一種大腸桿菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法與流程

2024-03-31 03:31:05

本發明涉及一種大腸桿菌利用柚皮素生物合成天然香橙素的方法，屬於發酵工程領域。
背景技術：
：香橙素(Aromadendrine)，又名二氫山萘酚(Dihydrokaempferol)是一種黃酮醇，屬於黃酮類化合物，是植物花色苷的一種重要前體物質。香橙素第一次是從桃中發現的，此後陸續發現存在於不同植物中，如流蘇樹屬的植物、酒神菊樹、山羊樹、側柏葉和西伯利亞紅松等，但在自然界分布並不廣泛。黃酮類化合物已被廣泛報導具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性，和神經保護活性。現在也已有多篇報導表明香橙素具有多種生物活性，如抗炎活性、清除自由基的活性和抗腫瘤活性。香橙素可以通過刺激葡萄糖吸收和改善胰島素抗性而具有抗糖尿病活性，而高濃度的香橙素還可以減少小膠質細胞中脂多糖誘導的一氧化氮的產生。此外，香橙素衍生物具有多種生物活性，如抗增殖和成骨作用。因此，香橙素在醫藥、保健品和食品添加劑等方面有著廣泛的用途。目前香橙素主要通過植物提取獲得，但由於香橙素在植物中含量太低，需要消耗大量的植物原料，植物原料的獲得、收集及儲存都不方便，使得通過植物提取的香橙素成本較高。因此，為了滿足工業大生產的要求，這就需要有一種新的技術來替代植物提取法生產香橙素，這種新方法操作起來要更簡便、生產成本更低、生產率更高。而利用微生物發酵的生物合成法是實現上述要求的有效途徑。目前為止，還未見以柚皮素為底物利用生物發酵法生產香橙素的報導。技術實現要素：本發明首先提供了一株大腸桿菌(Escherichiacoli)DHK-161114，於2016年11月17日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016645，保藏地址為中國武漢的武漢大學。該菌株形態呈短杆狀，在固體培養基上菌落呈透明的圓形。本發明還提供利用所述大腸桿菌生物轉化柚皮素生產香橙素的方法，包括以下步驟(1)製備種子培養液：將純種接種到種子培養基中，在28～32℃條件下，180～200rpm搖床振蕩培養13～17h，製得種子液；(2)細胞培養：將種子液，按體積比2～10％的接種量接入發酵培養基中，在35～37℃條件下，150～300rpm培養2～8h；(3)誘導：發酵液降溫至30℃，加入誘導劑進行誘導，繼續培養2～10h；(4)轉化：加入2～6g/L濃度為40％的柚皮素溶液進行發酵轉化，發酵周期為40～70h。在本發明的一種實施方式中，步驟(2)將種子液，按體積比3～8％的接種量接入發酵培養基中，在37℃條件下，150～300rpm培養2～8h。在本發明的一種實施方式中，步驟(3)將步驟(2)的細胞培養液降溫至30℃，加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mMIPTG進行誘導，繼續培養2～10h。在本發明的一種實施方式中，步驟(3)採用發酵罐發酵時，發酵罐培養條件為：溫度控制37℃，pH不低於6.5～6.8，轉速控制100～700rpm，溶氧偶聯攪拌，溶氧控制30％以上，通氣比0.6vvm；發酵液pH開始上升至7.3～8.0時，開始加入0.8～2.5％的乳糖或0.1～1.0mMIPTG誘導培養。在本發明的一種實施方式中，步驟(4)採用發酵罐發酵時，維持溫度30℃，pH控制7.3～8.6，轉速100～700rpm，溶氧偶聯攪拌，溶氧控制30％以上，通氣比0.6vvm，以0.1～0.6g/L/h的速率加入2～6g/L濃度為40％的柚皮素溶液開始轉化，同時以0.1～0.6g/L/h的速率補加葡萄糖。葡萄糖補加量為300g/L。在本發明的一種實施方式中，步驟(4)採用發酵罐發酵時，將2～6g/L濃度為40％的柚皮素溶液分批次加入，每次加入0.1～1.0g/L，同時以0.1～0.6g/L/h的速率補加葡萄糖。葡萄糖補加量為300g/L。在本發明的一種實施方式中，種子培養基：蛋白腖1～10g/L，酵母抽提物1～10g/L，氯化鈉0～10g/L，pH調節5.0～7.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min。在本發明的一種實施方式中，發酵培養基：蛋白腖1～10g/L，酵母抽提物1～10g/L，氯化鈉0～10g/L，pH調節5.0～7.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min。在本發明的一種實施方式中，發酵培養基：蛋白腖2.5～7.5g/L，酵母抽提物1～7.5g/L，氯化鈉0～10g/L，pH調節5.0～7.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min。在本發明的一種實施方式中，發酵培養基：蛋白腖2.5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH調節7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。在本發明的一種實施方式中，步驟(4)還可以將步驟(3)經誘導培養後的菌體離心收集，然後藉助緩衝液構建全細胞轉化體系，催化柚皮素合成香橙素。在本發明的一種實施方式中，發酵過程通過添加磷酸或鹽酸、氫氧化鈉或氨水來控制pH。本發明的優點：本發明以柚皮素為底物的微生物轉化法生產香橙素，質量轉化率達70～90％，生產成本低、生產工藝簡單、安全清潔、無汙染、環境友好等優點，充分保持了香橙素的天然性，首次實現了天然香橙素的生物合成。相比較於從植物中提取天然香橙素，本發明方法獲得單位天然香橙素的生產成本大大降低，且生產方法簡單，有利於實現工業生產。本發明所公布的方法所製得的發酵液中香橙素水平較高，發酵液中香橙素濃度達到3～5g/L，底物轉化率也達到70～90％，且得到的香橙素髮酵液成分簡單，底物殘留少，容易提取高純度香橙素晶體。生物材料保藏一株大腸桿菌(Escherichiacoli)DHK-161114，於2016年11月17日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016645，保藏地址為中國武漢的武漢大學。附圖說明圖1大腸桿菌使用不同濃度蛋白腖培養基搖瓶發酵合成香橙素的情況圖2大腸桿菌使用不同濃度酵母提取物培養基搖瓶發酵合成香橙素的情況圖3大腸桿菌搖瓶發酵合成香橙素不同誘導時間的情況具體實施方式分析方法：採用高效液相色譜法分析發酵液中的底物柚皮素和產物香橙素。採用島津SPD-M20A二極體陣列檢測器，Phenomenexluna5uC18色譜柱(150mm×4.6mm，5μ)；流動相15％～70％乙腈：85％～30％0.15％(w/v)乙酸溶液梯度洗脫；流速0.8ml/min；柱溫35℃；進樣量5μL。實施例1出發菌株：該出發菌株為大腸桿菌(E.coli)DHK-161114CCTCCNO:M2016645。平板培養：將穿刺管保存的大腸桿菌劃線接種至平板培養基上，在30℃培養箱中培養15～24h。製備大腸桿菌CCTCCNO:M2016645菌種庫：挑取單菌落，接種到種子培養基中，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養13～17h，吸取所得種子培養液0.5ml轉移至50％甘油溶液中，配製成終濃度25％的種子甘油管，-80℃保存。製備種子液：吸取20uL種子甘油管，接種到種子培養基中，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養13～17h，製得種子液。製備種子培養基：蛋白腖10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化鈉10g/L，自來水配製，pH調節7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。製備發酵培養基：蛋白腖10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化鈉10g/L，自來水配製，pH調節7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。吸取20μL種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養16h，按5％接種量移種至發酵培養基中(50ml/250ml)，在37℃條件下，200rpm搖床震蕩培養3h，降溫至30℃，加入1.5％的乳糖誘導3h，維持30℃，共加入2.7g/L的40％(w/v)的柚皮素溶液，整個發酵周期54h，發酵結束測定底物、產物含量，結果見表1。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：稱取一定量的柚皮素用DMSO溶解定容至40％(w/v)濃度。表1大腸桿菌搖瓶發酵合成香橙素的情況試驗批次香橙素產量(g/L)柚皮素含量(g/L)第一次1.790.50第二次1.750.59第三次1.740.79第四次1.820.65第五次1.680.53實施例2不同蛋白腖濃度出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備發酵培養基：分別配製蛋白腖0、2.5、5、7.5、10.0和12.5g/L，酵母抽提物5g/L，氯化鈉10g/L，自來水配製，pH調節7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。吸取20μL種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養16h，按5％接種量移種至不同蛋白腖濃度的發酵培養基中(50ml/250ml)，在37℃條件下，200rpm搖床震蕩培養3h，降溫至30℃，加入1.5％的乳糖誘導3h，維持30℃，共加入2.7g/L底物柚皮素，發酵時間54h，發酵結束測定底物、產物含量，結果見圖1，蛋白腖濃度為2.5g/L時，香橙素的產量達到2.1g/L。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。實施例3不同酵母提取物濃度出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備發酵培養基：蛋白腖10g/L，分別配製酵母抽提物濃度為0、2.5、5.0和7.5g/L，氯化鈉10g/L，自來水配製，pH調節7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。吸取20μL種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養16h，按5％接種量移種至不同酵母提取物濃度的發酵培養基中(50ml/250ml)，在37℃條件下，200rpm搖床震蕩培養3h，降溫至30℃，加入1.5％的乳糖誘導3h，維持30℃，共加入2.7g/L底物柚皮素，發酵時間54h，發酵結束測定底物、產物含量，結果見圖2，酵母抽提物濃度為2.5g/L時，香橙素的產量達到1.8g/L。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。實施例4全細胞轉化出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備發酵培養基：同實施例1。吸取20μL種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養16h，按5％接種量移種至發酵培養基中(50ml/250ml)，在37℃條件下，200rpm搖床震蕩培養3h，降溫至30℃，加入1.5％的乳糖分別誘導1h、3h和5h，再離心收集菌體懸浮於同樣體積的pH8.0的PBS緩衝液中進行轉化，維持30℃，共加入2.0g/L底物柚皮素，發酵周期54h，發酵結束測定底物、產物含量，結果見圖3，乳糖誘導5h後所得細胞轉化柚皮素生產香橙素的產量為0.6g/L左右。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。實施例5出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備發酵發酵培養基：蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH7.2。自來水配製，初始體積2.7L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。吸取20μL種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養8h，將100ml種子液(接種量3.3％)移種至發酵培養基中，在37℃條件下，300rpm發酵罐培養2h，降溫至30℃，加入1.5％的乳糖誘導2h後，加入40％(w/v)柚皮素溶液進行轉化，柚皮素分批次加入，每次加入量約0.1～1.0g/L，每當HPLC檢測底物濃度在0.1g/L以下時開始補加底物。發酵過程中測定底物、產物含量，發酵結束由柚皮素合成香橙素的質量轉化率達80％～90％，結果見表2。發酵罐發酵過程參數控制：生長階段溫度控制37℃，誘導及轉化階段溫度控制30℃；生長和轉化過程中pH無需進行控制；溶氧偶聯攪拌，控制30％以上；攪拌控制在100rpm～700rpm；通氣比為0.6vvm。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。實施例6出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備發酵發酵培養基：蛋白腖5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl5g/L，pH7.2。自來水配製，初始體積2.7L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。吸取20μL種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養8h，將100ml種子液(接種量3.3％)移種至發酵培養基中，在37℃條件下，300rpm發酵罐培養2h，降溫至30℃，加入1.5％的乳糖誘導2h後，加入40％(w/v)柚皮素溶液進行轉化，柚皮素分批次加入，每次加入量約0.1～1.0g/L，每當HPLC檢測底物濃度在0.1g/L以下時開始補加底物。發酵過程中測定底物、產物含量，發酵結束由柚皮素合成香橙素的質量轉化率達80％～90％，結果見表2。發酵罐發酵過程參數控制：生長階段溫度控制37℃，誘導及轉化階段溫度控制30℃；生長和轉化過程中pH無需進行控制；溶氧偶聯攪拌，控制30％以上；攪拌控制在100rpm～700rpm；通氣比為0.6vvm。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。實施例7出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備發酵發酵培養基：蛋白腖5g/L，酵母提取物7.5g/L，NaCl5g/L，pH7.2。自來水配製，初始體積2.7L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。吸取20μL種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養8h，將100ml種子液(接種量3.3％)移種至發酵培養基中，在37℃條件下，300rpm發酵罐培養2h，降溫至30℃，加入1.5％的乳糖誘導2h後，加入40％(w/v)柚皮素溶液進行轉化，柚皮素分批次加入，每次加入量約0.1～1.0g/L，每當HPLC檢測底物濃度在0.1g/L以下時開始補加底物。發酵過程中測定底物、產物含量，發酵結束由柚皮素合成香橙素的質量轉化率達80％～90％，結果見表2。發酵罐發酵過程參數控制：生長階段溫度控制37℃，誘導及轉化階段溫度控制30℃；生長和轉化過程中pH無需進行控制；溶氧偶聯攪拌，控制30％以上；攪拌控制在100rpm～700rpm；通氣比為0.6vvm。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。實施例8出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備發酵發酵培養基：蛋白腖5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl7.5g/L，pH7.2。自來水配製，初始體積2.7L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。吸取20μL種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養8h，將100ml種子液(接種量3.3％)移種至發酵培養基中，在37℃條件下，300rpm發酵罐培養2h，降溫至30℃，加入1.5％的乳糖誘導2h後，加入40％(w/v)柚皮素溶液進行轉化，柚皮素分批次加入，每次加入量約0.1～1.0g/L，每當HPLC檢測底物濃度在0.1g/L以下時開始補加底物。發酵過程中測定底物、產物含量，發酵結束由柚皮素合成香橙素的質量轉化率達80％～90％，結果見表2。發酵罐發酵過程參數控制：生長階段溫度控制37℃，誘導及轉化階段溫度控制30℃；生長和轉化過程中pH無需進行控制；溶氧偶聯攪拌，控制30％以上；攪拌控制在100rpm～700rpm；通氣比為0.6vvm。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。表25L發酵罐大腸桿菌採用不同發酵培養基成分合成香橙素的情況表3大腸桿菌5L發酵合成香橙素提高菌濃的情況實施例9流加發酵出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備種子液：吸取20μl種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量50ml/250ml，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養17h。製備發酵發酵培養基：蛋白腖5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl7.5g/L，pH7.2。自來水配製，初始體積2.75L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。初始葡萄糖15g/L，115℃高壓蒸汽滅菌後接種前加入。將100ml種子液(接種量3.3％)移種至發酵培養基中，在37℃條件下，300rpm發酵罐培養6h，降溫至30℃，加入1.2％的乳糖誘導3h後，開始流加40％(w/v)柚皮素溶液進行轉化，流加速率0.25g/L/h，同時以0.3g/L/h的速率流加葡萄糖溶液，葡萄糖流加量達到300g/L。發酵過程中測定底物、產物含量，發酵結束共消耗柚皮素9.3g，由柚皮素合成香橙素的質量轉化率達80％～90％，結果見表4。發酵罐發酵過程參數控制：生長階段溫度控制37℃，誘導及轉化階段溫度控制30℃；生長過程中控制pH7.0，誘導轉化階段維持pH8.0；溶氧偶聯攪拌，控制30％以上；攪拌控制在100rpm～700rpm；通氣比為0.6vvm。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。實施例10IPTG誘導出發菌株：同實施例1。製備種子培養基：同實施例1。製備種子液：吸取20μl種子甘油管接入種子搖瓶培養基中，裝液量200ml/1L，在30℃條件下，200rpm搖床震蕩培養17h。製備發酵發酵培養基：蛋白腖5g/L，酵母提取物5g/L，NaCl7.5g/L，pH7.2。自來水配製，初始體積2.75L，121℃高壓蒸汽滅菌20min。初始葡萄糖15g/L，115℃高壓蒸汽滅菌後接種前加入。將1.2L種子液(接種量4％)移種至50L發酵罐培養基中，在37℃條件下，200rpm發酵罐培養8h，降溫至30℃，加入0.8mMIPTG誘導2h，10h開始流加40％(w/v)柚皮素溶液進行轉化，流加速率0.15g/L/h，同時以0.3g/L/h的速率流加葡萄糖溶液，葡萄糖流加量達到300g/L。發酵過程中測定底物、產物含量，發酵結束由柚皮素合成香橙素的質量轉化率達70～90％，結果見表4。發酵罐發酵過程參數控制：生長階段溫度控制37℃，誘導及轉化階段溫度控制30℃；生長過程中控制pH7.0，誘導轉化階段維持pH8.0；溶氧偶聯攪拌，控制30％以上；攪拌控制在100rpm～700rpm；通氣比為0.6vvm。上述40％(w/v)柚皮素溶液製備：同實施例1。表4大腸桿菌50L發酵合成香橙素使用IPTG誘導的情況發酵時間(h)香橙素(g/L)柚皮素(g/L)OD6007//12.7710//11.16230.770.3115.81280.940.2615.9330.51.050.2716.2447.51.270.2715.35雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp