一種利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基的方法
2024-04-07 13:58:05
專利名稱：一種利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種發酵培養基生產方法，更具體地說，涉及一種利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基的方法。
背景技術：
一氧化碳營養菌(Carboxydotrophic bacteria)，一類既能利用CO作為唯一碳源和能源，又能以CO2和H2分別作為碳源和能源，通過獨特的Wood-Ljungdahl途徑進行自養生長代謝的細菌。當以CO2和H2作為代謝底物時，代謝過程中會形成CO中間體，因此，該類細菌統稱為一氧化碳營養菌。大部分一氧化碳營養菌為嚴格厭氧菌，對氧氣極為敏感，該類細菌以CO、CO2和H2為底物進行自養生長的同時能夠生成乙酸、丁酸、乙醇、丁醇和氫氣等重要的化工品和清潔能源，見反應式(1-9)；少部分一氧化碳營養菌為好氧菌或耐氧菌，對氧氣不敏感，該類細菌能夠利用CO和O2合成細胞，並將部分CO轉化為CO2，見反應式(10)，這類細菌可用於處理汽車尾氣中的CO以及其它含CO廢氣。因此，一氧化碳營養菌在能源和環境領域具有廣闊的應用前景。
6CO+3H2O→CH3CH2OH+4CO2(1) 2CO2+6H2→CH3CH2OH+3H2O(2) 4CO+2H2O→CH3COOH+2CO2 (3) 4H2+2CO2→CH3COOH+2H2O (4) 10CO+4H2O→CH3CH2CH2COOH+6CO2 (5) 12CO+5H2O→CH3CH2CH2C H2OH+86CO2 (6) 10H2+4CO2→CH3CH2CH2COOH+6H2O (7) 12H2+4CO2→CH3CH2CH2CH2OH+7H2O(8) CO+H2O→H2+CO2(9) 2.19CO+O2→1.83CO2+0.36C細胞 (10) 然而，微生物的生長代謝，除了碳源(CO或CO2)和能源(CO或H2)外，還需要氮源、無機鹽、生長因子。無機鹽包括P、S、K、Na、Mg、Fe等大量元素以及Cu、Zn、Mn、Co、Ni、Se等微量元素，生長因子主要為各類維生素。由於一氧化碳營養菌的底物為無機物(CO、CO2和H2)，因此生長代謝所需的大量元素、微量元素以及各類維生素均必須額外補充。
以嚴格厭氧一氧化碳營養菌Clostridium ljungdahlii(菌種保藏編號為ATCC 55383或DSM 13528)為例，該菌能夠利用合成氣的主要成分(CO、CO2和H2)進行細胞生長並發酵產乙醇和乙酸。ATCC(美國標準菌種收藏所)提供該菌的發酵培養基配方如下NH4Cl 1g，KClO.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.8g，KH2PO4 0.1g，CaCl2·2H2O 20mg，酵母膏1g，微量元素溶液10mL，維生素溶液10mL，還原劑溶液10mL，蒸餾水980mL。
上述微量元素溶液配方為次氨基三乙酸2g，MnSO4·H2O 1g，Fe(SO4)2(NH4)2·6H2O 0.8g，CoCl2·6H2O 0.2g，ZnSO4·7H2O 0.2g，CuCl2·2H2O 20mg，NiCl2·6H2O 20mg，Na2MoO4·2H2O20mg，Na2SeO4 20mg，Na2WO4 20mg，蒸餾水1L。
上述維生素溶液配方為生物素2mg，葉酸2mg，維生素B6 10mg，維生素B1 5mg，核黃素5mg，煙酸5mg，泛酸鈣5mg，維生素B12 0.1mg，氨基苯酸5mg，硫辛酸5mg，蒸餾水1L。
上述還原劑溶液配方為NaOH 0.9g，半胱氨酸·H2O 4g，NaS·9H2O 4g，蒸餾水100mL。
從上述配方可以看出，雖然用量很少，但是所需添加的營養成分較多，造成培養基配製程序較為繁雜，且某些微量元素和維生素的市場價格較為昂貴。因此，開發配製程序簡單且成本低廉的一氧化碳營養菌發酵培養基，對於該類細菌在能源與環境領域的大規模工業應用，是必須解決的技術關鍵之一。
發明內容
本發明的主要目的在於克服現有技術中的不足，提供一種利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基的方法，以簡化培養基配製程序和降低培養基生產成本。
為了解決上述技術問題，本發明通過以下兩種技術方案實現。
第一種技術方案為，利用沼液生產嚴格厭氧型一氧化碳營養菌發酵培養基，其流程如圖1所示，包括以下步驟 (1)取正常運行的沼氣池的沼液，經篩網過濾去除大顆粒固體雜質，獲得濾液，；濾液離心後獲得上清液； 優選的篩網孔徑小於2mm (2)根據不同的嚴格厭氧一氧化碳營養菌所需的pH值將上述上清液進行pH調節；表1列舉了部分嚴格厭氧一氧化碳營養菌的最佳pH值，表1的內容為本技術領域公知技術，但一氧化碳營養菌不局限於這些細菌。
表1 部分一氧化碳營養菌的最佳pH值 (3)對完成pH調節的上清液進行氮氣吹脫，以減少上清液中的溶解氧；將完成氮氣吹脫的上清液在無氧氣氛下進行分裝；將完成分裝的上清液滅菌，滅菌完成後取出冷卻至室溫； 上述無氧氣氛指在100％的N2或CO2氣體環境中。
(4)在無氧氣氛下配製還原劑溶液，所述還原劑溶液配方為NaOH 9g，半胱氨酸·H2O40g，NaS·9H2O 40g，蒸餾水1L； (5)將還原劑溶液加入到已滅菌的上清液內，並搖勻，添加量為1L上清液添加10mL還原劑溶液； (6)至此獲得成品瓶裝厭氧型一氧化碳營養菌發酵培養基，將其在0℃~4℃條件下冷藏備用。當使用時，可根據需要用無菌水進行稀釋。
第二種技術方案為，利用沼液生產好氧或耐氧型一氧化碳營養菌發酵培養基，其流程如圖2所示，包括以下步驟 (1)取正常運行的沼氣池的沼液，經篩網過濾去除大顆粒固體雜質，獲得濾液，濾液經離心獲得上清液； 優選的篩網孔徑小於2mm； (2)將上述上清液根據不同的一氧化碳營養菌所需的pH值進行pH調節； (3)將完成pH調節的上清液在常規條件(空氣氣氛下)進行分裝，將分裝後的瓶裝上清液滅菌； (4)至此獲得成品瓶裝好氧或耐氧型一氧化碳營養菌發酵培養基，將其在0℃~4℃條件下冷藏備用。當使用時，可根據需要用無菌水進行稀釋。
與現有技術相比，本發明的有益效果是 (1)本發明所用的沼液來源廣泛，且含有豐富的氮、磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣、鐵等氮源和大量元素，銅、鋅、鈷、鎳、鉬、錳、鎢、硒等微量元素，以及各種胺基酸和維生素等生長因子，非常適合一氧化碳營養菌的生長代謝需求。採用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基，可以節省培養基配製所需的各類化學藥品，降低生產成本。
(2)與傳統的一氧化碳營養菌發酵培養基生產方法相比，利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基，方法簡單、步驟較少、容易操作。
(3)以沼液作為生產一氧化碳營養菌的發酵培養基，能夠變廢為寶，提高沼液的附加值，實現物盡其用，從而使整個沼氣工程系統更具經濟性。
圖1是本發明利用沼液生產嚴格厭氧型一氧化碳營養菌發酵培養基的流程圖 圖2是本發明利用沼液生產好氧或耐氧型一氧化碳營養菌發酵培養基的流程圖
具體實施例方式 以下結合實施例對本發明進行進一步說明。
實施例1 利用畜禽養殖廢棄物沼氣池的沼液生產嚴格厭氧型一氧化碳營養菌的發酵培養基，具體過程如下 (1)取正常運行的畜禽養殖廢棄物厭氧消化沼氣池的沼液，利用孔徑為1mm的篩網過濾去除大顆粒固體雜質，獲得濾液； (2)將上述濾液於離心機內進行離心並獲得上清液，離心機轉速為5000轉/分，離心時間為20分鐘； (3)將上述上清液的pH調節為6.0； (4)對pH為6.0的上清液進行氮氣吹脫，用100％的N2從上清液儲罐底部通入並從頂部排出，氮氣吹脫以減少上清液中的溶解氧； (5)經氮氣吹脫後的上清液在厭氧操作箱內進行分裝，上清液被分裝在500mL密封瓶中，裝填量為250mL，並用丁基橡膠塞塞住瓶口，再用鋁封蓋或螺旋蓋封住瓶口，得到瓶裝上清液； (6)將瓶裝上清液置於高壓滅菌鍋內滅菌，控制滅菌溫度為121℃，滅菌時間為15分鐘，滅菌完成後取出冷卻至室溫； (7)在厭氧操作箱內配製還原劑溶液，並利用孔徑為0.45μm的無菌過濾器過濾，將過濾後的還原劑溶液裝入帶密封塞的1L無菌無氧瓶，並用丁基橡膠塞塞住瓶口，再用鋁封蓋或螺旋蓋封住瓶口，得到瓶裝還原劑溶液； 上述還原劑溶液配方為NaOH 9g，半胱氨酸·H2O 40g，NaS·9H2O 40g，蒸餾水1L。
(8)利用一次性無菌注射器取2.5mL瓶裝還原劑溶液加入到瓶裝上清液內，並攪拌均勻，至此獲得成品瓶裝厭氧型培養基，並在0℃~4℃條件下冷藏備用。
利用實施例1獲得的成品瓶裝培養基，以CO、CO2和H2作為嚴格厭氧型一氧化碳營養菌(Clostridium ljungdahlii，菌種編號為ATCC 55383或DSM13528)的底物，進行細胞生長及產乙酸和乙醇發酵。
在無菌厭氧操作箱內，採用一次性無菌注射器將5mL的Clostridium ljungdahlii菌種液接種到具體實施例1獲得的成品瓶裝培養基中，搖勻後取2mL液樣進行細菌濃度和乙酸、乙醇濃度檢測。接種後充入混合氣(10％N2+90％(CO+CO2+H2))，並在37℃的恆溫搖床培養箱中培養15天，取氣樣和液樣檢測氣體成分及液體中的細菌濃度和乙酸、乙醇濃度。培養前後的細菌濃度、氣體成分比例及乙酸和乙醇濃度見表2。
表2 Clostridium ljungdahlii培養前後的細菌濃度、氣體成分比例及乙酸和乙醇濃度 實施例2 利用城市生活有機垃圾厭氧消化沼氣池的沼液生產嚴格厭氧型一氧化碳營養菌的發酵培養基，具體過程如下 (1)取正常運行的城市生活有機垃圾厭氧消化沼氣池的沼液，利用孔徑為1.5mm的篩網過濾去除大顆粒固體雜質，獲得濾液； (2)將上述濾液於離心機內進行離心並獲得上清液，離心機轉速為6000轉/分，離心時間為15分鐘； (3)將上述上清液的pH調節為6.2； (4)對pH為6.2的上清液進行氮氣吹脫，用100％的N2從上清液儲罐底部通入並從頂部排出，氮氣吹脫以減少上清液中的溶解氧； (5)經氮氣吹脫後的上清液在厭氧操作箱(上海新苗醫療器械製造有限公司生產)內進行分裝，上清液被分裝在500mL密封瓶中，裝填量為200mL，並用丁基橡膠塞塞住瓶口，再用鋁封蓋或螺旋蓋封住瓶口，得到瓶裝上清液； (6)將瓶裝上清液置於高壓滅菌鍋內滅菌，控制滅菌溫度為115℃，滅菌時間為20分鐘，滅菌完成後取出冷卻至室溫； (7)在厭氧操作箱內配製還原劑溶液，並利用孔徑為0.45μm的無菌過濾器過濾，將過濾後的還原劑溶液裝入帶密封塞的1L無菌無氧瓶，並用丁基橡膠塞塞住瓶口，再用鋁封蓋或螺旋蓋封住瓶口，得到瓶裝還原劑溶液； 上述還原劑溶液配方為NaOH 9g，半胱氨酸·H2O 40g，NaS·9H2O 40g，蒸餾水1L。
(8)利用一次性無菌注射器取2mL瓶裝還原劑溶液加入到瓶裝上清液內，並攪拌均勻，至此獲得成品瓶裝厭氧型培養基，並在0℃~4℃條件下冷藏備用。
利用實施例2獲得的成品瓶裝培養基，以CO、CO2和H2作為嚴格厭氧型一氧化碳營養菌(Clostridium carboxidivorans，菌種編號為ATCC BAA-624或DSM 15243)的底物，進行細胞生長及產乙酸、乙醇、丁酸和丁醇發酵。
在無菌厭氧操作箱內，採用一次性無菌注射器將4mL的Clostridium carboxidivorans菌種液接種到實施例2獲得的成品瓶裝培養基中，搖勻後取2mL液樣進行細菌濃度和乙酸、乙醇、丁酸、丁醇濃度檢測。接種後充入混合氣(10％N2+90％(CO+CO2+H2))，並在38℃的恆溫搖床培養箱中培養20天，取氣樣和液樣檢測氣體成分及液體中的細菌濃度和乙酸、乙醇、丁酸、丁醇濃度。培養前後的細菌濃度、氣體成分比例、乙酸、乙醇、丁酸、丁醇濃度見表3。
表3 Clostridium carboxidivorans培養前後的 細菌濃度、氣體成分比例、乙酸、乙醇、丁酸、丁醇濃度 實施例3 利用來源於市政汙水汙泥厭氧消化沼氣池的沼液生產嚴格厭氧型一氧化碳營養菌的發酵培養基，具體過程如下 (1)取正常運行的市政汙水汙泥厭氧消化沼氣池的沼液，利用孔徑為1mm的篩網過濾去除大顆粒固體雜質，獲得濾液； (2)將上述濾液於離心機內進行離心並獲得上清液，離心機轉速為8000轉/分，離心時間為15分鐘； (3)將上述上清液的pH調節為6.8~7.0； (4)對pH為6.8~7.0的上清液進行氮氣吹脫，用100％的N2從上清液儲罐底部通入並從頂部排出，氮氣吹脫以減少上清液中的溶解氧； (5)經氮氣吹脫後的上清液在100％的N2氣氛下進行分裝，上清液被分裝在500mL密封瓶中，裝填量為250mL，並用丁基橡膠塞塞住瓶口，再用鋁封蓋或螺旋蓋封住瓶口，得到瓶裝上清液； (6)將瓶裝上清液置於高壓滅菌鍋內滅菌，控制滅菌溫度為121℃，滅菌時間為20分鐘，滅菌完成後取出冷卻至室溫； (7)在100％的N2氣氛下配製還原劑溶液，並利用孔徑為0.45μm的無菌過濾器過濾，將過濾後的還原劑溶液裝入帶密封塞的1L無菌無氧瓶，並用丁基橡膠塞塞住瓶口，再用鋁封蓋或螺旋蓋封住瓶口，得到瓶裝還原劑溶液； 上述還原劑溶液配方為NaOH 9g，半胱氨酸·H2O 40g，NaS·9H2O 40g，蒸餾水1L。
(8)利用一次性無菌注射器取2.5mL瓶裝還原劑溶液加入到瓶裝上清液內，並攪拌均勻，至此獲得成品瓶裝厭氧型培養基，並在0℃~4℃條件下冷藏備用。
利用實施例3獲得的成品瓶裝培養基，以CO作為嚴格厭氧型一氧化碳營養菌(Carboxydothermus hydrogenoformans，菌種編號為ATCC BAA-161或DSM 6008)的底物，進行細胞生長及一氧化碳產氫發酵。
在無菌厭氧操作箱內，採用一次性無菌注射器將5mL的Carboxydothermushydrogenoformans菌種液接種到具體實施例3獲得的成品瓶裝培養基中，並取2mL液樣進行細菌濃度檢測。接種後充入混合氣(10％N2+90％CO)，並在70℃的恆溫搖床培養箱中培養10天，取氣樣和液樣檢測氣體成分及液體中的細菌濃度。培養前後的細菌濃度和氣體成分比例見表4。
表4 Carboxydothermus hydrogenoformans培養前後的細菌濃度和氣體成分比例 實施例4 利用城市生活有機垃圾厭氧消化沼氣池的沼液生產好氧型一氧化碳營養菌的發酵培養基，具體過程如下 (1)取正常運行的城市生活有機垃圾厭氧消化沼氣池的沼液，利用孔徑為1.5mm的篩網過濾去除大顆粒固體雜質，獲得濾液； (2)將上述濾液於離心機內進行離心並獲得上清液，離心機轉速為6000轉/分，離心時間為15分鐘； (3)將上述上清液的pH調節為7.0； (4)將pH為7.0的上清液在常規條件(空氣氣氛下)進行分裝，上清液被分裝在500mL密封瓶中，裝填量為250mL，並用丁基橡膠塞塞住瓶口，再用鋁封蓋或螺旋蓋封住瓶口，得到瓶裝上清液； (5)將分裝後的瓶裝上清液置於滅菌鍋內滅菌，控制滅菌溫度為120℃，滅菌時間為15分鐘； (6)滅菌完成後取出冷卻至室溫，至此獲得成品瓶裝好氧型培養基，並在0℃~4℃條件下冷藏備用； 利用實施例4獲得的成品瓶裝培養基，以CO為好氧型一氧化碳營養菌(Oligotrophacarboxidovorans，菌種編號為ATCC 49405或DSM 1227)的底物，進行細胞生長及CO轉變為CO2的生化反應。
在無菌超淨工作檯內，採用一次性無菌注射器將5mL的Oligotropha carboxidovorans菌種液接種到具體實施例4獲得的成品瓶裝培養基中，搖勻後取2mL液樣進行細菌濃度檢測。接種後充入混合氣(10％N2+70％CO+20％O2)，並在30℃的恆溫搖床培養箱中培養25天，取氣樣和液樣檢測氣體成分及液體中的細菌濃度。培養前後的細菌濃度和氣體成分比例見表5。
表5 Oligotropha carboxidovorans培養前後的細菌濃度和氣體成分比例 最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯然，本發明不限於以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基的方法，其特徵在於包括如下步驟
(1)取正常運行的沼氣池的沼液，經篩網過濾去除大顆粒固體雜質，獲得濾液；濾液離心後獲得上清液；
(2)根據不同的嚴格厭氧一氧化碳營養菌調節所需的pH值將上述上清液進行pH調節；
(3)對完成pH調節的上清液進行氮氣吹脫，以減少上清液中的溶解氧；將完成氮氣吹脫的上清液滅菌，滅菌完成後取出冷卻至室溫；將完成氮氣吹脫的上清液在無氧氣氛下進行分裝；
(4)在無氧氣氛下配製還原劑溶液；
(5)將還原劑溶液加入到已滅菌的上清液內，並搖勻，添加量為1L上清液添加10mL還原劑溶液；
(6)至此獲得成品瓶裝厭氧型一氧化碳營養菌發酵培養基，將其在0℃~4℃條件下冷藏備用。
2.如權利要求1所述的利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基的方法，其特徵在於，所述還原劑溶液配方為NaOH 9g，半胱氨酸·H2O 40g，NaS·9H2O 40g，蒸餾水1L。
3.一種利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基的方法，其特徵在於包括如下步驟
(1)取正常運行的沼氣池的沼液，經篩網過濾去除大顆粒固體雜質，獲得濾液；濾液經離心獲得上清液；
(2)將上述上清液根據不同的一氧化碳營養菌調節所需的pH值進行pH調節；
(3)將完成pH調節的上清液在常規條件(空氣氣氛下)進行分裝，將分裝後的瓶裝上清液滅菌；
(4)至此獲得成品瓶裝好氧或耐氧型一氧化碳營養菌發酵培養基，將其在0℃~4℃條件下冷藏備用。
全文摘要
本發明提供了一種利用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基的方法，以簡化培養基配製程序和降低培養基生產成本。取正常運行的沼氣池的沼液，經過濾、離心後獲得上清液，根據不同的一氧化碳營養菌所需的pH值進行pH調節，然後分別在無氧或有氧氣氛下加入還原劑，分別得到厭氧型或耐氧型一氧化碳營養菌發酵培養基。本發明採用沼液生產一氧化碳營養菌發酵培養基，可以節省培養基配製所需的各類化學藥品，降低生產成本。方法簡單、步驟較少、容易操作，能夠變廢為寶，提高沼液的附加值，實現物盡其用，從而使整個沼氣工程系統更具經濟性。
文檔編號C12N1/20GK101768563SQ20101010947
公開日2010年7月7日 申請日期2010年2月5日 優先權日2010年2月5日
發明者李 東, 孫永明, 袁振宏, 孔曉英, 李連華 申請人:中國科學院廣州能源研究所