高速逆流色譜從紅花籽粕中製備5-羥色胺衍生物方法
2024-01-24 19:46:15 2
高速逆流色譜從紅花籽粕中製備5-羥色胺衍生物方法
【專利摘要】本發明涉及天然藥物的分離製備方法，具體涉及高速逆流色譜法從紅花籽粕中分離製備2個5-羥色胺衍生物的方法。高速逆流色譜的固定相和流動相由氯仿、甲醇和0.1mol/LHCL水混合後分層，下相作為固定相，上相作為流動相。本發明不需要使用固相載體，無不可逆吸附，操作方便，條件固定，易於重複，樣品無損失、無汙染、高效、快速、低成本分離製備5-羥色胺衍生物，獲得的N-(p-香豆醯)5-羥色胺和阿魏醯5-羥色胺單體純度可達95％以上，可以進行工業化生產。
【專利說明】高速逆流色譜從紅花籽粕中製備5-羥色胺衍生物方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及天然藥物的分離方法，具體涉及高速逆流色譜法從紅花籽柏中分離製備2個5-羥色胺衍生物的方法。
【背景技術】 [0002]^LlACarthamus tinctorius L.)菊科屬植物,是一種藥、油、染料、飼料兼用的經濟作物。紅花籽，中藥習稱「白平子」，是紅花的種子。紅花籽柏是紅花籽榨取油後的剩下廢棄物，多用作肥料和飼料，對其中的化學成分研究較少。近年來，國外對紅花籽柏中的一些微量成分進行了研究，發現紅花籽柏中的5-羥色胺衍生物具有極強的清除自由基和活性抗氧化性,並可以調節人體內免疫反應,抑制腫瘤、保護人體中的NK細胞免受程序性死亡、強烈抑制黑色素生成等活性。紅花籽柏中的N-阿魏醯5-羥色胺和N-1p-香豆醯)5-羥色胺，具有保護心臟功能，預防心肌機能發生障礙，可以促進心肌運動。有的研究還表明，N-(P-香豆醯)5-羥色胺可以促進成纖維細胞增殖，並且將會是一種很好的抗炎藥物，對人類的健康有重要的意義。
[0003]紅花籽柏中5-羥色胺衍生物傳統的色譜分離手段不能實現對其高效、快速分離。傳統研究中，通常使用多步矽膠柱層析以及聯用製備液相等方法分離製備紅花中5-羥色胺衍生物，不僅耗費時間長，不能在線檢測，也會造成死吸附，損失較大，得率較低。
[0004]高速逆流色譜(high-speedcountercurrent chromatography, HSCCC)是一種連續高效的液-液分配色譜技術，由於不需要固體支撐體，物質的分離依據其在兩相中分配係數的不同而實現，因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，樣品的理論回收率為100%，特別適合於天然物活性成分的分離。利用高速逆流色譜從紅花中分離製備5-羥色胺衍生物的工業化生產，目前尚未見國內外有關文獻和專利報導。
【發明內容】
[0005]本發明公開了高速逆流色譜從紅花籽柏中分離製備香豆醯)5_羥色胺和阿魏醯5-羥色胺的方法，其結構式如圖1所示。
[0006]本發明可以通過以下措施實現:
高速逆流色譜分離紅花籽柏中2個5-羥色胺衍生物的方法包括以下步驟:
①將氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液混合成混合溶劑，分層；
②將5-羥色胺衍生物粗提物溶於①步驟的下層中；
③取①步驟混合溶劑分層，下相作為固定相，上相作為流動相，將固定相和流動相先後泵入高速逆流色譜內，將②步驟溶液經進樣閥進入色譜柱，進樣完畢後繼續泵入流動相；
④依據檢測器譜圖分別收集分離物，濃縮，即得香豆醯)5_羥色胺和阿魏醯5-羥色胺單體。
[0007]本發明優點:
本發明利用高速逆流色譜並採用了合理的溶劑體系從紅花中獲得高純度的香豆醯)5-羥色胺和阿魏醯5-羥色胺單體，該技術不需要使用固相載體，無不可逆吸附，樣品無損失、無汙染、高效、快速、低成本分離製備5-羥色胺衍生物，獲得的5-羥色胺衍生物純度可達95%以上。
[0008]本發明工藝簡單、操作方便、安全、重複性好，可工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]本發明一種運用高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法有如下附圖:
圖1是本發明高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法2個5-羥色胺的化學結構式；
圖2是本發明高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法5-羥色胺衍生物譜圖；
圖3是本發明高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法5 —羥色胺衍生物提物液相檢測圖；
圖4是本發明高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法N —阿魏醯5-羥色胺衍生物單體液相檢測圖；
圖5是本發明高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法N-(P-香豆醯)5-羥色胺衍生物單體液相檢測圖。
【具體實施方式】
[0010]下面結合附圖和實施例對本發明高速逆流色譜從紅花籽柏中製備2個5-羥色胺衍生物方法技術方案作進一步·描述。
[0011]如圖1 一圖5所示，本發明高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法包括以下步驟:
①將氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液混合成混合溶劑，分層；
②將5-羥色胺衍生物粗提物溶於①步驟的下層中；
③取①步驟混合溶劑分層，下相作為固定相，上相作為流動相，將固定相和流動相先後泵入高速逆流色譜內，將②步驟溶液經進樣閥進入色譜柱，進樣完畢後繼續泵入流動相；
④依據檢測器譜圖分別收集分離物，濃縮，即得香豆醯)5_羥色胺和阿魏醯5-羥色胺單體。
[0012]所述的步驟①中的氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液的體積比為3~5: 4:
3~5。
[0013]所述的步驟②中5-羥色胺衍生物粗提物溶於混合溶劑後的濃度為10~30 mg/
mLo
[0014]所述的5-羥色胺衍生物粗提物由下列方法製備:將紅花籽柏按液料比5~20:1回流提取0.5~2 h，提取I~3次合併提取液，濃縮至幹，用60~90%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸乾，用乙酸乙酯溶解，然後等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸乾備用。
[0015]所述的高速逆流色譜儀流速範圍為I~3 mL/min,轉速範圍為600~900 r/min。
[0016]所述的檢測波長為210~360nm。[0017]實施例一:
1、5-羥色胺衍生物粗提物製備
取紅花籽柏300 g用無水乙醇(液料比:15:1)回流提取I h，提取3次合提取液，旋轉蒸發儀蒸乾，500 ml 80%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸乾，300 ml乙酸乙酯溶解，然後等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸乾備用。
[0018]2、高速逆流分離製備5-羥色胺衍生物
在分液漏鬥中配製氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(1: 1: 1，v/v)兩相溶劑系統，充分振搖後靜置過夜。下相為固定相，上相為流動相，使用前分別超聲脫氣30 min0取100 mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解於10 mL下相溶液中，備用。
[0019]用15 mL/min流速將溶劑系統下相泵入主機並充滿分離螺線管，開啟循環水浴並將溫度設定為25 °C。開啟主機電源以850 r/min正向旋轉，待轉速穩定後，以1.5 mL/min流速泵入流動相，待流動相從管柱出口流出且基線穩定後，將樣品溶液由進樣圈注入。管柱出口處流出液在310 nm波長下連續檢測，根據如圖2所示色譜圖手動收集各色譜峰組分，從100 mg待分離樣品中一次性分離製備得到18.5 mg Ar-香豆醯)5-輕色胺和16.9 mg阿魏醯5-羥色胺。HPLC檢測純度分別為97.3%和98.8%，如圖4、圖5所示。
[0020]HPLC 分析條件:色譜柱:Eslipse XDB C18 (4.6 mm*250 mm, 5 ym),流動相:甲醇-水(35:65 ~45:55，O ~15 min ;45:55 ~52:48，15 ~30 !11；[11),流速1.0 mL/min,柱溫25 °C，檢測波長310 nm。
[0021]3、結構鑑定
峰 I =1H-NMR (DMSO-Or6, 400 MHz) δ= 2.97 (2Η, t)，3.55 (2H, t)，6.37 (1H, d,/=15.5 Hz), 6.70 (1H, d, /=7.5 Hz), 6.81 (1H, d, /=8.5 Hz), 6.82 (1H, d, /=8.5Hz), 6.95 (1H, d, /=2.5 Hz), 7.07 (1H, S)，7.18 (1H, d, / = 8.7 Hz), 7.40 (2H,d, /= 8.5 Hz), 7.43 (1H, d, / = 15.5 Hz) ; (DMSO-Or6, 400 MHz) S= 25.071 (C-1O),40.03 (C-ll), 102.11 (C_4)，111.08 (C_6)，111.39 (C_7)，111.51 (C_3)，115.24(C-3' 50，117.38 (C-8 0，122.77 (C_2)，126.71 (C—1)，128.17 (C_9)，129.35(C-2' 60，131.86 (C-8), 140.47 (C-7 ^), 149.82 (C_5)，159.32 (C-40，167.98(CO)。確定為化合物#-(/7-香豆醯)5-羥色胺。
[0022]化合物2，粉末狀。1H-NMR ((DMSO-J6, 400 MHz) S= 2.97 (2H, t)，3.56 (2H,t), 3.86 (3H), 6.38 (1H, d, /=15.5 Hz), 6.71 (1H, d, /=2.5 Hz), 6.82 (1H, d,/=8.5 Hz), 6.95 (1H, d, /=2.5 Hz), 7.05 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.07 (1H, S)，7.15(1H, d, / = 1.5 Hz), 7.18 (1H, d, /=8.7 Hz), 7.42 (1H, d, / = 15.5 Hz) ; 13C-NMR(DMS0-14, 400 MHz) δ= 25.07 (C-10), 40.09 (C-ll), 54.99 (OCH3), 102.13 (C_4)，110.51 (C-60, 111.10 (C_6)，111.41 (C-7), 111.55 (C_3)，115.24 (C-30，117.68(C-8 ^), 121.97 (C-2，)，122.98 (C_2)，127.11 (C-1), 128.25 (C_9)，131.92(C-8), 140.69 (C-7 0, 147.95 (C-5 0, 148.60 (C-40, 149.87 (C_5)，167.95 (CO)。確定為化合物阿魏醯5-羥色胺。
[0023]實施例二:
1、5-羥色胺衍生物粗提物製備
5-羥色胺衍生物粗提物製備同實施例一。[0024]2、高速逆流分離製備5-羥色胺衍生物
在分液漏鬥中配製氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(3.5:4:4.5，v/v)兩相溶劑系統，充分振搖後靜置過夜。下相為固定相，上相為流動相，使用前分別超聲脫氣30 min。取120mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解於10 mL下相溶液中，備用。
[0025]用15 mL/min流速將溶劑系統下相泵入主機並充滿分離螺線管，開啟循環水浴並將溫度設定為25 °C。開啟主機電源以850 r/min正向旋轉，待轉速穩定後，以2.0 mL/min流速泵入流動相，待流動相從管柱出口流出且基線穩定後，將樣品溶液由進樣圈注入。管柱出口處流出液在310 nm波長下連續檢測，根據色譜圖手動收集各色譜峰組分，從120 mg待分離樣品中一次性分離製備得到19.8 mg香豆醯)5_羥色胺和17.4 mg阿魏醯5-羥色胺。HPLC檢測純度分別為96.5%和97.7%。
[0026]實施例三:
1、5-羥色胺衍生物粗提物製備
5-羥色胺衍生物粗提物製備同實施例一。
[0027]2、高速逆流分離製備5-羥色胺衍生物
在分液漏鬥中配製氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(1: 1: 1，v/v)兩相溶劑系統，充分振搖後靜置過夜。下相為固定相，上相為流動相，使用前分別超聲脫氣30 min。取100 mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解於10 mL下相溶液中，備用。
[0028]用15 mL/min流速將溶劑系統下相泵入主機並充滿分離螺線管，開啟循環水浴並將溫度設定為25 °C。開啟主機電源以800 r/min正向旋轉，待轉速穩定後，以2.5 mL/min流速泵入流動相，待流動相從管柱出口流出且基線穩定後，將樣品溶液由進樣圈注入。管柱出口處流出液在280 nm波長下連續檢測，根據色譜圖(見圖2)手動收集各色譜峰組分，從100 mg待分離樣品中一次性分離製備得到18.2 mg Ar-(p-香豆醯)5-輕色胺和16.3 mg阿魏醯5-羥色胺。HPLC檢測純度分別為96.5%和97.1%。
[0029]實施例四:
1、5-羥色胺衍生物粗提物製備
取紅花籽柏500 g用無水乙醇(液料比:10:1)回流提取1.5 h，提取3次合提取液，旋轉蒸發儀蒸乾，700 ml 70%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸乾，500 ml乙酸乙酯溶解，然後等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸乾備用。
[0030]2、高速逆流分離製備5-羥色胺衍生物
在分液漏鬥中配製氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(1: 1: 1，v/v)兩相溶劑系統，充分振搖後靜置過夜。下相為固定相，上相為流動相，使用前分別超聲脫氣30 min。取100 mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解於10 mL下相溶液中，備用。
[0031]用15 mL/min流速將溶劑系統下相泵入主機並充滿分離螺線管，開啟循環水浴並將溫度設定為25 °C。開啟主機電源以850 r/min正向旋轉，待轉速穩定後，以1.5 mL/min流速泵入流動相，待流動相從管柱出口流出且基線穩定後，將樣品溶液由進樣圈注入。管柱出口處流出液在310 nm波長下連續檢測，根據色譜圖手動收集各色譜峰組分，從100 mg待分離樣品中一次性分離製備得到18.5 mg香豆醯)5_羥色胺和16.9 mg阿魏醯5-羥色胺。HPLC檢測純度分別為97.3%和98.8%。
[0032]實施例五:1、5-羥色胺衍生物粗提物製備
取紅花籽柏I kg用無水乙醇(液料比:15:1)回流提取2 h，提取2次合提取液，旋轉蒸發儀蒸乾，1000 ml 85%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸乾，600 ml乙酸乙酯溶解，然後等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸乾備用。
[0033]2、高速逆流分離製備5-羥色胺衍生物
在分液漏鬥中配製氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(4:5:5，v/v)兩相溶劑系統，充分振搖後靜置過夜。下相為固定相，上相為流動相，使用前分別超聲脫氣30 min。取150 mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解於10 mL下相溶液中，備用。
[0034]用15 mL/min流速將溶劑系統下相泵入主機並充滿分離螺線管，開啟循環水浴並將溫度設定為25 °C。開啟主機電源以850 r/min正向旋轉，待轉速穩定後，以2.0 mL/min流速泵入流動相，待流動相從管柱出口流出且基線穩定後，將樣品溶液由進樣圈注入。管柱出口處流出液在260 nm波長下連續檢測，根據色譜圖手動收集各色譜峰組分，從150 mg待分離樣品中一次性分離製備得到23.5 !^#-&-香豆醯)5-羥色胺和20.7 mg阿魏醯5-羥色胺。HPLC檢測純度分別為95.7%和96.3%。
【權利要求】
1.一種高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法，其特徵在於所述的方法包括以下步驟: ①將氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液混合成混合溶劑，分層； ②將5-羥色胺衍生物粗提物溶於①步驟的下層中； ③取①步驟混合溶劑分層，下相作為固定相，上相作為流動相，將固定相和流動相先後泵入高速逆流色譜內，將②步驟溶液經進樣閥進入色譜柱，進樣完畢後繼續泵入流動相； ④依據檢測器譜圖分別收集分離物，濃縮，即得香豆醯)5_羥色胺和阿魏醯5-羥色胺單體。
2.如權利要求1所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法，其特徵在於:所述的步驟①中的氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液的體積比為3~5: 4: 3~5。
3.如權利要求1所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法，其特徵在於:所述的步驟②中5-羥色胺衍生物粗提物溶於混合溶劑後的濃度為10~30 mg/mL。
4.如權利要求1或3所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法，其特徵在於所述的5-羥色胺衍生物粗提物由下列方法製備:將紅花籽柏按液料比5~20:1回流提取0.5~2 h，提取I~3次合併提取液，濃縮至幹，用60~90%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸乾，用乙酸乙酯溶解，然後等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸乾備用。
5.如權利要求1所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法，其特徵在於:所述的高速逆流色譜儀流速範圍為I~3 mL/min，轉速範圍為600~900 r/min。
6.如權利要求1所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中製備5-羥色胺衍生物方法，其特徵在於:所述的檢測波長為210~360nm。
【文檔編號】C07D209/16GK103588696SQ201310402221
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】丁晨旭, 李文聰, 王小豔, 張秋龍, 王洪倫, 索有瑞 申請人:中國科學院西北高原生物研究所