一種快速定性檢測紅蓮型細胞質的方法
2023-10-10 06:33:09 1
專利名稱：一種快速定性檢測紅蓮型細胞質的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用分子標記檢測技術領域，更具體涉及一種快速定性檢測水稻種質資源中紅蓮型配子體細胞質的方法，適用於各種水稻栽培種、農家種和野生稻等水稻的配子體細胞質的篩選。
背景技術：
植物在漫長的進化過程中通過自然突變或重組在細胞內積累了大量的變異，從而導致同一種內不同株系或品系的差異。這種差異在遺傳水平即表現為彼此間某些DNA片段的不同。當這種變異與某一特定的基因緊密連鎖時，即可作為該基因的特有的分子標籤。如果將這些DNA片段通過體外擴增、電泳、顯色，就會形成人們肉眼可見的具有不同大小的帶型。這些不同品系間具有相對差異的帶型即我們通常所說的分子標記，它對某一個品種而言，具有唯一性。利用分子標記進行品種選擇或品種鑑定是當前植物生物技術育種的主要內容。它具有準確、快速、不受季節限制等優點，因而在生產中被廣為採用。
分子標記輔助選擇育種是現代生物技術與傳統的育種技術相結合的產物，它使傳統遺傳育種學中粗放、經驗型的育種技術向現代精細、定向選擇轉變，使育種變得更加具有可操作性。如果我們知道某一標籤的DNA序列，那麼就可以通過簡單的PCR擴增技術或者RFLP/AFLP技術，跟蹤特定的有利基因。由於分子標記具有唯一性，而且可藉助PCR技術等方法，具有操作非常簡單、結果可靠、效率高、不依賴表型等優點，在遺傳育種上已被廣泛應用，具有非常廣闊的應用前景。
楊子賢等結合分子標記輔助選擇將水稻抗白葉枯基因Xa21和Bt基因同時倒入9311中，在BC3F3家系中篩到8個含純合的Xa21和Bt基因，其中兩個與9311核背景具有90％的相似率，並表現出很高的白葉枯和螟蟲抗性(楊子賢，姜恭好，徐才國，何予卿。利用分子標記輔助選擇改良9311對白葉枯病和螟蟲的抗性。分子植物育種，2004，2(4)473-480)。譚彩霞等利用水稻品種特青與Lemont雜交組合的F2單株無性系群體，進行2年有重複的抗水稻紋枯病QTLs定位，在特青的第9號染色體和Lemont的第11號染色體上分別定位到了2個主效抗紋枯病QTL位點qSB-9和qSB-11，並以二者緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇，將兩個位點在子代中進行累積，獲得比兩親本抗性提高兩個數量級的材料。(譚彩霞，紀雪梅，楊勇，潘興元，左示敏，張亞芳，鄒軍煌，陳宗祥，朱立煌，潘學彪。水稻回交世代中兩個抗紋枯病主效數量基因的鑑定與標記輔助選擇。遺傳學報，2005，132(4)400-406)。
在細胞質雄性不育系的分子標記輔助選擇中，蓋樹鵬等曾試圖發展洋蔥細胞質雄性不育分子標記輔助選擇方法，他利用RAPD擴增尋找不育系線粒體基因組的特異性分子標記帶譜、然後將其轉換成SCAR標記的方法，但並沒有成功。其獲取的兩條A、B之間的差異條帶在轉化成SCAR標記後，一條沒有特異性擴增，而另一條不能與細胞質雄性不育株發生共分離(蓋樹鵬，孟祥棟，徐麗娟。大蔥雄性不育分子標記輔助選擇的研究。分子植物育種，2004，2(2)223-228)。說明該標記缺乏特異性，在實際生產中沒有應用價值。
而水稻中，何光華等利用RAPD技術篩選了野敗型珍汕97A和珍汕97B葉綠體基因組的差異，在A、B之間找到了一條特異性的穩定擴增條帶，並通過測序之後發現該序列位於葉綠體tRNA-Leu gene的上遊，其中A較B中多了一段包含AGAAAA六鹼基的重複片段單元，據此序列將其轉換成SCAR標記後，該片段在5個野敗不育系中可以穩定擴增，而保持系中沒有。因此，他們認為該片段可以作為篩選野敗型不育系的特異性分子標記(He GH，Hou L，Xiao YH，LuoXY，Niu GQ，Yang GW，Pei Y.A common sequence difference between cytoplasmicmale sterile lines and their maintainer lines existing in rice(Oryza sativa L.)chloroplast tRNA-Leu gene region.Euphytica，2003，131269-274)。
此外，日本的Ichii等也利用野敗型不育系珍汕97A和保持系珍汕97B進行大規模的RAPD篩選，在二者之間發現一條1.6Kb的差異性擴增帶，該片段為不育系所特有，而保持系缺乏。進一步提取不育系、保持系和恢復系的線粒體基因組DNA進行PCR驗證，發現該片段為不育系線粒體所特有，而保持系和恢復系線粒體均不含此片段。對雜種F1和F2的驗證表明該片段與不育株共分離，說明該標記的確為野敗型不育系所特有。但若以該標記引物對DA型不育系線粒體DNA進行擴增，其擴增帶為兩條，一條為0.7Kb，一條為1Kb，與野敗型的不同(Ichii M，Hong DL，Ohara Y，Zhao CM，Taketa S.Characterization of CMS andmaintainer lines in indica rice(Oryza sativa L.)based on RAPD marker analysis.Euphytica，2003，129249-252)。
以上的兩種方法均建立在野敗型不育系珍汕97A中特異性擴增的DNA片段基礎之上，只能跟蹤具有與珍汕97A完全相同的細胞質，因而主要適用於野敗型雜種的純度鑑定。由於在植物線粒體基因組中積累了大量的非編碼DNA序列，這些特定的DNA序列雖然在某一水稻生態型中具有唯一性，但他們並不編碼與細胞質雄性不育相關的功能基因，因而缺乏普遍性，不能廣泛地對含野敗型不育基因的其他野生稻和農家種的細胞質材料進行有效鑑定。
紅蓮型和包臺型細胞質雄性不育屬於配子體型細胞質雄性不育，遺傳上有別於傳統的野敗型。儘管日本的Kadowaki等於1990年克隆了包臺型細胞質雄性不育的相關基因orf79(Kadowaki KT，Suzuki T，Azama S.A chimeric gene containingthe 5portion of atp6 is associated with cytoplasmic male-sterility of rice.Mol GenGenet，1990，22410-16)，易平等也於2002年克隆了紅蓮型細胞質雄性不育相關基因orfH79(Yi Ping，Wang Li，Sun Qingping，ZhuYingguo.Discovery ofmitochondrial chimeric-gene associated with cytoplasmic male sterility of HL-rice，Chinese Science Bulletin，2002，47744-747)；但利用該基因作為分子標記選擇紅蓮型細胞質雄性不育系還沒有公開的報導。2003年我們以orfH79為標記進行PCR擴增，發現該基因在紅蓮型雜交稻及其衍生的子代中均可檢測到該分子標記的存在，說明該分子標記對紅蓮型具有專一性。進一步以該基因在野生稻和水稻農家品種中進行篩選，發現部分野生稻和農家品種中含有該基因，以這些野生稻為母本與紅蓮型保持系進行雜交並回交培育出穩定的具有圓敗特徵的新的紅蓮型細胞質雄性不育類型。說明利用該基因作為分子標記，可對紅蓮細胞質進行準確鑑定，選育類似於紅蓮的配子體細胞質雄性不育系。通過這種分子標記鑑定的方法，不僅具有準確，快速等優點，而且有益於豐富不育系的遺傳多樣性；同時，還將繁重的田間勞動變成簡單的實驗室操作，大大降低了田間勞動強度，可以大批量、廣泛地對野生稻和傳統水稻種質資源進行篩選，大幅度提高紅蓮型配子體細胞質雄性不育系的選育效率。
發明內容
本發明的目的在於提供一種快速定性檢測紅蓮型細胞質的方法，該方法可以使原來盲目的大量的田間雜交工作被簡單的實驗室操作所取代，對育種材料的選擇由盲目變為精確，大幅度減少了人力資源的浪費，提高了工作效率。為了實現上述目的，本發明涉及以下技術措施1、特異的細胞質雄性不育基因擴增的PCR引物設計引物設計基於水稻線粒體基因組內的紅蓮型細胞質雄性不育相關基因orfH79的全長(Yi P，Wang L，Sun Q，Zhu Y(2002)Discovery of mitochondriachimeric gene associated with male sterility of Honglian-rice.Chinese ScienceBulletin，47744-747.)，序列如下正向引物F5』-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3』反向引物R5』-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3』2、大規模微量DNA的提取DNA的快速、簡便提取方法的發展是分子標記在生產上大規模應用的前提條件，為了促進該方法在生產上的開發應用，發展了一套簡單高效、低成本的DNA提取方法，其流程是(1)取一段長1-2cm、寬0.5cm的水稻嫩葉及0.2克粉末狀石英沙，依次放入一1.5ml離心管中，用一次性微型塑料研杵將葉片研磨成漿，加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min。
(2)在水浴後的離心管中加入500μl氯仿-異戊醇(24∶1)，充分混勻，臺式離心機上10000rpm離心5min，取上清300μl轉移至另一1.5ml離心管。
(3)加入600μl冷凍的國產無水乙醇，充分混勻，4℃或冰上放置20min，12000rpm離心15min，到掉上清液，將離心管倒置10min使酒精濾幹，然後溶於30μl TE。
3、標準PCR擴增體系的建立PCR擴增反應以典型的紅蓮不育系粵泰A和保持系粵泰B作對照。
標準的PCR擴增反應體系體積為25μl，組成如下總DNA 1μl(50ng)10×PCR buffer(pH8.3) 2.5μl25mM MgCl21μl
25μm dNTP 1μl一單位Taq酶 1μl5pM的引物F 1μl5pM的引物R 1μl去離子無菌水(ddH2O) 16.5μl反應物混合後離心，用礦物油覆蓋，PCR擴增在MJ-100型PCR儀上進行，PCR反應程序如下1cycle 94℃ 5min30cycle94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min1cycle 72℃ 5minstore 4℃4、擴增DNA片段檢測分析擴增片段在1.5％的瓊脂糖膠上電泳，用DNAExtraction kit(Fermentas K0513，Canada)純化回收。
(1)如果對照粵泰A只有明亮的一條240bp的特異性擴增帶，而粵泰B為陰性(無特異性擴增帶)，那麼說明PCR結果可靠。
(2)被檢測材料(水稻或野生稻)的帶型同典型的紅蓮不育系粵泰A相一致時，說明該材料為陽性，含有類紅蓮型細胞質；如果與粵泰B一樣沒有擴增帶，則說明該材料為陰性，不含類紅蓮型細胞質。
5、核苷酸序列分析(1)在紫外透照儀上，用無菌刀片挖出瓊脂糖凝膠上的目標帶放入無菌Eppendorf管，用天平稱量瓊脂糖凝膠重量，並估算體積(1g≈1ml)，加入3倍體積的Binding Solution。
(2)55℃水浴5-10min，直到瓊脂糖凝膠完全熔化。
(3)加入5μl矽膠溶液，若DNA≥2.5μg，則每增1μgDNA多加1μl矽膠液。
(4)55℃水浴5min使DNA與矽膠結合，其間不時輕彈Eppendorf管使矽膠懸浮。
(5)室溫(20-25℃)10000rpm離心20sec，去上清液。
(6)Eppendorf管中加入0.5ml Washing buffer液，輕彈使矽膠懸浮。
(7)室溫(20-25℃)10000rpm離心20sec，去上清液，用Washing buffer重複洗滌兩次，風乾沉澱。
(8)用20μl TE或無菌ddH2O完全懸浮沉澱，55℃水浴5min使DNA釋放入TE或ddH2O中。
(9)室溫(20-25℃)14000rpm離心1min，吸取上清液，即得純化好的DNA片段，取少量電泳檢查回收純化效果。
(10)將回收片段根據Promega公司提供的標準程序將回收的DNA克隆到pGEM-T載體(Promega A3600，USA)，挑選白色的陽性克隆，由上海聯眾基因有限公司進行DNA測序。
(11)將測序結果與紅蓮的orfH79(SEQ ID NO1)以及包臺的orf79序列(SEQ IDNO4)在Gene Bank網頁上用Align two sequences(bl2seq)工具(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行網上同源比對。核苷酸序列的同源性比較表明，野生稻中擴增的基因序列與orfH79和orf79的同源程度達到98％-100％，說明這些野生稻和農家種含有紅蓮型配子體細胞質雄性不育基因。其中SEQ ID NO2和SEQ ID NO3是兩種新變異類型。
本發明的優點本發明與傳統雜交育種方法相比具有以下優點和效果(1)快速、準確、可靠核酸提取加上PCR反應，總共僅需3-4小時。
(2)設備簡單，只需要PCR儀、臺式離心機等即可，普通的分子生物學實驗室皆可完成。
(3)方法簡便、操作方便PCR反應不需要特別的技術培訓，一般的大學畢業生或經過短暫培訓的實驗員均可獨立操作。
(4)可同時進行高通量的樣品檢測一次PCR反應可以檢測96個材料。
(5)具有可預測性、大幅度提高育種效率傳統的雜交方法無法預測雜交的結果，而通過分子檢測的材料可以肯定獲得所需要的不育系，可以事先對材料進行選擇，大幅度提高育種效率。
(6)可以拓寬不育系育種材料的選擇範圍，增加遺傳多樣性傳統育種方法認為不育系的選育一般只能通過野生稻和栽培稻雜交來獲得，而且一般獲得的是孢子體類型不育系；而紅蓮型配子體細胞質目前還沒有第二家報導。而該方法不僅在野生稻中，而且在栽培稻中也檢測到配子體細胞質，並通過與紅蓮保持系雜交獲得了類似於紅蓮的圓敗型配子體不育系。
圖1orfH79在野生稻中的PCR擴增篩選示意圖。Marker，DNA分子量標記DL2000；YtA，粵泰A；YtB，粵泰B；含有與粵泰A相一致的240bp的擴增條帶，表明該材料攜帶類紅蓮型細胞質。
圖2以orfH79為標記經PCR擴增篩選的野生稻的進一步驗證示意圖。Marker，DNA分子量標記DL2000；YtA，粵泰A；YtB，粵泰B；粵泰B為陰性，而篩選的8個野生稻與粵泰A為陽性，含有一條特異性的240bp的擴增條帶。
圖3以orfH79為探針的Southern blot分析圖。M，DNAmarker λDNA/HindIII；粵泰A和野生稻均有一條500bp左右的特異帶。
圖4雜種及其子代花粉。野生稻w46/粵泰B雜交F1和BC2F1花粉粒育性(在I2-KI溶液中花粉粒染色較淺，並呈圓球形，顯示出典型的圓敗特徵)。
圖5利用野生稻w46與粵泰B雜交、回交選育的不育系及其雜種F1花粉。野生稻w46/粵泰B回交的BC6F1花粉粒在I2-KI溶液中花粉粒染色較淺，並呈圓球形，顯示出典型的圓敗特徵；而w46A/95102R有50％的花粉可育。
具體實施例方式
一種利用分子標記快速檢測配子體細胞質的方法，其具體步驟如下1、特異的細胞質雄性不育基因擴增的PCR引物設計引物設計基於水稻線粒體基因組內的紅蓮型細胞質雄性不育相關基因orfH79的全長，序列如下正向引物F5』-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3』反向引物R5』-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3』2、微量DNA的提取(1)以粵泰A、B作對照，選擇來自國際水稻所的172個AA基因組野生稻和190個農家種(部分材料見表1)為材料，分別剪取一段長2cm、寬0.5cm約0.1g嫩葉，放入一1.5ml的離心管中並加入0.2克粉末狀石英沙，標記離心管，用一次性微型塑料研杵將葉片研磨成漿；然後加入500μl的CTAB提取液，65℃水浴25-30min。
(2)在水浴後的EP管中加入500μl氯仿-異戊醇(24∶1)，充分混勻，臺式離心機上10000rpm離心5min，取上清300μl轉移至另一1.5ml離心管。
(3)加入600μl冷凍的國產無水乙醇，充分混勻，冰上放置20min，12000rpm離心15min，到掉上清液，將離心管倒置10min使酒精濾幹，然後溶於30μl TE溶液，分光光度計測定每個樣品的DNA濃度，-20℃保存。
表1 來自國際水稻研究所(IRRI)的野生稻材料鑑定
3、PCR擴增篩選對362個野生稻和農家種提取的DNA分別取5μl稀釋至50ng/μl，用於PCR擴增檢測。PCR擴增反應以典型的紅蓮不育系粵泰A和保持系粵泰B作對照，每個材料擴增一管，擴增採用標準的擴增體系反應體積為25μl，組成如下模板DNA 1μl(50ng)10×PCR buffer(pH8.3)2.5μl25mM MgCl21μl25μm dNTP 1μl一單位Taq酶 1μl5pM的引物F 1μ15pM的引物R 1μl去離子無菌水(ddH2O) 16.5μl反應物混合後離心，用礦物油覆蓋，在MJ-100型PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應程序如下1cycle 94℃ 5min30cycle94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min1cycle 72℃ 5minstore 4℃4、擴增DNA片段檢測分析(1)每管擴增產物在1.5％的瓊脂糖膠上電泳，結果表明對照粵泰A只有明亮的一條240bp的特異性擴增帶，而粵泰B為陰性(無任何擴增帶)，這說明PCR反應結果可靠。
(2)被檢測的362個材料中，有31個被擴增出同粵泰A完全相同的帶型，其他材料則同粵泰B一樣，均為空白(圖1)。說明這31個材料含有紅蓮型細胞質，和粵泰A一樣擁有紅蓮不育基因orfH79。
(3)選擇其中的8個與粵泰A、B進行進一步的PCR驗證，結果表明該特異帶擴增穩定，無其他雜帶出現，說明該方法穩定可靠(圖2)。
(4)為了進一步確證PCR擴增結果並非來自汙染的假陽性，以8個野生稻的嫩葉為材料，提取粗線粒體DNA用HindIII進行酶切消化，以orfH79為探針進行Southern雜交。Southern雜交圖譜顯示所有8個野生稻同粵泰A一樣，都有一條約500bp大小的雜交條帶；而對照粵泰B為空白(圖3)。這一結果進一步說明這一特異帶來自粵泰A和野生稻各自的線粒體基因組，orfH79具有紅蓮型的特異性和PCR擴增的穩定可靠。
5、核苷酸序列分析(1)對31個篩選出來的含orfH79的材料分別再一次擴增，然後進行電泳，每個加樣孔加樣20μl，80V電壓下電泳1h後，在紫外透照儀上，用無菌刀片挖出瓊脂糖凝膠上的目標帶約0.2g，放入無菌1.5ml離心管，分別標記離心管，用DNA Extraction kit(Fermentas K0513，Canada)純化回收。
(2)回收時，用天平準確稱量瓊脂糖凝膠重量，按照1g約等於1ml體積的辦法將重量轉換成體積，然後分別加入3倍體積的Binding Solution。
(3)55℃水浴5-10min，直到瓊脂糖凝膠完全熔化。
(4)加入5μl矽膠溶液，若DNA≥2.5μg，則每增1μg DNA多加1μl矽膠液。
(5)55℃水浴5min使DNA與矽膠結合，其間不時輕彈Eppendorf管使矽膠懸浮。
(6)室溫(20-25℃)10000rpm離心20sec，去上清液。
(7)Eppendorf管中加入0.5ml Washing buffer液，輕彈使矽膠懸浮。
(8)室溫(25℃)10000rpm離心20sec，去上清液，沉澱用Washing buffer重複洗滌兩次後涼幹。
(8)用20μl TE完全懸浮沉澱，55℃水浴5min使DNA釋放入TE中。
(9)室溫(20-25℃)14000rpm離心1min，吸取上清液，即得純化好的DNA片段，取少量電泳檢查回收純化效果。
(10)將回收片段根據Promega公司提供的標準程序將回收的DNA克隆到pGEM-T載體(Promega A3600，USA)，分別挑選3個陽性克隆，由上海聯眾基因有限公司進行DNA測序，得到SEQ ID NO2和SEQ ID NO3。
(11)將測序結果與紅蓮的orfH79(SEQ ID NO1)以及包臺的orf79序列(SEQ IDNO4)在Gene Bank網頁上用Align two sequences(bl2seq)工具(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行網上同源比對。核苷酸序列的同源性比較表明，野生稻中擴增的基因序列與orfH79和orf79的同源程度達到98％-100％，說明這些野生稻和農家種含有紅蓮型配子體細胞質雄性不育基因。其中SEQ ID NO2和SEQ ID NO3是兩種新變異類型。
6、雜種子代育性的表型分析(1)為了進一步驗證室內分析的結果，隨機選擇了4個含紅蓮型細胞質的野生稻作母本與保持系粵泰B進行雜交，觀察子代的育性表現。結果表明在雜交組合w15×粵泰B和w20×粵泰B中，其F1子代為可育或部分可育，花粉育性分別為73.8％和8.6％；自然結實率分別為67％和8.3％。而雜交組合w34×粵泰B和w46×粵泰B其子代F1不育(表2)。
(2)用F1與粵泰B回交得BC1F1一代的育性觀察發現，2個可育組合的回交群體發生育性分離，其不育株約佔一半，並呈典型的圓敗特徵(表3)。顯微觀察發現，在4個組合的雜種一代或者回交一代的不育株中，其花粉有染色和不染色(或染色較淺)之分，不染色的花粉在形態上絕大部分是規則的圓形(圖5)，少數為不規則形。
(3)選回交子代中的極端不育株連續與粵泰B回交，至BC6F1不育系群體育性已經完全穩定，花粉在1％的KI-I2溶液中不染色，並且95％以上的具有典型的圓敗特徵。
(4)用新選育的類紅蓮不育系與恢復系雜交，雜種F1的花粉只有50％可育，但是結實率正常，達80％以上(圖6)，說明從野生稻中新選育的不育系具有典型的配子體不育類型特徵。
以上的實驗結果說明該方法不僅理論上可靠，而且在實際生產中被證明完全可行。
表2 野生稻與粵泰B雜種F1的育性鑑定
表3 以粵泰B作輪迴親本的回交群體BC1F1中完全不育株的育性鑑定
SEQUENCE LISTING110武漢大學120紅蓮型細胞質雄性不育基因orfH79序列130紅蓮型細胞質雄性不育基因orfH79序列1604170PatentIn version 3.32101211240212DNA213rice4001atgacaaatc tgctccgatg gctcttctcc actacccgag ggactaacgg tcttccatat60ttcatcttcg gtgtcgttgt aggaggcgcc ctgttgtttg ctttgctaaa gtatcaggcc120cctctgtacg acccggcttt attggacaaa atcatagatc ataatataaa agccgggcac180cctatagagg ttgactattc gtggtggggc acctctattc gtgtagtctt tcctaagtaa2402102211240212DNA213rice4002atgacaaatc tgctccgatg gctcttctcc actacccgag ggactaacgg tcttccatat60ttcatcttcg gtgtcgttgt aggaggcgcc ctgttgtttg ctttgctaaa gtatcaggcc120cctctgtacg acccggcttt aatggctaaa atcatagatc ataatataaa agccgggcac180cctatagagg ttgactattc gtggtggggc acctctattc gtgtagtctt tcctaagtaa2402103211240212DNA213rice4003atgacaaatc tgctccgatg gctcttctcc actacccgag ggactaacgg tcttccatat60
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權利要求
1.一種快速定性檢測紅蓮型細胞質的方法，它包括下列步驟A、PCR引物設計正向引物F5』-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3』；反向引物R5』-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3』；B、DNA的提取首先取一段長1-2cm、寬0.5cm，重0.1克的水稻嫩葉及0.2克粉末狀石英沙，依次放入一1.5ml離心管中，將葉片研磨成漿，加入500μlCTAB提取液，65℃水浴25-30min；其次是在水浴後的離心管中加入500μl氯仿/異戊醇/24∶1，混勻，離心機上10000rpm離心5min，取上清300μl轉移至另一1.5ml離心管；第三是加入600μl無水乙醇/-20℃，混勻，4℃冰上放置20min，12000rpm離心15min，倒掉上清液，將離心管倒置10min使酒精濾幹，然後溶於30μl無菌水即可。C、PCR擴增體系的建立標準的PCR擴增反應體系為25μl，組成如下總DNA/50ng 1μl10×PCR buffer/pH8.32.5μl25mM MgCl21μl25μm dNTP 1μl一單位Taq酶 1μl5pM的引物F 1μl5pM的引物R 1μl去離子無菌水/ddH2O 16.5μl反應混合物用礦物油覆蓋，PCR反應程序如下1cycle94℃5min30cycle94℃1min；55℃1min；72℃1min1cycle72℃5minstore4℃；D、擴增DNA片段檢測首先是擴增片段在1.5％的瓊脂糖膠上電泳，用DNA Extraction kit純化回收；其次是陽性細胞質的鑑定(1)對照粵泰A有一條240bp的特異性擴增帶，粵泰B為陰性，PCR結果可靠；(2)被檢測材料的帶型同紅蓮不育系粵泰A相一致時，該被檢測材料為陽性，含有紅蓮型細胞質；被檢測材料沒有擴增帶，該材料為陰性，不含紅蓮型細胞質；E、核苷酸序列分析(1)在紫外透照儀上，用無菌刀片挖出瓊脂糖凝膠上的目標帶放入無菌Eppendorf管，用天平稱量瓊脂糖凝膠重量為1ml；(2)加入3倍體積的Binding Solution；(3)55℃水浴5-10min，直到瓊脂糖凝膠熔化；(4)加入5μl矽膠溶液，DNA≥2.5μg，每增1μg DNA多加1μl矽膠液；(5)55℃水浴5min使DNA與矽膠結合，其間彈Eppendorf管使矽膠懸浮；(6)室溫10000rpm離心20sec，去上清液；(7)Eppendorf管中加入0.5ml Washing buffer液，彈矽膠懸浮；(8)室溫10000rpm離心20sec，去上清液，用Washing buffer重複洗滌兩次，風乾沉澱；(9)用20μl TE或無菌ddH2O懸浮沉澱，55℃水浴5min使DNA釋放入TE或ddH2O中；(10)室溫14000rpm離心1min，吸取上清液，即得純化的DNA片段，電泳檢查回收純化效果；(11)將回收片段根據Promega程序將回收的DNA克隆到pGEM-T載體上，挑選白色的陽性克隆，由上海聯眾基因有限公司進行DNA測序；(12)將獲得的序列與紅蓮粵泰A的orfH79序列同源比對，擴增DNA序列與orfH79基因核苷酸的一致性。
全文摘要
本發明公開了一種快速定性檢測紅蓮型細胞質的方法，該方法包括下列步驟，首先是紅蓮型細胞質雄性不育基因擴增PCR引物設計；其次是DNA的提取；第三是標準PCR擴增體系的建立；第四是擴增DNA片段檢測分析；第五是核苷酸序列的分析。本發明方法簡便，操作方便，該方法以紅蓮型細胞質雄性不育特有的分子標記為基礎，快速、準確、可靠地通過實驗室篩選水稻種質材料，使紅蓮型細胞質不育系的選育具有強烈的目的性和針對性，克服了傳統育種方法的盲目性和低效、工作量巨大的缺陷，提高了新型配子體雄性不育細胞質的選育效率。
文檔編號C12Q1/68GK1876837SQ20061001894
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月27日 優先權日2006年4月27日
發明者李紹清, 朱英國, 段世華 申請人:武漢大學