一種用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的LAMP引物、試劑盒及其應用的製作方法

2024-04-04 02:59:05

本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物、試劑盒及其檢測方法。

背景技術：

大豆是世界上重要經濟農作物，大豆擬莖點種腐病菌(phomopsislongicolla)是大豆生產上的一種重要病原菌，可侵染大豆的根部、莖部和豆莢，引致大豆種腐、根腐和莖枯等。莖部感病後，常在下部莖稈葉、分枝與莖連接處產生病斑，顏色較淡，病斑沿莖擴展、環莖，失水褪綠、萎縮和乾枯，導致植株上部萎蔫和枯死，葉片不脫落；病株根系完整、健康；發病較輕植株，上部葉片沿脈間褪綠。豆莢或種子感染後，發病的種子會出現皺縮、伸長、破裂、發白，影響種子質量，造成大豆品質下降，並可能導致大豆種子不能發芽或發芽緩慢，重發時能造成90％的種子不能萌發或腐爛。目前該菌在美國、阿根廷、義大利、韓國、南斯拉夫等都有報導。我國是大豆消費大國，也是大豆貿易大國，每年需大量進口大豆，其中2015年進口大豆達8169萬噸，是國內生產量的6.8倍，佔國內消費量的87％。進口大豆多來自美國、巴西等大豆種腐病等病害發生較重的國家，而大豆擬莖點種腐病菌常殘留在大豆種子和豆莢、豆稈等病殘體上，並通過遠距離運輸而傳播蔓延，因此，我國存在較大的擬莖點種腐病菌輸入風險。大豆擬莖點種腐病菌侵染到大豆組織後具有一定的潛育期，並未顯症或症狀不明顯，常導致漏診或誤診。在這種嚴峻的形勢下，快速準確地檢測病原菌和診斷病害是控制病害成災的主要措施之一。

擬莖點黴屬真菌檢測與鑑定的方法主要有形態學鑑定、血清學方法和分子生物學方法等。目前擬莖點黴屬傳統的檢測方法主要以形態學監測為基礎，即：將待鑑定菌株接種在培養基上或其寄主上培養，利用光學顯微鏡和電子顯微鏡等儀器觀察菌落特徵、菌絲形態、產孢結構和孢子結構等表型特徵，結合寄主上的發病症狀，對照相關資料，再確定該菌的分類地位。這種方法需要較長的時間，且需大量的形態觀察，無疑加大了檢測難度。血清學檢測方法主要是elisa法，該技術目前已廣泛應用於植物病毒檢測中，但在真菌檢測中並不普遍，同時，由於血清製備困難、近似種特異性差及檢測成本過高，以及成品試劑盒不易獲得等原因，elisa方法在擬莖點黴真菌檢測上的應用很少。用於擬莖點黴屬真菌分子檢測鑑定的常用方法包括pcr、多重pcr、巢式pcr、螢光pcr、rlfp、rapd、ssr等，近年來，dna指紋、基因晶片技術等亦開始起步，雖然這些分子檢測技術的效率高、靈敏度高，且能從植物組織中直接檢測到病原菌，但大部分技術又存在重複性、可操作性、多態性、成本、檢測範圍及環境因素等問題，例如巢式pcr、多重pcr需要染膠處理，實時螢光pcr因螢光染料和螢光探針的價格及儀器價格等因素使得檢測成本較高，rapd只能對室內純培養的菌進行檢測，而在自然界的發病植株中，往往會感染多種真菌，這會導致分子檢測結果不全面，只能檢測到某種或某幾種病原菌。因此，這些檢測技術並未能得到普遍應用。

2000年，notomi等人研發出了一項全新的核酸擴增技術——環介導等溫擴增技術(lamp,loop-mediatedisothermalamplification)。該技術使用四條或六條引物，以bstdna聚合酶作為擴增酶，恆溫條件下對目標片段進行擴增。其產物可以通過凝膠電泳進行觀察，同時可以通過田間顯色反應指示劑目測直接進行觀察。lamp技術的發明，為病原物快速檢測建立了一個良好的平臺，該技術具有非常鮮明的特點，不需要模板核酸片段的熱變性、長時間的溫度變化循環、實驗結果不需要凝膠電泳染色後進行紫外觀察，這就避免了普通pcr所需要昂貴的實驗儀器以及專業的實驗操作場所，因而該技術適合在基層、進出口檢疫部門進行快速的病原物診斷。

發展分子檢測最重要的一點就是選用合適的分子檢測靶標。鈣調素(calmodulin,cam)編碼基因在進化較為保守，其外顯子區域在屬間具有一定的保守性，同時該基因存在序列差異較大的非編碼的內含子區域，該區域在鹼基水平上具有明顯的種間差異，因此該編碼基因可以用來作為分子檢測的靶標而加以應用。本發明通過序列比對分析大豆擬莖點種腐病菌和其他擬莖點黴病菌及大豆常發病原菌在cam基因序列上的差異，設計了大豆擬莖點種腐病菌特異性的lamp引物，在此基礎上建立了大豆擬莖點種腐病菌lamp快速檢測試劑盒。本發明能實現擬莖點種腐病菌引致病害的早期準確診斷，對及時採取防控措施、減少農藥使用、保障大豆生產安全和質量安全具有重要作用。

技術實現要素：

本發明公開了鈣調素cam蛋白編碼基因序列作為靶標在檢測大豆擬莖點種腐病菌中的應用，目的是提供一種用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物組。

本發明的另一目的是提供用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物組的應用。

本發明的又一目的是提供用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp試劑盒。

為實現上述目的本發明採用如下技術方案如下：

鈣調素cam蛋白編碼基因序列作為靶標在檢測大豆擬莖點種腐病菌中的應用，其特徵在於：所述的基因序列如序列表中seqidno.1所示。

用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物組，包括下列引物：

正向外引物f3:5』-tgctaacggaccgttttcg-3』，

反向外引物b3:5』-aagggaccgcatgactgt-3』，

正向內引物fip(f1c+f2):

5』-tgcgtagctgagaaagaggggagcctgcaggataaggatgg-3』，

反向內引物bip(b1c+b2):

5』-cgtgcagctactccgaccgagtgatttgtcctacacgcca-3』

所述的用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp試劑盒，包括：2.5μl10×thermopolbuffer，6mmmgso4、0.8mbetaine,1.4mmdntps,lamp所用的lamp特異性引物0.2μmf3,0.2μmb3,1.6μmfip,1.6μmbip，8ubstdnapolymerase組成的檢測溶液。

一種大豆擬莖點種腐病菌的lamp檢測方法，取16.5μl檢測溶液，加入2μl待檢測dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應總體積25μl，反應62℃，60min。反應結束後加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應指示劑，陽性反應溶液變為黃綠色，紫外燈下可以觀察到螢光，表示存在大豆擬莖點種腐病菌，陰性反應溶液沒有出現顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發螢光，表示不存在大豆擬莖點種腐病菌，或所含大豆擬莖點種腐病菌未達到最低檢測量。

有益效果：

與傳統的檢測技術相比，本發明具有更高的準確性、靈敏度和時效性。以形態特徵為基礎的傳統檢測方法耗時長、需要檢測的樣品量大，而且要求操作者具備專業的真菌分離、形態學鑑定知識和豐富的實踐操作經驗，因而經常導致漏檢，檢測準確率較低。本發明通過實驗驗證，在不同的大豆病害之間，大豆擬莖點種腐病菌的檢出率為100％，準確性及特異性高；本發明最低可以檢測出100pgdna含量的樣品，靈敏度高；本發明的耗時只要60min，加上樣品的富集及dna的提取，一般只需要半個工作日，時效性高。

本發明在生物信息學的基礎上，通過基因序列比對分析，得到的鈣調素(calmodulin,cam)編碼基因在進化時較為保守，其外顯子區域在屬間具有高度的保守性，同時該基因存在序列差異較大的非編碼的內含子區域，該區域在鹼基水平上具有明顯的種間差異，因此該編碼基因可以用來作為分子檢測的靶標而加以應用。通過lamp引物設計軟體設計出多條符合設計參數的引物，但並不是每組引物都具有較好的特異性和擴增靈敏度，容易出現假陽性，導致出現誤判及錯誤的檢測結果。因此，如何將軟體設計的引物同實際應用結合起來，顯得尤為關鍵，本發明核心正是在一定的理論基礎上，經過數次實驗篩選、驗證和甄別出來的。

與現在普遍使用的普通pcr分子檢測技術相比較，本發明對實驗場所的要求簡單、實驗操作方便、結果觀察簡便直觀。普通pcr分子檢測技術需要不同的溫度變化循環，需要較為專業的pcr操作儀器，實驗結果需要凝膠電泳染色後在凝膠成像儀中進行觀察，因此整個實驗需要專業、昂貴的實驗操作儀器，而且操作較為繁瑣。本發明在62℃恆溫條件下對目標片段進行擴增，實驗結果通過直接觀察反應體系顏色的變化即可進行判斷。因此本發明非常適合在基層及進出口檢驗檢疫部門推廣使用。

具體實施方式

一種用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物組，包括下列引物：

正向外引物f3：5』-tgctaacggaccgttttcg-3』，

反向外引物b3：5』-aagggaccgcatgactgt-3』，

正向內引物fip：

5』-tgcgtagctgagaaagaggggagcctgcaggataaggatgg-3』

反向內引物bip：

5』-cgtgcagctactccgaccgagtgatttgtcctacacgcca-3』。

實施列1

用於檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp試劑盒，包括：2.5μl10×thermopolbuffer，6mmmgso4、0.8mbetaine,1.4mmdntps,lamp所用的lamp特異性引物0.2μmf3,0.2μmb3,1.6μmfip,1.6μmbip，8ubstdnapolymerase組成的檢測溶液。各組分的濃度表示其在檢測溶液中的終濃度。

實施列2大豆擬莖點種腐病菌lamp引物的特異性試驗

為驗證大豆擬莖點種腐病菌lamp引物的特異性，選擇了4個大豆擬莖點種腐病菌、14個其它病原菌(1-4：phomopsislongicolla，5:diaportheactinidiae，6：diaporthemelonis，7：colletotrichumtruncatum，8:c.scovillei，9：c.spaethianum，10：fusariumoxysporum，11：f.equiseti，12:f.graminerum，13：f.solani，14：f.proliferatum，15：f.culmorum，16：phytophthorasojae，17:alternariatenussima，18：nigreosporasphaerica)的dna作為模版，取16.5μl實施列1所述的檢測溶液，加入2μl待檢測dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應總體積25μl，反應62℃，60min。反應結束後加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應指示劑。含有大豆擬莖點種腐的樣品(1-4號)反應溶液變為黃綠色，紫外燈下可以觀察到螢光，反應結果為陽性。而其它病原菌為模版的反應溶液沒有出現顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發螢光，反應結果為陰性，表示不存在大豆擬莖點種腐病菌。該結果表示，利用大豆擬莖點種腐病菌lamp引物及其反應溶液，恆溫擴增後添加sybrgreeni作為顯色反應指示劑可以特異性的檢測出含有大豆擬莖點種腐病原菌的存在，且具有省時、省錢、省力、可操作性強等諸多優點。

實施列3大豆擬莖點種腐病菌lamp特異性引物的靈敏度試驗

為驗證大豆擬莖點種腐病菌lamp特異性引物的靈敏度，將提取的大豆擬莖點種腐病菌菌株dna進行10倍遞度稀釋後(從1μg/μl到1fg/μl)，取16.5μl實施列1所述的檢測溶液，加入2μl系列稀釋的dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應總體積25μl，反應62℃，60min。反應結束後加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應指示劑進行結果觀察，模版濃度較高時，發生lamp擴增時，陽性反應溶液變為黃綠色，紫外燈下可以觀察到螢光，在含量較低的模版中，反應溶液沒有出現顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發螢光，反應結果為陰性。在25μl的反應體系中，lamp體系所能檢測的最低靈敏度為100pg/μl。

實施列4感病大豆植株lamp檢測試驗

取9株接種大豆擬莖點種腐病菌7天後的大豆莖基部組織1-2cm，使用鹼裂解法快速提取dna，每毫克組織加入10μl0.5mnaoh，充分研磨後轉移至1.5ml的ep管中，12000rpm離心5min，取2μl直接用於lamp反應。取16.5μl實施列1所述的檢測溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應總體積25μl，反應62℃，60min。反應結束後加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應指示劑進行結果觀察，接種大豆擬莖點種腐病菌7天後的大豆莖基部組織的dna作為模版發生lamp擴增，反應溶液變為黃綠色，紫外燈下可以觀察到螢光，而以健康植株提取的dna作為模版，反應溶液沒有出現顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發螢光，反應結果為陰性。

seqidno.1

tgcgcctgatgctaacggaccgttttcggcctgcaggataaggatggcgatggttagtgcggtcaccgcttcctcccctctttctcagctacgcacgcgtcatactcgatccgccgcgacggtctgcgcgtgcagctactccgaccgaccgaccatcaaatctatcacgagtagtatgctaaggctggcgtgtaggacaaatcaccaccaaggagctcggcacagtcatgcggtcccttggtcaaaacccttccgagtccgagctgcaggacatgatcaacgaggtcgacgccgacaacaacggcaccattgacttccctggtgagtctagatcctcgtacactggatattc