一種骨肉瘤分子標記物及其應用
2024-04-14 03:11:05 1
1.本發明屬於生物醫學技術領域，具體地說涉及一種骨肉瘤分子標記物及其應用。
背景技術：
2.骨肉瘤是骨惡性腫瘤中最多見的一種，骨腫瘤從間質細胞系發展而來，腫瘤迅速生長是由於腫瘤經軟骨階段直接或間接形成腫瘤骨樣組織和骨組織，骨腫瘤主要出現在較長的骨骼和少部分軟組織，主要發病人群集中在10-20歲的青少年，存在發病率和早期轉移率高、治癒生存率低的特點，早期轉移率高的主要表現體現在肺部轉移早，肺轉移灶對現有化療藥物不敏感，是骨腫瘤致死率高的一大重要原因。目前，骨肉瘤的診斷手段主要包括x-射線、核磁共振、血管造影、斷層攝影燈，但這些手段往往存在較為嚴重的滯後性，導致患者病情延誤，錯過最佳治療時機。
3.因此，尋找一種可早期診斷骨肉瘤的手段成為當前亟待解決的技術問題，隨著生物醫學的不斷發展，分子診斷和靶向治療為了骨肉瘤的診療提供了新的思路，分子標記物的存在或量變起到協助判斷腫瘤性質的作用，為腫瘤的診斷和治療提供指導，目前，可用於協助診斷骨肉瘤的標記物並不多，有必要尋找更多的標誌物以為骨肉瘤的臨床診斷提供參考。
技術實現要素：
4.為此，本發明所要解決的技術問題在於現有技術中診斷骨肉瘤的手段存在一定滯後性，從而提出一種骨肉瘤診療分子標記物及其應用。
5.為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：本發明提供一種骨肉瘤分子標記物，所述骨肉瘤分子標記物為紡錘體和中心粒相關蛋白1，所述紡錘體和中心粒相關蛋白1的胺基酸序列如seq id no：1所示。
6.作為優選，所述紡錘體和中心粒相關蛋白1在骨肉瘤組織中高表達。
7.本發明還提供一種所述的分子標記物在製備骨肉瘤輔助診斷產品中的應用。
8.作為優選，所述骨肉瘤的細胞係為143b、hos。
9.作為優選，所述輔助診斷產品為試劑盒或試紙。
10.本發明還提供一種所述的分子標記物作為靶標在篩選抗骨肉瘤藥物中的應用。
11.本發明另一方面提供一種抑制所述分子標記物表達的shrna，所述shrna的基因序列如seq id no：2所示。
12.本發明還提供一種所述的shrna在製備治療骨肉瘤的藥物中的應用。
13.作為優選，所述藥物為化合物，所述藥物用於抑制骨肉瘤細胞的增殖或轉移。
14.本發明的上述技術方案相比現有技術具有以下優點：（1）本發明提供的骨肉瘤分子標記物，該骨肉瘤分子標記物為紡錘體和中心粒相關蛋白1，所述紡錘體和中心粒相關蛋白1的胺基酸序列如seq id no1所示。經組織測序發現具有seq id no1胺基酸序列的紡錘體和中心粒相關蛋白1在骨肉瘤組織中的表達量明顯
高於正常骨組織，在敲低該蛋白後，骨肉瘤增殖及侵襲遷移受到明顯抑制且凋亡增加，從而使得該分子標誌物可以作為骨肉瘤的標記物，在骨肉瘤發生早期起到輔助診斷骨肉瘤的作用，使患者可以得到及時治療，防止了骨肉瘤轉移的問題。
15.（2）本發明提供的shrna，其可以抑制紡錘體和中心粒相關蛋白1的表達，進而可以用於治療骨肉瘤的藥物。
附圖說明
16.為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發明的具體實施例並結合附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中圖1（a）是骨肉瘤及正常骨組織中基因表達的情況；圖1（b）是高表達spice1骨肉瘤患者和低表達spice1骨肉瘤患者的總生存期的k-m曲線；圖1（c）是高表達spice1骨肉瘤患者和低表達spice1骨肉瘤患者的非進展生存期的k-m曲線；圖2（a）-（b）是cck-8實驗檢測hos細胞及143b細胞敲低組及對照組增殖情況檢測結果；圖3是平板克隆形成實驗檢測hos細胞及143b細胞敲低組及對照組克隆形成情況的檢測結果；圖4是流式凋亡實驗檢測hos細胞及143b細胞敲低組及對照組細胞情況的檢測結果；圖5是遷移實驗檢測hos細胞及143b細胞敲低組及對照組遷移情況的檢測結果；圖6是侵襲實驗檢測hos細胞及143b細胞敲低組及對照組侵襲情況的檢測結果；圖7是shrna重組表達載體及對照組的病毒敲低q-pcr檢測結果；圖8是shrna重組表達載體及對照組的病毒敲低western blotting檢測結果。
具體實施方式
17.實施例1本實施例提供一種骨肉瘤分子標記物，具體地，該骨肉瘤分子標記物為紡錘體和中心粒相關蛋白1（spindle and centriole-associated protein 1, spice1），spice1是一種定位於有絲分裂中的紡錘形微管和整個細胞周期中的中心粒的蛋白質，且spice1是有絲分裂中中心粒複製、兩極紡錘體形成和染色體聚集所需的調節因子，其胺基酸序列如seq id no：1所示：msfvrvnrcgprvgvrktpkvkkkktsvkqewdntvtdltvhratpedlvrrheihksknralvhwelqekalkrkwrkqkpetlnlekrrlsimkeilsdqyqmqdvleksdhliaaakelfprrrtgfpnvtvapdssqgpivvnqdpitqsifnesviepqalndvdgeeegtvnsqsgeseneneldnslnsqsntntdrflqqlteenfelisklwtdiqqkiatqsqitppgtpssalssgeqraalnatnavkrlqtrlqpeestetldssyvvghvlnsrkqkqllnkvkrkpnlhalskpkknissgsttsadlpnrtnsnldvlkhmihevehemeeyerwtgrevkglqssqgltgftlslvsslcrlvrylkeseiqlrkevetrqqleqvlgdhrelidaltaeilrlreenaatqarlqqymvttdeqlislthaikncpvinnrqeiqasesgatgrrvmdsperpvvnanvsvplmfreevaefpqeelpvklsqvpdppdnmnlakn
fpahifepavlltpprqksnlkfsplqdvlrrtvqtrpaprlpptveiiekeqnweektlpidtdiqnsseenrlftqrwrvshmgedlenktqapfvnlsqplcnshsntqqsrsptfseelpvlgdgqqlrtnesliqrkdimtriadltlqnsaikahmnniieprgeqgdglrelnkqesasdmtstfpvaqsltpgsmeeriaelnrqsmeargkllqlieqqklvglnlsppmspvqlplrawtegakrtievsipgaeapesskcstvspvsgintrrssgatgnscsplnatsgsgrftplnprakiekqneegwfalsthvs。
18.通過組織測序發現：紡錘體和中心粒相關蛋白1（spice1）在骨肉瘤組織中高表達，即spice1在骨肉瘤組織的表達量明顯高於正常骨組織，結合資料庫分析，分析結果顯示，高表達spice1的患者5年生存率更低。通過體外實驗敲低spice1後，骨肉瘤增殖及侵襲遷移受到抑制，凋亡增加。
19.本實施例中，用於進行生物信息學分析所需的資料庫分析具體是指tcga資料庫（the cancer genome atlas，癌症基因組圖譜），以及geo（gene expression omnibus）資料庫，並利用kaplan-meier plotter (https://kmplot.com/)網站對其生存數據進行可視化，進入sarcoma cancer板塊，在histology中輸入所需的病理類型，根據資料庫收錄，將數據可視化輸出，選擇表達水平、總生存期（os）和無病生存期(dfs)作為導出形式，結果如圖1（a）-（c）所示。
20.其中，圖1（a）表示骨肉瘤及正常骨組織中基因表達情況，該測試結果具體為：選定的閾值為|log2(fc)|》1 p.adj《0.05，滿足這一閾值的個數有1126個，其中，高表達(logfc為正)有337個，低表達(logfc為負)有789個。
21.圖1（b）-（c）為k-m曲線，採用統計分析與可視化軟體r（3.6.3版本）進行統計分析，其中r包：survminer包[0.4.9版本] (用於可視化)， survival包[3.2-10版本] (用於生存資料的統計分析)；分子： spice1[ensg00000163611]；分組： 0-50 vs 50-100；預後類型：overall survival；疾病骨肉瘤；數據：target ( https://ocg.cancer.gov/programs/target ) osteosarcoma（骨肉瘤）項目中mrna-seq數據文件中的tpm格式數據； 數據轉化方式： log2轉換；數據過濾：去除對照/正常並保留有臨床信息。
[0022]
圖1（b）中曲線1為低表達spice1骨肉瘤患者的總生存周期曲線，曲線2為高表達spice1骨肉瘤患者的總生存周期曲線；圖1（c）中曲線1為低表達spice1骨肉瘤患者的非進展生存周期曲線，曲線2為高表達spice1骨肉瘤患者的非進展生存周期曲線。
[0023]
可見，高表達spice1骨肉瘤患者較低表達spice1骨肉瘤患者總生存期及非進展生存期更短。即，spice1可作為標記物輔助診斷是否患有骨肉瘤，從而應用於輔助診斷骨肉瘤產品。
[0024]
實施例2細胞功能學實驗：骨肉瘤細胞的培養與轉染。
[0025]
1、細胞培養待培養測試的143b細胞和hos細胞由中國科學院細胞庫獲取。
[0026]
1.1細胞復甦（1）將水浴鍋預熱至37℃，將細胞凍存管從液氮罐中迅速取出，用水浴鍋進行溫水浴，使細胞凍存液迅速回溫、融化。
[0027]
（2）將融化的細胞凍存液放入生物安全櫃，用巴氏管吸出，並置於預先加好2ml完全培養基的15ml離心管內，開啟離心機，在800rpm的轉速下離心三分鐘後去除上清。
[0028]
（3）用3ml完全培養基重懸細胞，並將其轉移入乾淨的培養瓶中，將培養基體積補至5ml，搖勻細胞，放入37℃ 5%co2孵箱，待第二天觀察。
[0029]
1.2細胞換液（1）取出培養瓶，置於顯微鏡下觀察細胞狀態並記錄拍照。
[0030]
（2）將培養瓶用酒精消毒後置於生物安全櫃，用巴氏管吸淨原有培養基，並換一根新的巴氏管，吸取2ml pbs緩衝液、滴加進入培養瓶，輕搖晃培養瓶，利用pbs緩衝液洗滌細胞培養面，這一步驟可重複兩次。
[0031]
（3）向培養瓶中加入含10%胎牛血清（fbs）的α-mem培養基5ml（t25培養瓶) 。
[0032]
（4）將培養瓶放回孵箱，常規培養，可兩日進行一次細胞換液。
[0033]
1.3細胞傳代（1）從培養箱中取出細胞培養瓶，於倒置的顯微鏡下觀察細胞，注意觀察細胞生長匯合程度，當細胞生長至85%以上即可傳代。
[0034]
（2）用巴氏管吸去原培養基，用1ml pbs洗滌細胞，然後吸去洗滌液。
[0035]
（3）向培養瓶中加入1ml 0.25%的胰蛋白酶-edta消化液，輕輕搖動培養瓶，使胰酶浸潤整個細胞培養表面。
[0036]
（4）在消化時可用倒置顯微鏡觀察細胞形態，待細胞收縮呈圓形、周圍出現亮圈時可使用2ml完全培養基終止消化。
[0037]
（5）輕柔吹打帶細胞懸液的培養瓶中的細胞壁表面，使細胞儘量從培養瓶上分散下來，將該細胞懸液轉移到離心管中，在1000rpm轉速下離心5分鐘，棄去上清液。
[0038]
（6）用1ml完全培養基重懸細胞沉澱，取250μl放入一個新的培養瓶中，視為1：4傳代，按此密度傳代的細胞可以生長三天。繼續孵箱常規培養，次日觀察細胞狀態。
[0039]
1.4細胞凍存（1）取對數生長期的細胞，棄去原培養基後，用2ml pbs清洗2遍。
[0040]
（2）加入1ml胰酶，消化2min後，加入完全培養基終止消化。
[0041]
（3）輕柔吹打貼壁細胞，使其脫落，將細胞懸液移至離心管，在800rpm轉速下離心5分鐘，輕柔吸去上清液。
[0042]
（4）加入1ml預先配好的預冷細胞凍存液，輕輕吹打重懸細胞，移入凍存管，標記好相關信息後，在4℃下放置30分鐘，-20℃ 下放置2小時，-80℃下的冰箱內過夜，次日放入液氮灌長期保存。
[0043]
1.5細胞計數（1）將血細胞計數板及蓋玻片衝洗乾淨，酒精擦洗後晾乾。
[0044]
（2）將細胞消化、離心並採用1ml完全培養基重懸。
[0045]
（3）按一定倍數將細胞懸液稀釋，a549細胞長滿培養瓶時建議稀釋3倍。
[0046]
（4）吸取約10ul細胞懸液，加到血細胞計數板的加樣區域。
[0047]
（5）在4倍物鏡下計數血球計數板四個4x4大方格內細胞的數量。
[0048]
（6）按如下公式計算出細胞懸液的濃度，再根據原細胞懸液的體積及稀釋倍數估算總細胞數。
[0049]
細胞濃度=（計數板四角大方格內細胞數/4）
×
稀釋倍數
×
104個/ml。
[0050]
2、細胞轉染（慢病毒轉染）
2.1 shrna重組表達載體的構建與測序（1）構建spice1 (nm_144718）的幹擾質粒：首先構建陰性對照shrna片段：shctrl (scrambled shrna)，即不靶向任何基因，僅作為陰性對照組，scrambled shrna（sh-con）的基因序列如seq id no：3所示：5-ttctccgaacgtgtcacgt-3。構建shrna重組表達載體（sh-spice1），其基因序列如seq id no：2所示：5
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gactgatctaaccgttcat
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3，該shrna可抑制分子標記物spice1的表達。具體構建過程為：將設計好的序列導入慢病毒載體，經過克隆及工具細胞轉染等步驟，收穫病毒顆粒，將病毒顆粒純化、濃縮及滴度檢測後保存備用（上述慢病毒載體構建過程由上海吉凱公司完成）。
[0051]
2.2細胞慢病毒轉染（1）慢病毒轉染前24小時，將貼壁細胞以2
×
104/孔鋪到六孔板中。搖勻六孔板，以備次日轉染。
[0052]
（2）用含有1x 促感養液p的1ml新鮮培養基替換原培養基，加入適量病毒懸液(moi值=病毒顆粒數/細胞數=40)，37℃繼續培養。
[0053]
（3）轉染後16小時換去含病毒培養基，更換為新鮮常規培養基繼續培養。
[0054]
（4）繼續培養2-3天，在螢光顯微鏡下通過觀察gfp陽性率判斷細胞轉染效率。
[0055]
3、cck-8實驗檢測細胞增殖情況3.1 cck-8法實驗原理cck-8試劑（cell countingkit 8細胞技術試劑）中包含wst-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑單鈉鹽），它是一種易於保存的水溶性四唑鹽。在電子載體1-甲氧基-pms存在的情況下，wst-8可在細胞內被脫氧酶還原成水溶性的具有450nm處吸光度的黃色產物，產生的產物吸光度與活細胞的數量成正比。該試劑盒靈敏度高，對細胞的細胞毒性低，現在被廣泛使用。
[0056]
3.2加樣及檢測順序取對數生長的骨肉瘤細胞系hos、143b，消化重懸計數後鋪入96孔板，每個不同的細胞種類鋪設day0、day1、day2、day3四個組別，每組五個復孔，每孔1500個細胞，100μl 10%fbs培養基，在鋪入的6小時後往day0的五個復孔內各加入10μl cck-8試劑，37℃孵育3小時後用酶標儀檢測450nm處吸光度，此後在鋪板後第一天到第三天同一時間點往對應的孔內加入10μl cck-8試劑，同樣37℃孵育3小時後用酶標儀檢測450nm處吸光度，將數據統計繪折線圖，實驗重複三次以上。（結果如圖2（a）-（b）所示），圖中橫坐標為時間（days），縱坐標為溶液在450nm波長處的吸光值（od450），通過每一天加入cck8溶液檢測，在450nm波長檢測od值，從而得出細胞數量的數值，可見，敲低組細胞數量增長明顯低於對照組。
[0057]
4、平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力取對數生長期的骨肉瘤細胞系hos 、143b，用胰蛋白酶消化，重懸並計數，將不同處理的細胞按每孔1000個鋪入六孔板，用2ml完全培養基培養，每天觀察細胞集落生長情況，當出現細胞數大於50個的克隆集落形成時，採集樣品。吸出六孔板中的培養基，用pbs洗三次，先用4%多聚甲醛固定約30分鐘，用pbs洗三次，然後用1%結晶紫染色20分鐘，用pbs洗去多餘的染料，用倒置顯微鏡拍照並採集信息，用image j分析軟體統計克隆集落的數量，計算出細胞克隆形成率=克隆集落數/鋪入板內的細胞數。實驗重複三次（結果如圖3所示），
通過將hos和143b細胞敲低spice1基因後檢測細胞克隆形成能力，結果發現sh-spice1與對照組對比，克隆集落明顯減少。
[0058]
5、流式細胞術檢測細胞凋亡情況取對數生長期的骨肉瘤細胞系143b、hos，pbs清洗後，使用無edta胰酶消化，計數，取4x104個細胞，使用預冷的合緩衝液（binding buffer）將細胞重懸為100μl，分別加入annexin
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5μl，避光孵育5min後加入pi染液（碘化丙啶(propidium iodide,pi)）10μl，即刻使用流式細胞儀檢測不同螢光通道（apc-percp）下的細胞聚類情況，（結果如圖4所示），測試結果表明，sh-spice1與對照組對比，凋亡細胞明顯增多。
[0059]
6、侵襲遷移實驗檢測細胞侵襲、遷移能力應用 transwe小室進行細胞侵襲、遷移實驗。包被基底膜、水化基底膜，製備transwell小室。將處於對數生期的細胞用無血清培養基重懸，調整細胞濃度為1
×
105個/ml，取 200μl 細胞懸液接種小室，然後將小室放入加有 600μl/孔含 15%胎牛血清的 α-mem 培養基的 24 孔板中，常規培養 24h。取出小室，吸棄上室液體，用 pbs 漂洗 2 次，95%酒精固定 10min，用棉籤擦淨小室膜上側未遷移的細胞，結晶紫染色 20min，pbs 洗滌 2 次。倒置顯微鏡下計數遷移至小室膜背側面的細胞，隨機計數 10個視野，取平均數，重複3次實驗，（結果如圖5-6所示），測試結果表明，將143b和hos細胞敲低spice1基因後檢測細胞侵襲、遷移能力，結果發現sh-spice1與對照組對比，侵襲、遷移細胞明顯減少。
[0060]
7、病毒敲低效果測試陰性對照組shrna片段（sh-con）以及shrna重組表達載體（sh-spice1）對病毒的敲低效果，測試結果如圖7所示，通過q-pcr實驗檢測143b和hos細胞感染spice1病毒後的效率，結果發現sh-spice1與對照組對比，mrna水平明顯下降。測試結果表明，sh-spice1對骨肉瘤病毒有明顯的敲低效果，可以應用於製備治療骨肉瘤的藥物，具體地，用於治療骨肉瘤的藥物為化合物，其可通過抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移起到治療效果。另外，如圖8所示，實驗檢測143b和hos細胞感染spice1病毒後的效率，結果發現sh-spice1與對照組對比，蛋白水平明顯下降。
[0061]
顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而並非對實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明創造的保護範圍之中。