基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針及檢測方法
2024-04-14 17:43:05
1.本發明涉及一種水中汞離子的檢測方法，尤其是一種基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針及檢測方法，實現hg
2+
定量檢測。
背景技術：
2.重金屬汙染是當前重要的環境問題，汞是一種毒性較強的重金屬離子，其嚴重損害人體中樞神經系統，導致許多嚴重的健康問題，如腦損傷、腎衰竭以及各種認知和運動障礙。天然水體中最常見的有毒汞為水溶性二價汞離子(hg
2+
)，許多國家及組織都制定了飲用水中 hg
2+
的最高限量標準。現有的hg
2+
檢測技術，如原子吸收法、色譜法、光譜法、電耦合等離子質譜法（icp-ms）和電化學方法等，被廣泛應用於環境中hg
2+
檢測中，但是這些檢測方法對操作人員的專業性要求較高，很大程度上依賴於實驗室大型設備，難以實現實時測量，無法對突發汙染事件做出快速響應。因此，發展簡單、快速、高靈敏度、低成本的重金屬檢測技術對保護環境和人類健康具有重要的理論和實用價值。
3.近年來，基於有機小分子、dna酶、寡核苷酸、聚合物及納米粒子的探針技術被應用於hg
2+
檢測。在眾多研究中，基於t-hg
2+-t配位結構的hg
2+
檢測技術以其快捷、高靈敏、低成本、高穩定性等顯著優點，為hg
2+
檢測技術提供了新的思路。為進一步提高hg
2+
檢測的靈敏度，科研工作者們利用hg
2+
可與富t功能核酸序列相互作用這一特性，結合成熟的螢光檢測技術，發展了多種hg
2+
檢測方法。然而，螢光檢測方法的優良特性也取決於新的螢光探針的選擇，其實際應用中會面臨探針材料的選擇、體系易受環境因素幹擾、穩定性較差、靈敏度低等問題。如公開號為cn 107436297 a的文獻公布了「基於髮夾式dna探針的水中汞離子檢測方法
」ꢀ
，該文獻設計了一條兩端雙標螢光染料的富t序列髮夾式dna探針，加入hg
2+
之後，hg
2+
會與dna探針上的t鹼基生成t-hg
2+-t的穩定結構，使探針結構發生變化，通過改變螢光能量共振轉移的距離來實現hg
2+
定量檢測，但存在以下不足：（1）該法設計的發卡式dna探針其雙鏈部分本身就有很好的穩定性，檢測過程中需要hg
2+
競爭結合探針上的t從而改變原有探針的發卡結構，通過形成新的結構實現hg
2+
檢測，從專業角度出發，該步驟需要複雜的實驗條件，難以達到理想的實驗效果，影響因素較多，根據其公開的內容不難發現其檢測限及線性範圍較低。
4.同時，以sybr green
ꢀⅰꢀ
為代表的核酸染料作為螢光分子探針因具有價格低廉、光穩定性較好、安全等優良的螢光性能，近年來被廣泛應用於hg
2+
、pb
2+
、cu
2+
、ag
+
等離子的檢測，但存在sybr green
ꢀⅰꢀ
斯託克斯位移小，背景幹擾高，影響檢測靈敏度。
5.因此，針對上述問題，開發一種基於核酸染料的汞離子高靈敏螢光檢測探針，是本領域技術人員亟需解決的一項技術問題，具有重要的現實意義。
技術實現要素：
6.為了解決現有技術存在的不足，本發明提供了一種基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針及檢測方法，實現水溶液中的hg
2+
高靈敏度和高選擇性地檢測，有望用於商
業化的推廣應用。
7.為了實現上述目的，本發明採取以下技術方案。
8.一種基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針，包括hg
2+
特異識別探針tro（thymidine rich oligonucleotide）和螢光指示探針gelred；所述hg
2+
特異識別探針tro由25個鹼基組成，其中引入了五個t-t錯配鹼基對和三個自互補鹼基對，其核酸序列為：5
』‑
tttctttccgggggggcgtttgtta
ꢀ‑3』
；當存在hg
2+
時，t-hg
2+-t錯配能誘導tro摺疊形成具有穩定發卡結構的tro-hg
2+
複合物；所述螢光指示探針為高靈敏核酸螢光染料gelred，其在游離狀態下發出微弱的螢光，一旦與tro-hg
2+
複合物結合後，gelred螢光強度顯著增強，螢光信號強度與tro-hg
2+
複合物的數量相關；通過建立螢光強度與hg
2+
濃度之間對應的線性關係，實現對汞離子的定量檢測。
9.一種使用基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針的檢測方法，包括以下步驟：1）將tro與hg
2+
在tris緩衝液中反應，形成tro-hg
2+
複合物；所述tro濃度為0.01~5μmol/l；hg
2+
濃度為0.1nmol/l~5μmol/l；tris緩衝液濃度為0.01~0.1mol/l，其中含20~100mmol/l nano3，ph值為6.4~8.6；tro與hg
2+
的反應時間為3~15min；2）將gelred加入上述tro-hg
2+
複合物中，室溫下避光孵育，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定，並獲得hg
2+
濃度-螢光強度值標準曲線；所述gelred為0.01~2
×
gelred溶液；孵育時間時間為2～15分鐘。
10.進一步的：步驟1）中：所述tro濃度為0.05~2μmol/l；hg
2+
濃度為5nmol/l~2μmol/l；tris緩衝液濃度為0.02~0.05mol/l，其中含30~50mmol/l nano3，ph值為7.0~7.6；tro與hg
2+
的反應時間為為5~8min；步驟2）中：所述gelred為0.05~1
×
gelred溶液，孵育時間為5～10min。
11.hg
2+
濃度與螢光強度變化f/f0呈線性關係，且線性方程為y=-0.0004468x+0.8815，r2=0.99103。對水體中hg
2+
檢測線性範圍為10nmol/l～800nmol/l，檢出限為0.14 nmol/l。
12.與現有技術相比，本發明具有以下優勢：1、本發明製備的gelred/tro複合螢光探針，生物相容性良好，探針製備方法簡單，安全無毒，成本低。基於gelred/tro探針的於hg
2+
檢測該方法簡單易行，不需要複雜的處理，同時該方法檢測耗時短，檢測成本低，且能為後續實時在線現場檢測提供可能性。
13.2、本發明提供的hg
2+
特異識別探針（tro）包括了五個t-t錯配鹼基對和三個自互補鹼基對，探針分子的特異序列能夠與待測樣本中的hg
2+
配對形成兩端平齊的雙鏈序列，該兩端平齊的雙鏈序列能更好的促進 t-hg
2+-t結構的穩定性。實現了hg
2+
快速、高靈敏度檢測。
14.3、螢光探針檢測方法在hg
2+
高靈敏度和特異性檢測中顯示出了良好的應用前景。然而，每一種方法表現出一些限制其實際使用的特性，如水溶性差、受其他金屬離子幹擾大、螢光強度弱、短髮射波長、靈敏度差等。本發明選擇的gelred是一種核酸螢光染料，在游離狀態下其發出微弱的螢光，一旦與tro-hg
2+
複合物結合後，gelgreen螢光強度顯著增強，螢光信號強度與tro-hg
2+
複合物的數量相關。並且，gelred的吸收波長為290，發射波長為
620 nm，stokes shift（斯託克斯位移）高達330nm，光化學穩定性好，以gelred作為螢光檢測探針具有背景幹擾低、樣品穿透性強、對生物樣品的光損傷小、檢測靈敏度高等優點，選擇以gelred作為新的螢光探針，為hg
2+
的快速、高靈敏和高選擇性檢測提供新的思路。
15.4、gelred是一種核酸螢光染料，為eb的替代產品，主要用於凝膠中dna、rna等核酸的染色，gelred在生物學研究中已成功應用於dna的定性和定量技術。本發明將其應用於hg
2+
檢測，取得了較好的檢測效果，拓寬了核酸螢光染料gelred的應用領域。
16.本發明對水體中hg
2+
檢測線性範圍為10nmol/l～800nmol/l，檢出限為0.14 nmol/l。
17.本發明對標準濃度hg
2+
在自來水樣和黃河水樣中的平均回收率分別為98.08%和95.1%，說明該方法對檢測複雜水樣中的hg
2+
具有很大的潛力。
附圖說明
18.圖1為本發明gelred/tro螢光探針檢測hg
2+
濃度的原理圖；圖2為本發明gelred/tro螢光探針檢測hg
2+
濃度的螢光光譜圖；圖3為本發明gelred/tro螢光探針檢測hg
2+
性能對比光譜圖；圖4為gelred對hg
2+
濃度變化的螢光響應光譜圖；圖5為本發明gelred/tro螢光探針對hg
2+
檢測的靈敏度螢光光譜圖；圖6為本發明gelred/tro探針檢測hg
2+
的線性圖；圖7為本發明gelred/tro探針對hg
2+
檢測的特異性測試結果圖。
具體實施方式
19.本發明將通過以下實施例作進一步說明。
20.一種基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針，包括hg
2+
特異識別探針tro和螢光指示探針gelred；所述hg
2+
特異識別探針tro由25個鹼基組成，其中引入了五個t-t錯配鹼基對和三個自互補鹼基對，其核酸序列為：5
』‑
tttctttccgggggggcgtttgtta
ꢀ‑3』
；當存在hg
2+
時，t-hg
2+-t結構的形成能誘導hg
2+
特異識別探針摺疊成具有發卡結構的tro-hg
2+
複合物；所述螢光指示探針為高靈敏核酸螢光染料gelred，其在游離狀態下發出微弱的螢光，一旦與tro-hg
2+
複合物結合後，gelred螢光強度顯著增強，螢光信號強度與tro-hg
2+
複合物的數量相關；通過建立螢光強度變化與hg
2+
濃度之間對應的線性關係，實現對汞離子的定量檢測。
21.上述技術方案的基本原理為：hg
2+
特異識別探針tro由25個鹼基組成，其中引入了五個t-t錯配鹼基對和三個自互補鹼基對。在沒有hg
2+
時，tro通過靜電作用與gelred作用發出較弱螢光。然而，存在hg
2+
時，t-hg
2+-t結構的形成能誘導tro摺疊成發卡結構，形成穩定的tro-hg
2+
複合物，gelred與tro-hg
2+
複合物中的雙鏈相互作用，發出強螢光，其螢光增強量與hg
2+
的濃度呈正相關，通過加入不同濃度hg
2+
所引起的螢光強度的改變，從而實現對hg
2+
的定量檢測。
22.下面是通過利用上述gelred/tro螢光探針進行的具體檢測方法，以進一步說明本發明，本發明的技術方案包括但不限於以下實施例。
23.實施例1，一種使用基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針的檢測方法，包括以下步驟：1）在0.01mol/l tris-hcl（ph8.6，含20mmol/l nano3）緩衝液體系中，分別加入終濃度為5μmol/l的tro及終濃度為5μmol/l 的hg
2+
，輕輕混勻，室溫反應3min，形成tro-hg
2+
複合物。2）將2
×
gelred溶液加入上述tro-hg
2+
複合物中，混勻，室溫下孵育2min，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定。
24.實施例2，一種使用基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針的檢測方法，包括以下步驟：1）在0.1mol/l tris-hcl（ph6.4，含100mmol/l nano3）緩衝液體系中，分別加入終濃度為0.01μmol/l的tro及終濃度為0.1nmol/l 的hg
2+
，輕輕混勻，室溫反應15min，形成tro-hg
2+
複合物。2）將0.01
×
gelred溶液加入上述tro-hg
2+
複合物中，混勻，室溫下孵育15min，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定。
25.實施例3、一種使用基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針的檢測方法，包括以下步驟：1）在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含40mmol/l nano3）緩衝液體系中，分別加入終濃度為0.1μmol/l的tro及終濃度為5nmol/l 的hg
2+
，輕輕混勻，室溫反應5min，形成tro-hg
2+
複合物。
26.2）將0.05
×
gelred加入上述tro-hg
2+
複合物中，混勻，室溫下孵育5min，使用螢光分光光度計以290nm 的激發波長進行螢光光譜測定。
27.實施例4、一種使用基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針的檢測方法，包括以下步驟：1）在0.03mol/l tris-hcl（ph7.0，含30mmol/l nano3）緩衝液體系中，分別加入終濃度為2μmol/l的tro及終濃度為2μmol/l的hg
2+
，輕輕混勻，室溫反應6min，形成tro-hg
2+
複合物。
28.2）將1
×
gelred加入上述tro-hg
2+
複合物中，混勻，室溫下孵育8min，使用螢光分光光度計以290nm 的激發波長進行螢光光譜測定。
29.實施例5、一種使用基於功能核酸的檢測水體中汞離子的螢光探針的檢測方法，包括以下步驟：1）在0.02mol/l tris-hcl（ph7.6，含50mmol/l nano3）緩衝液體系中，分別加入終濃度為0.05μmol/l的tro及終濃度為800nmol/l 的hg
2+
，輕輕混勻，室溫反應8min，形成tro-hg
2+
複合物。
30.2）將0.5
×
gelred加入上述tro-hg
2+
複合物中，混勻，室溫下孵育10min，使用螢光分光光度計以290nm 的激發波長進行螢光光譜測定。
31.gelred/tro螢光探針對800nmol/l hg
2+
的螢光光譜測定結果見圖2，由圖可見，在622nm處有較強的螢光信號。
32.下面通過對比實驗及具體實驗進一步證明本發明。
33.一、對比實驗如下：以證明本發明採用的hg
2+
特異識別探針tro具有優異性能
1、gelred/tro螢光探針檢測hg
2+
性能。
34.gelred/tro探針組：在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含50mmol/l nano3）緩衝液體系中，分別加入終濃度為0.1μmol/l的tro（5
』‑
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ꢀ‑3』
）及終濃度為200nmol/l 的hg
2+
，輕輕混勻，室溫反應5min，形成tro-hg
2+
複合物。然後在上述tro-hg
2+
複合物中加入0.05
×
gelred溶液，混勻，室溫下孵育5min，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定。
35.gelred/t
25
螢光探針組：在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含50mmol/l nano3）緩衝液體系中，分別加入終濃度為0.1μmol/l的t
25
（tro對比鏈）（5
』‑
ttttttttttttttttttttttttt
ꢀ‑3』
）及終濃度為200nmol/l的hg
2+
，輕輕混勻，室溫反應5min，形成t
25-hg
2+
複合物。然後在上述t
25-hg
2+
複合物中加入0.05
×
gelred溶液，混勻，室溫下孵育5min，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定。
36.gelred螢光探針組（無hg
2+
識別序列）：在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含50mmol/l nano3）緩衝液體系中，加入終濃度為200nmol/l的hg
2+
，然後加入0.05
×
gelred溶液，輕輕混勻，室溫下孵育5min，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定。
37.圖3顯示了不同探針體系中加入200nmol/lhg
2+
後的螢光信號變化情況，由圖可見，gelred探針測試體系只有非常弱的螢光信號（曲線a），gelred/t
25
探針測試體系螢光強度較gelred探針測試體系略有增強（曲線b），但gelred/tro測試體系螢光信號顯著增強（曲線c），其螢光強度約為gelred/t
25
體系的2.5倍。表明tro與t
25
序列中的t都能與hg
2+
反應形成t-hg
2+-t結構，但本發明採用的tro序列由於其中引入了五個t-t錯配鹼基對和三個自互補鹼基對，其與hg
2+
反應後能誘導tro摺疊成穩定、有序的發卡結構，使gelred能與發卡結構中的雙鏈相互作用發出強螢光，其效果優於普通的富t序列。
38.2、gelred對hg
2+
濃度變化的螢光響應。
39.在0.02mol/l tris-hcl（ph7.6，含30 mmol/lnano3）緩衝液體系中，加入1
×
gelred溶液，然後加入終濃度分別為0、200nmol/l和400nmol/l 的hg
2+
，輕輕混勻，室溫反應10min，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定。
40.螢光檢測結果見圖4，在gelred溶液中加入不同濃度hg
2+
後，螢光強度幾乎沒有發生變化，證明gelred本身對hg
2+
的濃度變化是沒有響應的。
41.二、實驗例（gelred/tro複合探針的性能測試）實驗例1 ，gelred/tro複合探針對hg
2+
檢測的靈敏度。
42.在0.05mol/l tris-hcl（ph7.2，含40mmol/l nano3）緩衝液體系中，加入終濃度為0.1μmol/l的tro，然後加入不同濃度的hg
2+
（終濃度分別為0、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、200nmol/l、400nmol/l、600nmol/l、800nmol/l、1000nmol/l），輕輕混勻，室溫反應5min，形成tro-hg
2+
複合物。最後在上述tro-hg
2+
複合物中加入0.05
×
gelred溶液，混勻，室溫下孵育5min。用螢光分光光度計檢測不同金屬離子的螢光強度（f），並與對照f0（hg
2+
=0nmol/l）進行比較。
43.不同濃度hg
2+
對gelred/tro探針的螢光強度影響見圖5，隨著hg
2+
的濃度的增加，gelred的螢光信號增強。在10nmol/l～800nmol/l 範圍內，hg
2+
濃度與螢光強度變化(f/f0)呈線性關係（圖6），其線性方程為y=-0.0004468x+0.8815，r2=0.99103，有較寬的檢測範圍。根據3σ規則，本方法對hg
2+
的檢測限為0.14 nmol/l 。
實驗例2，gelred/tro探針對hg
2+
檢測的特異性。
44.選擇水體中常見的7種陽離子（fe
2+
、co
2+
、cu
2+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、ag
+
）和3種陰離子（cl-、so
42-、no
3-）作為幹擾因素，進行響應實驗和共存幹擾實驗，考察gelred/tro複合探針對hg
2+
檢測的特異性。
45.在0.02mol/l tris-hcl（ph7.6，含50mmol/l nano3）緩衝液體系中，加入終濃度為0.05μmol/l的tro，然後各加入終濃度為200nmol/l的不同離子（hg
2+
、fe
2+
、co
2+
、cu
2+
、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、ag
+
、cl-、so
42-、no
3-）及十種幹擾離子與hg
2+
的共存混合液（mix），輕輕混勻，室溫反應8min。最後加入0.5
×
gelred溶液，混勻，室溫下孵育10min，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定。用螢光分光光度計檢測不同離子的螢光強度（f），並與對照f0（hg
2+
=200nmol/l）進行比較，通過f/f0比值考察gelred/tro探針對hg
2+
檢測的特異性。
46.結果如圖7所示，與對照f0相比，其他幹擾離子的螢光響應（f/f0）都低於12%，陰離子對體系螢光檢測幹擾低於陽離子。混合離子共存檢測體系螢光響應（f/f0）大於95%，表明該探針檢測hg
2+
具有較好的選擇性和抗幹擾能力，適用於大多數環境監測應用場景。
47.實驗例3，gelred/tro探針對實際水樣中hg
2+
加標回收檢測。
48.實際水樣採用自來水以及黃河水，在樣品檢測前，對水樣靜置1h進行簡單前處理，去除水樣中微小固體顆粒。然後加入已知濃度的hg
2+
標準樣（終濃度為600nmol/l、700nmol/l、800nmol/l）及終濃度為2μmol/l的tro，室溫下避光反應6min。最後加入1
×
gelred溶液，混勻，室溫下孵育8min，使用螢光分光光度計以290nm的激發波長進行螢光光譜測定。結果見表1，hg
2+
在自來水樣和黃河水樣中的平均回收率分別為98.08%和95.1%，證明了該方法的可靠性，其在現場檢測中具有較大的潛力。
49.表1 自來水中不同濃度hg
2+
的檢測結果三、本發明和對比文件cn 107436297 a的效果比較對比文件cn 107436297 a記載其檢測hg
2+
的檢測限為1.5nm，且從圖3可看出該方法對hg
2+
的線性範圍約為2.5μmol/l
‑ꢀ
5μmol/l，本發明對水體中hg
2+
檢測線性範圍為10nmol/l～800nmol/l，檢出限為0.14 nmol/l。顯然對比文件的檢測限及線性範圍均低於本發明所獲得的結果且不在一個數量級上。該差異的存在源於：本發明設計的hg
2+
特異識別探針tro由25個鹼基組成，其中引入了五個t-t錯配鹼基對和三個自互補鹼基對，在無hg
2+
時，tro呈無規則捲曲狀態；存在hg
2+
時，t-hg
2+-t結構的形成能快速誘導tro摺疊成具有發卡結構的tro-hg
2+
複合物，同時三個自互補鹼基對能進一步增加tro-hg
2+
複合物的穩定性，使gelred能與tro-hg
2+
複合物中的雙鏈相互作用發出強螢光，tro、hg
2+
、gelred相互間的識別與結合非常容易實現，且不需要複雜的實驗條件、操作簡單易行、檢測靈敏度高，整個檢測過程約10-15min，因此，在檢測靈敏度、檢測限、抗幹擾、檢測成本、穩定性等方面本發明
都具有明顯優勢。