高產吩嗪‑1‑甲醯胺的基因工程菌株及其構建方法與流程
2024-04-05 06:46:05 2
本發明屬於基因工程領域，涉及假單胞菌基因工程菌株及其構建方法，尤其是一株高產吩嗪-1-甲醯胺的基因工程菌株及其構建方法。
背景技術：
我國常見的農作物病害生物達1600種，每年造成的損失約為1000億人民幣，嚴重地影響了我國農業的發展。近些年，化學農藥的大規模使用導致了病蟲害的抗藥性不斷增強。此外，高濃度和毒性的化學農藥的應用，對農田、水環境也造成了很大的汙染，嚴重威脅著我國的糧食安全和生命健康。因此，低毒性、低殘留和不易產生抗藥性的生物農藥獲得了各國政府和農藥企業的極大關注。
與化學農藥相比，生物農藥具有毒性低、對環境友好和不易產生抗藥性等明顯優勢，已經吸引了越來越多學者的關注並逐漸應用到生物防治實踐當中。其中，上海交通大學彭華松課題組率先利用銅綠假單胞菌株M18開發出了具有廣譜、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和莖腐的生物農藥吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，簡稱PCA，CAS號為2538-68-3)，定名為「申嗪黴素」，主要用於防治水稻紋枯病、小麥赤黴病、黃瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，並獲得了農業部頒發的新農藥藥證。
但最近相關研究發現，與PCA相比，另一種吩嗪類抗生素吩嗪-1-甲醯胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)具有更好的安全性、穩定性及對植物病原菌的抑菌活性，在防治水稻紋枯病和小麥赤黴病等方面具有重要的應用價值。據報導，目前能合成PCN的微生物菌株有綠針假單胞菌PCL1391，銅綠假單胞菌PAO1，PUPa3，PUP6，MML221等，但由於PCN產率較低，尚未能大規模推廣應用。上海交通大學彭華松課題組對篩選的一株綠針假單胞菌HT66進行基因工程改造後，PCN的產量已經達到1800mg/L並申報了中國發明專利(CN201310566864.5)，但是該產量距離PCN的工業化應用還存在一定的距離。因此，通過基因工程技術進一步改造該菌株將有利於提高PCN產量，實現其農業應用。
技術實現要素：
針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一株高產吩嗪-1-甲醯胺的基因工程菌株及其構建方法，克服現有菌株生產吩嗪-1-甲醯胺產量和效率較低的缺陷，提供一種用於生產吩嗪-1-甲醯胺的基因工程菌株及其用途。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
第一方面，本發明涉及一株高產吩嗪-1-甲醯胺的基因工程菌株，具體是敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因、parS基因中的一個或兩個基因而得到基因工程菌株；
或者，敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA單突變株或者雙突變株基因組的lon基因、parS基因中的一個或兩個基因而得到基因工程菌株；其中，所述單突變株為HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突變株為HT66ΔrpeAΔpsrA。
優選地，所述lon基因的鹼基序列如SEQ ID NO.1所示；所述parS基因的鹼基序列如SEQ ID NO.2所示。
優選地，所述基因工程菌株為HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。其中，所述基因工程菌株HT66Δlon是敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔparS是敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的parS基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔlonΔparS是敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因、parS基因而得到基因工程菌株。
更優選地，所述基因工程菌株為HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA。
第二方面，本發明還涉及所述高產吩嗪-1-甲醯胺的基因工程菌株的構建方法，具體是：敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因、parS基因中的一個基因或兩個基因，即可；
或者，敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467 rpeA、psrA單突變株或者雙突變株基因組的lon基因、parS基因中的一個或兩個基因而得到基因工程菌株；其中，所述單突變株為HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突變株為HT66ΔrpeAΔpsrA。
優選地，所述lon基因的鹼基序列如SEQ ID NO.1所示；所述parS基因的鹼基序列如SEQ ID NO.2所示。
優選地，所述構建方法中，敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467基因組的lon基因、parS基因中的一個基因的步驟具體包括：
i、擴增lon基因或parS基因片段的上下遊同源臂；
ii、採用融合PCR法連接上下遊同源臂並插入pK18mobsacB質粒中得lon基因或parS基因重組質粒；
iii、(a)使lon基因重組質粒上的lon基因上下遊同源臂片段與HT66、HT66ΔparS、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔparS、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔparS基因組中的lon基因發生同源重組；
或(b)使parS基因重組質粒上的parS基因上下遊同源臂片段與HT66、HT66Δlon、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔlon、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔlon、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔlon基因組中的parS基因發生同源重組；
篩選陽性克隆，即得。
上述敲除中，所述pK18mobsacB質粒為假單胞菌和大腸桿菌的穿梭質粒。
第三方面，本發明提供一種基於所述基因工程菌株的吩嗪-1-甲醯胺合成方法，具體包括如下步驟：將所述基因工程菌株的種子發酵液接種於KB發酵培養基中，培養，即可。
優選地，所述種子發酵液的製備具體為：將所述基因工程菌株接種於KB培養基中，置於28℃、180轉/分下培養至OD600為0.5～2.0，即得。
優選地，所述培養的條件具體為：24～30℃、100～300轉/分鐘、24～72h。
優選地，所述種子發酵液與所述KB發酵培養基的體積比為(1～10):100。
與現有技術相比，本發明的具備如下有益效果：
本發明具體是以綠針假單胞菌HT66為出發菌株，通過基因工程技術從HT66菌株基因組中分別或者同時敲除吩嗪合成過程中的lon、parS負調控基因，構建HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌株，使得吩嗪-1-甲醯胺(phenazine-1-carboxamide,CAS號為550-89-0，簡稱PCN)的產量大幅提高，能夠更加有效由於生物防治。其中，基因工程菌株HT66ΔlonΔparS具有最佳效果。
附圖說明
通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、目的和優點將會變得更明顯：
圖1為綠針假單胞菌HT66和lon敲除突變株中分別以內外部引物PCR擴增lon基因及其上下遊片段的電泳圖；
其中，從左到右依次為marker，HT66Δlon，HT66，空白對照；
圖2為HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌的生長曲線圖；
圖3為HT66HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖4為HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；
圖5為HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖6為HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；
圖7為HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖8為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；
圖9為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖10為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的生長曲線圖；
圖11為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖12為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的生長曲線圖；
圖13為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖14為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的生長曲線圖；
圖15為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖16為HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖17為HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖18為HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。
本發明的綠針假單胞菌(Pseudomonas choloraphis)HT66，該菌株已在中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏單位地址為：中國.武漢.武漢大學，郵編為：430072，保藏日期為：2013年10月12日，保藏編號為：CCTCC NO:M 2013467。
實施例1、lon基因體外突變體的構建
根據綠針假單胞菌HT66基因組中lon基因及其上下遊序列設計引物(見表1)：
表1
以該基因組DNA為模板，擴增基因組中的相應片段。
將上下遊PCR產物通過融合PCR連接，並將融合PCR產物與pK18mobsacB載體分別使用EcoRI和XbaI酶切，過柱回收，使用T4連接酶連接，獲得體外突變質粒。
用體外突變質粒轉化大腸桿菌S17。將攜帶重組質粒的S17菌株充分活化，接種於含有卡那黴素50mg/L的LB培養基中，37℃，180轉/分培養12h。將充分活化的HT66菌株接種於LB培養基中，28℃，180轉/分培養12h。5000轉/分收集並洗滌兩種菌體，LB培養基重懸並以HT66：S17濃度比為3:1的比例混合與EP管中，靜置1h；取混合菌液點在LB平板中，28℃培養24h；刮取長出來的混合菌落於LB中重懸，稀釋塗布於卡那黴素50mg/L，氨苄黴素100mg/L的LB平板上，28℃培養2～3d後挑取單克隆塗布10％蔗糖平板中，28℃培養1～2d；挑取蔗糖平板上的單克隆，分別點在卡那黴素50mg/L的抗性LB平板及無抗LB平板上，培養12～24h；挑取在卡那黴素50mg/L抗性平板上不生長，但在無抗平板上能夠正常生長的單菌落，即為同源重組成功的菌落。PCR驗證HT66菌株的lon基因被敲除，並命名為HT66Δlon。
圖1為綠針假單胞菌HT66和lon敲除突變株中分別以內外部引物PCR擴增lon基因及其上下遊片段的電泳圖；其中，M，Marker；Δ，lon基因敲除株HT66Δlon；WT，野生株HT66；N，空白對照組。左側引物為內部引物lon-F/lon-R，右側引物為外部引物lon-F1/lon-R2。內外部引物擴增結果表明，lon基因已被成功敲除。
實施例2、parS基因體外突變體的構建
根據綠針假單胞菌HT66基因組中parS及上下遊序列設計引物(見表2)：
表2
以該基因組DNA為模板，擴增基因組中的相應片段。
將上下遊PCR產物通過融合PCR連接，並將融合PCR產物與pK18mobsacB載體分別使用BamHI和HindIII酶切，過柱回收，使用T4連接酶連接，獲得體外突變質粒。
用所得體外突變質粒轉化大腸桿菌S17。將攜帶重組質粒的S17菌株充分活化，接種於含有卡那黴素50mg/L的LB培養基中，37℃，180轉/分培養12h。將充分活化的HT66菌株接種於LB培養基中，28℃，180轉/分培養12h。5000轉/分收集並洗滌兩種菌體，LB培養基重懸並以HT66：S17濃度比為3:1的比例混合與EP管中，靜置1h；取混合菌液點在LB平板中，28℃培養24h；刮取長出來的混合菌落於LB中重懸，稀釋塗布於卡那黴素50mg/L，氨苄黴素100mg/L的LB平板上，28℃培養2～3d後挑取單克隆塗布10％蔗糖平板中，28℃培養1～2d；挑取蔗糖平板上的單克隆，分別點在卡那黴素50mg/L的抗性LB平板及無抗LB平板上，培養12～24h；挑取在卡那黴素50mg/L抗性平板上不生長，但在無抗平板上能夠正常生長的單菌落，即為同源重組成功的菌落。PCR驗證HT66菌株的parS基因被敲除，並命名為HT66ΔparS。
實施例3、lon和parS雙突變株HT66ΔlonΔparS的構建
將攜帶parS重組質粒的S17菌株充分活化，接種於含有卡那黴素50mg/L的LB培養基中，37℃，180轉/分培養12h。將充分活化的HT66Δlon菌株接種於LB培養基中，28℃，180轉/分培養12h。5000轉/分收集並洗滌兩種菌體，LB培養基重懸並以HT66Δlon：S17濃度比為3:1的比例混合與EP管中，靜置1h；取混合菌液點在LB平板中，28℃培養24h；刮取長出來的混合菌落於LB中重懸，稀釋塗布於卡那黴素50mg/L，氨苄黴素100mg/L的LB平板上，28℃培養2～3d後挑取單克隆塗布10％蔗糖平板中，28℃培養1～2d；挑取蔗糖平板上的單克隆，分別點在卡那黴素50mg/L的抗性LB平板及無抗LB平板上，培養12～24h；挑取在卡那黴素50mg/L抗性平板上不生長，但在無抗平板上能夠正常生長的單菌落，即為同源重組成功的菌落。PCR驗證HT66Δlon菌株的parS基因被敲除，並命名為HT66ΔlonΔparS。
實施例4、假單胞菌HT66及基因工程菌株HT66ΔlonΔparS的生長曲線測定
將菌株充分活化並接種於新鮮的KB培養基中，培養過夜後以最初OD600為0.02的濃度接種於發酵培養基，28℃，180轉/分培養2～3d，並以一定的時間間隔測定菌液OD600。
圖2為綠針假單胞菌HT66及其不同基因工程菌株的生長曲線。由圖可知，敲除parS基因對菌株的生長影響不打；敲除lon基因會使菌株穩定期的OD600值略微下降，其中以雙敲除株HT66ΔlonΔparS的穩定期OD600值最低，說明兩個基因對菌體的生長有著複雜的影響。
實施例5、基因工程菌HT66ΔlonΔparS中PCN的生物合成
將活化後的綠針假單胞菌HT66及其基因工程菌株HT66ΔparS、HT66Δlon、HT66ΔlonΔparS分別接種於KB培養基中，置於28℃恆溫搖床(180轉/分)培養至OD600為0.5～2.0之間時，將上述菌液以1～10:100的體積比，加入到新鮮的KB發酵培養基中，24～30℃振蕩培養，搖床轉速100～300轉/分鐘，培養24～72h後收取菌液。取發酵液0.5mL加入3mL乙酸乙酯充分萃取後，取0.2mL有機相吹乾後用乙腈溶解，並通過HPLC檢測發酵液中吩嗪-1-甲醯胺產量。
HPLC檢測條件：
流動相為乙腈-25mM乙酸銨，色譜柱為WondaSilC18-WRreversephasecolumn(5μm；4.6X250mm,Shimadzu,Japan)，檢測波長為254nm，檢測條件：0～2min，8％乙腈-92％25mM乙酸銨，2-20min，乙腈濃度從8％升至60％，乙酸銨濃度從92％下降至40％，20～21min，8％乙腈-92％25mM乙酸銨。
圖3為綠針假單胞菌HT66不同基因工程菌株及野生株中吩嗪-1-甲醯胺的產量變化圖。由圖可知，敲除parS基因導致了PCN的產量由野生株的425mg/L上升到1102mg/L，敲除lon基因使PCN的產量由野生株的425mg/L上升到2053mg/L；兩個基因的雙突變株中PCN產量達到2425mg/L，為野生株的5.71倍。
實施例6
本實施例提供了一株高產吩嗪-1-甲醯胺的基因工程菌株，具體是通過敲除綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA單突變株或者雙突變株基因組的lon基因、parS基因中的一個或兩個基因而得到基因工程菌株；
其中，綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66 CCTCC NO:M 2013467 rpeA、psrA單突變株分為HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，雙突變株為HT66ΔrpeAΔpsrA；上述單突變株及雙突變株相關信息公開於在先申請CN 103642714 A中。
參照實施例1至3提供的方法，將基因工程菌株HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrA的lon基因、parS基因中的一個進行敲除或者兩個同時敲除，即得；包括基因工程菌株HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。上述基因工程菌株生長情況及PCN產量情況如圖4至圖18所示。其中：
圖4為HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；
圖5為HT66ΔlonΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖6為HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；
圖7為HT66ΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖8為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的生長曲線圖；
圖9為HT66ΔlonΔparSΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖10為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的生長曲線圖；
圖11為HT66ΔlonΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖12為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的生長曲線圖；
圖13為HT66ΔpsrAΔparS基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖14為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的生長曲線圖；
圖15為HT66ΔlonΔparSΔpsrA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖16為HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖17為HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖；
圖18為HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA基因工程菌的吩嗪-1-甲醯胺產量圖。
本發明具體是以綠針假單胞菌HT66為出發菌株，通過基因工程技術從HT66菌株及其已知突變株基因組中分別或者同時敲除吩嗪合成過程中的lon、parS負調控基因，構建lon、parS基因單基因突變株或雙基因工程菌株，使得吩嗪-1-甲醯胺(phenazine-1-carboxamide,CAS號為550-89-0，簡稱PCN)的產量大幅提高，能夠更加有效由於生物防治。
以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並不影響本發明的實質內容。