一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法
2024-04-16 08:10:05
1.本發明涉及植物離體培養領域，特別是涉及一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法。
背景技術：
2.梨是薔薇科蘋果亞科或梨亞科梨屬(pyrus l.)多年生落葉果樹，原產中國，因其適應性強，分布廣，在全球80多個國家和地區都有種植，是世界性重要水果之一。梨的原種起源於第三紀的中國西部或西南山區，已知的梨屬植物種有30個以上，其中我國原產的梨屬植物有13個種，品種資源在3000份以上。
3.農業種質資源是保障國家糧食安全和重要農副產品有效供給的戰略性資源，是農業科技原始創新與現代種業發展的物質基礎。種質資源安全保存與品種創新和種業發展直接相關，目前我國果樹種質資源保存以田間圃保存為主，而西方發達國家相繼建成了由種質圃、超低溫庫、試管苗庫、低溫種子庫、dna庫等組成的多元化完整保存體系。中國果樹種質資源多元化保存水平亟待提高，果樹種質資源的離體培養是試管苗庫能否建立的關鍵環節。
4.目前通過離體培養可以獲得不同梨品種的組培試管苗，比如
『
萊陽茌梨』、
『
錦豐』、
『
早酥』、
『
鴨梨』、
『
秋白梨』、
『
幸水』、
『
新梨七號』、
『
碭山酥梨』、
『
黃花梨』等品種都獲得了離體試管苗，不同品種離體培養方法有不同，沒有統一且高效的培養方法。梨的離體培養大多選用田間健壯植株上春季或秋季的萌發無病蟲害幼嫩新梢為外植體。幼嫩新梢去除葉片清水清洗後再消毒處理，消毒一般採用70％～75％乙醇浸泡10～30s，無菌水衝洗3～5次，再用0.1％ hgcl2(升汞)消毒8～10min，最後用無菌水衝洗3～5次；或者2％～5％次氯酸鈉浸泡8～15min，無菌水衝洗5～6次，再用0.1％ hgcl2消毒8～10min，無菌水衝洗3～5次。離體培養中外植體消毒大多使用升汞或次氯酸鈉為主要消毒劑，升汞的殺菌效果極好，但是有劇毒且不易將殘留的藥劑除淨，會給環境造成汙染，消毒後離體培養的死亡率極高；使用次氯酸鈣毒性較小但殺菌效果一般，離體培養易褐變汙染，成活率低。因此，以梨幼嫩新梢莖段為外植體，採用升汞或次氯酸鈉消毒獲得的離體培養試管苗的方法效率不高。目前，缺少一種高效快速簡單無毒且適用於不同品種資源的離體培養方法。
技術實現要素：
5.本發明的目的是提供一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法，以解決上述現有技術存在的問題，通過外植體的選擇、消毒方式的篩選和培養過程的優化，實現了高效、簡單、無毒的獲得梨種質資源離體試管苗的目的。
6.為實現上述目的，本發明提供了如下方案：
7.本發明提供一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法，包括以下步驟：
8.以休眠後的一年生梨樹枝條室內培養出的嫩稍為外植體，用75％乙醇浸泡消毒兩次後，接種ms固體培養基光照培養，獲取梨種質資源離體組培苗。
9.優選的是，所述梨樹枝條室內培養出的嫩稍的方法為：將所述梨樹枝條用1/10ms培養液培養，每5天更換一次所述1/10ms培養液，誘導培養出嫩稍；培養條件為：每天光照12h、光照強度為1500-2100lx、溫度為25-27℃。
10.優選的是，所述嫩稍長至5-10cm，展開葉片3-5片，長出可見的節間2-4個時，去除所述嫩稍上的葉片後作為外植體。
11.優選的是，消毒方法為：用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗3-5次，再用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗3-5次。
12.優選的是，所述ms固體培養基包括以下濃度組分：ms培養基+30g/l蔗糖+5.5g/l瓊脂。
13.優選的是，光照培養條件為：溫度為25-27℃，光照強度為2000lx和光照時間為16h/d。
14.本發明公開了以下技術效果：
15.本發明公開了一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法，採用休眠的梨枝條室內培養出的嫩稍為外植體，只用75％乙醇消毒兩次，每次30s。消毒處理簡單便捷無毒副作用，外植體不易褐變，汙染率低，6-9周可高效獲得不同梨種質資源的離體組培苗，離體培養組培苗成活率最高可達100％。本發明為梨種質資源試管苗庫的建立提供技術支撐，為梨遺傳改良和無病毒苗繁育奠定基礎。
附圖說明
16.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
17.圖1為一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法不同步驟的示意圖；a：外植體誘導；b：外植體採集；c：外植體消毒；d：外植體培養；e：獲得離體組培苗。
具體實施方式
18.現詳細說明本發明的多種示例性實施方式，該詳細說明不應認為是對本發明的限制，而應理解為是對本發明的某些方面、特性和實施方案的更詳細的描述。
19.應理解本發明中所述的術語僅僅是為描述特別的實施方式，並非用於限制本發明。另外，對於本發明中的數值範圍，應理解為還具體公開了該範圍的上限和下限之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述範圍內的中間值以及任何其他陳述值或在所述範圍內的中間值之間的每個較小的範圍也包括在本發明內。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包括或排除在範圍內。
20.除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所述領域的常規技術人員通常理解的相同含義。雖然本發明僅描述了優選的方法和材料，但是在本發明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻通過引用併入，用以公開和描述與所述文獻相關的方法和/或材料。在與任何併入的文獻衝突時，以本說明書的內容為準。
21.在不背離本發明的範圍或精神的情況下，可對本發明說明書的具體實施方式做多種改進和變化，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。由本發明的說明書得到的其他實施方式對技術人員而言是顯而易見的。本技術說明書和實施例僅是示例性的。
22.關於本文中所使用的「包含」、「包括」、「具有」、「含有」等等，均為開放性的用語，即意指包含但不限於。
23.實施例1
24.一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法，包括以下步驟：
25.(1)外植體誘導(圖1中a)
26.冬季休眠後，自湖北省農業科學院果樹茶葉研究所國家砂梨種質資源圃(武漢)採集砂梨、白梨、豆梨、杜梨、西洋梨等不同種的梨種質資源一年生健壯無病蟲害的枝條。枝條放置於含有1/10ms培養液的燒杯中，每5天換新鮮的培養液，在每天光照12小時、光照強度為1500lx、溫度為25℃條件下進行培養。
27.(2)外植體採集(圖1中b)
28.枝條培養3周後，待一年生枝條上抽生新鮮嫩稍時，採集培養的一年生枝條上抽出5cm的嫩稍為外植體，要求嫩稍的展開葉片3片、可見節間2個，去除嫩稍上展開的嫩葉所獲得的嫩莖作為外植體使用。
29.(3)外植體消毒(圖1中c)
30.在超淨工作檯上，將外植體用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗3次，再用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗3次。
31.(4)離體培養(圖1中d)
32.消毒後的外植體接種於ms固體培養基上，培養基為ms培養基+30g/l蔗糖+5.5g/l瓊脂，ph為5.8。在溫度為25℃、光照強度2000lx和光照16h/d條件下進行離體培養，3周後獲得健壯的梨種質資源離體組培苗(圖1中e)。
33.實施例2
34.一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法，包括以下步驟：
35.(1)外植體誘導
36.冬季休眠後，自湖北省農業科學院果樹茶葉研究所國家砂梨種質資源圃(武漢)採集砂梨、白梨、豆梨、杜梨、西洋梨等不同種的梨種質資源一年生健壯無病蟲害的枝條。枝條放置於含有1/10ms培養液的燒杯中，每5天換新鮮的培養液，在每天光照12小時、光照強度為1800lx、溫度為26℃條件下進行培養。
37.(2)外植體採集
38.枝條培養4周後，待一年生枝條上抽生新鮮嫩稍時，採集培養的一年生枝條上抽出8cm的嫩稍為外植體，要求嫩稍的展開葉片4片、可見節間3個，去除嫩稍上展開的嫩葉所獲得的嫩莖作為外植體使用。
39.(3)外植體消毒
40.在超淨工作檯上，將外植體用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗4次，再用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗4次。
41.(4)離體培養
42.消毒後的外植體接種於ms固體培養基上，培養基為ms培養基+30g/l蔗糖+5.5g/l
瓊脂，ph為5.9。在溫度為26℃、光照強度2000lx和光照16h/d條件下進行離體培養，4周後獲得健壯的梨種質資源離體組培苗。
43.實施例3
44.一種高效無毒梨種質資源離體培養的方法，包括以下步驟：
45.(1)外植體誘導
46.冬季休眠後，自湖北省農業科學院果樹茶葉研究所國家砂梨種質資源圃(武漢)採集砂梨、白梨、豆梨、杜梨、西洋梨等不同種的梨種質資源一年生健壯無病蟲害的枝條。枝條放置於含有1/10ms培養液的燒杯中，每5天換新鮮的培養液，在每天光照12小時、光照強度為2100lx、溫度為27℃條件下進行培養。
47.(2)外植體採集
48.枝條培養5周後，待一年生枝條上抽生新鮮嫩稍時，採集培養的一年生枝條上抽出10cm的嫩稍為外植體，要求嫩稍的展開葉片5片、可見節間4個，去除嫩稍上展開的嫩葉所獲得的嫩莖作為外植體使用。
49.(3)外植體消毒
50.在超淨工作檯上，將外植體用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗5次，再用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗5次。
51.(4)離體培養
52.消毒後的外植體接種於ms固體培養基上，培養基為ms培養基+30g/l蔗糖+5.5g/l瓊脂，ph為6.0。在溫度為27℃、光照強度2000lx和光照16h/d條件下進行離體培養，4周後獲得健壯的梨種質資源離體組培苗。
53.對比例1
54.與實施例1的區別在於：用春季田間抽生的嫩枝替換實施例1中的步驟(2)的外植體採集(步驟(1)外植體誘導相應的省略)，其他步驟均相同。
55.對比例2
56.與實施例1的區別在於：(2)用春季田間抽生的嫩枝替換實施例1中的外植體(步驟(1)外植體誘導相應的省略)，(3)外植體消毒在超淨工作檯上，將外植體用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗3次，再用0.1％ hgcl2消毒8～10min，最後用無菌水衝洗3次。其餘步驟均相同。
57.對比例3
58.與實施例1的區別在於：(2)用春季田間抽生的嫩枝替換實施例1中的外植體(步驟(1)外植體誘導相應的省略)，(3)外植體消毒在超淨工作檯上，將外植體用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗3次，5％次氯酸鈉浸泡8min，無菌水衝洗3次。其餘步驟均相同。
59.對比例4
60.與實施例1的區別在於：(2)用春季田間抽生的嫩枝替換實施例1中的外植體(步驟(1)外植體誘導相應的省略)，(3)外植體消毒在超淨工作檯上，將外植體5％次氯酸鈉浸泡8min，無菌水衝洗3次，再用0.1％ hgcl2消毒10min，無菌水衝洗3次。其餘步驟均相同。
61.對比例5
62.與實施例1的區別在於：(3)外植體消毒在超淨工作檯上，將外植體用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗3次，再用0.1％ hgcl2消毒8～10min，最後用無菌水衝洗3次。其餘步驟
均相同。
63.對比例6
64.與實施例1的區別在於：(3)外植體消毒在超淨工作檯上，將外植體用75％乙醇浸泡30s，無菌水衝洗3次，再用5％次氯酸鈉浸泡8min，無菌水衝洗3次。其餘步驟均相同。
65.對比例7
66.與實施例1的區別在於：(3)外植體消毒在超淨工作檯上，將外植體5％次氯酸鈉浸泡8min，無菌水衝洗3次，再用0.1％ hgcl2消毒10min，無菌水衝洗3次。其餘步驟均相同。
67.對上述實施例1-3以及對比例1-5的方法培養得到梨種質資源離體組培苗，經培養對外植體離體培養褐化情況、成活率進行統計，結果如表1所示。
68.成活率(％)＝(成活的梨種質資源離體組培苗/外植體總數)
×
100％
69.褐化率(％)＝(褐變外植體數/外植體總數)
×
100％
70.汙染率(％)＝(真菌或細菌汙染的離體組培苗/外植體總數)
×
100％
71.表1不同方法培養梨種質資源離體組培苗相關指標統計結果
[0072][0073][0074]
從上述數據可以看出，外植體的選擇，以及消毒試劑及消毒方式的選擇對梨種質資源離體組培苗的培養效果直接相關。經分析，可能是下述因素導致：常規梨離體培養時，選用的外植體多為春季或秋季田間抽生的嫩枝或剛萌動的莖尖，其通常情況下生長在自然環境或大田的植株容易在外部和內部感染微生物，攜帶病菌較多，致使離體培養易汙染，成活率不高。梨外植體消毒大多使用升汞或次氯酸鈉為主要消毒劑，雖然升汞的殺菌效果極好，但是有劇毒且不易將殘留的藥劑除淨，會給環境造成汙染，消毒後培養死亡率極高；使用次氯酸鈣毒性較小但殺菌效果一般，離體培養易褐變汙染，成活率低。梨外植體消毒時間一般為10-20min，清洗6-9次，消毒時間短則消毒不充分外植體易汙染，時間長則易褐變成活率低。本發明方法休眠的梨枝條培養出的嫩稍為外植體，嫩稍新鮮病原菌少，極大降低汙染源。消毒時只使用75％乙醇消毒兩次，總消毒時間1min，離體培養組培苗成活率最高可達100％。而減少乙醇消毒次數，可能由於少量病原菌的存在，導致成活率降低。總之，本發明
公開的方法簡單易行，操作簡單，快速高效，無毒無殘留，通過本發明可以便捷高效的獲得梨種質資源離體組培苗，為梨種質資源試管苗庫的建立提供技術支撐，為梨遺傳改良和無病毒苗繁育奠定基礎。
[0075]
以上所述的實施例僅是對本發明的優選方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案做出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護範圍內。