一種用於檢測TERT基因斷裂的探針組、試劑盒及其應用的製作方法

2024-03-30 13:50:05

本發明涉及原位雜交領域，具體而言，涉及一種用於檢測tert基因斷裂的探針組、試劑盒及其應用。

背景技術：

神經母細胞瘤(neuroblastoma，nb)屬於兒童外周交感神經系統腫瘤，是兒童最常見的胚胎性顱外腫瘤。nb腫瘤的惡性度高、進展快，易發生骨髓、骨及其他器官轉移，在兒童腫瘤相關死因中高達15％。nb腫瘤即使經過化療、手術和放療等多元化治療，仍有約60％的病例復發。神母腫瘤患兒中，約40％診斷為高危型nb，其5年生存率僅為30％-50％。由於缺乏有效治療手段、預後差、復發率和死亡率高，nb給患兒家庭和社會帶來沉重的經濟損失和負擔。因此，深入開展nb腫瘤分子標誌物研究，尤其是高危型nb腫瘤的分子標記物，對於兒童nb腫瘤的早期預防和診療具有重要的臨床意義和社會意義。

mycn基因是公認的nb腫瘤最主要致癌基因，也是國際神經母細胞瘤危險度分級協作組(theinternationalneuroblastomariskgroup,inrg)推薦的nb腫瘤分期/分級標誌物。但臨床上僅在20％高危nb患兒中發現mycn基因異常擴增(>10拷貝)，仍廣泛存在mycn未異常擴增的高危nb患者，說明現有nb腫瘤標誌物不能完全滿足病因複雜的nb腫瘤診治需要。

最新研究發現在高危nb腫瘤中，約有20-30％的腫瘤發生端粒酶逆轉錄酶(telomerasereversetranscriptase,tert)基因斷裂，能夠激活端粒酶活性，促進nb腫瘤進展，而且tert也可輔助mycn鑑別高危nb亞型。因此為了更好地對nb腫瘤患者進行分級、風險評估以及精準治療，檢測nb腫瘤患者是否出現tert基因的斷裂十分必要。

但目前檢測tert的斷裂只能基於全基因組測序技術，不但樣本處理複雜、專業要求高、檢測周期長並且成本昂貴，不適合醫院開展tert基因的快速檢測。

因此，本領域亟待提出一種快速、準確且成本低的檢測tert基因斷裂的試劑和方法。

有鑑於此，特提出本發明。

技術實現要素：

本發明的第一目的在於提供一種用於檢測tert基因斷裂的探針組，該探針組可以快速、準確、靈敏地檢測tert基因的斷裂。

本發明的第二目的在於提供一種用於檢測tert基因斷裂的試劑盒，該試劑盒包括上述探針組，可以快速、方便、準確、靈敏地檢測tert基因的斷裂。

本發明的第三目的在於提供上述探針組在製備用於鑑別高危神經母細胞瘤的試劑或試劑盒中的應用，由本發明上述應用製備的試劑或試劑盒能夠輔助鑑別高危神經母細胞瘤亞型，幫助神經母細胞瘤患者進行精準的個體化治療。

為了實現本發明的上述目的，特採用以下技術方案：

一種用於檢測tert基因斷裂的探針組，所述探針組包括標記有螢光標記的克隆片段rp11-325i22、rp11-768m3、rp11-1107m2和rp11-260h6，其中rp11-325i22和rp11-768m3標記有同一種顏色的螢光染料，rp11-1107m2和rp11-260h6標記有另一種顏色的螢光染料。

本發明提供上述探針組，通過上述探針組可以利用螢光原位雜交檢測樣品中tert基因的斷裂或斷裂。螢光原位雜交是利用標記有螢光素的探針特異性與染色體和(或)基因位點相結合，通過螢光顯微鏡即可觀察螢光信號的類型，從而檢測染色體和相應基因變化的方法，具有安全、經濟、快速、靈敏度高、檢測信號強、雜交特異性高、能同時顯示多種顏色等優點，而且彌補了傳統方法對間期細胞、複雜核型細胞以及染色體微缺失無法診斷的缺陷。同時螢光原位雜交技術應用於石蠟包埋的樣本上進行回顧性研究，大大降低了對研究樣本的要求。

tert基因兩端存在數十個細菌人工染色體(bac)克隆，但這些克隆沒有經過驗證，缺乏特徵性描述，且其中許多克隆為商品化克隆，只進行末端測序，存在約10％的錯誤率，體現為這些克隆標記後顯示的不是目的片段或在目的片段之外，還存在較多雜交信號。同時，bac克隆還存在標記後信號強度不強或bac克隆之間信號不連續的情況。因此，獲得特異性好、信號強度高且信號連續、不彌散的克隆是能夠準確、靈敏地檢測tert基因斷裂的關鍵。本發明經過多重分析和驗證之後，最終選擇確定的bac克隆為rp11-325i22、rp11-768m3、rp11-1107m2和rp11-260h6，其無論是在特異性、信號強度還是信號的連續性上都能滿足檢測要求，對上述bac克隆進行螢光標記，可以靈敏、準確地檢測tert基因斷裂。

首先，經efish預測和實際測試，本發明上述bac克隆在tert基因兩端具有極高的特異性，基本不與細胞內其他染色體發生非特異性雜交，且信號強度高，檢測的靈敏度高。另外，本發明上述克隆片段的大小相近，克隆片段彼此間的信號強度相似，不會出現因為克隆片段長短不一導致信號的強度差異較大的問題。

其次，tert基因兩端的bac克隆片段之間的最短距離約110kb，探針在未發生斷裂或重組時兩種信號能緊密靠近，不會因為兩個信號之間的距離過大而出現信號分離，導致假陽性。

再者，tert基因同側相鄰的克隆片段之間存在少量的片段重疊，避免同側克隆片段因為間距較大而出現信號斷裂或重組，出現單獨信號，造成假陽性。

一些實施方式中，所述rp11-325i22和rp11-768m3標記有綠色螢光染料，rp11-1107m2和rp11-260h6標記有紅色螢光染料。

在一些實施方式中，所述rp11-325i22和rp11-768m3標記有紅色螢光染料，rp11-1107m2和rp11-260h6標記有綠色螢光染料。

在一些實施方式中，所述綠色螢光染料選自光譜綠、螢光素、羧基螢光素、異硫氰酸螢光素、四氯螢光素、羅丹明、羧基四甲基羅丹明、bodipyfl或cy2中的一種或兩種，所述紅色螢光染料選自光譜橙、texasred、bodipytr、cy3或cy5中的一種或兩種。

在一些實施方式中，優選地，所述綠色螢光染料為光譜綠，所述紅色螢光染料為光譜橙。

本發明還涉及一種用於檢測tert基因斷裂的試劑盒，所述試劑盒包括上述的探針組，所述試劑盒還包括雜交緩衝液、洗滌緩衝液、非特異性雜交阻斷劑、水和細胞核染料中的一種或多種。。

本發明上述試劑盒包括用於檢測tert基因斷裂的探針組，能夠快速、方便、準確地實現對tert基因斷裂的檢測。

在一些實施方式中，所述雜交緩衝液為ssc緩衝液，所述洗滌緩衝液為含np-40的ssc緩衝液。

在一些實施方式中，所述非特異性雜交阻斷劑為牛血清白蛋白、鮭魚精子dna或人cot-1dna，優選地，所述非特異性雜交阻斷劑為人cot-1dna。

在一些實施方式中，所述細胞核染料選自dapi、吖啶橙、溴化乙錠、碘化丙啶和hoechst染料中的一種或多種，優選地，所述細胞核染料為dapi。

在一些實施方式中，所述探針組與所述雜交緩衝液、非特異性雜交阻斷劑和水混合配製為探針雜交液。

本發明還涉及上述探針組在製備用於鑑別高危神經母細胞瘤的試劑或試劑盒中的應用。

由本發明上述應用製備的試劑或試劑盒能夠輔助鑑別高危神經母細胞瘤亞型，幫助神經母瘤細胞患者進行精準的個體化治療。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

1)本發明提供用於螢光原位雜交的探針組或試劑盒，利用該探針組或試劑盒能夠通過螢光原位雜交檢測tert基因的斷裂，可以快速、準確、靈敏度、低成本地檢測tert基因的斷裂。

2)本發明上述探針組或試劑盒中的克隆片段具有信號強度高、特異性好的優點，上述克隆片段的組合具有信號連續、信號強度差異小，不容易出現假陽性等優點。

3)通過檢測tert基因斷裂，本發明上述探針組或試劑盒能夠輔助鑑別高危神經母細胞瘤亞型，幫助神經母細胞瘤患者進行精準的個體化治療。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為；bac克隆rp11-161f13的efish比對結果；

圖2為：bac克隆rp11-161f13在經培養的外周血中期染色體上的雜交結果；

圖3為：bac克隆rp11-379b11的efish比對結果；

圖4為：bac克隆rp11-379b11在經培養的外周血中期染色體上的雜交結果；

圖5為：螢光原位雜交多克隆分離探針定位模式示意圖；

圖6為：外周血塗片的fish檢測圖；

圖7為：兒童nb腫瘤組織樣本的fish檢測圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

實施例1

篩選檢測tert基因斷裂的探針組：

(1)通過http://genome.ucsc.edu/查找5號染色體tert基因兩側(即端粒側和著絲粒側)對應的細菌人工染色體(bac克隆)。結果表明，在tert基因(chr5:1,253,287-1,295,162)位置兩端約500kb處有數十個bac克隆可覆蓋，但這些克隆沒有經過驗證，缺乏特異性描述。

(2)探針設計原則：在基因斷裂點兩側分別選取多個大小相近的bac克隆，控制兩側bac克隆片段之間的最遠距離在1500kb以內且互不重疊，同側多個片段相互之間有一定序列的重疊，避免較大缺口造成信號彌散。根據上述探針設計原則，計劃在tert基因的一側選取3個bac克隆，分別為rp11-325i22(chr5：1317,996-1,509,712)、rp11-161f13(chr5：1,509,781-1,671,154)和rp11-768m3(chr5：1,682,330-1,844,278)，長約530kb，標記綠色螢光；在tert基因的另一側選取3個bac克隆，分別為rp11-379b11(chr5：620,050-842,110)、rp11-260h6(chr5：830,274-1,019,881)和rp11-1107m2(chr5：1,009,812-1,206,909)，長約470kb，標記綠色螢光。

(3)對上述bac克隆進行efish比對和用外周血培養的中期染色體塗片驗證：

①用efish(http://projects.tcag.ca/cgi-bin/efish/index.cgi)分析上述bac克隆的特異性，結果發現，rp11-161f13在基因組中存在非特異片段，分別在2號、3號染色體中有非特異雜交(參見說明書附圖圖1)，可能標記後有較明顯的非特異點幹擾判讀，其他五個bac克隆在比對過程中未發現非特異性雜交。

由於基於生物信息學的比對結果未必可靠，同時考慮到如果只選取rp11-325i22和rp11-768m3，中間約有173kb的缺口，擔心信號會有彌散，而如果只選取靠近tert基因的rp11-325i22，信號點螢光強度可能較弱，不滿足樣本檢測，因此最終對rp11-325i22、rp11-768m3和rp11-161f13均進行中期染色體塗片驗證。

②從invitrogen公司購買上述六個商品化的bac克隆，用綠色螢光染料標記，檢測上述bac克隆在外周血細胞中期染色體上的雜交情況。結果表明：

rp11-161f13在經培養的中期染色體細胞上顯示有非特異雜交信號(見說明書附圖圖2)，不能使用；rp11-325i22單個克隆的標記信號強度較弱；而rp11-325i22和rp11-768m3搭配的組合標記信號強度可以滿足樣本檢測的要求，且雖然其中存在173kb的缺口，並沒有對信號造成影響判斷的彌散效果。

rp11-379b11在efish比對過程中沒有發現非特異雜交(附圖3)，但是在培養的中期染色體和間期細胞中出現非特異信號點，不能用於後續試驗(見說明書附圖圖4)。而rp11-1107m2和rp11-260h6的組合可以滿足信號強度和信號連續性的要求。

根據上述外周血中期染色體塗片結果，最終確定用於檢測tert基因斷裂的bac克隆為rp11-325i22、rp11-768m3、rp11-1107m2和rp11-260h6，其定位模式如圖5所示。

實施例2

製備檢測tert基因斷裂的螢光標記bac克隆探針組：

從invitrogen公司購置相應的bac克隆，將bac克隆培養後提取質粒，利用缺口平移法，將端粒側的2個bac克隆片段rp11-1107m2和rp11-260h6用sptectrumgreen-dutp標記為綠色螢光，將著絲粒側2個bac克隆片段rp11-325i22和rp11-768m3用sptectrumorange-dutp標記為紅色螢光。將標記好的探針與humancot-1dna、雜交緩衝液、純化水按比例配置成探針雜交液，-20℃避光冷凍保存。

實施例3

製備用於檢測tert基因斷裂的試劑盒：

將實施例1製備的探針雜交液與用於細胞核dna染色的dapi染料組成試劑盒。

實驗例1

以人外周血淋巴細胞為檢測對象，評價實施例2製備的探針組的標記效果及檢測效果。

1、人外周血培養及染色體製備：

(1)準備以下實驗材料：人外周血；胰酶：gibico；培養液：dmem(hyclone)+10％新生牛血清(gibico)+100up.s。

(2)採血：用肝素潤溼注射針筒(0.2m1)後，常規取靜脈血約1-2ml，轉動針筒混勻肝素。

(3)接種(在超淨工作檯中無菌操作)：在每個培養瓶中(含20％血清的1640培養液5ml，ph7.2)，加入全血0.25-0.30ml(7號針頭13-15滴)、pha5mg，蓋緊膠塞，輕輕搖勻。

(4)培養：將培養瓶放在37℃恆溫培養箱內培養72h。終止培養前2-4h，加入0.01％秋水仙素溶液(100μg/m1)1-2滴(7號針頭)，使終濃度為0.2μg/ml培養液。輕輕搖勻後，放回培養箱繼續培養2-4h。

(5)收穫：將培養後的血細胞收集在離心管中，平衡後1000rpm離心8min，棄去上清。

(6)低滲：向離心管中加入37℃0.075mol/lkcl溶液至8ml，用吸管輕輕吹打混勻細胞，置於37℃水浴箱溫育15min。

(7)預固定：向離心管中滴加新配製的甲醇-冰醋酸固定液1-2ml，用吸管輕輕吹打混勻後1000rpm離心8min，棄去上清。

(8)固定：加入新配製的固定液至8ml，室溫靜置30min。3000rpm離心8min，棄去上清。可再重複固定1次。

2、細胞塗片處理方法：

(1)準備以下材料：

①樣本處理所需材料：固定液：體積比3:1的甲醇:冰醋酸，化學通風櫥中配製，充分混勻；離心機。

②製片時所需材料：載玻片、移液器、顯微鏡。

③預處理時所需材料：

20×pbs；70％、90％、100％梯度乙醇；圓形玻璃染色缸；恆溫水浴鍋(37±1℃)；

胃蛋白酶溶液：400μl1mol/l的hcl加入40ml水中，置於37±1℃水浴中，使用前加入75ul10％胃蛋白酶，混勻，使用一天後更換；

4％多聚甲醛：900ml去離子水中加入500μl1mol/lnaoh，加熱到65-70℃；邊攪拌邊加入40g多聚甲醛，持續攪拌直到溶解；冷卻至室溫後加入100ml的10×pbs；用hcl調節ph到7.3；過濾除菌，2-8℃避光保存；

1％多聚甲醛(水：26ml+20×pbs：2ml+4％的多聚甲醛：10ml+1m的mgcl2：2ml)。

④雜交時需要的材料：18×18mm蓋玻片、鑷子、橡皮膠(rubbercement)、原位雜交儀(abbott)。

⑤雜交後洗滌及復染所需材料：

20×ssc；np-40；鑷子；圓形玻璃染色缸；恆溫水浴鍋(72±1℃)；70％、90％、100％梯度乙醇；22×22mm蓋玻片；

洗液i(1×ssc/0.3％np-40)：37.88ml純水+2ml20×ssc+120μlnp-40，總體積40ml；

洗液ii(2×ssc/0.1％np-40)：35.96ml純水+4ml20×ssc+40μlnp-40，總體積40ml。

(2)將實施例2製備的探針組用於檢測經培養的外周血細胞的中期染色體：

①製片：

1.1、用新鮮固定液配平細胞懸液，5000rpm離心5分鐘，棄上清；

1.2、加1ml固定液，震蕩混勻，5000rpm離心5分鐘，棄上清；

1.3、重複1.2；

1.4、取一張乾淨的載玻片；

1.5、重懸細胞後取3μl懸液滴加到載玻片上；室溫下晾乾；

1.6、用10×物鏡在相差顯微鏡下觀察三個區域的細胞密度，記錄細胞沒有明顯重疊，且數量在100-200個以上；如果細胞密度及數目不合適，繼續步驟1.7；

1.7、如果滴加3μl懸液的區域仍然細胞數目太多，用新鮮固定液稀釋細胞懸液，重複步驟1.4-6；

1.8、另取一張乾淨的載玻片，滴加適量的細胞懸液；

1.9、在相差顯微鏡下觀察，如果細胞碎片太多，則需要做預處理並且選擇合適的雜交區域。

②玻片預處理：

2.1玻片放入37±1℃的1×pbs中孵育5分鐘；

2.2取出玻片，再將其放入37±1℃胃蛋白酶溶液中消化7-15分鐘(可通過預試驗確定酶效力)；

2.3取出玻片，再將其放入1×pbs室溫洗滌3分鐘；

2.4取出玻片，再將其放入1％多聚甲醛/pbs室溫固定10分鐘；

2.5取出玻片，再將其放入1×pbs室溫洗滌3分鐘；

2.6取出玻片，再將其放入70％、90％、100％梯度乙醇脫水各2分鐘；

2.7取出玻片，室溫晾乾。

③雜交：

3.1從-20℃冰箱中取出雜交液，震蕩混勻，瞬時離心；

3.2加10μl的雜交液到雜交區域，迅速蓋上18×18mm蓋玻片，輕壓使雜交液均勻分布，避免產生氣泡；

3.3用橡皮膠沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片和載玻片接觸的部位；

3.4溼潤原位雜交儀溼度條，將玻片置於原位雜交儀上，關閉原位雜交儀蓋子，設置「denat&hyb」程序，變性78℃2分鐘，雜交37℃10-18小時。

④雜交後洗滌及復染：

4.1關閉雜交儀電源，將玻片取出，輕輕撕去橡皮膠，移去蓋玻片(若蓋玻片難以去除，可以將其放入室溫2×ssc中微微搖晃，以利於其脫落)；

4.2玻片放入72±1℃洗液i(1×ssc/0.3％np-40)中2分鐘；

4.3取出玻片，再將其放入室溫洗液ii(0.1％np-40/2×ssc)中30秒；

4.4取出玻片，再將其放入室溫70％，90％，100％乙醇中各2分鐘；

4.5取出玻片，暗處自然乾燥玻片；室溫，滴加10μldapi復染劑到22×22mm的蓋玻片,載玻片目標區域朝下，輕放於蓋玻片上，輕壓，避免產生氣泡，在暗處存放，待觀察。

(3)結果判定：參照通行的雙色探針使用標準，在暗室中使用螢光顯微鏡dapi/fifc/texasred三色濾光鏡激發，100倍物鏡下觀察間期細胞，判別螢光信號，評價探針的特異性、靈敏度、信號的強弱以及信號連續性(見說明書附圖圖6)。

探針組質量評價：說明書附圖圖7的單個細胞核中只有兩個連續的紅綠信號或兩個黃色信號。首先，螢光信號的數量表明表明實施例1所述探針組的特異性好，只特異性地與5號染色體上tert兩側的目的片段結合，沒有非特異性地結合其他染色體；其次，紅綠信號緊密相連或融合形成黃色信號，表明上述探針之間的間距合適，不會因為間距過大而出現信號分離，造成檢測結果的誤判；再者，圖7所示螢光信號清晰，信號亮度高，探針組的檢測靈敏度高。考察染色體對應區段的螢光信號及計數50個細胞核中信號雜交情況，判定螢光探針的靈敏度和特異性。結果顯示100％的染色體顯示相應顏色的螢光信號，且無任何染色體位點之間的交叉雜交現象。探針靈敏度和特異性均達100％。

實驗例2

使用實施例2製備的探針組檢測兒童nb腫瘤組織，具體檢測方法如下所示：

(1)將包含腫瘤組織的樣本經10％中性福馬林固定，石蠟包埋後製備成3μm組織切片。

(2)將切片置於65±1℃恆溫箱烤片過夜；之後，取出後放入二甲苯浸泡30min，再放入無水乙醇浸泡10min；接著放入100％、85％、70％梯度乙醇和純化水中復水3min，再放入純化水中100±5℃煮片20min。

(3)取出晾乾後，在樣本區域滴加100μl胃蛋白酶反應液，消化5min；之後迅速放入2×ssc洗滌5min，最後放入室溫70％、85％、100％梯度乙醇依次脫水各3min，取出晾乾。

(4)加10μl本發明的探針雜交液至乾燥22×22mm蓋玻片上，將樣本片翻轉，使樣本朝下，迅速蓋上，反轉後輕壓蓋玻片使雜交液均勻分布；用橡皮膠水沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片與載玻片接觸邊緣。

(5)將玻片放在85±1℃的熱臺上，變性5min；迅速將玻片放入預熱的雜交盒中，避光，37±1℃孵育過夜。

(6)將2×ssc溶液和0.1％np-40/2×ssc溶液放入37±1℃的水浴中預熱；去除橡皮膠水和蓋玻片，將玻片放入2×ssc溶液中洗滌10min；再轉入0.1％np-40/2×ssc溶液中洗滌5min；然後室溫70％乙醇脫水3min。

(7)取出玻片在暗處晾乾後，滴加10μldapi復染劑至乾燥的22×22mm蓋玻片上，反轉樣本片，使蓋玻片載玻片的目標區域接觸，反轉後減壓，避免產生氣泡，在暗處存放，使用螢光顯微鏡觀察螢光性。

(8)結果判定：參照通行的雙色探針使用標準，在暗室中使用螢光顯微鏡dapi/fifc/texasred三色濾光鏡激發，100倍物鏡下觀察間期細胞，判別螢光信號，確定免疫螢光原位雜交檢測的有效性(具體檢測結果見說明書附圖圖7)。

使用螢光顯微鏡可以觀察到兩種信號類型：(1)正常信號：在未發生tert基因斷裂或重組的腫瘤組織中，由於雙色信號相距較近而出現紅綠連續信號或者黃色信號(紅綠雙色疊加的效果)，信號點的數量取決於細胞核內5號染色體數目；(2)分離信號：當發生tert基因斷裂或重組時，導致分別標記在tert基因兩端的紅綠信號出現分離。只有當紅綠信號分離同時出現且距離一個信號直徑以上時，才能記為分離信號。每一列切片的整個核心區域至少有100個互不重疊的細胞核，在核心區域有超過10％的腫瘤細胞核出現紅綠分離信號，判斷螢光原位雜交陽性；未出現紅綠信號分離，則判斷螢光原位雜交陰性；單獨出現紅色或綠色信號則不計數。

根據圖7所示結果可知，實施例2所述探針組在nb腫瘤組織的多數細胞核中均能顯示螢光信號，而且螢光信號清晰，信號亮度高，且在每一例組織切片中均成功進行fish檢測，表明實施例2所述探針組具有特異性強及敏感性高的優勢，同時該探針穿透性強，信號清晰，信號亮度高，符合製備成診斷試劑盒的要求。

實驗例3

參照實驗例2所述方法，使用實施例2製備的探針組檢測50例已經被確定為tert基因斷裂的nb腫瘤組織，結果顯示，其中的48例nb腫瘤組織被所述探針組檢測到紅綠分離信號，被判斷為tert斷裂或重組陽性。由此可見，本發明所述探針組在檢測腫瘤組織的tert斷裂或重組情況的準確率已經達到96％。

最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍。