進行人工改裝。
發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法。能進一步加大鈍頂螺旋藻完整藻膽體斯託克位移，更好的避免激發光對發射螢光的幹擾。
本發明的改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，步驟如下(1)以新鮮的藍藻—鈍頂螺旋藻為原料，溶於磷酸氫二鉀—磷酸二氫鉀溶液中，採用超聲波破碎細胞。
(2)在破碎的藻體中加入去汙劑，將藻膽體從類囊體膜上解離下來，離心，去除去汙劑和破碎的細胞，製備藻膽體的粗提物。
去汙劑的加入量本發明不作特別限定，按本領域現有技術，以能使藻膽體從類囊體膜上解離為宜。
(3)採用戊二醛交聯技術，用R-藻紅蛋白(RPE)改裝鈍頂螺旋藻藻膽體，具體如下取步驟(2)的藻膽體的粗提物用0.9mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液配製成溶液，取鈍頂螺旋藻藻膽體溶液0.3mL～0.4mL，迅速與0.07mL～0.09mL R-藻紅蛋白溶液混合，R-藻紅蛋白溶液用0.1mol/L磷酸緩衝液配製，pH6.8。將混合液邊振蕩邊緩慢滴加用0.75mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液配製的0.1％(W/V)戊二醛溶液0.02mL～0.04mL，19～22℃反應2小時～2.5小時，加1mol/L的甘氨酸溶液0.04mL～0.06mL終止反應30分鐘～40分鐘，即得改裝的鈍頂螺旋藻藻膽體。
對改裝的鈍頂螺旋藻藻膽體進一步純化，繼續以下步驟(4)用聚乙二醇沉澱改裝後的藻膽體，離心，收集沉澱。
(5)將步驟(4)所得的藻膽體沉澱重新溶解於磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀溶液中，再將該藻膽體溶液過Sepharose CL-4B柱層析，收集洗脫前端的紫紅色溶液，得到純化的改裝鈍頂螺旋藻整藻膽體。
對步驟(5)得到純化的改裝鈍頂螺旋藻整藻膽體測定光譜，檢測藻膽體的改裝效果(見圖3)。
上述各步驟中，沒有特別限定的部分均可採用本領域現有技術。也可採用本發明在下面提供的詳細的操作說明。
上述步驟(1)原料的破碎具體操作為新鮮鈍頂螺旋藻0.75～1.0g，溶於15～20mL1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液(pH＝6.8～7.0)中，超聲波破碎，破碎功率為12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，間隔2～3min。
上述步驟(2)藻膽體解離具體操作為在破碎的藻體溶液中加入去汙劑吐溫X-100(TritonX-100)，體積百分比濃度1.9～2.1％，室溫下，緩慢攪拌1小時～1.5小時，13000rpm～15000rpm離心3-4次，去除表層的TritonX-100、葉綠素和底部的細胞碎片，收集出離心管中部的溶液，即為藻膽體粗提液，其中混有少量的破碎藻膽體。
上述步驟(4)所用聚乙二醇為聚乙二醇6000。
上述步驟(5)所用的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液pH＝6.8～7.0，濃度為1mol·L-1，藻膽體沉澱與磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液的重量比為1∶1.5～2.0。
上述步驟(5)Sepharose CL-4B柱為2.0cm×30cm，用pH＝6.98濃度0.8mol·L-1～0.9mol·L-1磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液洗脫，流速為0.4mL·min-1～0.5mL·min-1。
本發明以可以大規模培養的藍藻鈍頂螺旋藻為材料，首先應用超聲波破碎細胞、去汙劑TritonX-100從類囊體膜上解離藻膽體、常規離心去除TritonX-100、葉綠素和細胞碎片得到鈍頂螺旋藻藻膽體，然後應用戊二醛交聯技術，用RPE改裝鈍頂螺旋藻藻膽體，最後經聚乙二醇沉澱和Sepharose CL-4B柱(2.0×30cm)層析得到純的用RPE改裝的鈍頂螺旋藻藻膽體。
本方法的優良效果為(1)以可以大規模人工培養的藻膽體由CPC和APC組成的鈍頂螺旋藻為材料，從而可以大量得到低成本的原材料；(2)以用常規設備和試劑為主的簡易方法大量、快速製備藻膽體，從而避免了傳統製備藻膽體的蔗糖密度剃度超速離心方法對設備要求高、操作複雜、並且很難進行大量製備的缺點；(3)用激發波長為498nm的RPE，依託戊二醛交聯技術，對鈍頂螺旋藻藻膽體進行改裝，改裝後的藻膽體，激發波長為RPE的吸收峰498nm，而發射波長為APC的螢光發射峰660～680nm，斯託克位移達到180nm，改裝前的斯託克位移為80nm，斯託克位移加大80～100nm，從而可有效避免激發光對發射光的幹擾。同時，由於每個RPE上含有6個色素色素基團，因此，改裝後的藻膽體含有更多的色素基團，亮度更高。因此，改裝後的藻膽體，可以大幅度的提高檢測的質量和檢測靈敏度，在超靈敏的生物醫學檢測中具有很好的應用前景。
圖1是R-藻紅蛋白(曲線1)和鈍頂螺旋藻藻膽體(曲線2)的吸收光譜。由曲線1可看到R-藻紅蛋白有三個吸收峰，分別位於565nm，539nm，498nm，這是三峰型R-藻紅蛋白的特徵吸收峰，曲線2可看到鈍頂螺旋藻的最大吸收峰在613nm，在650nm處有肩峰。
圖2是R-藻紅蛋白和鈍頂螺旋藻藻膽體的交聯物(粗線)及混合物(細線)的吸收光譜。與圖1比較，R-藻紅蛋白和鈍頂螺旋藻藻膽體混合物的吸收光譜(圖中細線)顯然是R-藻紅蛋白和藻膽體兩者吸收光譜的疊加，其中R-藻紅蛋白539nm的吸收峰在混合物中成為吸收肩峰，而混合物在紫外區的吸收峰依然在278nm。
圖3是R-藻紅蛋白和鈍頂螺旋藻藻膽體的交聯物(1)及混合物(2)的室溫螢光發射光譜(激發波長480nm)。可以看到，混合物(曲線2)在480nm光激發下在578nm有最大發射峰，此峰為R-藻紅蛋白的特徵發射峰，在其他位置沒有峰出現，說明R-藻紅蛋白吸收能量後以自身螢光的形式發散掉，中間無能量傳遞過程。而交聯物(曲線1)的發射光譜除在578nm出現R-藻紅蛋白的發射峰外，在660nm出現另一發射峰，這是藻膽體的螢光發射峰(或異藻藍蛋白的發射峰)，而且R-藻紅蛋白的發射峰的螢光強度明顯降低，說明R-藻紅蛋白已將部分能量傳遞給了藻膽體，證明R-藻紅蛋白與藻膽體交聯成功。
圖4是R-藻紅蛋白和鈍頂螺旋藻藻膽體的交聯物(1)及混合物(2)的室溫螢光激發光譜(發射波長660nm)。圖中，混合物(曲線2)的660nm的激發峰在618nm，這是藻膽體的峰，在其他位置沒有明顯的激發峰，說明混合物660nm螢光主要來自於藻膽體自身的光吸收；而交聯物的激發光譜(曲線1)顯示除了618nm的激發峰，還有498nm和568nm兩個R-藻紅蛋白的激發峰，568nm的峰值甚至與618nm的峰值相當，這說明交聯物660nm的螢光是由R-藻紅蛋白吸收光能產生激發態，並將能量傳遞給藻膽體產生的螢光。由以上分析可知，只有R-藻紅蛋白與藻膽體共價交聯在一起，才存在能量從R-藻紅蛋白向藻膽體的傳遞，若兩者沒有共價交聯在一起，則沒有能量傳遞進行。
具體實施方式
實施例1(1)新鮮的鈍頂螺旋藻1.0g溶於pH＝6.9的20mL 1mol·L-1磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液中，採用超聲波破碎細胞，破碎功率為15W，破碎5次，每次2min，間隔2min。
(2)在破碎的藻體中加入去汙劑TritonX-100，藻體與去汙劑體積比為1∶0.2，室溫下，緩慢攪拌1.5小時，使藻膽體從類囊體膜上解離下來。14000rpm離心4次，去除表層的TritonX-100、葉綠素和底部的細胞碎片，收集出離心管中部的溶液，即為藻膽體粗提液，其中混有少量的破碎藻膽體。
(3)取步驟(2)的藻膽體的粗提物用0.9mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液pH＝6.8～7.0按1∶1的比例配製成溶液，取鈍頂螺旋藻藻膽體溶液0.3mL，迅速與0.07mL R-藻紅蛋白溶液混合，R-藻紅蛋白溶液用0.1mol/L磷酸緩衝液配製，pH6.8，蛋白濃度1mg/ml。將混合液邊振蕩邊緩慢滴加用0.75mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液配製的0.1％(W/V)戊二醛溶液0.02mL，20℃反應2h，加1mol/L的甘氨酸溶液0.05mL終止反應30min，即得改裝的鈍頂螺旋藻藻膽體。
(4)用聚乙二醇6000沉澱藻膽體，收集沉澱。
(5)將沉澱重新溶解於pH＝6.9濃度1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀溶液中，然後過2.0×30cm的Sepharose CL-4B柱層析，用pH＝6.98濃度0.9mol·L-1磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液洗脫，流速為0.45mL·min-1。收集洗脫前端的藍紫色溶液，得到純化的改裝的鈍頂螺旋藻整藻膽體。
改裝的鈍頂螺旋藻整藻膽體用R-藻紅蛋白的吸收峰498nm激發，而發射波長為APC的螢光發射峰660nm，斯託克位移達到160nm，改裝前的斯託克位移為80nm，斯託克位移加大了80nm，從而可有效避免激發光對發射光的幹擾，同時，由於每個R-藻紅蛋白上含有6個色素色素基團，因此，改裝後的藻膽體含有更多的色素基團，亮度更高。因此，改裝後的藻膽體，可以大幅度的提高檢測的質量和檢測靈敏度。
實施例2如實施例1所不同的是步驟(3)如下取步驟(2)的藻膽體的粗提物用0.9mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液pH＝6.8～7.0按1∶1的比例配製成溶液，取鈍頂螺旋藻藻膽體溶液0.4mL，迅速與0.08mLR-藻紅蛋白溶液混合，R-藻紅蛋白溶液用0.1mol/L磷酸緩衝液配製，pH6.8，蛋白濃度1.5mg/ml。將混合液邊振蕩邊緩慢滴加用0.75mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩衝液配製的0.1％(W/V)戊二醛溶液0.03mL，19℃反應2.5小時，加1mol/L的甘氨酸溶液0.055mL終止反應35分鐘，即得改裝的鈍頂螺旋藻藻膽體。
權利要求
1.一種改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，步驟如下(1)以新鮮的藍藻-鈍頂螺旋藻為原料，溶於磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀溶液中，採用超聲波破碎細胞；(2)在破碎的藻體中加入去汙劑，將藻膽體從類囊體膜上解離下來，離心，去除去汙劑和破碎的細胞，製備藻膽體的粗提物；(3)採用戊二醛交聯技術，用R-藻紅蛋白改裝鈍頂螺旋藻藻膽體，具體如下取步驟(2)的藻膽體的粗提物用0.9mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液配製成溶液，取鈍頂螺旋藻藻膽體溶液0.3mL～0.4mL，迅速與0.07mL～0.09mL R-藻紅蛋白溶液混合，R-藻紅蛋白溶液用0.1mol/L磷酸緩衝液配製，pH6.8；將混合液邊振蕩邊緩慢滴加用0.75mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液配製的0.1％(W/V)戊二醛溶液0.02mL～0.04mL，19～22℃反應2小時～2.5小時，加1mol/L的甘氨酸溶液0.04mL～0.06mL終止反應30分鐘～40分鐘，即得改裝的鈍頂螺旋藻藻膽體。
2.如權利要求1所述的改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，其特徵在於，對改裝的鈍頂螺旋藻藻膽體進一步純化，繼續以下步驟(4)用聚乙二醇沉澱改裝後的藻膽體，離心，收集沉澱；(5)將步驟(4)所得的藻膽體沉澱重新溶解於磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀溶液中，再將該藻膽體溶液過Sepharose CL-4B柱層析，收集洗脫前端的紫紅色溶液，得到純化的改裝鈍頂螺旋藻整藻膽體。
3.如權利要求1所述的改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，其特徵在於，所述步驟(1)原料鈍頂螺旋藻0.75～1.0g，溶於15～20mL 1mol·L-1的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液中。
4.如權利要求1所述的改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，其特徵在於，所述步驟(1)超聲波破碎功率為12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，間隔2～3min。
5.如權利要求1所述的改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，其特徵在於，所述步驟(2)去汙劑是吐溫X-100，體積百分比濃度1.9～2.1％，室溫下，緩慢攪拌1小時～1.5小時，13000rpm～15000rpm離心3-4次，收集出離心管中部的溶液。
6.如權利要求2所述的改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，其特徵在於，所述步驟(4)所用聚乙二醇為聚乙二醇6000。
7.如權利要求2所述的改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，其特徵在於，所述步驟(5)所用的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液pH＝6.8～7.0，濃度為1mol·L-1。
8.如權利要求2所述的改裝鈍頂螺旋藻完整藻膽體的方法，其特徵在於，所述步驟(5)Sepharose CL-4B柱為2.0cm×30cm，用pH＝6.98濃度0.8mol·L-1～0.9mol·L-1磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液洗脫，流速為0.4mL·min-1～0.5mL·min-1。
全文摘要
一種改裝鈍頂螺旋藻整藻膽體的方法，屬於海洋生物技術領域。本發明以可以大規模培養的藍藻鈍頂螺旋藻為材料，首先應用超聲波破碎細胞、去汙劑TritonX－100從類囊體膜上解離藻膽體、常規離心去除TritonX－100、葉綠素和細胞碎片得到鈍頂螺旋藻藻膽體，然後應用戊二醛交聯技術，用RPE改裝鈍頂螺旋藻藻膽體，最後經聚乙二醇沉澱和Sepharose CL－4B柱層析得到純的用RPE改裝的鈍頂螺旋藻藻膽體。改裝後的藻膽體，可以大幅度的提高檢測的質量和檢測靈敏度，在超靈敏的生物醫學檢測中具有很好的應用前景。
文檔編號C12N1/12GK1654628SQ20051004202
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月17日 優先權日2005年1月17日
發明者張玉忠, 張熙穎, 陳秀蘭, 周百成 申請人:山東大學