由免疫複合物直接對微生物進行測序的測定法與方法

2024-04-05 13:01:05

由免疫複合物直接對微生物進行測序的測定法與方法
【專利摘要】本文提供了用於在患者樣品中對免疫刺激性微生物進行檢測和/或識別的MiIP-Seq測定法和方法。本文還提供了用於對感染性疾病進行診斷或在患者樣品中對先前未特徵化的微生物進行識別的方法。本文所述的方法和測定法相對於現有方法的優勢在於：（i）不需要用於微生物擴增的培養步驟；（ii）並非特異性針對特定微生物，可用於對先前未特徵化的微生物進行識別；以及（iii）由於不進行微生物培養步驟，因此允許快速處理。
【專利說明】由免疫複合物直接對微生物進行測序的測定法與方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]根據35U.S.C.§ 119(e)，本申請要求2011年I月26日提交的美國臨時專利申請序列N0.=61/436, 345的優先權，以引用的方式將其整體內容併入本文。
【技術領域】
[0003]本發明的【技術領域】涉及免疫系統刺激性微生物的檢測和識別，以及感染性疾病的診斷。
[0004]政府支持
[0005]本發明是在美國國立衛生研究院(NIH)授予的NIH DK44319的政府支持下作出的。美國政府對本發明享有一定的權利。
【背景技術】
[0006]據估計，有一百萬美國人患有慢性炎症性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)o IBD，如 Crohn』 s 病(CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)。這些疾病以導致腸內膜(intestinal lining)組織受損的慢性炎症性響應為特徵。⑶和UC兩者均顯出大量遷移至黏膜並進入腸腔的白細胞。兩種疾病均在疾病活性中的活性階段(即，存在腸炎)和非活性階段(即，最低限度的腸炎至無腸炎)之間交替。活性IBD可包括如出血性腹瀉、腹痛和發熱等症狀。非活性階段具有最低限度的腸炎至無腸炎，且無嚴重的胃腸病。已經具有下列假定:對共生細菌(co_ensal bacteria)的不當免疫響應是炎症性腸病的起因之一。不當免疫響應可導致形成免疫複合物，例如，抗體分子和抗原的組合。抗原可以為外來物質，如病毒或細菌多肽。抗體可以通過包覆病毒或細菌來防止感染。

【發明內容】

[0007]本文所述的測定法和方法提供了檢測和/或識別微生物的直接方法，先天性免疫系統或適應性免疫系統的一種或多種組分對所述微生物產生響應。此類方法的獨特之處在於其確定何種微生物被免疫系統識別為外來抗原的能力，而非單純檢測微生物的存在。由於許多微生物可以在不導致疾病的情況下存在(例如，共生細菌)，因此檢測微生物水平並不一定表明某微生物對於檢出該微生物的受試者來說是病原性的。然而，本文所述的方法允許對如下微生物進行檢測:受試者機體對該微生物產生免疫響應,這些方法在本文中被稱為「微生物免疫沉澱和測序(Microbe ImmunoPrecipitation and Sequencing)」法或者「MilP-Seq」法。這一區別對於一些情況來說可以是尤其重要的，例如，對於這樣的疾病尤其重要:在該疾病中，對個體的子集中的特定抗原產生免疫響應，而這一反應在群體中的多數個體中並不出現(例如，對於患有自身免疫病症的個體)。另一個實例包括炎症性腸病(IBD),所述疾病被認為在一些情況下由對共生微生物群(commensal microbiota)產生的不當免疫響應導致。相應地,本文所述的測定法和方法在一些實施方式中允許對在例如患有免疫性腸病的受試者中特異性引發免疫響應的共生微生物群(包括細菌、病毒和其它微生物)進行檢測和/或識別，並允許對感染性疾病進行診斷。
[0008]相應地，本文提供了用於對患者樣品中的免疫刺激性微生物進行檢測和/或識別的測定法和方法。本文還提供了用於對感染性疾病進行診斷或對患者樣品中的新型病原體進行識別的方法。
[0009]相應地,在一些方面,本文提供了用於在患有疾病或失調(disorder)的患者中對免疫刺激性微生物的存在進行識別或檢測的方法，所述方法包括如下步驟:(a)由從患者樣品獲得的免疫蛋白富集部分中提取核酸；(b)對提取的核酸進行測序；以及(C)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進行比較，以識別由所述免疫蛋白富集部分中提取的核酸是否是微生物核酸，其中，若所述提取的核酸是微生物核酸，則患者被檢測為具有免疫刺激性微生物。在一些方面，本文提供了用於在患有疾病或失調的患者中對免疫刺激性微生物的存在進行識別或檢測的方法，所述方法包括如下步驟:(a)由患者樣品製備免疫蛋白富集部分；(b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸；(c)對所述提取的核酸進行測序；以及(d)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進行比較，以識別由所述免疫蛋白富集部分中提取的核酸是否是微生物核酸，其中，若所述提取的核酸是微生物核酸，則患者被檢測為具有免疫刺激性微生物。 [0010]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，患有疾病或失調的患者患有炎症性腸病。在一些此類實施方式中，所述炎症性腸病為Crohn』 s病、潰瘍性結腸炎、膠原性結腸炎(collagenous colitis)、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎(diversion colitis)、Behcet』 s 症候群、或未定型結腸炎(indeterminate colitis)。
[0011]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，患有疾病或失調的患者患有自身免疫失調。
[0012]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，患有疾病或失調的患者患有硬化(cirrhosis)、敗血症(sepsis)或病毒血症(viremia)。
[0013]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對免疫球蛋白、補體蛋白(complement protein)或病原體識別受體(pathogenrecognition receptor)的特異性親和結合劑製備。
[0014]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過使用IgA、IgD、IgE、IgG、IgM的特異性親和結合劑或所述親和結合劑的任意組合製備。
[0015]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgG具有特異性的親和結合劑製備。
[0016]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過使用親和結合劑利用免疫沉澱製備。
[0017]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述親和結合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結合劑的任意組
八
口 ο
[0018]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，在所述方法中使用的親和結合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體、抗人IgA抗體、抗人IgD抗體、抗人IgE抗體、抗人IgM抗體,或所述親和結合劑或抗體的任意組合。[0019]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述方法中使用的親和結合劑對免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，並結合至免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
[0020]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述方法中使用的親和結合劑未結合至固相載體。
[0021]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述方法中使用的親和結合劑結合至固相載體。在一些此類實施方式中，所述固相載體包括超順磁微珠(superparamagnetic microbeads)、微尺度瓊月旨糖珠(microscopic agarose beads)、或瓊脂糖樹脂珠(agarose resin beads)。
[0022]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，被檢測的免疫系統刺激性微生物為細菌、真菌或病毒。
[0023]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，被檢測的免疫系統刺激性微生物屬於分類單元中的古細菌域、細菌域或真核生物域。
[0024]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，患者樣品為血液樣品、血眾樣品、尿樣品、腦脊液(cerebrospinal fluid)樣品、黏膜(mucous membrane)樣品、糞便(fecal)樣品、腸灌洗(intestinal lavage)樣品、腸液樣品、關節液樣品、呼吸道痰(respiratory sputum)樣品、或支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid)樣品。在一些此類實施方式中，腸灌洗樣品為迴腸灌洗(ileal lavage)樣品。
[0025]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，被檢測的免疫系統刺激性微生物為先前未特徵化(uncharacterized)的微生物。
[0026]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，所述測序步驟使用鳥槍法克隆(shotgun cloning)、16S rRNA/DNA擴增和/或宏基因組(metagenomic)測序進行。
[0027]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，使用微生物基因特異性引物進行步驟(b)或步驟(c)的測序。
[0028]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，使用非基因特異性引物進行步驟(b)或步驟(c)的測序。
[0029]在本文所述的這些方法和全部此類方法的一些實施方式中，製備免疫蛋白富集部分的患者樣品在提取核酸的步驟之前不進行培養步驟。
[0030]此外，在一些方面，本文還提供了一種在患者樣品中對免疫系統刺激性微生物進行直接檢測的測定法，所述測定法包括以下步驟:(a)由從患者樣品製備的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及(b)對存在於所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進行測序，從而獲得存在於所述患者樣品中的任何免疫系統刺激性微生物的序列。
[0031]在一些方面，本文還提供了一種在患者樣品中對免疫系統刺激性微生物進行直接檢測的測定法，所述測定法包括以下步驟:(a)由患者樣品製備免疫蛋白富集部分；(b)從所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及(c )對存在於所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進行測序，從而獲得存在於所述患者樣品中的任何免疫系統刺激性微生物的序列。
[0032]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對免疫球蛋白、補體蛋白或病原體識別受體具有特異性的親和結合劑製備。
[0033]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特異性的親和結合劑或所述親和結合劑的任意組合製備。
[0034]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgG具有特異性的親和結合劑製備。
[0035]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所述免疫蛋白富集部分通過使用親和結合劑利用免疫沉澱製備。在一些此類實施方式中，所述親和結合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結合劑的任
意組合。
[0036]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所使用的親和結合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體。
[0037]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所使用的親和結合劑對免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，並結合至免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
[0038]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所使用的親和結合劑未結合至固相載體。在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所使用的親和結合劑結合至 固相載體。在一些此類實施方式中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹脂珠。
[0039]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，被檢測的免疫系統刺激性微生物為細菌、真菌或病毒。
[0040]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，被檢測的免疫系統刺激性微生物屬於分類單元中的古細菌域、細菌域或真核生物域。
[0041]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、黏膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關節液樣品、呼吸道痰樣品、或支氣管肺泡灌洗液樣品。在一些此類實施方式中，所述腸灌洗樣品為迴腸灌洗樣品。
[0042]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，被檢測的免疫系統刺激性微生物為先前未特徵化的微生物。
[0043]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，所述測序步驟使用鳥槍法克隆、16S rRNA/DNA擴增和/或宏基因組測序進行。
[0044]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，使用微生物基因特異性引物進行步驟(b)或步驟(c)的測序。
[0045]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，使用非基因特異性引物進行步驟(b)或步驟(c)的測序。
[0046]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，製備免疫蛋白富集部分的患者樣品在提取核酸的步驟之前不進行培養步驟。
[0047]在本文所述的這些測定法和全部此類測定法的一些實施方式中，微生物不能使用標準培養條件進行培養。[0048]在一些方面，本文還提供了用於從至少一個測試樣品獲取數據的系統，所述測試樣品包含由免疫蛋白富集樣品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集樣品由至少一名患者處獲得，所述系統包含:測定模塊，其被配置為接收包含所述提取的核酸的所述至少一個測試樣品，並對所述至少一個測試樣品進行至少一次測序分析，以產生測序數據輸出；存儲裝置，其被配置為存儲來自所述測定模塊的所述測序數據輸出；比較模塊，其被配置為接收包含所述提取的核酸的測試樣品的所述測序數據輸出，並對所述測序數據輸出進行至少一次序列分析，從而確定下列條件之一存在與否，並產生比較數據輸出:(i )所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上、或(ii)所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低於20%;以及顯示模塊，其用於對部分基於來自所述比較模塊的所述比較數據輸出的內容進行顯示，其中，所述內容包括表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上的信號、或表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低於20%的信號。[0049]在本文所述的這些系統和全部此類系統的一些實施方式中，所述顯示模塊上顯示的內容進一步包括表明建議接受特定治療方案的患者的信號。
[0050]定義
[0051]為了方便起見，將本文在說明書、實施例和所附的權利要求中所使用的特定術語收集於此。除非另有說明或在上下文中有所暗示，下列術語和短語包括下文提供的含義。除非另有明確說明或從上下文中可明顯看出，下列術語和短語不排除在其所屬領域已具有的含義。提供所述定義以輔助描述【具體實施方式】，而由於本發明的範圍僅受權利要求所限，因此並不意味著限制所請求保護的發明。除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有與本發明所屬【技術領域】中的普通技術人員通常理解的相同的含義。
[0052]本文所使用的術語「炎症性腸病(IBD)」包括任意類型、病因或病機(etiology orpathogenesis)的炎症性腸病。其包括但不僅限於:潰瘍性結腸炎、膠原性結腸炎、息肉型結腸炎(colitispolyposa)、透壁性結腸炎(transmural colitis)、節段性結腸炎(segmentalcolitis)、Crohn』 s病、未定型結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎、Behcet』 s症候群、感染性結腸炎等。
[0053]本文所使用的術語「自身免疫疾病」是指免疫介導的、源於自身組織受攻擊的病症，其中，受試者的自身抗體與宿主組織反應，或免疫效應因子T細胞與內源性自身肽發生自體反應並引起組織破壞，但也可涉及對微生物的免疫響應。此類病症包括但不僅限於:自身免疫性糖尿病(I型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病)、ANCA陽性血管炎、類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、Sjogren』 s病或症候群、皮肌炎、牛皮癬、原發性硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、多發性硬化、強直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、自身免疫性腦脊髓炎、重症肌無力(MG)、自身免疫性淋巴組織增生症候群(ALPS)、Hashimoto』 s 甲狀腺炎、Goodpasture』 s 症候群、天皰瘡(pemphigus)(例如，尋常天皰瘡(pemphigus vulgaris))、Grave』 s病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血友病、自身免疫性血小板減少性紫癜(thrombocytopenic purpura)、具有抗膠原抗體的硬皮病、混合性結締組織病、多發性肌炎、惡性貧血(pernicious anemia)、特發性Addison’s病、自身免疫相關性不孕不育(autoimmune-associated infertility)、腎小球腎炎(例如，新月體性腎小球腎炎(crescentic glomerulonephritis)、增生性腎小球腎炎)、大皰性類天皰瘡(bullous pemphigoid)、自身免疫性葡萄膜視網膜炎(uveoretinitis)、腎小球腎炎、以及Guillain-Barre症候群。在一個實施方式中，自身免疫性疾病選自由如下疾病所組成的組:多發性硬化、I型糖尿病、Hashimoto’s甲狀腺炎、類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡、自身免疫性肝炎、溶血性貧血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴組織增生症候群(ALPS)、自身免疫性葡萄膜視網膜炎、腎小球腎炎、Guillain-Barre症候群、牛皮癬和重症肌無力。
[0054]本文所使用的術語「直接檢測」是指本文所述的方法在如下方面的能力:直接從免疫蛋白富集部分測定微生物的存在和類別(identity)(例如，通過測序)，而無需使用用於對微生物進行間接測試(如針對微生物的IgG ELISA)的測定法。本文所述的方法採用「直接檢測」，該「直接檢測」具有如下附加優勢:通過利用對微生物的先天性和/或適應性免疫響應，能夠以無偏倚的方式識別先前未特徵化的微生物。這在某些情況下是非常有用的，例如，當抗微生物的IgG抗體未知時、當微生物無法使用標準技術培養以增強檢測時、和/或當沒有抗微生物抗體的現有ELISA測試時。
[0055]本文所使用的術語「免疫系統刺激性微生物」是指細菌、真菌或病毒，所述微生物由受試者的先天性或獲得性免疫系統識別，從而在受試者產生針對該微生物的免疫介導的響應。免疫系統刺激性微生物可以來自分類單元中的古細菌域、細菌域或真核生物域。通常，如在本文中定義的術語，免疫系統刺激性微生物是「致病的」，然而在一些情況下，典型的非致病性微生物(例如，共生細菌)仍然可以在受試者群體的子集(如患有炎症性腸病的受試者)中產生免疫介導的響應。因此,術語「免疫系統刺激性微生物」在本文中不與「致病的」互換使用。在一個實施方式中，免疫刺激性微生物不為馬病原體，如裡氏埃裡希氏體(Ehrlichia risticii)。
[0056]本文所使用的術語「患者樣品」或「生物樣品」指的是從患者處獲得的流體樣品、細胞樣品、組織樣品或器官樣品。在一些實施方式中，從受試者處獲得細胞或細胞群、或一定量的組織或體液。「患者樣品」經常可包括來自動物的細胞，但該術語也可以指非細胞的生物材料，如可用於檢測微生物的存在或類別的血液、唾液或尿液的非細胞部分。生物樣品包括但不僅限於:活組織切片、刮取物(如口腔刮取物)、全血、血漿、血清、尿液、唾液、細胞培養物、活組織切片、黏膜樣品、糞便、腸灌洗物、關節液、腦脊液、膽汁樣品、呼吸道分泌物(如痰)、支氣管肺泡灌洗液樣品等。生物樣品或組織樣品可以指由個體分離的組織或流體，包括但不僅限於，例如，血、血漿、血清、尿、糞便、痰、脊髓液、胸膜液(pleural fluid)、淋巴液；皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外層；眼淚、唾液；和器官。樣品可包括冷凍組織。術語「樣品」還涵蓋任何由對此類樣品進行進一步加工而衍生的材料。衍生樣品可包括例如由樣品提取的核酸或蛋白；或經由將所述樣品進行如核酸擴增或mRNA逆轉錄，或對特定核酸、蛋白、其它細胞質組分或核組分進行分離和/或純化等技術而獲得的核酸或蛋白。
[0057]術語「患者」、「受試者」和「個體」在本文中可互換使用，並且是指動物，特別是人，對於所述受試者，期望對由其獲得的生物樣品中免疫系統刺激性微生物的存在進行分析。在一些實施方式中，受試者需要對疾病或失調進行診斷，例如對炎症性腸病進行診斷，其中，使用本文所述的測定法和方法對生物樣品進行分析。本文所使用的術語「受試者」或「患者」還指人類和非人類的動物。術語「非人類的動物」包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物，如非人靈長類動物(特別是高等靈長類動物)、綿羊、狗、嚙齒類動物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、豬、貓、兔、牛、和任何家畜或寵物；以及非哺乳動物，如雞，兩棲類，爬行動物等。在一個實施方式中，所述受試者為人。在一些實施方式中，所述受試者不是馬。
[0058]本文所使用的術語「免疫蛋白富集部分」是指部分純化(例如，通過免疫沉澱)的樣品，所述部分純化使得期望的免疫蛋白(例如，免疫球蛋白、補體、或先天性或適應性免疫響應的其它可溶性/循環組分)在樣品中的水平與衍生所述樣品的初始患者樣品相比提高至少10%。在一些實施方式中，與衍生所述樣品的患者樣品相比，富集部分中的免疫蛋白水平提高至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍以上。
[0059]本文所使用的術語「免疫球蛋白」是指通常存在於受試者血液或其它體液中的抗體，被用於識別和中和外來抗原(如細菌或病毒)。通常，免疫球蛋白包含兩條大的重鏈和兩條小的輕鏈，並且由白血細胞製造。哺乳動物中已知存在五種不同的抗體同種型(isotype)(BP, IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)，其各自發揮不同的作用，並幫助針對遇到的各個不同類型的外來對象引導適當的免疫響應。
[0060]本文所使用的術語「抗體」是指由免疫系統產生的蛋白(保護有機體不受抗原的作用)及其天然存在的變體。「抗體」通常包含彼此間通過二硫鍵連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。每條重鏈均由重鏈可變區和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈均由輕鏈可變區和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。重鏈可變區和輕鏈可變區可進一步細分成高可變區(稱作互補決定區(⑶R))，散布於較保守的區域(稱為框架區(FR))之中。每條可變重鏈和可變輕鏈由3個⑶R和4個FR組成，由氨基末端到羧基末端按以下順序排列:FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括多種免疫系統細胞(例如，效應細胞)和經典的補體系統的第一組分(Clq)。
[0061]本文所使用的術語「先前未特徵化的微生物」是指具有未知功能的微生物或先前未曾識別或測序的新型微生物。根據本文所述方法的實施方式，使用隨機引物對此類微生物進行測序。隨後將序列與已知的微生物序列(例如，微生物序列資料庫，如GenBank或宏基因組文庫資料庫)進行比較，從而允許識別(例如，使用搜尋引擎(如BLAST)或比對工具(如ClustalW))。例如，如果與資料庫中的另一微生物同源性很低或沒有同源性(例如，低於20%),則被識別為先前未特徵化的微生物。在一些實施方式中，先前未特徵化的微生物將與資料庫中的微生物 具有序列同源性，然而資料庫並未表明微生物的功能是已知的。
[0062]本文所使用的短語「不進行培養步驟」表示在對核酸進行提取和測序前，並未使用標準技術對免疫蛋白部分進行培養以擴增樣品中的微生物數量。
[0063]本文所使用的短語「不能使用標準培養條件進行培養」是指在標準培養條件下(例如，細菌的標準培養條件包括:例如，在37°C下、在連續振搖的情況下，在溶菌肉湯(LB培養基)中生長至少14h)並不生長或擴增的微生物。例如，微生物可具有高於或低於標準培養條件下所使用的溫度的最佳生長溫度、或微生物需要在標準培養基中並不存在的必需營養素，因此不能通過使微生物在標準條件下生長或增殖來提高檢測效果。類似地，在病毒微生物的情況下，「不能使用標準培養條件進行培養」可以是指例如，缺乏病毒在其中進行增殖的宿主細胞。本領域技術人員知曉微生物(如細菌和病毒)的標準生長技術和條件，並可容易地將這一知識應用於本文所述的測定法和方法中。
[0064]本文所使用的術語「已知的微生物序列」是指例如，微生物基因序列的資料庫，如GenBank，並且可使用搜索工具(如BLAST)來對樣品序列進行識別，從而在資料庫中查詢核酸序列同源性。在一些實施方式中，將已知序列與宏基因組文庫資料庫中的序列進行比較。術語「對照樣品」包括無可檢測的疾病的個體或多個個體的核酸，所述核酸已經使用本文所述的測定法和方法進行製備和測序。
[0065]本文所使用的術語「包含/包括(comprising或comprises)」表示對本發明必要的組合物、方法及其各自的組成部分，並且無論是否必要都仍然對未指定的要素保持開放。
[0066]本文所使用的術語「基本由…組成(consisting essentially of)」對於給定實施方式所需的那些元素。該術語允許存在實質上不影響本發明實施方式的基礎和新穎性或起作用的特徵的額外元素。
[0067]術語「由…組成(consisting of )」涉及本文所述的組合物、方法及其各自的組成部分，排除沒有在實施方式描述中詳述的任何要素。
[0068]除非上下文中明確地另有所指，在本說明書和所附權利要求中所使用的單數形式「一(a/an)」和「該/所述(the)」涵蓋複數的所指物。因此，例如，「方法(method)」的所指物包括一種或多種方法、和/或本文所述的類型的步驟、和/或對於本領域技術人員而言在閱讀本發明後變得顯而易見的內容等。
[0069]除非另有說明，本 文所述方法的實施將採用屬於本領域之內的分子生物學、微生物學和重組DNA技術的常規技術。此類技術在文獻中有充分的解釋。參見，例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis, 1989年，分子克隆:實驗室手冊，第二版；寡核苷酸合成(M.J.Gait主編，1984年)；多核苷酸雜交(B.D.Harnes&S.J.Higgins主編，1984年)；分子克隆實用指南(B.Perbal, 1984年);酶學方法系列叢書(Academic Press公司);精編分子生物學實驗指南(Ausubel 等主編，1995 年)。
[0070]可以理解的是，以下的詳細描述和實例僅是說明性的，不應被視為對本發明範圍的限制。對所公開的實施方式所做的各種改變和修改對於本領域技術人員來說將是顯而易見的，其可在不脫離本發明的精神和範圍的情況下作出。另外，出於描述和公開的目的，將說明書和實施例中提及的全部專利、專利申請以及出版物通過引用明確併入本文，例如，在這些出版物中描述的可以與本發明相聯繫使用的方法學。這些出版物僅僅由於它們的公開早於本申請的申請日而提供。在這一方面不應當視作承認本發明人沒有權利藉助於先前的發明或因為任何其它原因而將公開的內容提前。所有關於這些文件的日期的聲明或這些文件的內容的表述是基於 申請人:可得的信息，並且不構成關於這些文件的日期或這些文件的內容的正確性的任何承認。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0071]圖1A-圖1C為顯示迴腸灌洗樣品中的細菌比例的一系列餅狀圖。圖1A示出第一患者的迴腸灌洗樣品；圖1B示出使用未包覆珠進行免疫沉澱的相同迴腸灌洗樣品(即，對照)；圖1C示出通過使用抗人IgG包覆珠進行迴腸灌洗樣品的免疫沉澱而製備的IgG富集部分。在IgG富集部分和對照非包覆珠部分之間，觀測到10個PCR循環的豐度差異(SP，IgG珠中的富集與對照珠中相比超出1000倍)。在由腸灌洗和灌入(input-lavage)進行如本文所述的免疫沉澱程序後，由抗IgG珠和對照珠中分離DNA ;使用附著有適當的銜接子(adaptor)和接頭(linker)的擴增16S DNA的V2區域的引物來產生文庫，隨後在454測序儀上對其進行測序。圖1A-圖1C顯示基於V2同源序列並使用公共資料庫的分配至個體操作分類單元(operational taxonomic units, 0TU)的序列的相對豐度，所述資料庫如全球資訊網上的greengenes.lbl.gov (在相比於對照沉澱灌洗和灌入的抗IgG免疫沉澱灌洗中)。為允許定性比較，對照珠免疫沉澱的DNA比IgG珠的DNA擴增更多倍。在灌洗中的細菌群落在組成上與以對照珠沉澱的細菌群落非常相似，但與由IgG珠下拉(pull down)的細菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的術語，IgG富集部分中的細菌為免疫系統刺激性微生物。[0072]圖2A-圖2C為顯示迴腸灌洗樣品中的細菌比例的一系列餅狀圖。圖2A示出第二患者的迴腸灌洗樣品；圖2B示出使用未包覆珠進行免疫沉澱的相同迴腸灌洗樣品(即，對照)；圖2C示出通過使用抗人IgG包覆珠進行迴腸灌洗樣品的免疫沉澱而製備的IgG富集部分。在由腸灌洗和灌入進行如本文所述的免疫沉澱程序後，由抗IgG珠和對照珠中分離DNA ;使用附著有適當的銜接子和接頭的擴增16S DNA的V2區域的引物來產生文庫，隨後在454測序儀上對其進行測序。圖2A-圖2C顯示基於V2同源序列並使用公共資料庫的分配至個體操作分類單元0TU的序列的相對豐度，所述資料庫如全球資訊網上的greengenes.lbl.gov (在相比於對照沉澱灌洗和灌入的抗IgG免疫沉澱灌洗中)。為允許定性比較，對照珠免疫沉澱的DNA比IgG珠的DNA擴增更多倍。在灌洗中的細菌群落在組成上與以對照珠沉澱的細菌群落非常相似，但與由IgG珠下拉的細菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的術語，IgG富集部分中的細菌為免疫系統刺激性微生物。[0073]圖3為示出來自患有炎症性腸病的患者的小腸分泌物的IgG包覆的細菌可以以本文所述的方法的實施方式，使用16S rDNA進行特異性下拉和測序的圖。由16S rDNA的特異性引物，通過基於SYBR綠的定量實時PCR對16S rDNA的豐度(表示附著於抗IgG珠和對照珠的細菌的豐度)進行定量。IgG富集部分中的細菌相對於對照(灌洗，未包覆珠)而言是特異性的，並以兩個以上的數量級(logs)(或大於100倍)富集。免疫沉澱物可包含活體微生物，包括可培養的細菌。免疫沉澱物也可包含不可培養的微生物，這可需要下一代測序以及鳥槍法、宏基因組、下一代測序。[0074]圖4A-圖4C表明，本文所述的免疫沉澱方法的實施方式可用於在使用常規方法被認為是無菌的樣品中檢測微生物(如病毒)。如本文所述，使用抗IgG或對照對來自HCV感染患者(圖4A和圖4C中的個體患者)的血清進行免疫沉澱，並由抗hlgG免疫沉澱物和對照沉澱物分離RNA。對RNA進行逆轉錄，並使用特異性引物測試HCV cDNA是否存在。如圖4C中所示(與圖4A為相同樣品)，在抗hlgG免疫沉澱中檢測到HCV信號的184倍和117倍的富集，對照沉澱物中則幾乎不存在信號。這些附圖表明，本文所述的免疫沉澱程序還可應用於「無菌」環境(如外周血);並且表明了，如本文所述，使用特異性檢測這一 HCV陽性供體內的HCV RNA的引物，能夠沉澱完全的病毒。可隨後通過任何基於測序的手段檢測擴增產物，例如，在病毒的情況下使用宏基因組手段、或對於細菌的情況使用宏基因組手段或基於16S的手段等。[0075]圖5為示出用於本文所述的測定法和方法的示例性系統的方框圖。[0076]圖6為示出用於本文所述的系統的編碼於計算機可讀存儲介質上的示例性指令的方框圖。
【具體實施方式】
[0077]本文提供了用於在患者樣品中檢測和/或識別免疫刺激性微生物的「MilP-Seq」(Microbe ImmunoPrecipitation and Sequencing)測定法和方法。本文還提供了對感染性疾病進行診斷或對患者樣品中的先前未特徵化的微生物進行識別的方法。本文所述的測定法和方法與現有方法相比具有如下優勢:(i)不需要用於微生物擴增的培養步驟；(ii)並非特異性針對特定微生物，可以用來識別先前未特徵化的微生物；以及(iii)由於缺少微生物培養步驟，因此允許快速處理。
[0078]哺乳動物宿主(人類和非人類)中生長著(colonized)各種各樣的共生微生物或致病微生物。免疫系統是否對微生物產生響應表示著微生物對於宿主是共生的還是致病的。目前的微生物學方法並未必然地將對生物體的免疫響應作為直接識別生物體的手段而納入考量。微生物的存在通常由培養或類似類型的生物測定法確定。然而，僅僅存在微生物並未指明或確定微生物是否對宿主造成危害。例如，一些個體中的共生微生物在其它個體中可以為致病的。
[0079]相反，本文所述的測定法和方法利用免疫響應過程中產生的免疫蛋白對微生物進行直接檢測，從而識別和區分介導特定疾病和失調的微生物，特別是對於不能對生物體進行培養的疾病和失調而言。此外，本文所述的方法適合於範圍廣泛的生物樣品(如體液)的直接分析。
[0080]更具體而言，本文所述的測定法和方法針對微生物的檢測，所述微生物刺激免疫系統並誘發免疫系統的一個或多個細胞或組件產生免疫蛋白。通過明確靶向以免疫複合物的形式存在的免疫蛋白所結合的微生物，本文所述的測定法和方法允許僅對來自宿主的生物樣品中的誘發免疫響應的微生物進行檢測和/或識別，而並不對存在但不引起對宿主的危害的微生物(例如，共生微生物)進行檢測和/或識別。因此，通過關注結合至微生物的免疫蛋白，而非僅僅對微生物進行檢測，本文所述的測定法和方法提供有針對性的和無偏倚的手段來對所述誘發免疫響應的微生物進行識別和富集。
[0081]免疫蛋白和免疫複合物
[0082]本文所述的測定法和方法針對微生物的檢測，所述微生物刺激免疫系統並誘發免疫系統的一個或多個細胞或組件產生免疫蛋白。因此，在一些實施方式中，本文所述的測定法和方法涉及對一種或多種免疫蛋白或免疫複合物進行檢測。
[0083]本文所使用的短語「免疫系統刺激性微生物」或「刺激免疫系統的微生物」是指既被受試者或宿主的先天性或獲得性免疫系統識別、又在受試者中誘發免疫介導的響應的微生物(如細菌、真菌或病毒)。免疫系統刺激性微生物可以來自分類單元中的古細菌域、細菌域或真核生物域。通常情況下，如在本文中定義的術語，免疫系統刺激性微生物是「致病的」的，然而在一些情況下，典型的非致病性微生物(例如，共生細菌)仍然可以在受試者群體的子集(例如，患有炎症性腸病的受試者)中產生免疫介導的響應。因此，術語「免疫系統刺激性微生物」在本文中不與「致病的」互換使用。
[0084]基本上來說，任何響應外來微生物而活化或分泌的蛋白、或參與免疫介導的除去或結合微生物的蛋白可用 於與本文所述的測定法和方法結合來製備免疫蛋白富集部分。在免疫響應期間，分泌或產生一些可以結合至微生物或固定微生物的蛋白。結合至微生物時，無論是特異性(例如，抗體)還是非特異性(例如，補體級聯(complement cascade)的組分)地，此類免疫蛋白形成「免疫複合物」，其被用於本文所述的測定法和方法中以促進對引起免疫響應的微生物進行檢測和/或識別。
[0085]本文所使用的「免疫複合物」是指免疫蛋白(如抗體或補體分子)與可溶性抗原(如微生物)相結合的整體。此類包含結合的微生物的免疫複合物可使用本文所述的測定法和方法來進行識別和/或沉澱。在本文所述的方面的一些實施方式中，免疫蛋白為適應性免疫系統的蛋白(例如，免疫球蛋白)。在本文所述的方法的其它實施方式中，免疫蛋白為先天性免疫系統的免疫蛋白(例如，補體組分)。
[0086]補體系統
[0087]在本文所述的方面的一些實施方式中，補體可以為使用本文所述的測定法和方法來檢測或靶向的免疫蛋白或免疫蛋白富集部分的組分。補體系統是指輔助抗體(例如，免疫球蛋白)和免疫系統細胞來從生物體中清除病原體的生化級聯繫統。這是在傳統上稱為先天性免疫系統的免疫系統的一部分，不具有適應性(即，在個體的一生中不發生變化)。然而，它可以對適應性免疫系統組分進行招募和活化，並且可以通過適應性免疫系統組分進行招募和活化。
[0088]補體系統包括血液中的小型蛋白，所述蛋白由數種觸發物(trigger)之一刺激，並誘導系統中的蛋白酶切割特定蛋白以釋放細胞因子，並起始進一步分裂的放大級聯反應。這一活化級聯反應的最終結果為細胞殺傷性膜攻擊複合物(membrane attack complex)的響應和激活得以放大。超過25種蛋白和蛋白片段組成了補體系統，包括血清蛋白、漿膜蛋白(serosal protein)和細胞膜受體。補體系統通常被分為經典補體途徑、替代補體途徑、以及甘露糖結合凝集 素途徑。任何可以結合或移除微生物(如細菌、真菌或病毒)的補體系統的蛋白均可用於使用本文所述的測定法和方法製備供使用的免疫蛋白富集部分。
[0089]經典補體途徑的組分包括C1-複合物(由1分子的Clq、2分子的Clr和2分子的Cls組成，從而形成Clqr2s2),其在Clq結合至與抗原複合的IgG或IgM時形成、或在Clq直接結合至病原體表面時形成；C4及其片段(C4a和C4b) ;C2及其片段(C2a和C2b);經典途徑C3轉化酶，包含C4b和C2a ；C3及其片段(C3a和C3b);C5轉化酶(包含C4b、C2a和C3b);C5及其片段(C5a和C5b) ；C6 ；C7 ；C8 ；C9 ;以及膜攻擊複合物(包含C5b、C6、C7、C8和C9)。C3b也可以結合至病原體表面。因此，在本文所述的測定法和方法的一些實施方式中，免疫蛋白為C1-複合物，Clq, C3b,或包含C5b、C6、C7、C8和C9的膜攻擊複合物。
[0090]替代補體途徑的組分包括C3及其片段(C3a和C3b)，所述片段由C3自發水解直接觸發而形成，原因為通過縮合反應導致的硫酯鍵斷裂；B因子；C3bB複合物，由B因子與結合至細胞膜的C3b相結合而形成；D因子；片段Ba和Bb，由B因子通過D因子切割形成；C3bBb或替代途徑C3轉化酶；C3bBb3b，其將C5裂解為C5a和C5b ；C5及其片段(C5a和C5b )；C6 ；C7 ；C8 ;C9 ;以及膜攻擊複合物(包含C5b、C6、C7、C8和C9)。IgA與替代途徑的活化相聯繫。在本文所述的測定法和方法的一些實施方式中，免疫蛋白為C3b，C3bB複合物，或包含C5b、C6、C7、C8和C9的膜攻擊複合物。
[0091]甘露糖結合凝集素途徑包括甘露糖結合凝集素(MBL)，這是與MASP-1(甘露聚糖結合凝集素相關的絲氨酸蛋白酶)和MASP-1I (兩種蛋白酶酶原)形成複合物的具有2-6個頭部的分子。MBL包含識別碳水化合物的頭部，其結合至特定排列於病原體磷脂雙分子層上的甘露糖殘基，如微生物的碳水化合物或糖蛋白組分上的甘露糖殘基，所述微生物包括細菌，如沙門氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)和奈瑟氏球菌(Neisseria)菌株；真菌病原體，如白色念珠菌(Candida albicans)和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)；以及病毒，如HIV-1和呼吸道合胞病毒(RSV)。由MBL對病原體上的碳水化合物進行識別使得MASP-1和MASP-1I活化，從而將補體組分C4和C2切割為C4a、C4b、C2a和C2b。在本文所述的測定法和方法的一些實施方式中，免疫蛋白為甘露糖結合凝集素(MBL)。
[0092]免瘡球蛋白
[0093]在本文所述的方面的一些實施方式中，免疫球蛋白可以是使用本文所述的測定法和方法來檢測或靶向的免疫蛋白或免疫蛋白富集部分的組分。從本質上講，任何本領域技術人員已知的免疫球蛋白均可用於製備免疫球蛋白富集部分(即，免疫蛋白富集部分)。 [0094]免疫球蛋白為具有抗體分子特徵性的免疫球蛋白摺疊的多肽家族，通常包含兩個β摺疊和保守的二硫鍵。免疫球蛋白超家族的成員參與細胞性和非細胞性的體內相互作用的許多方面，包括在免疫系統中的廣泛角色(例如，抗體、Τ細胞受體分子等)、參與細胞粘附(例如ICAM分子)、以及細胞內的信號轉導(例如，受體分子，如TOGF受體)。
[0095]在一些實施方式中，用作本文所述的測定法和方法中的免疫蛋白的免疫球蛋白為抗體分子。在一些此類實施方式中，所述免疫球蛋白為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些此類實施方式中，免疫球蛋白為IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在一些此類實施方式中，免疫球蛋白為IgAl或IgA2。
[0096]所有的抗體免疫球蛋白的基本結構基於由兩條輕多肽鏈和兩條重多肽鏈組成的單元。每條輕鏈包含稱為輕鏈可變區和輕鏈恆定區的兩個區域。同樣，免疫球蛋白重鏈包含稱為重鏈可變區和重鏈恆定區的兩個區域。
[0097]重鏈或輕鏈的恆定區由稱為重鏈或輕鏈恆定區基因(CM)區段(segment)的基因組序列進行編碼。特定重鏈基因區段的使用限定了免疫球蛋白的類型。例如，在人類中，μ恆定區基因區段限定了 IgM類抗體；而Yl、Y2、口或Y 4恆定區基因區段的使用則限定了 IgG類抗體，以及由IgGl至IgG4的IgG亞類。同樣，α 1或α 2恆定區基因區段的使用限定了 IgA類抗體，以及IgAl和IgA2亞類。δ和ε恆定區基因區段則分別限定了 IgD和IgE類抗體。
[0098]免疫球蛋白的重鏈可變區和輕鏈可變區中一起含有抗體的抗原結合域。可變區要求抗體具有允許與範圍廣泛的抗原相結合的多樣性。結合至循環的抗原的抗體可形成免疫複合物，這可使用本文所述的測定法和方法進行富集。
[0099]其它免疫蛋白
[0100]也可考慮將其它在響應微生物(如細菌、病毒或真菌)時誘發並可與微生物結合、並可用於形成免疫蛋白富集部分的免疫蛋白用於本文所述的方法和測定法中。此類免疫蛋白應當能夠與微生物相結合，從而形成如本文所述的術語的免疫複合物，其可包括但不僅限於:c-反應蛋白(CRP)，存在於血液中，並且可與在死亡或瀕臨死亡的細胞和某些類型的細菌表面上表達的磷酸膽鹼相結合；血清澱粉樣蛋白P (SAP);膠原凝集素(collectin),包括表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白D(SP-D)、肝膠原凝集素1 (CL-L1)、胎盤膠原凝集素1 (CL-P1)、共凝集素(conglutinin)、43kDa的膠原凝集素(CL-43)和46kDa的膠原凝集素(CL-46 )，其包含C-型凝集素域(也稱為碳水化合物識別域(CRD ))，並被用於選擇性結合至微生物的特定碳水化合物複合物；肽聚糖(peptidoglycan)識別蛋白(PGR) ;LRR、XA21D ；防禦素(例如，防禦素α 1、中性粒細胞防禦素1、防禦素αΙΒ、防禦素α 3、中性粒細胞防禦素3、防禦素α 4、防禦素5、防禦素6、0_防禦素1、β _防禦素2、β -防禦素103、β-防禦素107、β-防禦素110、β-防禦素136);脂多糖結合蛋白(LBP);N0D蛋白，其通過C-末端富含亮氨酸的區域與微生物相互作用(N0D1，其識別含有胞壁醯二肽NAG-NAM- y -D-穀氨醯基-內消旋-二氨基庚二酸的肽聚糖，其為常見的革蘭氏陰性菌以及少數革蘭氏陽性菌中肽聚糖單體的部分；以及N0D-2，其識別含有胞壁醯二肽NAG-NAM-L-丙氨醯基-異穀氨醯胺的肽聚糖，其存在於幾乎所有細菌中)；NALPS (NALP1、NALP2、NALP3、NALP4、NALP5、NALP6、NALP7、NALP8、NALP9、NALP10、NALP11、NALP12、NALP13 和 NALP14)、IPAF、以及 NAIP5/Bircle。
[0101]在本文所述的方面的一些實施方式中，由響應微生物(如細菌、病毒或真菌)而誘發、可與微生物相結合從而形成免疫複合物、並可用於形成免疫蛋白富集部分的免疫蛋白屬於稱為「模式識別受體」或PRR的分子組。
[0102]模式識別受體或PRR是指可以特異性結合至微生物分子的保守部分(由相關微生物所共有，對於這些生物體的生存必不可少)的多種受體分子，且並未發現與非微生物細胞(如哺乳動物細胞)有關聯。這些獨特的微生物分子在本文中稱為「病原體相關的分子模式(PAMP)」或「微生物相關的分子模式(MAMP)」。可以由PRR識別的微生物相關的分子模式的實例包括但不僅限於:革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜的脂多糖(LPS);細菌的脂蛋白和脂肽；革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中的孔蛋白(porin);革蘭氏陽性細菌細胞壁中大量存在、革蘭氏陰性細菌細胞壁中存在程度較低的肽聚糖；革蘭氏陽性細菌細胞壁中發現的脂磷壁酸；抗酸(acid-fast)細胞壁 中發現的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan);富含甘露糖的聚糖(glycan)(甘露糖或果糖作為末端糖的短糖鏈)，在微生物的糖蛋白和糖脂中常見，但在人類的糖蛋白和糖脂中罕見；在細菌鞭毛中發現的鞭毛蛋白；細菌和病毒核酸，因為細菌和病毒的基因組中含有高頻率的非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸或CpG序列(缺少甲基或CH3基團並與鳥嘌呤相鄰的胞嘧啶)，而哺乳動物DNA的CpG序列頻率較低且大部分被甲基化(可以掩蔽模式識別受體的識別)，並且人類的DNA和RNA通常不會進入細胞內體(endosome)(微生物的DNA和RNA的模式識別受體位於其中)；N_甲醯甲硫氨酸，細菌蛋白中的常見胺基酸；雙鏈病毒RNA，為許多病毒在其複製的一些階段所特有；來自具有RNA基因組的多種病毒的單鏈病毒RNA ;酵母細胞壁中的脂磷壁酸、糖脂和酵母多糖；以及磷酸膽鹼和微生物膜中的其它常見脂質。
[0103]可以用作免疫蛋白或用於形成免疫蛋白富集部分而在本文所述的方法和測定法中使用的PRR的實例包括但不僅限於:甘露糖受體，其結合至富含甘露糖的聚糖(甘露糖或果糖作為末端糖的短糖鏈，在微生物的糖蛋白和糖脂中常見，但在人類的糖蛋白和糖脂中罕見)；清道夫受體(scavenger receptor),其可以結合至細菌細胞壁組分(如LPS、肽聚糖和磷壁酸)，並且包括例如⑶36、⑶68和SRB-1 ;調理素受體，如在血漿中循環的急性期蛋白(acute phase protein),如甘露糖結合凝集素和C_反應蛋白(CRP)(結合至細菌膜中的磷酸膽鹼和真菌膜中的磷脂醯乙醇胺)、在肺部的肺泡內發現的表面活性蛋白，如SP-A和SP-D ；N-甲醯蛋氨酸受體，如FPR和FPRL1 ;CD14，其促進TLR-4響應LPS的能力；含CARD(半胱天冬酶活化和招募結構域)的蛋白，如RIG-1 (視黃酸誘導基因-1)和MDA-5 (黑色素瘤分化相關基因-5)，其為細胞質的傳感器，識別在病毒感染的細胞中產生的病毒雙鏈和單鏈RNA分子，並觸發稱為幹擾素的細胞因子(阻斷在感染的宿主細胞內的病毒複製)的合成；以及Toll樣受體或TLR家族的成員，其直接或間接地與不同微生物分子相結合。
[0104]TLR家族的不同成員對於不同的MAMP具有結合特異性，如TLR-2識別肽聚糖、細菌脂蛋白、脂磷壁酸(LTA)和孔蛋白；TLR-4識別革蘭氏陰性細菌細胞壁的脂多糖(LPS)、真菌甘露聚糖、病毒包膜蛋白、寄生磷脂和熱休克蛋白；TLR-5識別細菌鞭毛；TLR-l/TLR-2對與寄生蟲中的糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定蛋白和細菌脂肽特異性結合；TLR-2/TLR-6對與革蘭氏陽性細菌細胞壁的脂磷壁酸(LTA)、細菌脂肽和肽聚糖結合；TLR-3，與雙鏈病毒RNA結合；TLR-7，與單鏈病毒RNA (如愛滋病中)(富含鳥嘌呤/尿嘧啶核苷酸對)結合；TLR-8，與單鏈病毒RNA結合；TLR-9，與在細菌和病毒基因組中發現的未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸序列(CpG DNA)結合。
[0105]患者和患者樣品
[0106]若生物樣品包含免疫蛋白，如補體蛋白、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、或病原體識別受體(PRR)，則來自患者的生物樣品可以使用本文所述的測定法和方法從待分析個體的任何器官或組織中獲得。在一些實施方式中，此類樣品可以進一步處理，以對樣品中期望的免疫蛋白進行富集，從而產生如本文所使用的術語「免疫蛋白富集樣品」。在其它實施方式中，可在製備免疫蛋白富集部分之前對生物樣品進行進一步分離或純化。例如，可以通過例如以抗凝血劑(如肝素)處理全血樣品、離心樣品直至細胞沉澱以允許從上層水層中去除血漿，從而從全血樣品中分離血漿和血清。可以從生物樣品或根據如上文所述或本領域技術人員已知的方式處理過的樣品中檢測蛋白和核酸。
[0107]用於本文所述的 方法和測定法的生物樣品的一些非限制性實例包括血液樣品、尿樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊液樣品、血漿樣品、血清樣品、膿液(pus )樣品、羊水樣品、體液樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、活檢樣品、拭子(swab )樣品、口腔漱洗樣品、組織樣品、皮膚分泌物樣品，或此類樣品的組合。對於本文所述的方法，生物樣品優選來自全血、血漿、腸灌洗樣品、腦脊液、關節液、血清、和/或呼吸道樣品，如呼吸道分泌物(如痰)或呼吸道灌洗液(如支氣管肺泡灌洗液)。術語「生物樣品」包括由初始樣品衍生的樣品，例如，在進一步處理後用於本文所述的測定法和方法的生物樣品。此類衍生樣品例如可包括由樣品提取的核酸或蛋白；或經由將所述樣品進行如核酸擴增或mRNA逆轉錄，或對特定核酸、蛋白、其它細胞質組分或核組分進行分離和/或純化等技術而獲得的核酸或蛋白。
[0108]術語「患者」、「受試者」和「個體」在本文中可互換使用，是指動物，特別是人，對於所述受試者，期望對由其獲得的生物樣品中免疫系統刺激性微生物的存在進行分析。在一些實施方式中，受試者需要對疾病或失調進行診斷，例如對炎症性腸病、感染性疾病或自身免疫性失調進行診斷，其中，使用本文所述的方法和測定法對生物樣品進行分析。
[0109]製備免疫蛋白g集部分
[0110]用於本文所述的方法的免疫蛋白富集部分通常通過免疫沉澱來製備，免疫沉澱是指使用特異性結合至特定蛋白抗原的抗體，將蛋白抗原或蛋白複合物(例如，與微生物結合的免疫蛋白(如IgG)、PRR、或補體)由溶液中沉澱出來的技術。對免疫蛋白進行免疫沉澱的方法在本領域是公知的和/或在例如美國專利N0.4，618，589中有所描述(以引用的方式將其整體併入本文)。本文中提供了關於免疫沉澱方法的注意事項的一般概述，並且，如本文所證實的，本領域技術人員可以容易地改進這些注意事項來為用於檢測結合的微生物的期望的免疫蛋白進行免疫沉澱方案的優化。
[0111]免疫沉澱是一種基於親和性的分子「下拉」方法，該方法允許本領域技術人員使用任何親和結合劑(所述親和結合劑例如直接綴合至聚合物載體，對一個或多個特定生物分子靶標具有特異性親和性)對複合物進行純化。免疫沉澱的基本過程包括三個階段。第一階段涉及製備抗原溶液或裂解物。第二階段涉及預清除抗原溶液或裂解物的非特異性背景結合；第三階段涉及免疫複合物的形成和純化。純化後，可以採用許多方法中的任一種來對通過免疫沉澱過程「下拉」的抗原和材料進行分析。可用於基於親和性的分子下拉與免疫沉澱技術的多種程序在Harlow，E.和Lane，D.(編輯)，「抗體:實驗室手冊」，第7章，ColdSpring Harbor Press，紐約(1988)中有詳細描述，以引用的方式將其內容整體併入本文。
[0112]在本文所述的方法的各個方面和實施方式中，免疫沉澱可使用由患者獲得的待用作用於進行免疫沉澱的溶液的任何生物樣品進行。在本文中還涵蓋了如下情況:在一些實施方式中，通過將包含細胞或組織的患者樣品與溫和的清潔劑接觸而由該樣品製備裂解物。溫和的清潔劑在除去膜、幹擾多種弱分子間相互作用及從細胞中釋放大多數抗原這些方面有效，並且不破壞感興趣的抗原(如結合至微生物的免疫蛋白)的構象或生化活性。通過以不與感興趣的抗原(例如本文所述的免疫蛋白)結合的抗體對抗原溶液進行預處理而使非特異性結合的蛋白的幹擾最小化，以除去非特異性結合的蛋白。
[0113]用於使用本文所述的方法對微生物進行分析和測定的完整蛋白複合物(如患者樣品中存在的免疫複合物)的免疫沉澱通過選擇親和結合劑(如抗體或其片段)起作用，其靶向已知的蛋白(例如免疫蛋白，如補體蛋白、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、或病原體識別受體(PRR))，該已知蛋白被認為是複合物的組件(member )。通過使用抗體或其片段祀向這一已知組件，使得如下成 為可能:將整個蛋白複合物從溶液中拉出，從而識別和/或檢測該免疫複合物中的未知組分(如結合至免疫蛋白的微生物)。在本文所述的方法中使用的免疫複合物的免疫沉澱可以通過向裂解物或患者樣品中加入親和結合劑(如，在一些實施方式中為抗體或其片段，所述抗體或其片段對所富集的免疫蛋白具有特異性)而實現。抗體對於其各自的抗原具有高親和力，因此迅速形成抗體-抗原複合物。在本文所述的方法的一些實施方式中，用於對免疫複合物進行免疫沉澱的親和結合劑例如可包括對於一類或一組目標免疫蛋白(例如，全部人類IgG分子，無論任何亞類)具有特異性的蛋白或分子；或對於具有共同的結構域的一組免疫蛋白具有特異性的蛋白或分子。
[0114]因此，本文所述的免疫沉澱步驟可用於產生在本文所述的測定法和方法中所使用的免疫蛋白富集部分。「免疫蛋白富集部分」是指部分純化(例如，通過免疫沉澱)的樣品，所述部分純化使得期望的或目標免疫蛋白(例如，免疫球蛋白、補體、PRR、或先天性或適應性免疫相應的其它可溶性/循環組分)在樣品中的水平與衍生所述樣品的初始患者樣品相比提高至少10%。在一些實施方式中，與衍生所述樣品的患者樣品相比，富集部分中的免疫蛋白水平提高至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍以上。由此產生的免疫蛋白富集部分隨後用於本文所述的測定法和方法中，從而對任何結合至目標免疫蛋白的微生物進行識別。[0115]任何對於目標免疫蛋白具有親和性和特異性的親和結合劑均可以用於本文所述的免疫沉澱方法。「親和結合劑」為對於目標免疫蛋白、免疫蛋白類、或免疫蛋白家族具有高親和性和特異性的試劑(如蛋白(例如抗體或其片段))，其可用於製備在本文所述的測定法和方法中使用的免疫蛋白富集部分。對用於製備免疫蛋白富集部分的親和結合劑的選擇涉及本領域普通技術人員已知的注意事項，如具有期望特異性和親和性的親和結合劑的可利用性、由所述親和結合劑靶向的不同免疫蛋白的數量和/或類型、具有同等特異性和/或親和性的不同親和結合劑的相對成本等。
[0116]相應地，在本文所述的方法的一些實施方式中，使用抗體或其片段作為親和結合劑製備免疫蛋白富集部分。適於製備免疫蛋白富集部分並進行如本文所述的MilP-Seq方法和測定法的免疫沉澱步驟的抗體優選為單克隆特異性抗體，可包括但不僅限於:小鼠、大鼠、兔、驢、山羊、人或嵌合抗體(chimeric antibody),並且可以包括單鏈抗體、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表達文庫產生的片段、和/或任何上述抗體的抗原結合片段。如本領域技術人員所知的，用於本文所述的方法的抗體及其抗原結合片段的優點包括針對任何期望的免疫蛋白、免疫蛋白類、或免疫蛋白家族而產生所述抗體及其抗原結合片段的能力。
[0117]術語「單克隆抗體」是指由大體上均質的抗體群中獲得的抗體，即，除了可能少量存在的可能的自然發生的突變以外，抗體群中所包含的各個抗體均是相同的。單克隆抗體針對單一抗原(如免疫蛋白)具有高度特異性。此外，與通常包括針對抗原的不同決定簇(表位)(例如，免疫蛋白(如IgG分子或PRR)上的多個位點)的不同抗體的多克隆抗體製劑不同，每一單克隆抗體均針對抗原上的單個決定簇。修飾語「單克隆」不應解釋為要求由任何特定方法進行抗體生產。例如，根據本發明所使用的單克隆抗體可以通過Kohler等，Nature256:495 (1975)首先描述的雜交瘤方法製備，或者可以通過重組DNA法(參見，例如，美國專利N0.4，816，567)製備。「單克隆抗體」也可以通過使用例如Clackson等，Nature352:624-628 (1991)或 Marks 等，J.Mol.Biol.222:581-597 (1991)中所描述的技術由噬菌體抗體文庫中分離。存在許多用於獲取對在本文所述的免疫沉澱步驟中使用的免疫蛋白具有特異性的單克隆抗體或其片段的商業來源，所述商業來源包括但不僅限於:BDBiosciences、eBioscienc es、RnD Systems、Invitrogen、BioLegend、Abeam 等。
[0118]在一些實施方式中，用於本文所述的方法的免疫沉澱步驟的抗體可以是雙特異性抗體或多特異性抗體。此類抗體例如在期望具有針對免疫蛋白富集部分中的兩種以上免疫蛋白的特異性的情況下是有用的。在一些此類實施方式中，可以使用具有IgG樣結構的雙特異性抗體，其中，一個抗原結合區(由VH和VL結構域組成)特異性結合至一種免疫蛋白；另一個抗原結合區(也由VH和VL結構域組成)特異性結合至另一種免疫蛋白。在一些實施方式中，每一可變區(2個VH區和2個VL區)被替換為dAb或單個可變結構域。包含於IgG樣結構中的dAb或單個可變結構域可具有相同特異性或不同特異性。在一些實施方式中，IgG樣結構是四價的，並可具有兩種、三種或四種特異性。IgG樣結構的抗原結合片段(例如，Fab、F(ab' )2、Fab'、Fv、scFv)可通過本領域技術人員已知的方法製備。在其它實施方式中，雙特異性抗體包括交聯抗體或「雜綴合物(heteroconjugate)」抗體。例如，雜綴合物中的抗體之一可結合至親和素(avidin)、另一抗體則結合至生物素。此類抗體例如已被提出用於使免疫系統細胞靶向不需要的細胞(美國專利號4676980);以及用於治療HIV感染(W0 91/00360.W0 92/200373、以及EP 03089)。雜綴合物抗體可以使用任何方便的交聯方法製得。合適的交聯劑在本領域中是公知的，並在美國專利N0.4，676，980中和許多交聯技術一同公開。
[0119]在一些實施方式中，用於在本文所述的方法的免疫沉澱步驟中使用的抗體可包括「抗體片段(antibody fragment)」 或「其抗體片段(antibody fragment thereof)」。本文所使用的術語「抗體片段」或「其抗體片段」是指僅包含完整抗體的一部分的蛋白片段，通常包含完整抗體的抗原結合位點，並因此保留結合抗原(如免疫蛋白)的能力。所涵蓋的用於本文所述的方法的抗體片段的實例包括:(i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1結構域；(ii)Fab/片段，為在CH1結構域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1結構域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1結構域並在CH1結構域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fd』片段；(v)具有抗體單臂上的VL和VH結構域的Fv片段；(vi )由 VH 結構域組成的 dAb 片段(Ward 等，Nature341, 544-546 (1989))； (vii )分離的 CDR區；(viii)F(ab' ) 2片段，為包含兩個Fab'片段(這兩個片段在鉸鏈區由二硫橋連接)的二價片段;(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈 Fv ；scFv) (Bird 等,Science242:423-426 (1988)和Huston等，PNAS (USA)85:5879-5883 (1988)); (x)具有兩個抗原結合位點的「雙抗體」，其包含在同一多肽鏈上連接至輕鏈可變結構域(VL)的重鏈可變結構域(VH)(參見，例如，EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;以及 Hollinger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448(1993)) ;(xi)包含一對串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)的「線性抗體」，其與互補的輕鏈多肽形成一對抗原結合區(Zapata等，Protein Eng.8 (10):1057-1062 (1995)和美國專利N0.5，641，870)。 [0120]在本文所述的方法的一些實施方式中，免疫富集部分使用不是抗體或抗原結合片段的蛋白分子作為親和結合劑而製備，所述蛋白分子例如為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L
坐寸。
[0121]蛋白A是40_60kDa的MSCRAMM表面蛋白，最初發現於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細胞壁中。蛋白A包含5個同源Ig結合域，摺疊成一個三螺旋束，其中每一個都能夠結合來自許多不同的哺乳動物的蛋白，尤其是IgG。蛋白A在多數免疫球蛋白的Fc區域內與重鏈結合，並且在人VH3抗體家族的情況下還在Fab區域內與重鏈結合。蛋白A以高親和性與人IgGl、IgG2和IgG4以及小鼠IgG2a和IgG2b結合。蛋白A以中等親和性至高親和性與人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgGl結合。蛋白A與人IgG3或I⑶不起反應，也不與小鼠IgM、IgA或IgE起反應。因此，在本文所述的方法的一些實施方式中，當本文所述的方法中的目標免疫蛋白為人IgGl、人IgG2、人IgG3或它們的任意組合時，使用蛋白A作為親和結合劑。在本文所述的方法的一些實施方式中，當本文所述的方法中的目標免疫蛋白為人IgA、人IgM、人IgE或它們的任意組合時，使用蛋白A作為親和結合劑。在本文所述的方法的一些實施方式中，當本文所述的方法中的目標免疫蛋白為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgA、人IgM、人IgE或它們的任意組合時，使用蛋白A作為親和結合劑。
[0122]蛋白G為在C族和G族鏈球菌中表達的免疫球蛋白結合蛋白，與蛋白A很相似，但具有不同的特異性。蛋白G為65-kDa (G148蛋白G)和58kDa (C40蛋白G)的細胞表面蛋白。天然分子還結合白蛋白，然而，由於血清白蛋白是抗體源的主要汙染物，因此白蛋白結合位點已從重組型蛋白G中移除。蛋白G以高親和性與所有人類IgG亞類結合，即，人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4，但不與人IgG、IgM、IgA、IgD和IgE結合。因此，在本文所述的方法的一些實施方式中，當本文所述的方法中的目標免疫蛋白為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4或它們的任意組合時，使用蛋白G作為親和結合劑。
[0123]蛋白Α/G是聯合了蛋白A和蛋白G兩者的IgG結合域的重組融合蛋白。蛋白A/G包含4個來自蛋白A的Fc結合域和2個來自蛋白G的Fc結合域。與蛋白A相比，蛋白A/G的結合比較不依賴於pH值，但除此以外具有蛋白A和蛋白G的額外特性。蛋白Α/G與人IgG的所有亞類(即，人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4)以及IgA、IgE、IgM和IgD (與IgD的程度較低)結合。相應地，在本文所述的方法的一些實施方式中，當本文所述方法中的目標免疫蛋白為人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD或它們的任意組合時，使用蛋白A/G作為親和結合劑。
[0124]蛋白L最早由大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)細菌的表面分離，並發現其通過L鏈相互作用與免疫球蛋白結合。蛋白L不包含任何鏈間二硫環，也並非由二硫鍵連接的亞基組成。與結合至免疫球蛋白Fc區域的蛋白A和蛋白G不同，蛋白L通過輕鏈kappa相互作用與抗體結合。由於在結合相互作用中不涉及重鏈的任何部分，因此蛋白L結合的抗體類比蛋白A或蛋白G範圍更廣。蛋白L與典型的全部抗體類結合，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。單鏈可變片段(scFv)和Fab片段也與蛋白L結合。蛋白L結合限於包含kappa輕鏈的抗體,並且在此類抗體中僅與kappa輕鏈的特定亞型結合。例如，蛋白L與人Vk 1.Vk III和Vk IV亞型結合，但不與Vk II亞型結合。因此，在本文所述的方法的一些實施方式中，當目標免疫蛋白為包含人Vk 1.Vk III和Vk IV亞型輕鏈的任何人Ig分子(IgG、IgM、IgA、IgE和IgD)時，使用蛋白L作為親和結合劑。
[0125]在本文所述的方法的一些實施方式中，對目標免疫蛋白具有特異性的親和結合劑(例如，蛋白G、蛋白A、對特定蛋白或蛋白類/家族/族具有特異性的抗體或其片段)被固定於固相基底(例如超順磁微珠或微尺度瓊脂糖珠或瓊脂糖樹脂珠(非磁性))上。隨後可通過以下方法對免疫蛋白複合物進行純化:將親和性珠懸浮液(如蛋白A或蛋白G珠懸浮液)或預包覆有對免疫蛋白具有特異性的抗體或其片段的珠(如抗-1gG、抗-1gA、或抗補體組分的預包覆珠，例如MACS順磁珠(Miltenyi Biotec.))加入含有抗體-抗原複合物的溶液中。例如，當免疫蛋白富集部分包含IgG或IgA作為欲沉澱的免疫蛋白、並且使用蛋白A或蛋白G作為親和結合劑時，由於蛋白A和蛋白G對於抗體的Fc部分具有高親和性，因此發生純化。
[0126]在其它實施方式中，將親和結合劑(如蛋白G、蛋白A、對特定蛋白或蛋白類/家族/族具有特異性的抗體或其片段)直接加入包含待富集的免疫蛋白(如免疫球蛋白、PRR、補體蛋白)的樣品中。在此類實施方式中，親和結合劑未附著至固相載體，因此，例如，親和結合劑自由浮動於包含待富集的免疫蛋白的樣品周圍，並與它們的目標結合。隨後，將包覆有第二親和結合劑(如對第一親和結合劑具有特異性的蛋白Α/G)的珠添加至親和結合劑(例如抗體或其片段)與免疫蛋白複合物的混合物。目前與其免疫蛋白目標相結合的親合結合劑(例如抗體或其片段)隨後可由第二親和結合劑與珠結合。
[0127]在目標免疫複合物通過例如免疫蛋白Α/G-抗體相互作用而結合至珠之後，通過離心收集珠，並通過洗滌珠除去未結合的蛋白。可以通過如下方式對珠進行清洗:使用如裂解緩衝液的溶液衝洗珠並通過抽吸除去裂解物和洗滌緩衝液。完全除去洗滌緩衝液對於降低背景和提高免疫測定法的有效性是很重要的。
[0128]適合用於實施本文所述的MilP-Seq方法的免疫沉澱步驟的珠或其它固相載體平臺可以是本領域技術人員已知的任何形式或材料。可以使用高多孔性瓊脂糖珠(也被稱為瓊脂糖樹脂或眾料(slurry)),由於瓊脂糖顆粒(大小50至150微米)的幾乎全部海綿狀結構均可用於親和性結合劑(如抗體或其片段)的附著，該珠具有非常高的潛在結合能力。
[0129]超順磁珠也可以用於本文所述的Milp-Seq測定法和方法的一些實施方式中。此類磁珠為固體，，取決於不同的珠類型，通常是球形的，並且，親和結合劑(如抗體或其片段、蛋白A、蛋白G等)的結合被限制於各珠的表面。磁珠明顯小於瓊脂糖珠(1至4μπι)，並且，雖然這些珠不具備增加結合能力的多孔中心這一優點，較高的每體積的磁珠數總體使得磁珠具有用於最佳結合的有效表面面積與體積的比值。可商購的磁珠可根據大小的均一程度分為單分散珠和多分散珠。單分散珠也稱為微珠，表現出精確的均一'I"生，因此，全部珠具有相同的物理特性(包括結合能力和對磁鐵的吸引水平)。多分散珠儘管與單分散珠大小相似，但顯示出寬範圍的大小可變性(1至4μπΟ，其可以影響所述多分散珠的結合能力和磁場捕獲。雖然可用於本文所述的測定法和方法的免疫沉澱步驟的這兩種類型的珠均是可商購的，然而質量更高的單分散超順磁珠憑藉其一致的尺寸、形狀和性能而更加適合用於自動化方案。單分散性超順磁珠和多分散性超順磁珠由許多公司提供，包括但不僅限於Invitrogen、Thermo Scientific 以及 Millipore。
[0130]在免疫複合物的形成和純化完成後，可立即對產生的免疫沉澱的蛋白或免疫蛋白複合物進行進一步分析，或將其存儲以用於後續分析。通常，在傳統免疫沉澱方法中，下一步驟為通過SDS-PAGE分離蛋白。然而，在本文所述的MilP-Seq方法中，接下來通過如下方式對免疫沉澱的免疫複合物在核酸水平上進行分析:裂解免疫沉澱的免疫複合物的微生物組分或細胞，從裂解的微生物 組分中提取核酸，並對提取的核酸進行測序。
[0131]對微生物核酸進行提取
[0132]從樣品(如來自如本文所述的免疫沉澱的免疫複合物的微生物組分的裂解提取物)中提取核酸的方法是本領域中的常規方法，其包括例如如下方法:苯酚-氯仿沉澱、基於離心柱(spin column)的核酸純化、乙醇沉澱和柱純化。這些方法是本領域中公知的，並且，用於核酸純化的試劑盒可容易地由商業來源(如QIAGEN?、Mo-Biol?以及
SIGMA-ALDRICH*)獲得。
[0133]對提取的核酸進行測序
[0134]由免疫蛋白富集部分中提取的核酸可通過本領域中已知的任何方法(包括例如，鳥槍法克隆和下一代測序法)進行測序。
[0135]在本文所述的方法和測定法的一些實施方式中，對提取的核酸的測序通過Sanger測序方法或其變體進行。這一過程涉及製備樣品(通常為PCR產物的擴增產物或擴增子)。在本文所述的方法和測定法的一些實施方式中，從免疫蛋白富集部分中提取的核酸在測序前不進行擴增。隨後對所提取的核酸樣品或其擴增子進行測序反應(即，ABI』 s BigDye終止子循環反應(terminator cycle reaction)),在該反應中，DNA聚合酶摻入2' ,3' -二脫氧-dNTP終止子，產生早期鏈終止DNA片段。採用電泳分析對反應混合物進行分析，測序結果示於色譜圖中。在自動測序儀中，一輪ABI的96通道毛細管電泳(CE)分析產生總數為96X700、或67k鹼基(kbp)的讀段(read)。在CE測序中，對每個序列製備測序樣品，並隨後加載於96孔板中。有文獻報導，微晶片上的CE允許更快和更簡單的結果，但操作模式基本上類似於自動化CE測序儀。
[0136]在本文所述的方法和測定法的一些實施方式中，對提取的核酸使用的測序方法為焦磷酸測序(pyrosequencing)。焦磷酸測序在多種出版物和專利(包括例如，美國專利N0.6，210, 891,7, 264，929和7，335，762)中已有所描述。在焦磷酸測序中，通過使用沉積於PTP孔中的1百萬或2百萬珠進行乳液PCR來製備模板。硫酸化酶(sulphurylase)和螢光素酶(luciferase)附著的較小的珠圍繞於模板珠周圍，並且個體磷酸脫氧核苷酸(dNTP)被依次分配於各個孔中。當與模板互補的dNTP摻入增長鏈時，焦磷酸鹽(ppi)被釋放，並轉化為ATP。ATP將螢光素氧化為氧化螢光素並釋放出光。檢測器檢測釋放的光並將該事件與摻入的dNTP建立聯繫。這一技術提供了約400個鹼基的讀段，並可檢測約6個鹼基的均聚物鏈。[0137]在本文所述的方法和測定法的一些實施方式中，使用連接反應(ligation)對提取的核酸進行測序。通過連接反應進行的測序已在多種出版物和專利中有所描述，包括美國專利N0.5,912, 148和6，130,073。在「通過連接反應進行的測序」中，約一百百萬個乳液PCR模板珠沉積在載玻片上，並將通用引物退火至模板上。將含有兩組探測鹼基(interrogation base)(每組探測鹼基具有與其相連的選定的染料)的探針加入模板，與目標序列互補的探針則與之退火。探針內的16種不同的二核苷酸以4種不同的染料進行編碼。根據四色成像，連接的二核苷酸探針被化學裂解，產生磷酸基團。雜交、連接、成像和裂解的循環總共重複七次，從而可識別正確的兩個鹼基序列。然後，從模板中移除通用引物，並使用η-l引物進行第二輪連接,所述連接使得探測鹼基之一連結至51末端(sets theinterrogation base one base to the51 end)。再進行七輪雜交、連接、成像和裂解，並再進行3輪的移除和連接，產生以色彩空間編碼的35數據位的字符串(string)。將這些字符串與參比基因組進行比對，從而解碼該DNA序列。
[0138]存在兩種採用可逆終止子來完成供本文所述的方法和測定法使用的DNA測序的技術。在第一種技術中，DNA片段的橋式擴增隨機分布在載玻片的8個通道上，高密度的正向和反向引物與這些片段共價連接。固相擴增由個體單鏈模板產生約8000萬個分子簇。引物退火至模板中各分子簇的游離末端。聚合酶延伸並隨後由四種可逆終止子組終止DNA合成，各終止子標記有不同染料。未摻入的可逆終止子被洗滌去除，並使用四色成像完成鹼基識別。通過化學裂解除去阻斷和染料基團，以使得可以進行另一循環。在使用可逆終止子的第二種技術中，數百萬的未擴增的ssDNA模板被製備為帶有聚(dA)尾，該聚(dA)尾與共價結合至載玻片上的聚(dT)引物雜交。對於一通測序(one pass sequencing),這一引物-模板複合物是足夠的；但對於雙通測序(two pass sequencing),模板鏈被拷貝，原始模板被移除並將引物朝向表面退火。與第一可逆終止子技術不同，可逆終止子均標記有相同的染料，並以預定的順序各自進行分配。摻入事件引發螢光信號。美國專利N0.7，169，560描述了利用這種可逆引物技術的方法。
[0139]在本文所述的方法和測定法的一些實施方式中，將如下測序用於所提取的核酸:利用標記有螢光共振能量轉移(FRET)的分子的DNA聚合酶，通過在cognate dNTP (其末端磷酸基團處標記有FRET分子)的摻入過程中產生的FRET信號進行的測序。標記的dNTP在與模板鏈具有正確互補性時摻入，而由於兩個FRET分子之間的相互作用的FRET標記了鹼基延伸事件，由此產生序列讀段。此方法的優點在於，實時記錄DNA聚合，併合成不作任何修飾的常規DNA，從而可記錄更長的DNA讀段(參見，例如，美國專利N0.7，329，492、美國專利 N0.7，361，466 ；Eid, J.等，(2009 年):323 (5910):133_8)。
[0140]為了提高速度和降低成本的這些目標，已經在包括通過雜交、通過合成(3』 -延伸)、通過連接、通過聚合酶克隆(polony)聚合、通過納米孔、通過染料標記的dNTP的聚合酶摻入、以及通過其它一些方法對DNA進行測序的方面有所進展。DNA測序技術的快速進步(例如454』 s高通量焦磷酸測序(454 Life Science) (Margulies等，(2005)Nature437, 376-380 ；Wheeler 等，(2008) Nature452，872-826 ；Ronaghi 等，(1996) AnalBiochem242,84-89 ；Ronaghi 等(1998) Science281，363-365);通過在表面上由單一克隆進行合成的 Illumina/Solexa 測序(Illumina) (Margulies 等，(2005) Nature437,376-380 ；Wheeler 等，(2008) Nature452,872-826) ；ABI 公司的 SOLiD 技術(「SupportedOligonucleotide Ligation and Detection，，, Applied Biosystems) (Cloonan 等，(2008)Nat Methods5,613-619);基因組學分析；和生物信息學技術)已經大大開闢研究人員獲得複雜生物系統的深入的分子圖片的機會。各種類型的高通量DNA測序已被開發，並已被用於解析(delineate)核酸序列。此類方法應用於測序儀中，所述測序儀例如包括454GenomeSequencer FLX 儀器(Roche Applied Science)、Illumina (Solexa) GenomeAnalyzer>Applied Biosystems 的 ABI SOLiD 系統、Helicos 單分子測序裝置(HeliScope)、以及1n Torrent Systems Inc.的1n半導體測序。另見，例如，美國專利申請公開N0.20110111401和N0.20110098193。可以理解的是，隨著測序技術的發展，對通過本文所述的方法提取的核酸所進行的分析可使用本領域技術人員認為適當的任何新測序方法進行。
[0141]鳥槍法克隆
[0142]在本文所述的方法和測定法的一些實施方式中，使用鳥槍法對提取的核酸進行測序。在鳥槍法測序中，DNA被隨機破壞為許多小區段，並使用鏈終止法對所述小區段進行測序以獲得「讀段」。通過進行數輪這一片段化和測序過程來獲得目標DNA的多個重疊讀段。電腦程式隨後使用不同讀段的重疊末端以將其彙編為連續序列。
[0143]通常情況下，將長度往往超過100，000個鹼基(1001*)的大分子DNA進行片段化和縮減(reduced),從而成為許多約l_4kb的亞克隆的文庫，以用於擴增(propagation)和序列分析。多數大規模DNA測序策略依賴於多步過程，使目標分子隨機片段化為這些更小的碎片，然後在反應中將這些碎片酶連(連接)至克隆載體，所述反應將一個或多個DNA片段插入各載體分子的單個位點(Fitzgerald等,Nucleic Acids Res.14:3753 (1992))。將這一連接混合物引入到大腸桿菌(E.coli)的特定菌株，其中，各細菌細胞對載體及載體上所攜帶的任何DNA片段進行擴增。將可能包含或不包含插入物的載體DNA從各細胞系中純化，並用作酶促測序反應的模板(Sanger等，Proc Natl Acad Sci USA74:5463 (1977);Prober 等，Science238:336 (1987) ;Tabor 和 Richarson, Proc Natl Acad Sci USA92:6339 (1995)，將這些文獻全部以引用的方式併入本文)。通過自動測序儀對反應產物進行分析，以確定亞克隆的DNA片段的線性序列(Smith等，Nature321:674 (1986)，以引用的方式併入本文)。使用計算機算法來對來自於亞克隆片段文庫的數據進行彙編，通常產生原始DNA分子80-95%的序列信息。使用「間隙填補(Gap filling)」技術確定目標DNA剩餘的5-20%ο
[0144]下一代測序
[0145]在本文所述的方法和測定法中，本文所考慮的用於對提取的核酸進行測序的另一種方法為「下一代測序」。這些技術產生較短的讀段(25-500bp)，但在相對較短的時間(如一天)內產生幾十萬或上百萬的讀段。由於這些技術的數據量高且進行全基因組測序所需時間相對較短，因而優於鳥槍法測序。主要缺點是精確度通常較低(雖然這一點由高覆蓋度而得以補償)。
[0146]下一代測序法通常採用並行化進行測序過程的高通量技術，一次產生數千或數百萬的序列。高通量測序技術的目的在於最大可能地降低使用標準染料終止子法的DNA測序的成本。下一代測序法和機器的一些非限制性實例包括但不僅限於:大規模平行標籤測序(MPSS)、454 焦憐酸測序、454GenomeSequencer FLX 儀(Roche Applied Science)、Illumina (Solexa)測序、SOLiD 測序、Applied Biosystems ABI SOLiD 系統、Helicos 單分子測序裝置(HeliScope)以及1n Torrent System Inc.的1n半導體測序。本領域技術人員可以將這些測序方法以及任何新測序方法應用於本文所述的測定法和方法中。
[0147]宏基因組
[0148]如本領域已知的，術語「宏基因組」定義了給定生境(habitat)(例如，患者樣品)的全部有機體的基因組的總體(參見例如，Handelsman等，(1998) Chemistry and Biology5:245-249)。特別是，術語「宏基因組」涉及來自微生物的基因組核酸，優選DNA，所述微生物包括可培養的微生物 和不可培養的微生物(即，不能通過標準方法分離、且不能在標準人工培養基中活性複製無限的時間周期的有機體)。特別地，宏基因組的提取部分中的任何特定的微生物基因組的表現度(representation)不被該微生物的可培養性影響或不依賴於該微生物的可培養性。因此，不可培養的微生物和可培養的微生物的核酸實質上在宏基因組的提取部分中均有所表現。
[0149]相應地，在本文所述的方法和測定法的一些實施方式中，宏基因組涉及由患者樣品中直接獲取(extrusion) DNA以及這些DNA在培養的宿主細胞(通常為細菌)中的表達和擴增。宏基因組被首先開發並用於識別新型細菌門(Pacel997)，其基於識別為其關注的系統發育標記物的基因(如16s rDNA基因)的特異性克隆。
[0150]宏基因組更近期的發展關注在未進行任何選擇和/或識別的情況下克隆的總體宏基因組，從而建立隨機「宏基因組DNA文庫」。這提供了，在不進行任何特定選擇的情況下獲取整個細菌多樣性的遺傳潛力的路徑。通過已被克隆的環境DNA片段，宏基因組DNA文庫由數十萬彼此不同的克隆組成。在這一方面，已對大DNA片段(超過30KB)進行克隆，從而(i)對需要分析的克隆數量進行限制；以及(ii)使得能夠恢復針對由多酶法合成的新型代謝產物的整個生物合成途徑。
[0151 ] 將序列與已知微生物的序列進行比較
[0152]在本文所述的測定法和方法的一些實施方式中，將使用任何上述方法或在本領域普通技術人員已知的方法所提取的核酸的序列與已知的微生物序列進行比較，所述已知的微生物序列例如為微生物基因序列的資料庫，如GenBank或GreenGenes (全球資訊網網址為greengenes.lbl.gov)(作為16S序列及其注釋的文庫)；並且，可使用搜索工具(如BLAST)在資料庫中查詢核酸序列同源性，從而對樣品序列進行識別。在一些此類實施方式中，資料庫包含來源於微生物群的宏基因組數據。
[0153]如果進行比較的序列的同源性低於20%，則確定所提取並測序的核酸來自先前未特徵化的微生物；而如果進行比較的序列的同源性高於20%，則確定所述同源性高於20%的微生物來自於相同的微生物家族。
[0154]疾病和失調
[0155]在一些方面和實施方式中，本文所述的方法和測定法在對患有疾病或失調的受試者或患者中的免疫刺激性微生物的存在進行識別和診斷方面是有用的。
[0156]炎症性腸病
[0157]在一些實施方式中，本文所述的測定法和方法可用於診斷炎症性腸病和/或識別在患有炎症性腸病的受試者中引發免疫響應的微生物。
[0158]炎症性腸病(IBD)被定義為病因不明的慢性、復發性腸炎症。仍未充分了解IBD的病因學。然而，基於對患者的研究和來自結腸炎的轉基因動物模型的研究，在如下方面存在著越來越多的共識:結腸炎為由對非致病性腸道細菌的異常響應導致的腸感染。IBD的發病機制中涉及細菌的一些最引人注目的證據來自表明取自Crohn』 s病患者的迴腸黏膜活檢樣品中存在E.coli的研究。儘管缺乏傳統的細菌致病性標記物，這些有機體能侵入腸細胞系並宿於巨噬細胞內而不誘導細胞凋亡。其它使用廣泛特異性16S核糖體探針進行原位雜交來檢測所有種類的細菌的研究發現，UC和CD中的粘液層內存在的未識別的細菌增加。另外，不希望受理論約束或 限制，IBD的遺傳基礎與所描述的關於響應感染性試劑(如麻風(leprosy))的遺傳基礎相重疊，提高了如下可能性:IBD作為對外源感染性試劑的響應而產生(N Engl J Med2010)。
[0159]炎症性腸病包括例如Crohn』 s病、潰瘍性結腸炎、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎、Behcet』 s症候群或未定型結腸炎。然而，最常見的炎症性腸病為Crohn’s病和潰瘍性結腸炎。這些疾病可能由腸中不受限制的炎症響應活化而導致。這一炎症級聯反應某種程度上通過促炎性細胞因子的活化和淋巴細胞亞群的選擇性活化而延續。對於IBD患者，腸內壁的潰瘍和炎症導致腹痛、腹瀉和直腸出血等症狀。潰瘍性結腸炎在大腸中發生，而在Crohn』 s病中可涉及整個胃腸道(GI tract)以及小腸和大腸。對於大多數患者而言，IBD為症狀持續數月至數年的慢性病症。這一疾病最常見於青年成人，但可在任何年齡發生。這一疾病在全世界均有發現，但最常見於工業化國家，如美國、英國和北歐。該病在猶太血統的人中尤其常見，並且其發病率也具有種族差異。IBD的臨床症狀為間歇性的直腸出血、疫攣性腹痛、體重減輕和腹瀉。IBD的診斷根據臨床症狀、鋇灌腸劑的使用進行，但直接目測觀察(乙狀結腸鏡或結腸鏡檢查)是最準確的測試。拖延性IBD是結腸癌的危險因素，IBD治療可包括藥物和手術。
[0160]一些UC患者僅患有直腸疾病(直腸炎)，而其他患者可以患有限於直腸和相鄰的左側結腸的疾病(直腸乙狀結腸炎(proctosigmoiditis))。在一些個體中，UC發生於整個結腸(全結腸炎)。UC的症狀通常更嚴重且疾病更廣泛(疾病涉及結腸更大的部分)。類似地，患有限於直腸的直腸炎或僅限於左端結腸(直腸乙狀結腸炎)的UC的患者的預後優於疾病涉及整個結腸的受試者的預後。
[0161]在一些情況下，使用口服藥物或灌腸劑進行的短暫周期性治療可能足以在潰瘍性結腸炎患者中引起緩解，即，如疼痛、出血和體重減輕的症狀消失。對於患有更廣泛的疾病的患者而言，發炎的腸道的失血可導致貧血，並可能需要通過補充鐵、甚至輸血進行治療。在少數情況下，當炎症變得非常嚴重時，結腸可急性擴張到大尺寸。這種病症被稱為中毒性巨結腸(toxic megacolon)。中毒性巨結腸患者極度病重，伴有發燒、腹痛、腹脹、脫水和營養不良。除非病人利用藥物迅速改善，否則通常需要進行手術以防止結腸破裂。
[0162]Crohn』 s病可發生於胃腸道的所有區域。由於炎症和纖維化，很多該病的患者中發生腸梗阻。肉芽腫(Granulomas)和瘻管(fistula)形成是Crohn』 s病的常見併發症。Crohn』 s病的患者在嚴重情況下可能需要靜脈輸送營養、手術和結腸造口(colostomy)來對疾病進行適當治療。
[0163]炎症性腸病患者患結腸癌的風險也有所提高。在IBD8-10年後，癌症的風險開始
顯著上升。
[0164]一旦作出陽性診斷，可使用消炎藥物(如水楊酸鹽/酯)對IBD進行藥理學治療。水楊酸鹽/酯製劑在治療輕度至中度疾病中有效，並且在長期攝入藥物時可減少疾病發作(flare)頻率。水楊酸鹽/酯的例子包括柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、奧沙拉嗪(olsalazine)和美沙拉嗪(mesalamine)。這些藥物通常以高劑量口服給予，以實現最大治療效果。在不響應水楊酸鹽/酯或皮質激素(corticosteroids)的IBD患者中，使用抑制免疫系統的藥物。免疫抑制劑的例子包括硫唑嘌呤(azathioprine)和6_巰基嘌呤(6-mercaptopurine)。
[0165]自身免疫失調
[0166]在本文的多個方面和實施方式中描述的方法和測定法對於識別與誘發或導致自身免疫失調或自身免疫疾病的新型微生物也可特別有利。廣義上所稱的「自身免疫疾病」是指這樣一類疾病:在該疾病中，受試者的自身抗體與宿主組織反應，或免疫效應因子T細胞與內源性自身肽發生自體反應並 引起組織破壞。由此產生了針對受試者自身抗原(稱為自體抗原(se 1 f-antigen ))的免疫響應。本文所使用的術語「自體抗原」是指正常宿主組織的抗原。正常宿主組織不包括癌細胞。不希望受理論限制或束縛，認為某些自身免疫疾病在疾病的起始或進展或病因學中，可能涉及額外的、目前尚未識別的微生物病因學試劑、觸發子或組分(如細菌、真菌或病毒)。相應地，本文所述的方法可用於患有自身免疫疾病或具有自身免疫疾病易感性的受試者中，其中，免疫蛋白富集部分由受試者的樣品獲得，核酸由該部分中提取，並對提取的核酸進行測序以識別受試者中的任何免疫刺激性微生物。
[0167]相應地，本文所述的方法和測定法的一些實施方式中，受試者患有自身免疫疾病或具有自身免疫疾病易感性，所述自身免疫疾病包括但不僅限於:類風溼關節炎、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性腦脊髓炎、重症肌無力(MG)、Hashimoto』 s甲狀腺炎、Goodpasture』 s症候群、天皰瘡(例如，尋常天皰瘡)、Grave』 s病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少性紫癜、具有抗膠原蛋白的抗體的硬皮病、混合性結締組織病、多發性肌炎、惡性貧血、特發性Addison』 s病、自身免疫相關性不孕不育、腎小球腎炎(例如，新月體性腎小球腎炎、增生性腎小球腎炎)、大皰性類天皰瘡、Sjogren’s症候群、胰島素抵抗、以及自身免疫性糖尿病(1型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病)。自身免疫性疾病已被認為還涵蓋動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病。在本文所述的方面的一個實施方式中，自身免疫疾病選自於由如下疾病所組成的組:多發性硬化、I型糖尿病、Hashimoto’s甲狀腺炎、類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡、胃炎(gastritis)、自身免疫性肝炎、溶血性貧血、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴淋巴組織增生症候群(ALPS)、自身免疫性葡萄膜視網膜炎、腎小球腎炎、Guillain-Barre症候群、牛皮癖和重症肌無力。
[0168]系統
[0169]在其它方面和實施方式中，本文還提供系統(和用於使計算機系統運行的計算機可讀介質)，用以執行用於在患者樣品中檢測和/或識別免疫系統刺激性微生物的方法。 [0170]本文所提供的系統的實施方式可以通過功能模塊來進行描述，所述功能模塊由記錄在計算機可讀介質上的計算機可執行指令所定義，並且所述功能模塊在執行時使計算機執行方法步驟。為了清楚起見，將本文所述的模塊按功能進行區分。然而，應該理解的是，模塊/系統不必對應於分散的(discreet)代碼塊，所描述的功能可以通過存儲在多種介質上的不同代碼部分執行以及可以在不同時間執行。此外，應該理解的是，這些模塊可以執行其它功能，因此所述模塊並不僅限於具有任何特定功能或功能組合。
[0171]所述計算機可讀存儲介質#30可以是能由計算機訪問的任何可用的有形介質。計算機可讀存儲介質包括在用於存儲信息(如計算機可讀指令、數據結構、程序模塊或其它數據)的任何方法或技術中使用的易失性的(vo 1 at i 1 e )和非易失性的、可移動的和不可移動的有形介質。計算機可讀存儲介質包括但不僅限於:RAM (隨機存取存儲器)、ROM (只讀存儲器)、EPR0M (可擦除可編程只讀存儲器)、EEPR0M (電可擦除可編程只讀存儲器)、USB存儲器、快閃記憶體存儲器或其它存儲器技術、⑶-ROM (光碟只讀存儲器)、DVD (數字通用盤)或其它光學存儲介質、磁帶盒、磁帶、磁碟存儲器或其它磁性存儲介質、雲伺服器存儲系統、其它類型的易失性和非易失性存儲器、以及任何其它可用於存儲所期望的信息並可通過計算機訪問的有形介質，以及前述介質的任何合適的組合。
[0172]一個或多個計算機可讀存儲介質上體現的計算機可讀數據可以定義指令，例如，作為一個或多個程序的一部分，即，作為由計算機執行的結果，指示計算機執行一個或多個本文所述的功能，和/或不同的實施方式、變型和它們的組合。此類指令可以使用多種程式語言中的任何一種編寫，例如，Java、J#、Visual Basic、C、C#、C++、Fortran、Pascal、Eiffel、C0B0L彙編語言等，或使用多種所述程式語言的組合中的任何一種編寫。體現了這樣的指示的計算機可讀存儲介質可以駐存於系統或本文所述的計算機可讀存儲介質的一個或多個組件之中，或可跨越分布於一個或多個此類組件中。
[0173]所述計算機可讀存儲介質可以是可傳輸的，這樣使得存儲於其上的指令可以被加載至任何計算機資源，以執行本文所討論的本發明的方面。此外，應當理解的是，如上所述，計算機可讀介質中存儲的指令並不僅限於體現為在主機上運行的一個應用程式的一部分的指令。相反，所述指令可以體現為可用於對計算機進行編程以實現本發明的各個方面的任何類型的計算機代碼(例如，軟體或微代碼)。計算機可執行指令可以用合適的計算機語言或幾種語言的組合進行編寫。基本計算生物學方法對於本領域普通技術人員來說是已知的，並在例如 Setubal 和 Meidanis 等，Introduction to Computational BiologyMethods (PWS Publishing Company, Boston, 1997 年)；Salzberg, Searles, Kasif,(主編)，Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998年);Rashidi和Buehler,Bioinformatics Basics -Application in Biological Science and Medicine(CRC Press, London, 2000 年)；以及 Ouelette 和 Bzevanis, Bioinformatics:A PracticalGuide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley&Sons, Inc.,第 2 版，2001 年)中有所描述。
[0174] 在本文所述的系統的一些實施方式中，功能模塊至少包括:測定系統#40、存儲裝置#30、比較模塊#80、以及顯示模塊#110。功能模塊可以在一個或多個計算機上執行，或通過使用一個或多個計算機網絡執行。測定系統具有計算機可執行指令，從而以計算機可讀的形式提供例如序列信息。
[0175]測定系統#40可以包含用於對免疫系統刺激性微生物進行測序的任何系統。如本領域技術人員所知的，此類系統可包括但不僅限於:下一代測序平臺、高通量測序平臺、PCR或定量PCR機器或裝置等。
[0176]在測定系統中測定的信息可通過存儲裝置#30讀取。本文所使用的「存儲裝置」旨在包括任何合適的計算或處理設備或其它被配置或調整用於存儲數據或信息的裝置。適合用於本發明的電子設備的實例可以包括獨立的計算設備、數據通信網絡(包括區域網(LAN)、廣域網(WAN)、網際網路、內聯網以及外聯網)、本地和遠程伺服器、以及本地和分布式計算機處理系統。存儲裝置還包括但不僅限於:磁性存儲介質(如軟盤，硬碟存儲介質)、遠程或本地伺服器、磁帶、光存儲介質(例如CD-ROM、DVD)、電子存儲介質(如RAM、ROM、EPROM、EEPR0M)等、普通硬碟以及這些類別的混合(如磁性/光存儲介質)。存儲裝置被調整或配置為在其上記錄核酸序列信息。此類信息可通過數位化形式提供，該形式例如可通過網際網路、在磁碟(diskette)上、通過USB (通用串行總線)、或通過任何其它合適的通信模式來傳輸和電子閱讀。
[0177]本文所使用的「存儲」是指對存儲裝置上的信息進行編碼的過程。本領域技術人員可以容易地採用任何目前已知的方法來將信息記錄於已知的介質上，以生成包含有關免疫刺激性微生物的信息的產品。
[0178]在一些實施方式中，存儲在存儲裝置中、待通過比較模塊讀取的參比數據例如為由從患者樣品獲得的免疫蛋白富集部分獲得的序列數據。
[0179]「比較模塊」#80可使用多種可獲得的軟體程序和格式進行如下比較:將測定系統中測定的序列信息數據與一種或多種參比樣品和/或存儲的參比數據進行比較。在本文所述的系統的一些實施方式中，比較模塊被配置為使用模式識別技術(pattern recognitiontechnique),從而將來自一個或多個條目(entries)的信息與一個或多個參考數據模式進行比較。比較模塊可以被配置為使用現有的可商購的或可自由使用的軟體來進行模式比較，並可為所實施的特定的數據比較進行優化。比較模塊提供了涉及免疫系統刺激性微生物的核酸序列的計算機可讀信息。
[0180]比較模塊或本發明任何其它的模塊可以包括作業系統(例如，UNIX)，在該作業系統上運行相關資料庫管理系統、全球資訊網應用程式、以及全球資訊網伺服器。全球資訊網應用程式包括生成資料庫語言語句所需的可執行代碼(如結構化查詢語言(SQL)語句)。一般來說，可執行文件將包括嵌入式SQL語句。此外，全球資訊網應用程式可包括配置文件，該配置文件包含對於各種軟體實體的指針和地址，所述軟體實體包括伺服器以及各種外部和內部資料庫(必須通過服務用戶請求訪問)。配置文件還將對伺服器資源的請求定向至相應的硬體-這在伺服器分布在兩個以上分離的計算機上時可能是必要的。在一個實施方式中，全球資訊網伺服器支持TCP/IP協議。諸如此類的本地網絡有時也被稱為「內聯網(Intranets)」。此類內聯網的優勢在於，其允許方便地與駐存在全球資訊網上的公共領域資料庫(例如，GenBank或瑞士Pro全球資訊網站點)進行溝通。因此，在一些實施方式中，使用由Web瀏覽器和Web伺服器提供的HTML界面，用戶可以直接訪問駐存在網際網路資料庫上的數據(例如通過超文本連結)。
[0181]比較模塊提供了計算機可讀的比較結果，該結果可通過預定義的標準或由用戶定義的標準以使用計算機可讀的形式進行處理，從而提供部分基於比較結果的內容，該內容可以根據用戶的需求使用顯示模塊#110進行存儲和輸出。
[0182]基於比較結果的內容可以是免疫系統刺激性微生物的類別。或者，基於比較結果的內容可以是免疫系統刺激性微生物類別的缺乏，表明該微生物是先前未特徵化的微生物。
[0183]在本文所述的系統的一些實施方式中，基於比較結果的內容顯示在計算機顯示器#120上。在本文所述的系統的一些實施方式中，基於比較結果的內容通過可列印介質#130,#140顯示。顯示模塊可以是任何適當的裝置，所述裝置被配置為從計算機處接收、並將計算機可讀信息顯示給用戶。非限制性的實例包括，例如，基於下列的通用計算機:IntelPENTIUM 型處理器、Motorola PowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISC 處理器，以及可由 Advanced Micro Devices (AMD), Sunnyvale, California 購得的多種處理器、平板或行動電話設備、或任何其它類型的處理器、視覺顯示裝置如平板顯示器、陰極射線管等，以及各種類型的計算機印表機。
[0184]在本文所述的系統的一些實施方式中，全球資訊網瀏覽器被用來提供用於顯示基於比較結果的內容的用戶界面。應當理解的是，本發明的其它模塊可以調整為具有Web瀏覽器界面。通過Web瀏覽器，用戶可以創建從比較模塊中檢索數據的請求。因此，用戶通常會指向並點擊用戶界面元素(如常規使用於圖形用戶界面中的按鈕、下拉菜單、滾動條等)。
[0185]因此，本文所述的方法提供系統(和用於引起計算機系統運行的計算機可讀介質)以執行用於在患者樣品中檢測和/或識別免疫系統刺激性微生物的方法，並任選地執行對患有感染性疾病的患者進行診斷。
[0186]對於在個體中所進行的診斷方法，本文所述的系統和計算機可讀介質僅為本發明的示例性實施方式，並不旨在限制本發明的範圍。本文所述的系統和計算機可讀介質的變型是可能的，並旨在落入本發明的範圍內。
[0187]機器的模塊或在計算機可讀介質中所使用的模塊可以承擔多種配置。例如，可以在一臺機器上提供功能、或者所述功能可分布於多臺機器。
[0188]本文公開的一些方面和實施方式可通過例如以下編號段落中的任一項加以說明:
[0189]1.一種用於在患有疾病或失調的患者中對免疫刺激性微生物的存在進行識別或檢測的方法，所述方法包括下列步驟:
[0190](a)由從患者樣品獲得的免疫蛋白富集部分中提取核酸；
[0191](b)對提取的核酸進行測序；以及
[0192](c)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進行比較，以識別由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否為微生物核酸，其中，若所述提取的核酸為微生物核酸，則所述患者被檢測為具有免疫刺激性微生物。
[0193]2.一種用於在患有疾病或失調的患者中對免疫刺激性微生物的存在進行識別或檢測的方法，所述方法包括下列步驟:[0194](a)由患者樣品製備免疫蛋白g集部分；
[0195](b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸；
[0196](c)對提取的核酸進行測序；以及
[0197](d)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進行比較，以識別由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否為微生物核酸，其中，若所述提取的核酸為微生物核酸，則所述患者被檢測為具有免疫刺激性微生物。
[0198]3.如段1或2所述的方法，其中，所述患有疾病或失調的患者患有炎症性腸病。
[0199]4.如段3所述的方法，其中，所述炎症性腸病為Crohn' s病、潰瘍性結腸炎、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎、Behcet/ s症候群或未定型結腸炎。
[0200]5.如段1-4中任一項所述的方法，其中，所述患有疾病或失調的患者患有自身免疫失調。
[0201]6.如段1-5中任一項所述的方法，其中，所述患有疾病或失調的患者患有硬化、敗
血症或病毒血症。
[0202]7.如段1-6中任一項所 述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對免疫球蛋白、補體蛋白或病原體識別受體具有特異性的親和結合劑製備。
[0203]8.如段1-7中任一項所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特異性的親和結合劑或所述親和結合劑的任意組合製備。
[0204]9.如段1-8中任一項所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgG具有特異性的親和結合劑製備。
[0205]10.如段1-9中任一項所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用親和結合劑利用免疫沉澱製備。
[0206]11.如段7-10中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白Α/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結合劑的任意組合。
[0207]12.如段7-11中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體、抗人IgA抗體、抗人IgD抗體、抗人IgE抗體、抗人IgM抗體,或所述親和結合劑或抗體的任意組合。
[0208]13.如段7-12中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑對免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，並結合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fc片段上的抗原表位。
[0209]14.如段7-13中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑未結合至固相載體。
[0210]15.如段7-13中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑結合至固相載體。
[0211]16.如段15所述的方法，其中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹脂珠。
[0212]17.如段1-16中任一項所述的方法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物為細菌、真菌或病毒。
[0213]18.如段1-17中任一項所述的方法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物屬於分類單元中的古細菌域、細菌域或真核生物域。
[0214]19.如段1-18中任一項所述的方法，其中，所述患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、黏膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關節液樣品、呼吸道痰樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
[0215]20.如段19所述的方法，其中，所述腸灌洗樣品為迴腸灌洗樣品。
[0216]21.如段1-20中任一項所述的方法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物為先前未特徵化的微生物。
[0217]22.如段1-21中任一項所述的方法，其中，所述測序步驟使用鳥槍法克隆、16SrRNA/DNA擴增和/或宏基因組測序進行。
[0218]23.如段1-22中任一項所述的方法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測序使用微生物基因特異性引物進行。
[0219]24.如段1-22中任一項所述的方法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測序使用非基因特異性引物進行。
[0220]25.如段1-24中任一項所述的方法，其中，用於從中製備所述免疫蛋白富集部分的所述患者樣品在所述提取核酸的步驟之前並未進行培養步驟。
[0221]26.一種用於在患者樣品中對免疫系統刺激性微生物進行直接檢測的測定法，所述測定法包括下列步驟:
[0222](a)由從患者樣品製備的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及
[0223](b)對存在於所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進行測序，從而獲得存在於所述患者樣品中的任何免疫系統刺激性微生物的序列。
[0224]27.一種用於在患者樣品中對免疫系統刺激性微生物進行直接檢測的測定法，所述測定法包括下列步驟:
[0225](a)從患者樣品製備免疫蛋白g集部分；
[0226](b)由所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及
[0227](c)對存在於所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進行測序，從而獲得存在於所述患者樣品中的任何免疫系統刺激性微生物的序列。
[0228]28.如段26或27所述的測定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對免疫球蛋白、補體蛋白或病原體識別受體具有特異性的親和結合劑製備。
[0229]29.如段26-28中任一項所述的測定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特異性的親和結合劑或所述親和結合劑的任意組合製備。
[0230]30.如段26-29中任一項所述的測定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgG具有特異性的親和結合劑製備。
[0231]31.如段26-30中任一項所述的測定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用親和結合劑利用免疫沉澱製備。
[0232]32.如段31所述的測定法，其中，所述親和結合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白Α/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結合劑的任意組合。
[0233]33.如段31或32所述的測定法，其中，所述親和結合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體。
[0234]34.如段28-33中任一項所述的測定法，其中，所述親和結合劑對免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，並結合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fc片段上的抗原表位。
[0235]35.如段28-34中任一項所述的測定法，其中，所述親和結合劑未結合至固相載體。[0236]36.如段28-34中任一項所述的測定法，其中，所述親和結合劑結合至固相載體。
[0237]37.如段36所述的測定法，其中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹脂珠。
[0238]38.如段26-38中任一項所述的測定法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物為細菌、真菌或病毒。
[0239]39.如段26-39中任一項所述的測定法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物屬於分類單元中的古細菌域、細菌域或真核生物域。
[0240]40.如段26-40中任一項所述的測定法，其中，所述患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、黏膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關節液樣品、呼吸道痰樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
[0241]41.如段40所述的測定法，其中，所述腸灌洗樣品為迴腸灌洗樣品。
[0242]42.如段26-41中任一項所述的測定法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物為先前未特徵化的微生物。
[0243]43.如段26-42中任一項所述的測定法，其中，所述測序步驟使用鳥槍法克隆、16SrRNA/DNA擴增和/或宏基因組測序進行。
[0244]44.如段26-43中任一項所述的測定法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測序使用微生物基因特異性 引物進行。
[0245]45.如段26-43中任一項所述的測定法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測序使用非基因特異性引物進行。
[0246]46.如段26-45中任一項所述的測定法，其中，用於從中製備所述免疫蛋白富集部分的所述患者樣品在所述提取核酸的步驟之前並未進行培養步驟。
[0247]47.如段26-47中任一項所述的測定法，其中，所述微生物不能使用標準培養條件進行培養。
[0248]48.一種用於由至少一個測試樣品獲取數據的系統，所述測試樣品包含由免疫蛋白富集樣品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集樣品由至少一名患者處獲得，所述系統包含:
[0249]a.測定模塊，所述測定模塊被配置用於接收包含所述提取的核酸的所述至少一個測試樣品，並對所述至少一個測試樣品進行至少一次測序分析，以產生測序數據輸出；
[0250]b.存儲裝置，所述存儲裝置被配置用於存儲來自所述測定模塊的所述測序數據輸出；
[0251]c.比較模塊，所述比較模塊被配置用於接收包含提取的核酸的所述測試樣品的所述測序數據輸出，並對所述測序數據輸出進行至少一次測序分析，以確定下列條件之一存在與否，並產生比較數據輸出:
[0252]1.所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上；或者
[0253]i1.所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低於20%;
[0254]以及
[0255]d.顯示模塊，所述顯示模塊用於對部分基於來自所述比較模塊的所述比較數據輸出的內容進行顯示，其中，所述內容包括表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上的信號；或者表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低於20%的信號。
[0256]49.如段46所述的系統，其中，所述顯示模塊上顯示的內容進一步包括表明建議接受特定治療方案的患者的信號。
[0257]實施例
[0258]本文提供了對先天或適應性免疫系統響應的微生物進行直接識別的測定法和方法。哺乳動物宿主(人類和非人類)中生長著多種多樣的共生微生物或致病微生物。免疫系統的響應是共生微生物或病原微生物的指紋。目前的微生物學方法並不必然將對生物體的免疫響應作為直接識別生物體的手段而納入考量。免疫響應被定義為基於免疫響應的存在直接顯示微生物的證據。作為結果，微生物的存在通常通過培養或類似類型的生物測定法來確定。本文所述的測定法和方法將免疫響應與微生物的直接檢測相結合，用於診斷和識別特定的感染性疾病、特別是其中的有機體無法被培養的疾病的目的。此外，這一方法能夠直接應用於範圍廣泛的體液直接測定法。
[0259]在一些實施方式中，本文所述的測定法和方法包括通過多種不同手段(例如蛋白A或蛋白G瓊脂糖、IgG的Fc片段的特異性抗體)直接由體液(例如腸液、血液、關節液、腦脊液)對IgG分子進行直接免疫沉澱。一旦沉澱，直接由免疫沉澱物提取核酸。可利用設計用於檢測特定微生物的引物對DNA進行測序、或可進行16S rRNA/DNA擴增或鳥槍法克隆以及宏基因組測序，從而在跨越原核界和真核界的頻譜中搜索微生物。因此，本文所述的測定法和方法將免疫響應的選擇性與DNA測序的靈敏度和特異性相結合。通過首先將核糖核酸轉化為互補的DNA或使免疫沉澱針對免疫響應的其它組分(如IgM、IgE、IgA和IgD或甚至先天性免疫響應的組分(如補體))，這一方法可適於對這些核糖核酸進行的測序。本文所述的測定法和方法也具有廣泛的獸醫應用、以及在對遺傳物質並非DNA而是RNA的有機體進行識別中的應用、並且適合逆轉錄。
[0260]例如，圖1A-圖1C和圖2A-圖2C表明，如使用一系列示出了迴腸灌洗樣品中細菌比例的餅形圖所示的，由迴腸灌洗樣品識別的微生物群隨它們被分離的方法不同而不同。圖1A示出患者的迴腸灌洗樣品；圖1B示出使用未包覆珠進行免疫沉澱的相同迴腸灌洗樣品(即，對照)；圖1C示出通過使用抗人IgG包覆珠進行迴腸灌洗樣品的免疫沉澱而製備的IgG富集部分。在IgG富集部分和對照非包覆珠部分之間，觀測到10個PCR循環的豐度差異(即，IgG珠中的富集與對照珠中相比超出1000倍)。在由腸灌洗和灌入進行如本文所述的免疫沉澱程序後，由抗IgG珠和對照珠中分離DNA ;使用附著有適當的銜接子和接頭的擴增16S DNA的V2區域的引物來生成文庫，隨後在454測序儀上對其進行測序。圖1A-圖1C顯示基於V2同源序列並使用公共資料庫的分配至個體操作分類單元0TU的序列的相對豐度，所述資料庫如全球資訊網上的greengenes.lbl.gov(在相比於對照沉澱灌洗和灌入的抗IgG免疫沉澱灌洗中)。為允許定性比較，對照未包覆珠免疫沉澱的DNA比IgG珠的DNA擴增更多倍。在灌洗中的細菌群落在組成上與以對照珠沉澱的細菌群落非常相似，但與由IgG珠下拉的細菌群落相比非常不同。因此，如本文所使用的術語，IgG富集部分中識別的細菌為「免疫系統刺激性微生物」。對於在迴腸灌洗樣品識別的細菌群落，圖2A-圖2C顯示了類似的結果。
[0261]本文所述的方法的優點之一在於，它是用於識別微生物的非培養方法，免疫系統的一個或多個臂(arm)對所述微生物產生特異性響應，並因此與宿主具有生物相關性，而不需要在先或在後的培養步驟。所述測定法也可自動化進行，形成高通量模式。使用本文所述的方法和測定法對免疫系統刺激性微生物進行測序的能力允許對微生物進行直接檢測，從而用於對特定感染性疾病、尤其是其中的生物體無法培養的疾病進行診斷和識別。例如，如圖3所示，使用本文所述的方法的實施方式，來自患有炎症性腸病的患者的小腸分泌物的IgG包覆的細菌被特異性下拉並測序(使用來自免疫沉澱物的16s rDNA)。由16S rDNA的特異性引物，通過基於SYBR綠的定量實時PCR對16S rDNA的豐度(表示附著於抗IgG珠和對照珠的細菌的豐度)進行定量。IgG富集部分中的細菌相對於對照(灌洗，未包覆珠)而言是特異性的，並以兩個以上的數量級(或大於100倍)富集。免疫沉澱物也可包含不可培養的微生物，這可需要下一代測序以及鳥槍法、宏基因組、下一代測序。
[0262]如圖4A-圖4C所示，本文所述的方法和測定法也可用於在使用常規方法時被認為是無菌的樣品中識別病毒。如本文所述，使用抗IgG或對照對來自HCV感染患者(圖4A和圖4C中的個體患者)的血清進行免疫沉澱，並由抗hlgG免疫沉澱物和對照沉澱物分離RNA。對RNA進行逆轉錄，並使用特異性引物測試HCV cDNA是否存在。如圖4C中所示(與圖4A為相同樣品)，在抗hlgG免疫沉澱物中檢測到HCV信號的184倍和117倍的富集，對照沉澱物中則幾乎不存在信號。這些附圖表明，本文所述的免疫沉澱程序還可應用於「無菌」環境(如外周血)；並且表明了，如本文所述，使用特異性檢測這一 HCV陽性供體內的HCV RNA的引物，能夠沉澱完全的病毒。可隨後通過任何基於測序的手段檢測擴增產物，例如，在病毒的情況下使用宏基因組手段、或對於細菌的情況使用宏基因組手段或基於16S的手段等。
[0263]這些測定法和方法對於(新發)感染性疾病的新型病原體識別以及常規(目前定義的)感染性疾病的診斷方法方面是有用的。本文所述的方法允許非常快速的診斷以及對生物體在體內的生物學特性(例如抗 生素/抗病毒劑耐藥性)進行實時檢測的機會。
【權利要求】
1.一種用於在患有疾病或失調的患者中對免疫刺激性微生物的存在進行識別或檢測的方法，所述方法包括下列步驟: (a)由患者樣品製備免疫蛋白g集部分； (b)由所述免疫蛋白富集部分提取核酸； (c)對提取的核酸進行測序；以及 (d)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進行比較，以識別由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否為微生物核酸，其中，若所述提取的核酸為微生物核酸，則所述患者被檢測為具有免疫刺激性微生物。
2.一種用於在患有疾病或失調的患者中對免疫刺激性微生物的存在進行識別或檢測的方法，所述方法包括下列步驟: (a)由從患者樣品獲得的免疫蛋白富集部分中提取核酸； (b)對提取的核酸進行測序；以及 (c)將所述提取的核酸的序列與已知的微生物核酸序列進行比較，以識別由所述免疫蛋白富集部分提取的核酸是否為微生物核酸，其中，若所述提取的核酸為微生物核酸，則所述患者被檢測為具有免疫刺激性微生物。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述患有疾病或失調的患者患有炎症性腸病。
4.如權利要求3所述的方法，其中，所述炎症性腸病為Crohn's病、潰瘍性結腸炎、膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎、Behcet' s症候群或未定型結腸炎。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述患有疾病或失調的患者患有自身免疫失調。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中，所述患有疾病或失調的患者患有硬化、敗血症或病毒血症。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對免疫球蛋白、補體蛋白或病原體識別受體具有特異性的親和結合劑製備。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對1gA, 1gD, 1gE, 1gG, IgM具有特異性的親和結合劑或所述親和結合劑的任意組合製備。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgG具有特異性的親和結合劑製備。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用親和結合劑利用免疫沉澱製備。
11.如權利要求7-10中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結合劑的任意組合。
12.如權利要求7-11中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體、抗人IgA抗體、抗人IgD抗體、抗人IgE抗體、抗人IgM抗體，或所述親和結合劑或抗體的任意組合。
13.如權利要求7-12中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑對免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，並結合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
14.如權利要求7-13中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑未結合至固相載體。
15.如權利要求7-13中任一項所述的方法，其中，所述親和結合劑結合至固相載體。
16.如權利要求15所述的方法，其中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹脂珠。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物為細菌、真菌或病毒。
18.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物屬於分類單元中的古細菌域、細菌域或真核生物域。
19.如權利要求1-18中任一項所述的方法，其中，所述患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、黏膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關節液樣品、呼吸道痰樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
20.如權利要求19所述的方法，其中，所述腸灌洗樣品為迴腸灌洗樣品。
21.如權利要求1-20中任一項所述的方法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物為先前未特徵化的微生物。
22.如權利要求1-21中任一項所述的方法，其中，所述測序步驟使用鳥槍法克隆、16SrRNA/DNA擴增和/或宏基因組測序進行。
23.如權利要求1-22中任一項所述的方法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測序使用微生物基因特異性引物進行。
24.如權利要求1-22中任一項所述的方法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測序使用非基因特異性引物進行。
25.如權利要求1-24中任一項所述的方法，其中，用於從中製備所述免疫蛋白富集部分的所述患者樣品在所述提取核酸的步驟之前並未進行培養步驟。
26.一種用於在患者樣品中對免疫系統刺激性微生物進行直接檢測的測定法，所述測定法包括下列步驟: Ca)由從患者樣品製備的免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及 (b)對存在於所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進行測序，從而獲得存在於所述患者樣品中的任何免疫系統刺激性微生物的序列。
27.一種用於在患者樣品中對免疫系統刺激性微生物進行直接檢測的測定法，所述測定法包括下列步驟: (a)從患者樣品製備免疫蛋白g集部分； (b)由所述免疫蛋白富集部分中提取核酸；以及 (c)對存在於所述免疫蛋白富集部分中的提取的核酸進行測序，從而獲得存在於所述患者樣品中的任何免疫系統刺激性微生物的序列。
28.如權利要求26或27所述的測定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對免疫球蛋白、補體蛋白或病原體識別受體具有特異性的親和結合劑製備。
29.如權利要求26-28中任一項所述的測定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgA、IgD、IgE、IgG、IgM具有特異性的親和結合劑或所述親和結合劑的任意組合製備。
30.如權利要求26-29中任一項所述的測定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用對IgG具有特異性的親和結合劑製備。
31.如權利要求26-30中任一項所述的測定法，其中，所述免疫蛋白富集部分通過使用親和結合劑利用免疫沉澱製備。
32.如權利要求31所述的測定法，其中，所述親和結合劑為蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、免疫蛋白特異性抗體或其片段，或所述親和結合劑的任意組合。
33.如權利要求28-32中任一項所述的測定法，其中，所述親和結合劑或免疫蛋白特異性抗體包括抗人IgG抗體。
34.如權利要求28-33中任一項所述的測定法，其中，所述親和結合劑對免疫球蛋白免疫蛋白具有特異性，並結合至所述免疫球蛋白免疫蛋白的Fe片段上的抗原表位。
35.如權利要求28-34中任一項所述的測定法，其中，所述親和結合劑未結合至固相載體。
36.如權利要求28-34中任一項所述的測定法，其中，所述親和結合劑結合至固相載體。
37.如權利要求36所述的測定法，其中，所述固相載體包括超順磁微珠、微尺度瓊脂糖珠、或瓊脂糖樹脂珠。
38.如權利要求26-38中任一項所述的測定法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物為細菌、真菌或病毒。
39.如權利要求26-39中任一項所述的測定法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物屬於分類單元中的古細菌域、細菌域或真核生物域。
40.如權利要求26-40中任一項所述的測定法，其中，所述患者樣品為血液樣品、血漿樣品、尿樣品、腦脊液樣品、黏膜樣品、糞便樣品、腸灌洗樣品、腸液樣品、關節液樣品、呼吸道痰樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
41.如權利要求40所述的測定法，其中，所述腸灌洗樣品為迴腸灌洗樣品。
42.如權利要求26-41中任一項所述的測定法，其中，被檢測的所述免疫系統刺激性微生物為先前未特徵化的微生物。
43.如權利要求26-42中任一項所述的測定法，其中，所述測序步驟使用鳥槍法克隆、16S rRNA/DNA擴增和/或宏基因組測序進行。
44.如權利要求26-43中任一項所述的測定法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測序使用微生物基因特異性引物進行。
45.如權利要求26-43中任一項所述的測定法，其中，步驟(b)或步驟(c)中的所述測序使用非基因特異性引物進行。
46.如權利要求26-45中任一項所述的測定法，其中，用於從中製備所述免疫蛋白富集部分的所述患者樣品在所述提取核酸的步驟之前並未進行培養步驟。
47.如權利要求26-47中任一項所述的測定法，其中，所述微生物不能使用標準培養條件進行培養。
48.一種用於由至少一個測試樣品獲取數據的系統，所述測試樣品包含由免疫蛋白富集樣品中提取的核酸，所述免疫蛋白富集樣品由至少一名患者處獲得，所述系統包含: a.測定模塊，所述測定模塊被配置用於接收包含所述提取的核酸的所述至少一個測試樣品，並對所述至少一個測試樣品進行至少一次測序分析，以產生測序數據輸出； b.存儲裝置，所述存儲裝置被配置用於存儲來自所述測定模塊的所述測序數據輸出； c.比較模塊，所述比較模塊 被配置用於接收包含提取的核酸的所述測試樣品的所述測序數據輸出，並對所述測序數據輸出進行至少一次測序分析，以確定下列條件之一存在與否，並產生比較數據輸出:. 1.所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上；或者 ?.所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低於20% ； 以及 d.顯示模塊，所述顯示模塊用於對部分基於來自所述比較模塊的所述比較數據輸出的內容進行顯示，其中，所述內容包括表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性為20%以上的信號；或者表明所述提取的核酸的序列與已知微生物家族的序列的同源性低於20%的信號。
49.如權利要求46所述的系統，其中，所述顯示模塊上顯示的內容進一步包括表明建議接受特定治療方案的 患者的信號。
【文檔編號】G01N33/68GK103635591SQ201280015562
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年1月26日 優先權日:2011年1月26日
【發明者】阿瑟·卡澤爾, 理察·布隆伯格 申請人:布裡格姆及婦女醫院股份有限公司, 因斯布魯克醫科大學