一種3M症候群致病基因CUL7複合雜合突變位點的應用及其診斷試劑的製作方法

2024-04-12 13:49:05 2

一種3m症候群致病基因cul7複合雜合突變位點的應用及其診斷試劑
技術領域
1.本發明屬於基因診斷技術領域，具體涉及一種3m症候群致病基因cul7複合雜合突變位點的應用及其診斷試劑。


背景技術：

2.3m症候群(omim 273750)是於1975年由5位科學家報導，並以前3位作者(miller jd，mckusick va，malvaux p)名字的首字母命名。該病是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，其最顯著的臨床特徵是從宮內開始的嚴重的生長遲緩，出生身長大多為40～42cm，頭圍大，生後無追趕性生長，最終身高低於正常均值5～6倍標準差。女性性腺功能正常，男性睪丸體積小及精液異常，可存在性腺功能紊亂及生育功能低下或是不孕，少數男性可有尿道下裂。頜面部特點：三角臉，前額突出，上頜骨發育不全，高顴弓，眉毛濃密，鼻頭厚，長人中，突唇，尖下巴，舌體中間裂縫，牙齒萌出延遲及牙釉質鈣化不全。影像學特點：長骨幹骺端壓縮變形，高位椎體縮短，胸椎椎體前楔入，胸椎後側凸，隱形脊柱裂，小骨盆，小髂翼，伴有纖細水平肋的寬胸骨，骨齡稍微延遲。其他特點：頸部短寬，斜方肌突出，胸骨畸形，方肩，翼狀肩胛骨，脊柱前凸，小指短，腳踝突出，關節鬆動。冠狀縫扁平化，眼距縮短，肘關節發育不全，尺骨短，第二掌骨假骨骺，小指彎曲，髖關節脫位。有研究通過對3m症候群患者下一代測序進行產前及早期診斷，顯示中國3m症候群患者新的臨床表現，如早期的運動發育延遲，下眼瞼脂肪墊，骨齡為延遲。
3.3m症候群致病基因包括cul7(cullin7)、obsl1(obscurin-like 1)和ccdc8(coiled-coil domain containing 8，ccdc8/p90)，其中cul7基因突變導致的3m症候群佔84％。研究表明cul7基因是3m症候群最常見的、首位致病候選基因。cul7基因(mim 609577)是定位於染色體6p21.1，基因長16.2kb，包含26各外顯子和25個內含子，編碼1668個胺基酸。cul7、obsl1、ccdc8在一個信號通路中，該信號通路與人類的生長發育有重要聯繫。下調cul7後，細胞的有絲分裂出現諸如微管運動障礙、前中期停滯、出現4倍體、有絲分裂細胞死亡等問題。這種現象在cul7突變的3m綜合症細胞中也出現，但在野生型細胞中沒有。提示3m綜合症蛋白複合物與有絲分裂中微管運動和基因組的完整性出現問題有關，也就可以解釋3m綜合症中出現的身體畸形現象。一定程度的gh抵抗或缺乏可能與3m症候群有關，3m症候群可能與gh、igf1和igf結合蛋白的失調有關，或許這是其矮小的原因。
4.基因突變是導致疾病發生發展的重要遺傳基礎，基因診斷是確診3m症候群的重要遺傳學標準。臨床上需要針對不同突變建立相應的檢測技術用於明確病因和疾病診斷。


技術實現要素：

5.有鑑於此，本發明的目的在於提供一種3m症候群致病基因cul7複合雜合突變位點的應用及其診斷試劑，可將3m症候群患者、攜帶者和正常人群區分開。
6.本發明提供了一種3m症候群致病基因cul7複合雜合突變位點c.616c》a和c.1825g
》a在製備3m症候群診斷試劑或製備預防和/或治療3m症候群靶點藥物中的應用。
7.本發明提供了一種用於3m症候群基因診斷的試劑，所述試劑是擴增cul7複合雜合突變位點c.616c》a和c.1825g》a的引物，包括核苷酸序列如seq id no:1所示的cul7-1f、核苷酸序列如seq id no:2所示的cul7-1r、核苷酸序列如seq id no:3所示的cul7-2f、核苷酸序列如seq id no:4所示的cul7-2r。
8.優選的，所述試劑包括測序引物；所述測序引物包括核苷酸序列如seq id no:5所示的cul7-seq1f、核苷酸序列如seq id no:6所示的cul7-seq1r、核苷酸序列如seq id no:7所示的cul7-seq2f、核苷酸序列如seq id no:8所示的cul7-seq2r。
9.本發明提供了，所述試劑包括pcr擴增試劑。
10.本發明提供了所述的試劑在製備3m症候群診斷試劑盒中的應用。
11.優選的，所述診斷的方法為利用所述診斷試劑盒檢測樣本中基因突變位點的基因型來診斷個體是否患有3m症候群，所述基因突變位點是cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a和exon7:c.1825g》a；檢測結果為「c.616c》a和c.1825g》a」複合雜合突變，則診斷受試個體為3m症候群。
12.優選的，所述樣本為血液。
13.本發明提供了一種3m症候群診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括所述的試劑。
14.本發明提供了一種3m症候群致病基因cul7複合雜合突變位點c.616c》a和c.1825g》a在製備3m症候群診斷試劑或製備預防和/或治療3m症候群靶點藥物中的應用。本發明通過外顯子組測序技術首次發現了cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a和exon7:c.1825g》a位點突變可以導致3m症候群發病。一方面，通過檢測受試者是否攜帶有上述突變，用於篩查或診斷3m症候群的遺傳學診斷，以指導治療。特別地，本發明所提供的診斷試劑盒可用於快速、有效地預測或診斷3m症候群。另一方面，本發明為3m症候群的發病機制研究奠定了重要基礎，為3m症候群患者的治療提供全新的理論依據。第三方面，本發明可以為治療3m症候群提供可能的藥物靶點。
附圖說明
15.圖1為3m症候群1號家系遺傳圖譜；其中，表示男性攜帶者，表示女性攜帶者，
●
表示女性患者，表示先證者。
16.圖2為利用sanger測序檢測1號家系cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a位點基因型的結果圖，1號家系中先證者、先證者父親、先證者妹妹為c.616c》a雜合突變(測序圖中箭頭所指為突變發生位置)；
17.圖3為利用sanger測序檢測1號家系cul7:nm_014780.5:exon7:c.1825g》a位點基因型的結果圖，1號家系中先證者及先證者母親為c.1825g》a雜合突變(測序圖中箭頭所指為突變發生位置)；
18.圖4為3m症候群2號家系遺傳圖譜。其中，表示男性攜帶者，表示女性攜帶者，
●
表示女性患者，表示先證者；
19.圖5為利用試劑盒檢測2號家系cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a位點基因型的結果圖，2號家系中先證者、先證者母親為c.616c》a雜合突變(測序圖中箭頭所指為突變發生位置)；
20.圖6為利用試劑盒檢測2號家系cul7:nm_014780.5:exon7:c.1825g》a位點基因型的結果圖，2號家系中先證者及先證者父親為c.1825g》a雜合突變(測序圖中箭頭所指為突變發生位置)。
具體實施方式
21.本發明提供了一種3m症候群致病基因cul7複合雜合突變位點c.616c》a和c.1825g》a在製備3m症候群診斷試劑或製備預防和/或治療3m症候群靶點藥物中的應用。
22.在本發明中，致病基因cul7的突變體核苷酸序列如seq id no：11(ctgagccaaaaagaagccatt)和seq id no：12(aaagtggaaagtgggtgccag)所示，基因全長參見登錄號為nm_014780.5的序列。致病基因cul7複合雜合突變位點c.616c》a和c.1825g》a表示在616位點鹼基由c突變為a，同時在1825位鹼基由g突變為a。致病蛋白cul7的突變體胺基酸序列如seq id no：13(lsqkeai)和seq id no：14(kvesgcq)所示。
23.本發明提供了一種用於3m症候群基因診斷的試劑，所述試劑是擴增cul7複合雜合突變位點c.616c》a和c.1825g》a的引物，包括核苷酸序列如seq id no:1(gatacaagccctgtcctc)所示的cul7-1f、核苷酸序列如seq id no:2(tccccactcaactcctc)所示的cul7-1r、核苷酸序列如seq id no:3(ctccttgatggcagattc)所示的cul7-2f、核苷酸序列如seq id no:4(tttacatcctccttcattct)所示的cul7-2r。
24.在本發明中，所述試劑優選包括測序引物；所述測序引物優選包括核苷酸序列如seq id no:5(tgtggtggcaaaaggatt)所示的cul7-seq1f、核苷酸序列如seq id no:6(tccaccttgtcccagttt)所示的cul7-seq1r、核苷酸序列如seq id no:7(aaccaagcctacccatccc)所示的cul7-seq2f、核苷酸序列如seq id no:8(ccttcattctttgagggaacac)所示的cul7-seq2r。所述試劑包括pcr擴增試劑。所述pcr擴增試劑包括但不限於dntp、pcr緩衝液、鎂離子和tap聚合酶。
25.本發明提供了所述的試劑在製備3m症候群診斷試劑盒中的應用。
26.在本發明中，所述診斷的方法優選為利用所述診斷試劑盒檢測樣本中基因突變位點的基因型來診斷個體是否患有3m症候群，所述基因突變位點是cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a和exon7:c.1825g》a；檢測結果為「c.616c》a和c.1825g》a」複合雜合突變，則診斷受試個體為3m症候群。所述樣本為血優選液。所述診斷試劑盒檢測樣本中基因突變位點的基因型的方法優選提取樣本的基因組dna，利用擴增引物進行pcr擴增，pcr產物經過dna測序，根據測序結果確定616位和1825位基因型，若616位同時存在和a，說明616基因型為「c.616c》a」雜合子，若616位點僅為a，說明基因突變位點未突變，屬於野生型，若1825位同時存在g和a，說明1825位基因型為「c.1825g》a」雜合子，若1825位僅為g，說明該基因突變位點未發生突變，屬於野生型。
27.本發明提供了一種3m症候群診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括所述的試劑。
28.在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的分子遺傳學、核酸化學和分子生物學相關術語和實驗室操作步驟均為相應領域內的廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
29.文中術語「診斷」包括疾病風險的預測、疾病發病與否的診斷、還包括對疾病預後
的評估。
30.文中術語「突變」是指野生型的多核苷酸序列發生改變，成為變異體，變異體可以是天然發生的或非天然發生的。
31.在本發明中，術語「複合雜合突變」是指是指等位基因均出現1處或以上的雜合突變，也就是雙等位突變，每條染色體均突變。
32.在本發明中，「引物」指用於在pcr反應中擴增靶標核酸的多核苷酸片段，其通常為寡核苷酸，例如含有至少5個鹼基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或者更多個鹼基的多核苷酸片段。引物不必與待擴增的目的基因或其互補鏈完全互補，只要其能夠特異性擴增目的基因。如本文中所使用的，
33.術語「特異性擴增」是指引物能夠通過pcr反應擴增目的基因，而不擴增其他基因。例如，特異性擴增cul7基因是指，在pcr反應中引物只擴增cul7基因，而不擴增其他基因。
34.下面結合實施例對本發明提供的一種3m症候群致病基因cul7複合雜合突變位點的應用及其診斷試劑進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。
35.實施例1
36.樣本獲取
37.發明人發現了一個3m症候群家系(簡稱cul7家系)，該cul7家系部分成員的臨床信息見表1。圖1顯示了cul7家系圖譜，其中，表示男性攜帶者，表示女性攜帶者，
●
表示女性患者，表示先證者。
38.1.診斷標準：
39.可參照《人類單基因遺傳疾病》2010版和《矮小症診治指南》2008版：
40.3-m症候群的診斷包括：
①
低出生體重；
②
嚴重的生長遲緩；
③
臨床特點及影像學特點；
④
3種基因突變(cul7、obsl1、ccdc8)。
41.表1 3m症候群家系成員的臨床信息
[0042][0043]
如圖1所示，編號採用ⅰ(第一代)、ⅱ(第二代)。
[0044]
家系人員ⅰ1(父親)、ⅰ2(母親)、ⅱ1(先證者)、ⅱ2(妹妹)外周血dna用於測序分析。
[0045]
實施例2外顯子測序
[0046]
1.儀器設備如表2所示。
[0047]
表2儀器設備一覽表
[0048][0049]
2.試劑耗材
[0050]
人類全外顯子測序試劑盒(agilent)、dna 1000試劑盒(agilent)、96孔板(axygen)、不同型號槍頭(axygen)、200μl離心管(eppendorf)、1.5ml離心管(eppendorf)、毛細管電泳緩衝液(thermo)、測序標準物(thermo)、無水乙醇(thermo)、bigdye terminatorv3.1(thermo)、外周血gdna提取試劑盒(tiangen)、瓊脂糖(tiangen)、eb染液(amresco)。
[0051]
3.試劑配方
[0052]5×
tbe電泳液貯存液按照表3配製。
[0053]
表3 5
×
tbe電泳液配方
[0054]
試劑體積/重量tris5.4g硼酸750mgedta(ph8.0,0.5mol/l)2mlddh2o90ml
[0055]
用ddh2o將最終體積調整為100ml。
[0056]
0.5
×
tbe電泳液工作液，用ddh2o稀釋10倍即可。
[0057]
10
×
紅細胞裂解液按照表4配製。
[0058]
表4 10
×
紅細胞裂解液配方
[0059]
試劑體積/重量nh4cl82.9gkhco310gedta0.37g加dh2o至1000ml
[0060]
高壓滅菌，4℃保存。
[0061]1×
細胞核裂解液按照表5配製。
[0062]
表5 1
×
細胞核裂解液配方
[0063]
試劑體積/重量2mtris-hcl,ph8.20.5ml4mnacl10ml2mmedta0.4ml
[0064]
4.實驗步驟
[0065]
籤署知情同意書後，採集家系中ⅰ1(父親)、ⅰ2(母親)、ⅱ1(先證者)、ⅱ2(妹妹)等成員的外周血3～5ml。
[0066]
4.1樣本dna提取
[0067]
1)如為肝素抗凝外周血樣本，則將外周血3-5ml裝入15ml離心管中，加2～3倍體積的1
×
紅細胞裂解液，混勻，冰上靜置30分鐘，直至溶液變透明。
[0068]
2)4℃，3000轉/分鐘離心10分鐘，小心去上清液。沉澱中加1ml 1
×
細胞核裂解液，混勻，再加2ml 1
×
細胞核裂解液和150μl 20％sds，搖勻，至出現粘稠透明狀。加10μl 20mg/ml蛋白酶k，搖勻。37℃消化6小時以上或過夜。
[0069]
3)加等體積飽和酚，輕搖混勻，室溫3000轉/分鐘離心10分鐘。
[0070]
4)小心移上清至另一離心管，加等體積酚/氯仿(1:1v/v)混勻，室溫3000轉/分鐘離心10分鐘。
[0071]
5)小心移上清，若上清不清亮透明，則用等體積氯仿再抽提一次。
[0072]
6)將上清移入另一離心管中，加二倍體積無水乙醇，搖勻，見白色絮狀dna。用火焰滅菌的玻璃鉤針將dna鉤出，70％乙醇洗二次，室溫乾燥5分鐘，再將dna溶於200μl 1
×
te中，轉鼓溶解過夜。紫外測od值。
[0073]
7)te溶解的dna，在4℃下可保存一年，如要求長期保存，則需加2倍體積無水乙醇置-70℃保存。
[0074]
4.2外顯子測序
[0075]
1)取2μg dna，機械打斷，使片段大小在200bp左右，切膠回收150-250bp片段；
[0076]
2)dna片段做末端修復和3』末端加a；
[0077]
3)連接測序接頭，對連接產物進行純化，再行pcr擴增，擴增產物純化；
[0078]
4)agilent試劑盒探針加入純化後的擴增產物進行雜交捕獲，雜交產物經洗脫回收後做pcr擴增，再行最終產物回收，取小樣行瓊脂糖凝膠電泳進行質控分析；
[0079]
5)nextseq500測序儀測序和數據分析。
[0080]
4.3結果
[0081]
最終得到2個具有致病意義的基因突變cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a和exon7:c.1825g》a；c.616c》a突變造成第206穀氨醯胺變為賴氨酸，c.1825g位於7號外顯子最後一個鹼基，c.1824_1825位點與後面7號內含子初始2個鹼基(c.1825+1，c.1825+2)共同組成剪切位點，c.1825g》a突變破壞了剪切位點序列，造成剪切信號異常，進而造成mrna剪切異常。在家系患者個體中cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a和exon7:c.1825g》a位點的基因型是「c.616c》a和c.1825g》a」複合雜合突變，在cul7家系在攜帶者個體中基因型是「c.616c》a」或「c.1825g》a」單個雜合突變。
[0082]
實施例3
[0083]
sanger測序驗證
[0084]
對於外顯子組測序結果進一步利用sanger測序法，對cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a和exon7:c.1825g》a位點進行驗證。分別對實施例1中的ⅰ1、ⅰ2、ⅱ1、ⅱ2等家系人員和100名家系外正常人進行cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a和exon7:c.1825g》a位點基因型檢測。
[0085]
具體方法步驟如下：
[0086]
1、dna提取
[0087]
按照實施例1的方法提基因組dna。
[0088]
2、候選引物設計、驗證及優選
[0089]
2.1引物設計參考人類基因組序列資料庫hg19/build36.3，引物序列由上海生工生物技術公司合成。
[0090]
2.2針對c.616c》a和c.1825g》a位點分別設計15對候選引物(見表6)，並利用pcr實驗來驗證和評價各對候選引物的優劣情況
[0091]
表6各對候選引物基本情況和驗證實驗結果一覽表
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096]
[0097][0098]
註：正常pcr擴增結果電泳後只有一條特異性條帶，若出現引物二聚體條帶、非特異產物條帶均是引物異常反應的結果；目標引物儘可能避免這類情況。另外參考如下原則來綜合評價和選擇最優引物對：
[0099]
①
引物長度為15-30nt，常用為20nt左右；
[0100]
②
g+c含量以40-60％為宜，g+c太少擴增效果不佳，g+c過多易出現非特異條帶。atgc最好隨機分布；
[0101]
③
避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照；
[0102]
④
引物內部不應出現互補序列；
[0103]
⑤
兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3`端的互補重疊；
[0104]
⑥
引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70％，引物3`末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增；
[0105]
2.3候選引物pcr驗證反應
[0106]
按照表7中的反應體系進行pcr並保持反應體系在冰上；每對引物設置8個反應測試管(表7中序號1至8)。
[0107]
表7引物檢測pcr反應體系
[0108]
[0109]
[0110][0111]
反應條件：將上述測試反應管放入pcr儀，執行以下反應程序：
[0112]
第一步：95℃，5分鐘；
[0113]
第二步：30個循環(95℃，30秒
→
tm，30秒
→
72℃，60秒)；(根據表6中各引物tm值設置pcr擴增參數，如為雙引物則取tm平均值)。
[0114]
第三步：72℃，7分鐘；
[0115]
第四步：4℃直至取樣時。
[0116]
2.4候選引物pcr結果進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以評估引物反應的有效性、特異性：
[0117]
1)用膠帶將洗淨乾燥的凝膠成樣器兩端封好，置於一水平檯面上，在成樣器的一端約1cm處放置梳子。
[0118]
2)稱量2g瓊脂粉末於一錐形瓶中，加入100ml 0.5
×
tbe電泳緩衝液，搖勻後置微波爐或電爐上(加石棉網)加熱，沸騰後取出搖勻，再加熱，直至凝膠完全熔解，取出室溫冷卻。
[0119]
3)待凝膠冷卻至50℃左右，倒入封好的凝膠成樣器，使厚度在5mm左右。
[0120]
4)凝膠凝固拆除膠帶，將凝膠與成樣器一起放入電泳槽中。
[0121]
5)加入電泳緩衝液，使液面高於膠面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器將樣品和dna大小標準品分別與載樣液混勻後，加入各加樣孔內，由於載樣液中蔗糖比重較大，dna沉入孔底。
[0122]
6)蓋上電泳槽，接通電源，調至適當電壓，開始電泳。根據載樣液中溴酚藍的指示，判斷樣品的大概位置，決定是否終止電泳。
[0123]
7)切斷電源，取出凝膠，放入0.5g/ml的eb水溶液中染色10-15分鐘。
[0124]
8)將凝膠放到透射式紫外照射儀下觀察結果，波長254nm，並用加紅色濾色片的相機照相或用凝膠掃描系統記錄電泳結果。
[0125]
2.5結果評價：
[0126]
1)如果7號管僅出現一條明亮清晰目的條帶，無其它條帶，則判斷該對引物和發應體系有效性好和特異性強；
[0127]
2)如果7號管沒有出現目的條帶，則判斷該對引物和反應體系無效；
[0128]
3)如果7號管出現目的條帶外的引物引物二聚體帶，並在2、3、4、5、6號部分管中也同樣出現引物二聚體帶，則判斷該對引物和反應體系有效性差；
[0129]
4)如果7號管出現目的條帶外的非特異性帶，並在5、6號部分管中也同樣出現非特異性帶，則判斷該對引物和反應體系特異性差；
[0130]
5)如果7號管出現目的條帶外的引物二聚體和非特異性帶，並在2、3、4、5、6號部分管中也同樣出現引物二聚體和非特異性帶，則判斷該對引物和反應體系有效性和特異性差。
[0131]
2.6根據表6驗證測試後統計的結果，選擇其中最優一對(表6中1號對)作為突變家系檢測用引物，針對c.616c》a位點的擴增引物序列如下所示：針對cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a位點的引物序列如下所示：
[0132]5』‑
gatacaagccctgtcctc-3』(seq id no：1)
[0133]5』‑
tccccactcaactcctc-3』(seq id no：2)
[0134]
針對cul7:nm_014780.5:exon7:c.1825g》a位點的引物序列如下所示：
[0135]5』‑
gatacaagccctgtcctc-3』(seq id no：3)
[0136]5』‑
tccccactcaactcctc-3』(seq id no：4)
[0137]
3、1號家系人員和100名家系外人員突變位點pcr擴增
[0138]
按照表8中的反應體系進行pcr並保持反應體系在冰上。
[0139]
表8突變位點pcr反應體系
[0140]
試劑體積10
×
pcr緩衝液2.0μl10mmol/ldntps0.4μl100ng/μlcul7-f0.5μl100ng/μlcul7-r0.5μl100ng/μl外周血抽提dna1.0μl5u/μltaq酶0.2μlddh2o15.4μl
[0141]
反應條件：將反應體系放入pcr儀，執行以下反應程序：
[0142]
第一步：95℃，5分鐘；
[0143]
第二步：30個循環(95℃，30秒
→
51℃，30秒
→
72℃，60秒)；
[0144]
第三步：72℃，7分鐘；
[0145]
第四步：4℃直至取樣時。
[0146]
4、瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0147]
參照上述2.4步驟。
[0148]
5、pcr產物酶解法純化：5μl pcr產物中分別加入0.5μl核酸外切酶i(exo i)，1μl鹼性磷酸酶(aip)，37℃消化15分鐘，85℃使酶失活15分鐘。
[0149]
6、bigdye反應
[0150]
bigdye反應體系見表9。
[0151]
表9 bigdye反應體系
[0152][0153][0154]
測序pcr循環條件：
[0155]
第一步：96℃，1分鐘；
[0156]
第二步：33個循環(96℃，30秒
→
55℃，15秒
→
60℃，4分鐘)；
[0157]
第三步：4℃直至取樣時。
[0158]
7、bigdye反應產物純化：
[0159]
1)每管加入1μl 125mm edta(ph8.0)，加到管底，再加入1μl 3mol/lnaac(ph5.2)；
[0160]
2)加入70μl 70％酒精，震蕩混勻4次，室溫放置15分鐘；
[0161]
3)3000g，4℃離心30分鐘；馬上倒置96孔板，185g離心1分鐘；
[0162]
4)室溫放置5分鐘，讓殘餘的酒精在室溫揮發乾，加入10μl hi-di甲醯胺溶解dna，96℃變性4分鐘，迅速置冰上4分鐘，上機測序。
[0163]
8、測序
[0164]
將純化後的bigdye反應產物進行dna測序，測序引物則在上述pcr優選引物的基礎上設計巢式引物(第二組引物是在第一組引物擴增得到的產物序列範圍內設計的)作為測序引物，針對cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a位點的引物序列如下所示：
[0165]5』‑
tgtggtggcaaaaggatt-3』(seq id no：5)
[0166]5』‑
tccaccttgtcccagttt-3』(seq id no：6)
[0167]
將純化後的bigdye反應產物進行dna測序，針對cul7:nm_014780.5:exon7:c.1825g》a位點的引物序列如下所示：。
[0168]5』‑
aaccaagcctacccatccc-3』(seq id no：7)
[0169]5』‑
ccttcattctttgagggaacac-3』(seq id no：8)
[0170]
9、結果分析
[0171]
圖2的sanger測序結果顯示，家系3名人員cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a位
點基因型是「c.616c》a」雜合突變。圖2測序圖中箭頭所指位置顯示a、c和d層cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a位點基因型是「c.616c》a」雜合突變，圖b層該基因位點為野生型。
[0172]
圖3的sanger測序結果顯示，家系2名人員cul7:nm_014780.5:exon7:c.1825g》a位點基因型是「c.1825g》a」雜合突變。圖3測序圖中箭頭所指位置顯示b、c層個體cul7:nm_014780.5:exon7:c.1825g》a位點基因型是「c.1825g》a」雜合突變，圖a層和d層該位點基因型野生型。
[0173]
實施例4
[0174]
cul7基因c.616c》a、c.1825g》a複合雜合突變診斷試劑盒及應用
[0175]
1、試劑盒組成：
[0176]
1)擴增引物：如實施例3所示
[0177]
2)緩衝液
[0178]
3)taq酶
[0179]
4)dntps
[0180]
5)cul7:c.616c》a、c.1825g》a陽性突變參考品dna該參考品為一段雙鏈dna，c.616c》a陽性突變參考品dna具體序列如下所示：
[0181][0182]
[0183]
c.1825g》a陽性突變參考品dna具體序列如下所示：
[0184][0185]
其中，加粗鹼基為pcr擴增上下遊引物，單下劃線鹼基為突變位點，雙下劃線鹼基為上下遊測序引物。
[0186]
6)測序引物：如實施例3所示。
[0187]
2、使用方法：
[0188]
應用於2號家系基因突變檢測。
[0189]
表10 3m症候群2號家系成員的臨床信息
[0190]
[0191]
如圖4所示，編號採用ⅰ(第一代)、ⅱ(第二代)。
[0192]
2號家系人員ⅰ1(父親)、ⅰ2(母親)、ⅱ1(先證者)外周血dna用於試劑盒檢測分析。
[0193]
1)基因組dna提取：提取樣本基因組dna。
[0194]
2)先採用上述pcr擴增引物、taq酶、緩衝液、dntps、樣本基因組dna等進行pcr擴增反應；
[0195]
3)對pcr擴增產物進行純化；
[0196]
4)採用上述測序引物對純化的pcr產物進行bigdye反應；
[0197]
5)對biydye反應產物純化；
[0198]
6)對biydye反應產物測序，測序序列與正常序列相比較。
[0199]
圖5顯示利用試劑盒檢測2號家系cul7:nm_014780.5:exon3:c.616c》a位點基因型的結果圖，先證者、先證者母親為c.616c》a雜合突變；其中2號家系cul7:nm_014780.5:exon7:c.1825g》a位點基因型的結果圖，先證者及先證者父親為c.1825g》a雜合突變；檢測結果確認先證者為3m症候群患者；檢測結果提示先證者父母突變攜帶者，下次妊娠3m症候群患孩的概率是1/4，妊娠攜帶者的概率是1/2，出生正常個體的概率是1/4；推薦先證者父母下次計劃生育二孩時，可去生殖醫學中心行胚胎植入前遺傳學診斷或去產前診斷機構行產前診斷。
[0200]
由以上實施例結果可以看出，本發明發現了新的cul7基因突變，且確認了新突變體與3m症候群的發病密切相關，所述致病突變體可用於3m症候群的分子診斷及與相關疾病的鑑別診斷。
[0201]
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。