一種強化表達Streptomycessp.FA1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌的製作方法

2024-04-04 23:45:05 3

本發明涉及一種強化表達streptomycessp.fa1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，屬於基因工程領域。

背景技術：

木聚糖酶屬於糖苷水解酶[ec3.2.1.x]，根據作用位點的不同，這類酶可分為兩種：一類是作用於木聚糖的主鏈骨架，主要有內切β-1,4-d-木聚糖酶和β-木糖苷酶，前者作用於木聚糖中間β-1,4-d-糖苷鍵，後者則是作用於低聚木糖的末端分解成木糖單糖，在這兩種酶的共同參與下，實現木聚糖的降解。第二類是作用於作用於支鏈取代基的酶，包括α-l-呋喃阿拉伯糖苷酶[ec3.2.1.55]、α-d-葡萄糖醛酸酶[ec3.2.1.139]、乙醯木聚糖酯酶[ec3.2.1.72]、p-香豆酸酯酶[ec3.1.1]等。

木聚糖酶分布廣泛，主要來自自然界中一些真菌、細菌、一些無脊椎的動物體內以及植物組織等，既可以通過動植物體內提取，也可以通過微生物發酵獲木聚糖酶。人們研究比較多的是微生物產木聚糖酶，已經報導的產木聚糖酶菌株有各種黴菌和鏈黴菌以及芽孢桿菌等。木聚糖酶種類繁多組成各異，性質上也有所不同。

木聚糖酶能應用在多個領域中。在食品領域可以用於麵製品烘焙，能夠改善麵製品的品質；另外木聚糖可用於製備低聚木糖。在飼料工業木聚糖酶和其他半纖維素酶一起添加在飼料中利於增加飼料營養分解。在製漿和造紙工業領域，木聚糖酶可作為預漂白劑處理紙漿，從而降低紙漿漂白過程中化學試劑使用量，減少對環境的汙染。在紡織工業麻類植物的纖維素含量豐富，是紡織行業中纖維原材料，但是麻類植物中含有半纖維素、木質素、果膠等雜質不利於紡織，木聚糖酶可以進行脫膠以去除這些膠質，減少化學品對環境的汙染。迄今為止，國內外已報導了400多種木聚糖酶基因，大多數木聚糖酶在野生菌中表達量僅在10-20iu·ml-1。為了進一步推動木聚糖酶在工業生產中的應用，利用分子生物學方法將木聚糖酶基因進行異源表達以提高木聚糖酶的表達水平，是目前普遍採用的木聚糖酶製備方式。

畢氏酵母表達系統是近年發展起來的應用廣泛的真核表達系統。畢氏酵母菌屬於單細胞微生物，具有生長力旺盛、營養條件簡單、發酵技術成熟、ph適應範圍較寬、不產有毒物質等優點，至今已有數百種的外源蛋白利用該表達系統表達成功。用於外源基因表達的啟動子主要有乙醇氧化酶(aox)啟動子和3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(gap)。aox是一種強啟動子，以甲醇為誘導劑能嚴格控制外源蛋白的誘導表達。gap啟動子則屬於組成型啟動子，在菌體生長過程中都能啟動表達。外源基因的表達方式有兩種，分別是整合到基因組中表達和構建游離的重組質粒進行表達。整合型表達中通過將外源基因整合到微生物基因組中從而使菌株具有遺傳穩定的特點。基於質粒高拷貝數通過構建游離表達質粒進行表達可獲得多拷貝外源基因表達菌株，從而顯著提高表達量。目前在畢氏酵母表達系統中均是構建整合型重組菌株進行外源基因重組表達，尚未見到採用游離型表達質粒來進行表達。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發明提供了一種穩定的、可以大量分泌木聚糖酶的游離表達型畢氏酵母重組菌及其構建方法，工業應用前景廣闊。

本發明的第一個目的是提供一種表達木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，所述畢氏酵母重組菌是將木聚糖酶基因連接到含有自主複製序列的游離表達載體上，然後轉化至已整合表達木聚糖酶基因的畢氏酵母中，得到畢氏酵母重組菌。

在本發明的一種實施方式中，所述木聚糖酶基因胺基酸序列如seqidno:1所示。

在本發明的一種實施方式中，所述自主複製序列的核苷酸序列如seqidno:2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述游離表達載體為通過將核苷酸序列如seqidno:2的pars複製子連接到pgapzαa質粒上得到pgapzαa-pars游離表達載體。

在本發明的一種實施方式中，所述已整合表達木聚糖酶基因的畢氏酵母為畢氏酵母km71/ppic9k-xyna(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)

本發明第二個目的是提供一種所述畢氏酵母重組菌的構建方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲得胺基酸序列如seqidno:1所示的木聚糖酶基因；

(2)獲得序列如seqidno:2所示的自主複製序列pars基因；

(3)將步驟(2)所得pars基因與質粒pgapzαa相連，得到表達載體pgapzαa-pars；

(4)將步驟(1)中的木聚糖酶基因與步驟(3)中的表達載體pgapzαa-pars相連，得到重組載體pgapzαa-pars-xyna；

(5)將重組載體pgapzαa-pars-xyna轉化到已整合表達木聚糖酶基因的畢氏酵母中，得到所述畢氏酵母重組菌。

本發明的第三個目的是提供所述的畢氏酵母重組菌生產木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)以權利要求1所述畢氏酵母重組菌為生產菌株，活化後，30℃、200rpm條件下培養24h，得一級種子發酵液；

(2)以2.5％接種量接種一級種子發酵液至種子培養基中，30℃、200rpm條件下培養24h，得二級種子發酵液；

(3)以10％的接種量將二級種子發酵液接種至發酵培養基中30℃、200rpm進行發酵；

(4)待do值迅速上升時，進行補料，od600＝100時停止補料，飢餓至第二次出現do值迅速上升時繼續補料。

在本發明的一種實施方式中，所述種子培養基為ypd培養基；所述發酵培養基為bsm培養基；其中bsm培養基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l，上述成分均溶於水中形成所述bsm培養基。

在本發明的一種實施方式中，所述方法中補料配方為100％甲醇、1.25％ptm1；甲醇和ptm1溶於水中形成所述補料。

本發明的第四個目的是提供所述畢氏酵母重組菌在飼料、食品、紡織或化工領域的應用。

本發明的有益效果

本發明在原有基因組已整合aox啟動子啟動表達xyna基因的菌株中進一步導入含有gap啟動子啟動表達xyna基因的游離表達質粒，從而強化xyna在畢氏酵母中的分泌表達。和單一整合性表達菌株相比，進一步導入游離型重組表達質粒後木聚糖酶產量顯著提高了53％，重組酶的比活力提高了90％。本發明為利用畢氏酵母高效分泌表達外源蛋白提供了一種新方法。

附圖說明

圖1重組質粒pgapzαa-pars-xyna的構建過程圖；

圖2pgapzαa-pars-xyna重組質粒的雙酶切驗證圖；

圖3km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌3.6l發酵sds-page電泳圖；

圖4km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌3.6l發酵酶活對比圖。

具體實施方式

將0.5g的木聚糖溶於100ml，50mmol/l，ph5.5的磷酸緩衝液充分混勻，取1ml底物，在55℃預熱10min，加入1ml的酶液，反應10min後加入3mldns，煮沸10min迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml，540nm下測吸光度(以滅活的酶液為催化劑同樣操作作為空白對照)。

在上述條件下，將每分鐘水解木聚糖糖生成1μmol的木糖所需酶量定義為木聚糖酶的一個單位的酶活力(u)。

實施例1：表達載體pgapzαa-pars的構建

利用全基因合成技術合成核苷酸序列如seqidno.2所示的自主複製序列pars；將回收得到的pars基因片段，用infusion酶與質粒pgapzαa相連，構建得到表達載體pgapzαa-pars。

實施例2：畢氏酵母km71/ppic9k-xyna感受態細胞製作：

1)挑取酵母km71/ppic9k-xyna單菌落，接種至含有10mlypd培養基的50ml三角瓶中，30℃，250rpm培養過夜；

2)接種培養細胞100μl於含有100mlypd培養基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm培養過夜，至od600達到1.3～1.5；

3)3個50ml無菌離心管於4℃，5000rpm離心5min棄上清，每管加入4ml無菌水充分懸浮細胞，收集合併成一管；加入2ml10*te緩衝液(ph＝7.5)2ml10*liac和0.5ml1mdtt旋轉混勻，在30℃50rpm水浴搖床45min。

4)將3)中菌懸液加無菌水稀釋至30ml，於4℃，5000rpm離心5min棄上清收集菌體，並加入預冷的無菌水25ml，充分懸浮細胞；

5)於4℃，5000rpm離心5min收集菌體，加入20ml預冷的1mol/l山梨醇重懸菌體；

6)重複步驟5)

7)於4℃，5000rpm離心5min收集菌體，加入1ml預冷的1mol/l山梨醇輕輕吹打，充分懸浮細胞，分裝，當天使用。

實施例3：強化表達重組菌km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna的構建

重組質粒pgapzαa-pars-xyna的構建：

以質粒pmd18-t-xyna(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)為模板，設計序列如seqidno.3所示的正向引物：ccggaattcatggccgagaacaccctt，序列如seqidno.4所示的反向引物：atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt。通過聚合酶鏈式反應獲得具有noti和ecori酶切位點的xyna片段。

pcr反應體系(50μl)：

pcr程序：94℃，4min(預變性)；98℃，10s(變性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；設置30個循環；72℃，10min(保溫)後設置保藏溫度為4℃。將pcr產物進行膠回收、酶切回收目的基因將其與表達載體pgapzαa-pars進行雙酶切，並於16℃連接過夜，轉化e.colijm109，塗布含zecoin抗性的lb平板，37℃培養8-10h，挑取轉化子，提取重組質粒並雙酶切驗證，然後對驗證正確的重組質粒測定dna序列，陽性克隆子即pgapzαa-pars-xyna。見圖1和圖2。

重組質粒pgapzαa-pars-xyna的轉化：

(1)從乙醇中取出電轉杯，置於超淨臺中吹乾，並置於冰中預冷備用；

(2)在冰上進行以下操作：將重組游離質粒pgapzαa-pars-xyna預冷，吸取5μl快速與80μlkm71/ppic9k-xyna酵母感受態中混勻，轉移到0.2cm經過紫外照射的的電轉杯，冰浴5min，電擊條件為：電壓1500v，時間控制4-10ms；

(3)迅速向電擊杯中加入1ml1mol·l-1預冷的山梨醇，輕輕吹打均勻，然後將其轉移至冰冷的1.5ml無菌ep管中，30℃、50r·min-1培養1-2h；

(4)離心菌體，重新懸浮均勻後吸取200μl-300μl塗布上還有zecoin抗性的ypd平板上，於30℃恆溫條件下培養，至長出單菌落，即為含有游離質粒的重組單菌落。

(5)使用無菌牙籤挑取ypd平板上的菌落，接種於含有10ml液體ypd培養基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min，培養24h；

(6)將2.5ml(5)中菌液轉入裝有50mlbmgy培養基的500ml三角瓶培養表達24h，培養物經離心後,將菌體重懸轉入25mlbmmy培養基的250ml三角瓶培養並每天加入375μl甲醇，誘導表達4～5天；培養物經離心後得到含重木聚糖酶的上清，利用dns法對其進行酶活檢測。

實施例4：km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌3.6l發酵罐發酵

重組畢氏酵母工程菌發酵罐發酵生產木聚糖酶的方法在3.6linfors罐進行，過程分為三階段進行：

第一階段：接種實施例3中的陽性轉化子單菌落至裝有10mlypd培養基的50ml三角瓶中，200rpm，30℃振蕩培養24h，作為一級種子發酵液；

第二階段：取所述一級種子發酵液2.5ml接種於裝有100ml發酵培養基的500ml三角瓶中，200rpm，30℃振蕩培養24h，作為二級種子發酵液；

第三階段：將100ml的種子發酵液接種到裝有900mlbsm培養基中的3.6l發酵罐中，200rpm，30℃的條件下培養，全程用25％氨水進行ph值的調節，保持在5.0；所述bsm培養基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l上述成分均溶於水中形成所述bsm培養基；

待碳源耗盡，即do值迅速上升時，進行補料，待od600＝100時，停止補料，飢餓至第二次出現do值迅速上升時，繼續補料，補料配方為100％甲醇；1.25％ptm1；甲醇和ptm1互溶形成所述補料。

實施例5：木聚糖酶酶活測定

取實施例3中km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌產的酶進行酶活測定，實驗結果見圖4。結果表明，強化表達重組菌km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna獲得的木聚糖酶的最大酶活力2100u/ml，蛋白含量4.8mg/ml。整合型km71/ppic9k-xyna重組菌獲得的木聚糖酶的最大酶活力為1370u/ml，蛋白含量6.3mg/ml(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)，同整合型km71/ppic9k-xyna重組菌相比，強化表達重組菌表達木聚糖酶酶活提高了53％，同時表達的酶的比活力提高了90％，從而顯著降低了工業化生產木聚糖酶的生產成本。此外，km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌所產酶的蛋白電泳結果顯示在43kda處有一條與理論分子量一致的條帶(結果如圖3所示)。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動和修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。

序列表

江南大學

一種強化表達streptomycessp.fa1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌

4

patentinversion3.3

1

436

prt

streptomycessp.fa1

1

metalagluasnthrleuglyalaalaalaalaglnserglyargtyr

151015

pheglyvalalailealaserglylysleuglyaspserthrtyrthr

202530

serilealaasnargglupheasnservalthralagluasnglumet

354045

lysileaspalathrgluproasnargglyglnpheasnpheserser

505560

alaaspargvaltyrasntrpalavalglnasnglylysglnvalarg

65707580

glyhisthrleualatrphisserglnglnproglytrpmetglnser

859095

leuserglyserserleuargglnalametileasphisileasngly

100105110

valmetalahistyrlysglylysilealaglntrpaspvalvalasn

115120125

glualaphealagluglyserserglyalaargargaspserasnleu

130135140

glnargthrglyasnasptrpilegluvalalapheargthralaarg

145150155160

alaalaaspproseralalysleucystyrasnasptyrasnvalglu

165170175

asntrpthrtrpalalysthrglnalamettyrasnmetvallysasp

180185190

phelysserargglyvalproileaspcysvalglypheglnserhis

195200205

pheasnserglyserprotyrasnserasnpheargthrthrleugln

210215220

asnphealaalaleuglyvalaspvalalavalthrgluleuaspile

225230235240

glnglyalaserserserthrtyralaalavalvalasnaspcysleu

245250255

alavalserargcysleuglyvalthrvaltrpglyvalargaspser

260265270

aspsertrpargalaseraspthrproleuleupheasnasnaspgly

275280285

serlyslysalaalatyrseralavalleuasnalaleuasnglygly

290295300

thrthrthrproproprothrglyaspglyglyglnilelysglyval

305310315320

alaserglyargcysleuaspvalproasnalaserthrthraspgly

325330335

thrglnileglnleutyraspcyshisserasnserasnglnglntrp

340345350

alavalthraspserglygluileargvaltyrglyasplyscysleu

355360365

aspalaalaglythrglyasnglyalaprovalglniletyrsercys

370375380

trpglyglyaspasnglnlystrpargleuasnseraspglyserile

385390395400

valglyvalglnserglyargcysleuaspalaalaglythrglyasn

405410415

glyalaargileglnleutyrsercysserglyglyserasnglnarg

420425430

trpthrargthr

435

2

164

dna

人工合成

2

tcgagataagctgggggaacattcgcgaaaatgaaacaagtcggctgttatagtatattt60

attataatattgaaagatctcaaaagactacttatttttgaatgaaccaagtatgaaatc120

aacctatttggggttgaccaaaataagtaaatattaattgtcga164

3

27

dna

人工合成

3

ccggaattcatggccgagaacaccctt27

4

32

dna

人工合成

4

atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt32