一種擴增造血幹細胞的方法

2023-10-04 17:45:19

專利名稱：一種擴增造血幹細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種三維條件下擴增造血幹細胞的方法。具體地說是製備 微囊化單個核細胞，利用微膠囊及微囊化材料自身的理化性質促進基質細 胞生成，實現造血幹細胞與同源基質細胞三維共培養，基質細胞同時分泌 細胞外基質和細胞因子，在微膠囊內共同構成類造血微環境，在僅用少量 細胞因子的情況下，抑制/延緩造血幹細胞走向分化，並實現造血幹細胞的 有效擴增。
背景技術：
造血幹細胞在臨床上有廣泛的應用前景，它在血液系統疾病、實體瘤、 免疫缺陷病、遺傳性疾病、自身免疫性疾病等的支持治療、免疫治療、替 代治療及基因治療中具有廣泛的用途。但造血幹細胞移植在實際應用中存 在數量限制的問題，需要有效擴增。目前，模擬體內造血微環境已經被認 為是體外擴增造血幹細胞的最佳方法之一 。
造血微環境是由基質細胞、基質細胞分泌的細胞外基質和細胞因子構 成的三維空間。體外模擬造血微環境的方法包括(1)在三維支架上培養 造血細胞；(2)與基質細胞共培養；(3)添加造血細胞因子。但上述途徑分 別存在如下問題(1)培養規模難以放大，不能滿足臨床使用要求；(2) 異源性基質細胞及建系的基質細胞與造血幹細胞共培養，可能存在免疫排
斥問題，而同源基質細胞的製備過程繁瑣，需要較長時間；(3)單用細胞
因子不能維持體外長期造血，而且細胞因子用量大，費用昂貴，大大限制 了造血幹細胞的大規模擴增。因此，需要發展一種三維培養體系，不但能 免除同源基質細胞的製備過程，而且僅需少量細胞因子就能有效擴增造血 幹細胞。
基於造血幹細胞的不對稱分裂原則，起始培養細胞中儘可能多的保留 造血幹細胞是體外擴增的關鍵。而造血幹細胞從單個核細胞中分離、純化 時不可避免的會發生部分丟失，且高度純化的造血幹細胞完全丟失其他輔 助細胞，不僅導致增殖能力的降低，移植物抗白血病及移植物抗宿主效應 也會發生變化。因此，為擴增出更多、更原始的造血幹細胞，以單個核細 胞為起始培養細胞是最佳的選擇。
本專利提出以海藻酸鈉-殼聚糖(alginate-chitosan,AC)為複合材料、 根據單個核細胞來源及初始單個核細胞中CD34+細胞數量確定製備工藝及 材料選擇，製備微囊化單個核細胞，並利用微膠囊膜對生物分子的選擇性 通透作用、海藻酸鈉的理化性質和微膠囊內的滲透壓脅迫等微環境，促進
基質細胞生成，實現造血幹細胞與同源基質細胞的三維共培養。由於微膠 囊膜的截留特性，基質細胞分泌的細胞外基質將聚集在微膠囊內，細胞因 子在微膠囊內也會實現暫態高濃度，這樣就可以少用或不用細胞因子實現 造血幹細胞的有效擴增。

發明內容
本發明的目的在於提供一種操作簡單、成本低廉、可規模化的造血幹 細胞體外擴增方法，其將在血液生物學和臨床應用研究中發揮重要作用。 該方法可以利用微膠囊的特定理化性質模擬造血微環境，實現造血幹細胞 與多種細胞(如基質細胞、轉基因細胞)三維共培養，有效擴增造血幹 細胞。
為實現上述目的，本發明採用技術方案為
一種擴增造血幹細胞的方法，以海藻酸鈉、殼聚糖為複合材料，採用 擠出/外部凝膠化法製備AC微囊化單個核細胞；將微囊化單個核細胞加入
到擴增培養基中，置37。C、空氣中含體積5XC02的培養箱中培養，每2-3 天定期更換培養基，即為造血幹細胞擴增體系。
具體為
1) 單個核細胞的分離採用密度梯度離心法，用Ficoll淋巴細胞分離 液密度梯度離心分離臍血或骨髓中的單個核細胞；其中含有總細胞個數0.7 _3.1%的CD34+細胞；
2) 微囊化單個核細胞的製備
A. 將(3-L-古洛糖醛酸重量含量30-40%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為 60-70%的海藻酸鈉配製成1.0-3.0G/。w/v海藻酸鈉溶液I ;
將卩-L-古洛糖醛酸重量含量60-70% 、a-D-甘露糖醛酸重量含量為30-40 %的海藻酸鈉配製成0.8-2.5%w/v海藻酸鈉溶液II;
將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按1: 5 — 5: l體積比例混合，得
海藻酸鈉溶液m;
B. 將單個核細胞重懸於海藻酸鈉溶液III中，每ml溶液中含有細胞
8xl。5畫2xl07個；
C. 採用擠出/外部凝膠化法將海藻酸鈉細胞懸液加入pH=7.0-7.4質量 濃度0.8-1.6%氯化鈣的水溶液中，獲得直徑大小在300-500|iim之間的海藻 酸鈣膠珠；
將分子量40—230KDa、脫乙醯度80-94%、質量濃度0.3-0.8%的殼聚 糖按體積比8-14: l加入海藻酸鈣膠珠中，成膜時間為5—20min，膜厚在5 一50^im範圍內；收集非液化的微膠囊；
將10-100iaM檸檬酸鈉溶液按體積比8-14: 1加入非液化的微膠囊中，
靜置3-8分鐘；收集液化的微膠囊；
3) 將微膠囊按體積比1: 8-15置於擴增培養基中，單個核細胞能夠在
微膠囊內存活，並發生顯著增殖；
擴增培養基為於IMDM培養液中添加2-5ng/ml白介素-3， 15-25ng/ml 幹細胞因子，5-10ng/ml人FLT-3配體，1.2-2.5ng/ml血小板生成因子，終體 積濃度10%胎牛血清，pH=7.0-7.4。
當所述擠出/外部凝膠化法為靜電液滴發生法時，通過控制微膠囊製備 儀的操作條件來調整微膠囊粒徑，其操作條件為電壓40 — 85v、頻率IOO 一160Hz、泵速5-16ml/小時、針頭孔徑4一8弁。
單個核細胞為人、鼠等多來源單個核細胞，如人臍血、人骨髓或鼠骨髓。
培養時間5-15天，培養基的組成根據所選定的單個核細胞及初始單個 核細胞中CD34+細胞數量確定。
為滿足造血幹細胞擴增對物質擴散和三維生長環境等的特殊要求，本 發明提出以海藻酸鈉、殼聚糖為複合材料，製備AC微膠囊，包括液化型與 非液化型；採用的細胞類型是單個核細胞，包括臍血單個核細胞和骨髓單 個核細胞等；
根據初始單個核細胞中CD34+細胞數量採用海藻酸鈉組合配置，按照 海藻酸鈉基質強度、與膜材料交聯程度及物質傳遞等標準，確定海藻酸鈉 濃度、海藻酸鈉(3-L-古洛糖醛酸與a-D-甘露糖醛酸比例；並採用不同濃度、 分子量和脫乙醯度的殼聚糖以製備與其通透性和強度相匹配的微膠囊膜； 採用靜電液滴發生法、氣流噴射法等擠出/外部凝膠化方法對單個核細胞進 行微囊化包封，製備微囊化單個核細胞並培養，以有效擴增造血幹細胞。
經過培養，部分單個核細胞生成基質細胞，實現造血幹細胞與同源基 質細胞的共培養，基質細胞同時分泌細胞因子和細胞外基質，在微囊內共 同形成類造血微環境的三維結構，在僅用少量細胞因子的情況下，抑制/延 緩造血幹細胞走向分化，有效擴增造血幹細胞，並可用於規模化培養；
與已有的造血幹細胞擴增方法相比，本發明有其明顯的優勢第一， 微膠囊可以實現規模化製備和規模化培養，滿足臨床使用要求；第二，微 膠囊及微囊化材料自身特殊的理化性質可以促進基質細胞生成，免除基質 細胞的製備過程，實現造血幹細胞與同源基質細胞的共培養；第三，在微 膠囊的三維空間內，造血幹細胞和基質細胞充分接觸，基質細胞分泌的細 胞因子和細胞外基質既可直接作用於造血幹細胞，又可在局部實現暫態富 集，加之微膠囊膜的控釋性，大大增強了營養成份在三維空間中對造血幹 細胞的生物學作用，從而減少細胞因子用量，降低了擴增成本；第四，本 發明所用的微膠囊成膜材料是殼聚糖，其製備方法為本實驗室發明，成本 僅Yl元/克。第五，殼聚糖材料來自於天然，有很好的生物相容性。因此， 利用ACA微膠囊擴增造血幹細胞，成本低廉，在僅用少量細胞因子的情況 下，能抑制/減少造血幹細胞走向分化，並實現造血幹細胞的有效和規模化 擴增。


圖1是本發明實施例的微膠囊製備示意圖2是本發明實施例1的相差顯微鏡照片(ba產100um);可見微囊化單 個核細胞經培養6天後形成三維細胞聚集體；
圖3為本發明實施例1的HE染色照片(bar^00^im);可見微膠囊內的 細胞聚集體結構鬆散，細胞外有明顯(嗜酸紅染)的細胞外基質；
圖4為本發明實施例1微囊化單個核細胞CD45染色的免疫螢光共聚 焦圖片(ba^lOOum); A為CD45染色陽性細胞，B為同一部位的光鏡照片， C為A和B的疊加。C圖顯示微膠囊內疊加部位(紅染部位)為造血細胞， 未疊加部位(非紅染部位)為基質細胞；可見微膠囊內的細胞聚集體中， 大部分為造血細胞，小部分為基質細胞(A和B疊加部位為造血細胞，未 疊加部位為基質細胞)。
具體實施例方式
實施例1
一種擴增造血幹細胞的方法，
1) 單個核細胞的分離
人臍帶血中的有核細胞的獲取將重量濃度0.125%的甲基纖維素溶液 按4: 1的體積比加入人的臍帶血中，室溫靜置，沉降紅細胞；取上清液 1500rpm/min離心，沉降物即有核細胞。
密度梯度離心，將密度為1.077/ml的Ficoll淋巴細胞分離液按1: 1的 體積比加於有核細胞上，1500rpm/mim,30min，吸取中間層的單個核細胞； 其中含有CD34 +細胞的數量為細胞總個數的0.9 % ; PBS洗滌 (1500rpm/min,5min)後調整細胞密度待用。
2) 微囊化單個核細胞的製備
A. 將P-L-古洛糖醛酸重量含量31.2%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為 68.8%的海藻酸鈉配製成1.5。/。w/v海藻酸鈉溶液I ;
將P-L-古洛糖醛酸重量含量66X、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為34 %的 海藻酸鈉配製成0.9%w/v海藻酸鈉溶液II;
將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按5: l體積比例混合，得海藻酸
鈉溶液III;
B. 將單個核細胞均勻重懸於海藻酸鈉溶液III中，每ml溶液中細胞為
6xl6個；
C. 採用靜電液滴發生法，操作條件為電壓45v、頻率120Hz、泵速 8ml/小時、針頭孔徑5#，將海藻酸鈉細胞重懸液滴入pH-7.0-7.4質量濃度 1.1%氯化鈣的水溶液中，靜置20分鐘得海藻酸鈣膠珠，膠珠直徑300-400)iim 精確可控；
將分子量45KDa、脫乙醯度90%、質量濃度0.5%的殼聚糖按體積比10: l加入海藻酸鈣膠珠中，成膜時間5min，膜厚約25pm;得到非液化的微膠
將55pM檸檬酸鈉溶液按體積比10: 1加入非液化的微膠囊中，靜置5 分鐘；收集液化的微膠囊；製備過程如圖l所示；
3)將微膠囊按體積比l: 12置於擴增培養基中，37"C擴增6天，單個 核細胞能夠在微膠囊內存活，並發生顯著增殖；如圖2、 3;
在AC微膠囊化培養過程中，部分單個核細胞藉助微膠囊所提供的特殊 微環境生成基質細胞，如圖4;基質細胞生成並分泌細胞外基質和細胞因子，
共同在微膠囊內構建三維類造血微環境，促進造血幹細胞的高效擴增；
擴增培養基為於IMDM培養液中添加3ng/ml白介素-3， 20ng/ml幹細
胞因子，8ng/ml人FLT-3配體，1.8ng/ml血小板生成因子，終體積濃度10%
胎牛血清，pH=7.0-7.2。
造血幹細胞在微膠囊內重構的造血微環境中實現高效擴增，即在添
加極少量細胞因子的情況下，AC微囊化單個核細胞在體外培養6天後，
CD34+細胞及集落形成細胞(CFU-C)的擴增倍數分別可達14.5倍和11.9倍。
採用本發明可以實現造血幹細胞在體外的規模化培養，批量獲得幹細 胞，滿足組織工程研究中對種子細胞的需求;利用AC微膠囊的特定微環境， 幹細胞可與多種細胞(包括基質細胞、轉基因細胞)實現共培養。
實施例2
一種擴增造血幹細胞的方法，
1) 單個核細胞的分離
密度梯度離心，將密度為1.077/ml的Ficoll淋巴細胞分離液按1.5: 1 的體積比加於人骨髓液上，1500rpm/mim,30min，吸取中間層的單個核細胞； 其中含有CD34 +細胞的數量細胞總個數的1.9%; PBS洗滌 (1500rpm/min,5min)後調整細胞密度待用；
2) 微囊化單個核細胞的製備
A. 將卩丄-古洛糖醛酸重量含量37%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為63 %的海藻酸鈉配製成1.0y。w/v海藻酸鈉溶液I ;
將(3-L-古洛糖醛酸重量含量62%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量為38 %的 海藻酸鈉配製成2.5%w/v海藻酸鈉溶液II;
將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按1: 1體積比例混合，得海藻酸 鈉溶液III;
B. 將單個核細胞重懸於海藻酸鈉溶液III中，每ml溶液中細胞為3xl06個.
C. 將重懸液滴入pH:7.0-7.4質量濃度0.9y。氯化鈣的水溶液中，靜置
15分鐘得海藻酸鈣膠珠，控制膠珠直徑大小在300-500|am之間；
將分子量120KDa、脫乙醯度84%、質量濃度0.4 %的殼聚糖按體積比 8: l加入海藻酸鈣膠珠中，成膜時間為8min，膜厚約40pm範圍；收集非 液化的微膠囊；
將8(HiM檸檬酸鈉溶液按體積比10: 1加入非液化的微膠囊中，靜置6 分鐘；收集液化的微膠囊；
3)將液化的微膠囊按體積比1: 10置於擴增培養基中，37"C擴增15
天，單個核細胞能夠在微膠囊內存活，並發生顯著增殖
擴增培養基為於IMDM培養液中添加3ng/ml白介素-3， 20ng/ml幹細 胞因子，8ng/ml人FLT-3配體，1.8ng/ml血小板生成因子，終體積濃度10% 胎牛血清，pH=7.0-7.2。
造血幹細胞在微膠囊內重構的造血微環境中實現高效擴增，g卩在添 加極少量細胞因子的情況下，AC微囊化單個核細胞在體外培養6天後， CD34+細胞及集落形成細胞(CFU-C)的擴增倍數分別可達17倍和13倍。
採用本發明可以實現造血幹細胞在體外的規模化培養，批量獲得幹細 胞，滿足組織工程研究中對種子細胞的需求;利用AC微膠囊的特定微環境， 幹細胞可與多種細胞(包括基質細胞、轉基因細胞)實現共培養。
權利要求
1. 一種擴增造血幹細胞的方法，其特徵在於以海藻酸鈉、殼聚糖為複合材料，採用擠出/外部凝膠化法製備AC微囊化單個核細胞；將微囊化單個核細胞加入到擴增培養基中，置37℃、空氣中含體積5％CO2的培養箱中培養，每2-3天定期更換培養基，即為造血幹細胞擴增體系。
2. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於具體步驟如下，1) 單個核細胞的分離:用Ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心分離臍血 或骨髓中的單個核細胞；2) 微囊化單個核細胞的製備A. 將(3-L-古洛糖醛酸重量含量30-40%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量 60-70%的海藻酸鈉配製成1.0-3.0。/。w/v海藻酸鈉溶液I ;將卩-L-古洛糖醛酸重量含量60-70%、 a-D-甘露糖醛酸重量含量30-40 %的海藻酸鈉配製成0.8-2.5%w/v海藻酸鈉溶液II;將海藻酸鈉溶液I和海藻酸鈉溶液II按1: 5 — 5: l體積比例混合，得 海藻酸鈉溶液III;將單個核細胞均勻重懸於海藻酸鈉溶液III中，每ml溶液中含有細胞8xl5-2xl07個；B. 採用擠出/外部凝膠化法將海藻酸鈉細胞重懸液加入pH-7.0-7.4、質 量濃度0.8-1.6%氯化鈣的水溶液中，靜置10_30分鐘，獲得直徑大小在 300-500pm之間的海藻酸鈣凝膠珠；將海藻酸鈣凝膠珠與殼聚糖溶液反應成膜，海藻酸鈣膠珠與殼聚糖溶 液的體積比為l: 8-14，殼聚糖的分子量40—230KDa、脫乙醯度80-94%、 w/v濃度0.3-0.8%，反應成膜時間為5—20min，膜厚在5 —50|im範圍內， 形成非液化的海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊；將10-100)iM檸檬酸鈉溶液按體積比8-14: 1加入非液化的微膠囊中， 靜置3-8分鐘，得到海藻酸鈉/殼聚糖半透膜包封的內部為液態環境的液化 微膠囊；3) 將微膠囊按體積比1: 8-15置於擴增培養基中，擴增培養基為於 IMDM培養液中添力卩2-5ng/ml白介素-3， 15-25ng/ml幹細胞因子，5-10ng/ml FLT-3配體，1.2-2.5ng/ml血小板生成因子，終體積濃度10%胎牛血清， pH=7.0-7.4。
3. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於當所述擠出/外部凝膠化法為靜電液滴發生法時，通過控制微膠囊製備 儀的操作條件來調整微膠囊粒徑，其操作條件為電壓40 — 85v、頻率IOO 一160Hz、泵速5-16ml/小時、針頭孔徑4一8#。
4. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於 所述單個核細胞為人臍血、人骨髓或鼠骨髓中的單個核細胞。
5. 按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述培養時間5-15天， 培養基的組成根據所選定的單個核細胞確定。
全文摘要
本發明涉及一種擴增造血幹細胞的方法，包括單個核細胞的分離、微囊化單個核細胞的製備和培養；造血幹細胞的擴增。本發明不但能實現造血幹細胞的有效擴增，還能進行規模化培養，在血液生物學和臨床應用研究中將發揮重要作用。
文檔編號C12N5/0786GK101381700SQ20071001276
公開日2009年3月11日 申請日期2007年9月7日 優先權日2007年9月7日
發明者於煒婷, 李雙月, 為 王, 馬小軍 申請人:中國科學院大連化學物理研究所